בניית מיקרו-מערך רקמות מבוסס דבק לחקר גידולים ומחלות

Summary

פרוטוקול זה מתאר ייצור בעלות נמוכה ושיטת אימות יעילה לבניית TMA מבוססת דבק, המספקת פלטפורמת אבחון פתולוגית נוחה לחקר גידולים ומחלות.

Abstract

טכנולוגיית מיקרו-מערך רקמות (TMA) היא פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי וניתוח בו זמנית של דגימות רקמה מרובות, המאפשרת מחקר יעיל של סמנים ביולוגיים של גידולים ומחלות. עם זאת, שיטות בניית TMA קונבנציונליות מתמודדות לעתים קרובות עם מגבלות כגון מורכבות תפעולית, נהלים גוזלי זמן ודיוק משתנה. שיטת בנייה מבוססת דבק פותחה כדי להתגבר על אתגרים אלה, ומציעה קיבוע משופר של ליבת הרקמה ויציבות מבנית משופרת. אימות שיטתי כלל הערכה היסטולוגית (צביעת HE), פרופיל אימונוהיסטוכימי של חלבוני מטרה וניתוח פלואורסצנטי במקום הכלאה (FISH). התוצאות הראו כי השיטה מבוססת הדבק שמרה על שלמות פרוסה מצוינת, שיפרה את יחס האות לרעש והבטיחה שחזור עקבי של אצווה לאצווה. למרות שהגישה מוגבלת להפעלה ידנית, היא מציגה אפשרות אמינה וחסכונית לייצור TMA בתפוקה בינונית. שיטה זו מתאימה במיוחד לסביבות מחקר שמעריכות גמישות וגיוון מדגם על פני אוטומציה בקנה מידה גדול, ומרחיבה את התועלת של TMA במסגרות אקדמיות ואבחון.

Introduction

מיקרו-מערך רקמות (TMA) היא טכניקה בעלת תפוקה גבוהה לניתוח דגימות רקמה ^1,2,3. מתקבלות ליבות רקמת תורם מרובות, וגושי פרפין של התורם מועברים לבלוקים של רקמת הנמען לניתוח מולקולרי דיפרנציאלי והשוואתי בו זמנית באותם תנאי ביצועים^{תיאורטית 2,4}. הדרך הקלאסית לבנות מיקרו-מערך רקמות (TMA) היא להשתמש באגרוף חור כדי לחלץ ליבות רקמה מדגימת רקמה של תורם ולסדר אותן ברצף לתוך גוש פרפין מקבל. שיטה זו מתאימה לגושי פרפין תורמים בעומק דומה ומאפשרת ניתוח יעיל של דגימות מרובות על פרוסה אחת, מה שמשפר מאוד את יעילות המחקר ואת עקביות הנתונים ^5,6,7. עם זאת, לשיטה זו עדיין יש מגבלות מסוימות, כולל טיפול לקוי בליבת הרקמה במהלך תהליך ההטבעה, מה שעלול לגרום לצביעה לא עקבית של דגימות בניתוחים הבאים⁸.

השיטה השנייה של בניית TMA היא שיטת הסרט ^9,10. שיטה זו הופכת את תהליך הבנייה על ידי יציקת הבלוק סביב ליבות זקופות הפוכות, שעם השלמתן, צמודות לחלק העליון של ה-TMA, ללא קשר לאורך הליבה^11,12. עם זאת, שיטה זו מחייבת הקפדה על מיקום נכון של ליבת הרקמה ויעילות הסרט, וגם מגבילה את מספר הדגימות שניתן לעבד בהשוואה לטכניקות מסורתיות.

מחקר זה מציע שיטת דבק חדשנית לבניית TMA, שמטרתה לפתור בעיות כגון יציבות לא מספקת של ליבות רקמה ופעולות מורכבות הקיימות בטכניקות מסורתיות¹³. שיטה זו משתמשת בדבק כדי לתקן במדויק ליבות רקמה מרובות יחד ויש לה את היתרונות של פעולה פשוטה ומוצקות דגימה חזקה. בהשוואה לשיטות החיתוך או הסרט המסורתיות, שיטת הדבק יכולה להגדיל את קצב השמירה של ליבות הרקמות ולהפחית עלויות. שיטה זו ישימה למחקרים קליניים עם גודל מדגם בינוני ומתאימה במיוחד לעיצובי מחקר הדורשים התאמה גמישה של תוכנית הניסוי. עם זאת, יש לציין כי יכולת העיבוד של שיטה זו אינה עומדת בדרישות של תפוקה גבוהה במיוחד⁹. בינתיים, בתהליך היישום בפועל, יש להקים מערך שלם של נורמות הפעלה סטנדרטיות ומערכות בקרת איכות. המפעילים צריכים לקבל הכשרה שיטתית ולעבור הערכות מקצועיות כדי להבטיח סטנדרטיזציה של פעולות טכניות וחזרתיות של תוצאות. ניתוח מקיף מצביע על כך שטכנולוגיה זו משיגה איזון טוב בין גמישות תפעולית, עלות-תועלת ואמינות טכנית, ומתאימה במיוחד לתרחישי מחקר שבהם המשאבים מוגבלים אך עדיין יש להבטיח בקרת איכות.

Protocol

כל גושי התורמים התקבלו מדגימות פתולוגיות ארכיוניות שנאספו בין 2016 ל-2018 בבית החולים העממי מס' 1 של האוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג. הדגימות הוסרו לפני השימוש ועובדו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו (ועדת האתיקה של בית החולים העממי מס' 1 של האוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג, KY-2024-250-01).

1. הערכה ותיוג של רקמת תורם

1. בחר גושי רקמה בעובי של ≥5 מ"מ ושטח של ≥15 מ"מ × 15 מ"מ. הקפידו על מרווח בטיחות של 2 מ"מ בקצוות, ואל תכלול אזורים המציגים נמק, דימום או הסתיידות כדי לשמור על שלמות הרקמות.
2. זיהוי וסימון אזור יעד
   1. העריכו את החלקים המוכתמים ב-H&E באמצעות מיקרוסקופ אופטי. אתר את אזור היעד באמצעות סריקה בהספק נמוך, ולאחר מכן עבור להספק גבוה כדי לאשר את המאפיינים המורפולוגיים של התא. סמן את גבולות אזור היעד בשקופיות.
   2. מפה את הקואורדינטות של האזור שנבחר לפני השטח של גוש הפרפין כדי להשלים את המרת הסימון.

2. מיצוי ליבת רקמה

1. הכנת פנצ'ר וטיפול מקדים לדוגמא
   1. בחר מנקב חורים ידני בקוטר 2 מ"מ ואשר את החלקות של קצה החיתוך וקלות התפעול שלו.
   2. מניחים את גוש הפרפין התורם על פלטפורמה קרה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
2. יישר את המחט אנכית עם הנקודה המסומנת, והפעל לחץ סיבובי קבוע כדי להגיע לעומק המגביל. הימנע מהטיה או רטט במהלך התהליך⁷ (איור 1A).
3. סובב בעדינות את המחט נגד כיוון השעון (≤2 סיבובים/שניות) כדי למשוך אותה. הוציאו בזהירות את ליבת הרקמה מהמחט והעבירו אותה לבאר אינדיבידואלית של צלחת מקוררת מראש של 96 בארות. רשום את מיקום הליבה בכל באר (איור 1B).
   הערה: אם החלק התחתון של ליבת הרקמה אינו אחיד, יישר אותו עם להב. לאחר החיתוך, בדוק שוב את התקינות.
4. רשום מראש את כל מספרי התורמים ואת מיקומי באר הצלחות המתאימים של ELISA (A1-H12) בטופס ההרשמה. במהלך הניתוח, בדוק שוב כדי לוודא התאמה קפדנית בין מספר התורמים למיקומי הבאר.
5. בדוק מיד את הליבות לאיתור תקינות. השלך גרעינים שבורים, מכופפים או בעלי סטיות קוטר >0.1 מ"מ.
   הערה: ודא עקביות באורך הליבה (מקדם וריאציה, CV ≤5%) והימנע משריטות משטח או חפצי דחיסה.

3. קיבוע ליבת רקמות

1. השתמש בטוש עמיד למים כדי לצייר רשת ישירות על משטח התבנית, מה שמבטיח קווים ברורים ומרווחים באופן שווה.
   1. השתמש בתבנית סטנדרטית עם שטח תחתון יעיל של 3.0 ס"מ × 2.5 ס"מ, ושמור שטח גבול ריק של 1.5 מ"מ מכל צד.
   2. השתמש בטוש עמיד למים בנקודה עדינה של 0.5 מ"מ כדי לצייר תשעה קווים מקבילים במרווחים שווים אופקית ואנכית, ויוצרים רשת מיקום של 9 × 9 (81 נקודות חיתוך בסך הכל).
      הערה: לפני שמתחילים, נקו את פנים התבנית בעזרת צמר גפן ספוג קסילן כדי להסיר שאריות פרפין, שעלולות לגרום לדלמינציה. במהלך תהליך השרטוט, השתמש בסרגל פלדה כדי להבטיח עובי קו אחיד ונקודות חיתוך הניתנות להבחנה בבירור.
2. השתמש בפיפטה כדי לצייר 5 מיקרוליטר דבק והנח אותו בעדינות במרכז השקופית המסומנת מראש ליצירת טיפה אחת. השתמש מיד בפינצטה עדינה כדי להרים אנכית את ליבת הרקמה בזווית של 90 מעלות וללחוץ אותה לאט אנכית לתוך טיפת הדבק (איור 1C).
3. הכנס את הליבות לצמתים המתאימים ברשת על התבנית באמצעות פינצטה. הפעל לחץ עדין למשך 5 שניות כדי להבטיח הידבקות בטוחה (איור 1D).
4. אם ליבת הרקמה נעקרת, כוונן ואפס אותה מיד באמצעות פינצטה עדינה לפני שהדבק מתמצק (תוך 30 שניות). השלך ליבות מוצקות ולא מיושרות כדי לשמור על איכות ההכנה תוך שמירה על דגימות יקרות במידה המרבית.

4. התקנת קלטות והטמעת פרפין

1. הנח אנכית את קלטת הרקמות מעל תבנית הפלדה, והבטיח מגע עם קצות הליבה מבלי להפעיל דחיסה. אבטח את הקסטה באמצעות מהדקים מגנטיים בכל ארבע הפינות, ואטום את התפרים בפרפין מותך.
2. להחדיר פרפין מותך בזווית של 45° בתבנית זיגזג, תוך שמירה על קצב זרימה של 1 מ"ל לשנייה. ודא שרמת הפרפין עולה על קצות הליבה ב-2 מ"מ (איור 1E).
3. יש לקרר במהירות את הבלוק על צלחת קרה של 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ליצירת שכבת תמיכה קשיחה. העבר את הבלוק לסביבה של 22 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להפחית את הלחץ הפנימי. לבסוף, השתמש באקדח חום של 40 מעלות צלזיוס כדי להחליק בעדינות את פני השטח ולהעלים סימני הצטמקות.
4. מחממים מעט את הפרפין כדי לרכך אותו, ואז חותכים בזהירות לאורך שולי הקסטה כדי לשחרר את הבלוק. הרם בעדינות את הקסטה והסר את שאריות הפרפין כדי להבטיח את שלמות ליבות הרקמה (איור 1F).

Results

במחקר הנוכחי נבנו מיקרו-מערכי רקמות איכותיים בשיטת הדבק. כדי לאמת את יעילות השיטה, בוצעה סדרה של ניסויים, כולל צביעת H&E, זיהוי אימונוהיסטוכימי של חלבונים ספציפיים וניתוח פלואורסצנטי במקום הכלאה (FISH). מרכיב קריטי בתהליך הבנייה הוא נוכחותן של נקודות ליבת רקמה במיקומים ובמרחקים הצפויים זה מזה, המוערכת על ידי בדיקה חזותית. בדיקה ויזואלית של בלוקי ה-TMA מראה שהליבות קיימות ומרווחות באופן קבוע בכל TMA (איור 2A). צביעת H&E הראתה שכל ליבות הרקמות היו מסודרות בצורה מסודרת, עם מרוו...

Discussion

כשיטה חדשנית לבניית מיקרו-מערכי רקמות (TMA), שיטת הדבק הראתה יתרונות משמעותיים בשל קלות הליכי הבנייה והעלות-תועלת שלה. בהשוואה לשיטת מערך המחטים המסורתית, המסתמכת על מכשירים מתוחכמים^14,15, שיטת הדבק מאפשרת קיבוע דגימה על ידי הדבקה, שניתן לעשות זאת בכלים בסיסיים בלבד, מה שמפחית מאוד את הסף הטכני. בניגוד לשיטת ההטבעה המסורתית, שיטת ההדבקה קבועה על ידי חלוקה מקומית, מה שמקצר משמעותית את זמן הלוקליזציה של ליבת הרקמה ומונע הרס של אנטי...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
סרטן השד ערכת זיהוי HER2	Anbiping	2502001	סרטן השד ערכת זיהוי HER2
נוגדן CDHR4 נוגדן	Abcam	ab166914	נוגדן CDHR4
CDK1 נוגדן	Abcam	ab265590	CDK1 נוגדן CRTAC1
נוגדן	Abcam	ab254691	נוגדן CRTAC1
DNASE1L3 נוגדן	Abcam	ab203669	DNASE1L3 נוגדן
מכונת הטבעה	PSJ רפואי	BM450A	מכונת הטבעה
רקמות אוטומטי לחלוטין	Leica Biosystems	ASP3005	מייבש רקמות אוטומטי לחלוטין
שקופיות מיקרוסקופ זכוכית	Citotest	250124A1	זכוכית מיקרוסקופ שקופיות
דבק	TIZO	200	דבק
GPR146 נוגדן	Abcam	ab117104	GPR146
נוגדן IGSF10 נוגדן	Abcam	ab197671	IGSF10 נוגדן
ITIH1 נוגדן	Abcam	ab233032	ITIH1 נוגדן
להבי מיקרוטום בפרופיל נמוך	תרמו פישר	3052835	להבי מיקרוטום בפרופיל נמוך
עט סמן	מעדנייה	SK109	עט סמן
מיקרוטום	Leica Biosystems	HistoCore BIOCUT	Microtome
	Solarbio	YA0012	שעוות פרפין
SMAD9 נוגדן	Abcam	ab262940	SMAD9
נוגדן TARBP1 נוגדן	Abcam	ab115896	נוגדן TARBP1
ZCCHC24 נוגדן	Abcam	ab88756	נוגדן ZCCHC24