זרימה ציטומטרית וניתוח תא בודד לאפיון הפעלת מיקרוגליה בהתפתחות מוח מוקדמת של עכבר לאחר לידה

Summary

פרוטוקול זה משלב זרימה ציטומטרית וריצוף RNA של תא בודד כדי לבודד ולאפיין מצבי תאי מיקרוגליה במוח הקטן של מוחות עכברים מוקדמים לאחר הלידה. הוא משתמש בדיסוציאציה אנזימטית, צנטריפוגה פרקול וצביעה חיסונית כדי לחשוף הטרוגניות של מיקרוגליה ולשפר את ההבנה של תפקידיהם בהתפתחות המוח הקטן ובמחלות.

Abstract

מיקרוגליה, תאי החיסון השוכנים במוח, מציגים פרופילי שעתוק ספציפיים לאזור ולהקשר במהלך ההתפתחות והמחלה. פרוטוקול זה מציג שתי שיטות משלימות לחקר אוכלוסיות מיקרוגליה ברקמת המוח הקטן של העכבר: ציטומטריית זרימה וריצוף RNA של תא בודד.

כשיטה הראשונה בה נעשה שימוש, הפרוטוקול המבוסס על ציטומטריית זרימה מותאם למוחות מוקדמים לאחר הלידה, ומבטיח בידוד תאים חזק ועקביות בתנאי ניסוי. זה מתחיל בדיסוציאציה של רקמות באמצעות עיכול אנזימטי, ואחריו הסרת מיאלין באמצעות צנטריפוגה של שיפוע צפיפות פרקול כדי להניב תרחיף תאים עצביים באיכות גבוהה, ואסטרטגיית שער המבוססת על ביטוי CD45 ו-CD11b. צביעה חיה/מתה מבטיחה את כדאיות התאים, ונוגדנים מצומדים פלואורוכרום משמשים לפרופיל הביטוי של סמני משטח נבחרים על מיקרוגליה. בקרות מפצות מבוצעות באמצעות חרוזי לטקס עם אסטרטגיות שער מאומתות באמצעות בקרת פלואורסצנטיות מינוס אחד (FMO).

השיטה השנייה כוללת ריצוף RNA של תא בודד באמצעות 10X Genomics, בעקבות אותם שלבי בידוד במעלה הזרם, המאפשרים פרופיל טרנסקריפטומי של מיקרוגליה על פני תנאים. אשכולות מיקרוגליה מזוהים באמצעות ניתוח ביטוי גנים, וניתוח ביטוי דיפרנציאלי מתבצע בין קבוצות ניסוי. מסווג יער אקראי מיושם אך ורק כדי להבחין בין דגימות זכר ונקבה בעת ריבוב.

יחד, פרוטוקולים אלה הניתנים לשחזור וניתנים להתאמה מספקים מסגרת חזקה לחקירת מגוון המיקרוגליה במוח הקטן במהלך התפתחות המוח המוקדמת והשינוי הפוטנציאלי שלו בעקבות הפרעות ניסיוניות.

Introduction

התקופה המוקדמת שלאחר הלידה היא שלב קריטי להתפתחות המוח, המאופיינת בתהליכים תאיים ומולקולריים מורכבים המניחים את היסודות לתפקודים קוגניטיביים, רגשיים והתנהגותיים¹. עם זאת, תקופה זו מאופיינת גם בפגיעות, שכן שיבושים יכולים לשנות מסלולים נוירו-התפתחותיים ולהוביל להפרעות נוירולוגיות או פסיכיאטריות ארוכות טווח. מיקרוגליה, תאי החיסון השוכנים במוח, ממלאים תפקיד מרכזי בעיצוב המוח המתפתח באמצעות גיזום סינפטי, פגוציטוזיס, מעקב חיסוני ותגובות לעלבונות סביבתיים ^2,3. תאים אלה מציגים פלסטיות יוצאת דופן, ומאמצים פרופילי שעתוק המשתנים בהתאם לאזור המוח, שלב ההתפתחות וההקשר הפתולוגי ^4,5.

ניתוח מדויק של הפעלת מיקרוגליה במוח המתפתח דורש מתודולוגיות חזקות וחוזרות על עצמן המסוגלות לנתח את הפנוטיפים הדינמיים שלהם בהקשר של רקמות מוח לא בשלות. ציטומטריית זרימה מספקת פתרון אמין, המאפשר אפיון תפוקה גבוהה של אוכלוסיות תאים וביטוי סמנים⁶. עם זאת, היישום שלו בחקר מיקרוגליה ממוחות מוקדמים לאחר לידה הוא מאתגר מבחינה טכנית בשל האופי העדין של הרקמה והצורך בפרוטוקולי בידוד והעשרה יעילים של תאים ^7,8.

הפרוטוקול המוצג כאן משלב זרימה ציטומטרית וריצוף RNA של תא בודד (scRNA-seq) כדי לבודד ולאפיין מיקרוגליה ממוחות עכברים מוקדמים לאחר הלידה, עם דגש מיוחד על המוח הקטן מהיום השלישי (P3) שלאחר הלידה ועד היום ה-30 שלאחר הלידה (P30)⁹, אזור ושלב התפתחותי שעבורו הפניות מתודולוגיות מפורטות נותרו מוגבלות.

זרימת עבודה זו כוללת דיסוציאציה אנזימטית, צנטריפוגה של שיפוע צפיפות להסרת פסולת והעשרת תאים, וצביעה חיסונית באמצעות פאנל של סמנים חוץ-תאיים ותוך-תאיים. כדי לאפיין את מגוון המיקרוגליה, נעשה שימוש במגוון סמנים פני השטח והתוך-תאיים^10,11. במקום להקצות תוויות קבועות (דלקתיות או מתקנות), הפרוטוקול מגדיר תת-אוכלוסיות על סמך פרופילי ביטוי סמנים בדידים. לדוגמה, מיקרוגליה המבטאת CD80, CD86 ו-iNOS, CD206 ו-Arg1, CD86 ו-CD64, או CD163 ו-CD206 מזוהות ומנותחות כתת-קבוצות נפרדות מולקולריות. סמנים אלה משקפים מצבי מיקרוגליה מופעלים שונים^10,11 ומוצגים כפרופילי ביטוי.

אסטרטגיית שער רב-פרמטרית זו מאפשרת זיהוי מדויק של תת-קבוצות מיקרוגליה על סמך ביטוי סמני פני השטח, ומציעה מסגרת יעילה לניתוח הטרוגניות חיסונית במהלך התפתחות המוח לאחר הלידה. כדי להרחיב את הפרופיל הפנוטיפי ולחשוף מגוון שעתוק, ריצוף RNA של תא בודד מבוצע לאחר בידוד התאים. מחקר זה מבסס זרימת עבודה עקבית וניתנת להרחבה כדי לקדם את ההבנה של תהליכים נוירו-התפתחותיים וההשפעה ארוכת הטווח של הפעלת מיקרוגליה. על ידי שילוב ציטומטריית זרימה אופטימלית ו-scRNA-seq במסגרת מושכלת התפתחותית ואזורית, פרוטוקול זה משמש ככלי רב עוצמה לחקירת ביולוגיה של מיקרוגליה בתחילת החיים והרלוונטיות שלה לתוצאות נוירו-התפתחותיות.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה האתית של מרכז המחקר CHU Sainte-Justine ועומדים בהנחיות ובמדיניות של מרכז המחקר Ste-Justine ואוניברסיטת מונטריאול (מונטריאול, קוויבק, קנדה).

1. בידוד תאים מהמוח

1. לאחר הליכי הרדמה/המתת חסד, הסר במהירות את כל המוח מחלל הגולגולת והנח אותו בצינור של 15 מ"ל המכיל מדיום תרבית תאי מיקרוגליה (ראה טבלת חומרים). שמור את הצינור על קרח. חזור על אותו הליך עבור עכברים נוספים במידת הצורך.
   כל העכברים ששימשו במחקר זה הופקו ממושבות רבייה פנימיות במעבדתו של ד"ר טרמבליי. עכברי הניסוי נוצרו על ידי הכלאה של עכברי B6.129-Cx3Cr1^{CreERT2-EYFP/WT} עם עכברי B6-Rosa26^iDTR/WT , שניהם מקורם במקור במעבדות ג'קסון. אסטרטגיית רבייה זו ייצרה צאצאים הטרוזיגוטיים עבור אלל IDTR , מה שאפשר דלדול מותנה של תאים המבטאים Cx3Cr1 (בעיקר מיקרוגליה) באמצעות מערכת Cre-loxP המושרה על ידי טמוקסיפן. לפני איסוף הרקמות, העכברים הורדמו באמצעות הזרקה תוך-צפקית של קטמין (150 מיקרוגרם/גרם) וקסילזין (10 מיקרוגרם/גרם). המתת החסד בוצעה על ידי עריפת ראש בהרדמה עמוקה, בהתאם להנחיות מוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים.
2. או לשמר את המוח כולו או להמשיך בניתוח של אזורים ספציפיים אם תרצה. בצע את הדיסקציה בצלחת פטרי קטנה המכילה מדיום תרבית תאי מיקרוגליה (ראה טבלת חומרים) על קרח כדי לשמור על כדאיות התא.
   הערה: פרוטוקול זה אושר עבור כל המוח והמוח הקטן מ-P1 עד P30.
3. הסר את מדיום תרבית תאי המיקרוגליה וחתוך דק את רקמת המוח בעזרת אזמל בצלחת פטרי.
4. לצורך העיכול האנזימטי , העבירו את הרקמה ההומוגנית לצינורות של 5 מ"ל. הוסף 2 מ"ל של HBSS (1x) בתוספת 2 מ"ג/מ"ל קולגנאז D ו-14 מיקרוגרם/מ"ל DNase I (ראה טבלה 1). אטום את מכסי הצינור עם פרפילם. דגרו את הצינורות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ונערו את הצינור כל 5 דקות. כדי להפסיק את העיכול, הניחו את הצינורות על קרח.
5. העבירו את ההומוגנאט דרך מסנן רשת מתכת של 140 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) כדי להסיר פסולת גדולה. השתמש בעלי זכוכית כדי לנתק את התאים.
6. שטפו את המסנן מספר פעמים עם מדיום תרבית תאי מיקרוגליה (3 מ"ל לכל כביסה).
7. אוספים את המסנן באמצעות פיפטה של 10 מ"ל ומעבירים אותו לצינור של 15 מ"ל. צנטריפוגה את התמיסה ב-500 גרם למשך 7 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
8. השליכו את הסופרנטנט על ידי היפוך בזהירות של הצינור. השעו מחדש את הגלולה על ידי גירוד בעדינות על מתלה.
9. הוסף 10 מ"ל של תמיסה קולואידית על בסיס 37% סיליקה (ראה טבלה 1) כדי להסיר מיאלין ופסולת. צנטריפוגה בתמיסה ב-500 גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס עם כוח בלימה מינימלי.
10. שאפו את שכבת המיאלין בחלק העליון של התמיסה באמצעות פיפטה של 10 מ"ל.
    הערה: שאיפה מתמשכת מונעת מהמיאלין להתערבב בחזרה לתמיסה.
11. שטפו את התאים על ידי הוספת 10 מ"ל HBSS (1x) וצנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 7 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
12. השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה על ידי גירוד בעדינות עם מתלה, ולאחר מכן הוסיפו 10 מ"ל של מאגר מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנט (FACS) (ראה טבלה 1). צנטריפוגה את התמיסה ב-500 גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
13. השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה הסופית ושמרו על התאים. התאים המבודדים מוכנים כעת לצביעה ציטומטרית זרימה או לריצוף RNA של תא בודד.
14. לבידוד ריצוף RNA של תא בודד, ספרו את התאים תחת מיקרוסקופ באמצעות ריאגנטים פלואורסצנטיים יציבים (ראו טבלת חומרים) כדי להבחין בין תאים גרעיניים חיים ומתים, יחד עם טריפן כחול (ראו טבלת חומרים). ודא שהתאים במצב מצוין, עם כדאיות של עד 90%, ומגיעים לריכוז של 1000 תאים/מיקרוליטר). השלבים הבאים מתוארים בסעיף 9.1.
    הערה: שמור את הצינורות על קרח לאורך כל הפרוטוקול. יש לבצע את כל שלבי הצנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס עם בלם מקסימלי, למעט שלב פרקול, שבו מצוין בלם מינימלי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, בצע את הפרוטוקול כולו באותו היום. עבור מסנן פרוטוקול רצף RNA חד-תא את כל הפתרונות המשמשים לבידוד, בשלב 1.11, השתמש ב-HBSS (1x) עבור השטיפה השנייה, ובשלב 1.12, שמור על 70-100 מיקרוליטר של תמיסת התא.

2. פרוטוקול צביעה חוץ-תאי של ציטומטריית זרימה

1. מעבירים את כל התאים לצלחת של 96 בארות עם תחתית חרוטית (ראה טבלת חומרים). צנטריפוגה את הצלחת בחום של 500 גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. הפוך במהירות את הצלחת כדי להסיר סופרנטנט בתנועה אחת.
3. השעו מחדש את גלולת התא ב-25 מיקרוליטר של תמיסת חסימה (ראה טבלה 1). יש לדגור למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
4. כדי להכין את תערובת צביעת הנוגדנים החוץ-תאית (ראה טבלה 2), מלאי נוגדנים צנטריפוגה ב-10,000 × גרם להסרת אגרגטים פוטנציאליים. מבלי להפריע לגלולה, שאפו בזהירות את הנפח הרצוי מהסופרנטנט כדי להכין את תערובת הצביעה והתאימו את הנפח ל-25 מיקרוליטר עם FACS Buffer.
5. הוסף 25 מיקרוליטר מתערובת הנוגדנים החוץ-תאית לכל באר. דגירה למשך 20 דקות ב-RT.
   הערה: לפני השימוש הניסיוני, כל הנוגדנים נבדקו על תרחיפי תאים בודדים במוח הקטן (או במוח) כדי לקבוע את ריכוז העבודה האופטימלי. טיטרציה בוצעה על ידי דילולים סדרתיים ליצירת עקומת רוויה, והדילול המתאים למישור אות עם רקע מינימלי נבחר עבור בימוי האות.
6. מבלי לערבב, הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר FACS לבארות. צנטריפוגה את הצלחת בחום של 500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הפוך את הצלחת כדי להסיר את הסופרנטנט בתנועה אחת.
7. השעו מחדש את גלולת התא ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS. צנטריפוגה את הצלחת בחום של 500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הפוך את הצלחת כדי להסיר את הסופרנטנט בתנועה אחת. חזור על הכביסה פעם נוספת באמצעות 200 מיקרוליטר של מאגר FACS באותם תנאים.

3. צביעה תוך תאית

1. השעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר ספונין-פרפורמלדהיד (PFA) (ראה טבלה 1) כדי לתקן ולחדור את התאים. דגירה למשך 10 דקות ב-RT, מוגן מפני אור.
2. מבלי לערבב, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר ספונין (ראה טבלה 1). צנטריפוגה את הצלחת בחום של 500 × גרם למשך 6 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הפוך את הצלחת כדי להסיר את הסופרנטנט בתנועה אחת.
3. השעו מחדש את כדור התא ב-200 מיקרוליטר של מאגר ספונין. הכן בקרות פיצוי על ידי הוספת 20 מיקרוליטר חרוזים (ראה טבלת חומרים) ל-11 בארות ריקות. צנטריפוגה את הצלחת בחום של 500 × גרם למשך 6 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הפוך את הצלחת כדי להסיר את הסופרנטנט בתנועה אחת.
4. כדי להכין את תערובת צביעת הנוגדנים התוך-תאית (ראה טבלה 3), מלאי נוגדנים צנטריפוגות ב-10,000 × גרם כדי להסיר אגרגטים פוטנציאליים. מבלי להפריע לגלולה, שאפו בזהירות את הנפח הרצוי מהסופרנטנט להכנת תערובת הצביעה והתאימו את הנפח ל-50 מיקרוליטר עם מאגר ספונין.
5. השעו מחדש את הגלולה ב-50 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים תוך תאית (ראה בטבלה 3). הוסף 1 מיקרוליטר מכל נוגדן לבארות החרוזים. דגירה למשך 30 דקות ב-RT.
6. ללא ערבוב, הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר ספונין לכל באר דגימת תא, והוסף 100 מיקרוליטר של מאגר FACS לכל באר המכילה את בקרות הקיזוז לשטיפת החרוזים. צנטריפוגה את הצלחת בחום של 500 × גרם למשך 6 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הפוך את הצלחת כדי להסיר את הסופרנטנט בתנועה אחת.
7. השעו מחדש את גלולת התא ב-200 מיקרוליטר של מאגר ספונין והשעו מחדש את בקרות הפיצוי ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS. צנטריפוגה את הצלחת בחום של 500 × גרם למשך 6 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הפוך את הצלחת כדי להסיר את הסופרנטנט בתנועה אחת. חזור על הכביסה פעם נוספת באמצעות 200 מיקרוליטר של מאגר ספונין באותם תנאים.
8. השעו מחדש את התאים ואת בקרות הפיצוי ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS. העבירו את המתלה לצינור FACS ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לרכישת ציטומטריית זרימה.
   הערה: ודא שכל השלבים הכרוכים בריאגנטים רגישים לאור מבוצעים בתנאי תאורה מינימליים. באר חרוזים אחת אינה מכילה נוגדן, המתאים לצינור החרוז הלא מוכתם.

4. רכישת ציטומטריית זרימה

1. הפעל את ציטומטר הזרימה ולאחר מכן את המחשב.
2. פתח את תוכנת ציטומטר הזרימה והתחל את הפעלת הנוזלים על ידי בחירה באפשרות הפעל תחת הכרטיסייה ציטומטר.
3. צור תיקיית ניסוי חדשה על-ידי לחיצה על תיקיה חדשה והקצאת שם. לאחר מכן לחץ על ניסוי חדש כדי לתת שם לניסוי ובחר צינור חדש כדי להוסיף דגימה וצינור דגימה.

5. הגדר בקרות פיצוי

1. הכן חרוזי פיצוי מוכתמים בודדים לכל פלואורוכרום המשמש בלוח, יחד עם בקרה לא מוכתמת.
2. טען את צינורות הפיצוי על הציטומטר. הגדר את מתח הפיזור קדימה (FSC) ופיזור הצד (SSC) לכ-250.
3. התאם את המתחים עבור כל ערוץ פלורסנט כך שהאוכלוסייה השלילית תהיה בעשור הראשון של הציר.
4. להשיג לפחות 5,000 אירועים לכל צינור.
5. השתמש במטריצת הפיצוי כדי להתאים לחפיפה ספקטרלית עד שכל הפסגות החיוביות מופרדות בבירור מהאוכלוסייה השלילית ומרוכזות מעל 10⁴ על הציר המתאים.
   הערה: יש לבצע בקרות פיצוי עבור כל ניסוי, שכן הגדרות ציטומטר, או ביצועי פלואורוכרום יכולים להשפיע באופן משמעותי על חפיפה ספקטרלית. למרות שבקרות פיצוי מבוססות תאים מומלצות בחלק מהיישומים של רקמת המוח, נעשה שימוש בחרוזי לכידת נוגדנים בפרוטוקול זה בשל המספר הנמוך יותר של מיקרוגליה שניתן להשיג מהמוח הקטן של עכבר P3, מה שמגביל את ההיתכנות של פיצוי מבוסס תאים. פלואורסצנציה של נוגדנים אומתה בתחילה על תאים שמקורם במוח ונמצאה דומה לאותות מבוססי חרוזים. כלול תרחיף תאים לא מוכתם שמקורו במוח במהלך אופטימיזציה ראשונית של הפאנל כדי להעריך אוטו-פלואורסצנטיות של רקמות ולקבוע רמות אות בסיסיות. בקרה זו חיונית להגדרה נכונה של אוכלוסיות שליליות בכל ערוץ פלורסנט.

6. הכן ורכוש בקרות FMO

1. עבור כל סמן מפתח, הכינו בקרת פלואורסצנטיות מינוס אחד (FMO) הכוללת את כל הנוגדנים מלבד זה הנבדק.
2. הפעל את פקדי ה-FMO באמצעות אותן הגדרות רכישה כמו הדגימות המוכתמות במלואן.
3. השתמש בעלילות FMO כדי להגדיר ספי שער עבור אוכלוסיות נמוכות או חופפות וכדי להבחין בין חיובי אמיתי לרעשי רקע.
   הערה: יש לבצע בקרות FMO במהלך אופטימיזציה ראשונית של הפאנל כדי להגדיר גבולות שער מדויקים ואמינים, במיוחד ברקמות עם אוטופלואורסצנטיות גבוהה, כגון המוח. אם לוח הצביעה, הגדרות המכשיר או תנאי הניסוי משתנים, יש לחזור על פקדי FMO. עבור ניסויים עוקבים המשתמשים באותן הגדרות פאנל וציטומטר מאומתות, ניתן לעשות שימוש חוזר בספי שער שהוגדרו בעבר כדי להבטיח עקביות על פני שכפולים ביולוגיים.

7. הכן ורכוש בקרות איזוטיפ

1. מכתים את דגימת הבקרה בנוגדני בקרת איזוטיפ המותאמים בפלואורוכרום ובריכוז לנוגדני הבדיקה.
2. רכוש נתונים באמצעות אותן הגדרות ציטומטר.
3. השתמש בבקרות איזוטיפ רק כדי להעריך קשירה לא ספציפית פוטנציאלית, במיוחד במקרה של סמנים תוך-תאיים או נוגדנים בעלי אופי גרוע. אל תשתמש בבקרות איזוטיפ לשער, מכיוון שהם אינם משקפים את אותה קינטיקה מחייבת כמו נוגדנים ספציפיים.
   הערה: בקרות איזוטיפ אינן מתאימות לשער ואין להשתמש בהן להגדרת אוכלוסיות. השימוש בהם הוא אופציונלי ויש לשמור אותו לאימות ספציפיות הנוגדנים במקרים נבחרים.

8. אסטרטגיית שער ציטומטריית זרימה

1. צור את עלילות הנקודות הבאות עבור שער רציף:
   FSC-A לעומת SSC-A כדי לא לכלול פסולת
   FSC-A לעומת FSC-H לבחירת סינגלים.
   FSC-A לעומת Amcyan (צבע כדאיות) לשער תאים חיים.
2. זהה מיקרוגליה כ-CD11b⁺CD45⁺ באמצעות CD11b (FITC) לעומת CD45 (AF700).
   הערה: בשל השלב ההתפתחותי (P3-P15), ההקשר הדלקתי והעיכול האנזימטי, TMEM119 ו-P2RY12 לא היו אמינים להפרדה ברורה של מיקרוגליה מאוכלוסיות מיאלואידיות אחרות על ידי ציטומטריית זרימה. אסטרטגיית השער CD11b⁺CD45⁺ , שאומתה בעבר במוח שלאחר הלידה, שימשה אפוא לזיהוי אוכלוסיות מיקרוגליה תוך מזעור הזיהום. בתנאי ביקורת, התפוקה האופיינית נעה בין 30,000 ל-200,000 תאי מיקרוגליה לכל מוח מ-P3 עד P15. עבור ניסויים המתמקדים ספציפית במוח הקטן, התפוקה הממוצעת היא כ-5,000 תאי מיקרוגליה למוח.
3. השתמש בפקדי FMO כדי להגדיר ספי שער לסמני הפעלה.
4. לזהות תת-אוכלוסיות מיקרוגליה על סמך ביטוי של סמנים הקשורים למערכת החיסון:
   CD80⁺ (סופר בהיר 436)
   CD86⁺ (PE)
   iNOS⁺ (PE-eFluor 610)
5. מאפיינים עוד יותר תת-קבוצות מיקרוגליה על ידי שילובים של ביטוי סמן:
   CD206⁺ (APC) ^{ואז Arg1+} (PE-Cy7)
   CD86⁺ (PE) ^{ולאחר מכן CD64+} (PerCP-eFluor 710)
   CD163⁺ (Super Bright 600) ^{ולאחר מכן CD206+} (APC)
   הערה: שילובי סמנים משמשים לתיאור הטרוגניות מולקולרית בתוך אוכלוסיית המיקרוגליה. תת-קבוצות אלה מדווחות על סמך ביטוי סמן בלבד ואינן מוקצות לתפקידים פונקציונליים ספציפיים, בהתאם לתקנים הנוכחיים המכירים בפלסטיות מיקרוגליאלית ופנוטיפים תלויי הקשר.
6. טען מדגם ניסיוני. הגדר את FSC ל-300 ואת SSC ל-200. השתמש בקצב זרימה נמוך ורשום את מספר האירועים הרצוי.
7. לאחר הרכישה, שטפו את הציטומטר וייצאו נתונים כ-. FSC לניתוח.
8. נתח את הנתונים באמצעות תוכנת ציטומטר זרימה.

9. מדגם ריצוף RNA של תא יחיד

1. באמצעות אותו פרוטוקול בידוד תאים המתואר עבור ציטומטריית זרימה (ראה שלב 1.14), השעו מחדש את התאים המנותקים במאגר FACS. השתמש במאגר FACS בצינורות איסוף ובכל שלבי הטיפול הבאים כדי לשמור על יציבות התא.
2. אל תבצעו מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנט (FACS) אם המטרה היא ללכוד את כל סוגי התאים מאזור במוח. עם זאת, אם הניסוי דורש העשרה למיקרוגליה, כלול שלב מיון FACS לפני הריצוף.
3. העריכו מיד את כדאיות התאים באמצעות צבעי כדאיות פלואורסצנטיים יציבים וטריפן כחול (ראו טבלת חומרים). ספרו את התאים במיקרוסקופ באמצעות המוציטומטר (ראו טבלת חומרים).
4. ודא שהשעיית התאים מציגה כדאיות של לפחות 90% והתאם לריכוז סופי של כ-1,000 תאים/מיקרוליטר לפני שתמשיך בריצוף RNA של תא בודד.
5. שמור את כל הדגימות על קרח ועבד מיד לאחר הדיסוציאציה כדי למזער את הלחץ התאי ושינויי השעתוק.
6. מרבבים את הדגימות בזוגות בהתאם להוראות היצרן.
   הערה: זכר אחד ונקבה אחת מאותה קבוצת ניסוי אוחדו כדי להפחית את עלויות הניסוי.
7. הכן את ספריות scRNAseq (ראה טבלת חומרים) ופעל לפי הנחיות היצרן המומלצות.
   הערה: הכנת הספרייה בוצעה על ידי פלטפורמת הגנומיקה של המכון לחקר אימונולוגיה וסרטן (IRIC) באוניברסיטת מונטריאול.
8. רצף את ספריות scRNA-seq באמצעות מערכת ריצוף לעומק ממוצע של 3200M קריאות לנתיב.
   הערה: ריצוף בוצע ב-Genome Quebec במונטריאול.

10. ניתוח ריצוף RNA של תא בודד

1. בצע ניתוח ספירת מזהה מולקולרי ייחודי (UMI) באמצעות תוכנת Cell Ranger של 10X Genomics (v8.0.0) עם גנום הייחוס של העכבר GRCm39 2024-A. השתמש בחבילת Seurat R (v5.1) לניתוח במורד הזרם.
2. בצע בקרת איכות על ידי אי הכללת תאים עם RNA מיטוכונדריאלי החורג, למשל, מ-30% מסך ה-RNA (איור 1A), או סף מחמיר יותר שנבחר להסרת תאים עם לחץ פוטנציאלי. סינון תאים באיכות נמוכה עם log10GenesPerUMI גדול מ-0.75 (איור 1B), ספירת תכונות ייחודיות ("nUMI") מתחת ל-500, ומספר הגנים שזוהו לתא ("nGene") גדול מ-300 (איור 1C). לאחר מכן, הסר טיפות עם חבילת "scDblFinder" ב- R. עם תרשים מתאם של nUMI ו-nGene המציג את הספים, אפקט הסינון אמור להיות גלוי כעת (איור 1D).
3. הפחת את השפעות האצווה על ידי זיהוי 2,000 גנים משתנים מאוד לדגימה באמצעות פונקציית SelectIntegrationFeatures של Seurat.
4. שלב מערכי נתונים באמצעות ניתוח מתאם קנוני (CCA) ובצע ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) להפחתת מימדיות. השתמש בפונקציה RunPCA עם 50 רכיבים עיקריים (PCs), שינוי קנה המידה של הנתונים ונסיגה החוצה של מקורות שונות לא רצויים (למשל, תוכן מיטוכונדריאלי). הערך את מספר המחשבים שנשמרו על סמך תרשים המרפק וניתוח JackStraw.
5. דמיין אשכולות באמצעות אלגוריתם קירוב והקרנה של סעפת אחידה (UMAP) באמצעות פונקציית Seurat RunUMAP . זהה פרופילי ביטוי גנים ספציפיים לאשכול באמצעות הפונקציה FindAllMarkers . ביאורים לאשכולות המבוססים על חתימות שעתוק על ידי הצלבת גנים סמנים מזוהים עם משאבי תא בודד שנאספו כגון PanglaoDB ו-CellMarker (איור 2). סוגי תאים, כולל מיקרוגליה, מוסקים מפרופילים טרנסקריפטומיים אלה ולא מסמן פני השטח שהוגדר מראש.

11. הפרדת תאים מבוססת מין

1. זהה תאים זכריים ונקביים על סמך ביטוי גנים ספציפיים למין: ארבעה ספציפיים לנקבה (Xist, Tsix, Usp9x, Eif2s3x) ושלושה ספציפיים לזכר (Eif2s3y, Uty, Ddx3y).
2. סווג אוכלוסיות זכרים ונקבות על ידי סינון תאים המבטאים ספירת UMI מנורמלת > 1 עבור כל אחד מהגנים הללו באמצעות פונקציית תת-הקבוצה של Seurat.
3. צור אובייקטים של Seurat על ידי תת-הגדרה של תאים זכריים ונקביים בנפרד. אחסן ונתח אובייקטים אלה באופן עצמאי לצורך השוואות במורד הזרם.
4. אמת סיווג על ידי הדמיה של ביטוי גנים ספציפי למין באמצעות הפונקציות FeaturePlot ו-VlnPlot, תוך הבטחת הפרדה ברורה בין אוכלוסיות תאים זכריים ונקביים.
   הערה: יש לבצע את שלבים 12.1 ו-12.2 רק כאשר הדגימה הוכפלה על ידי ערבוב זכר אחד ונקבה אחת.

12. סיווג מיקרוגליה מבוסס מודל סטטיסטי

1. בנה חמישה מודלים סטטיסטיים ב-R (יער אקראי, רגרסיה לוגיסטית, בייס נאיבי, מכונה וקטורית תומכת, עץ החלטות) באמצעות ערכת אימון של ~1,000 תאים עם תוויות קבוצתיות ידועות.
2. העריכו את ביצועי המודל באמצעות עקומות אימות צולב ומאפייני פעולה של מקלט (ROC) פי 10 (איור 3). זהה גנים מרכזיים התורמים לסיווג באמצעות פונקציית FindAllMarkers ב-Seurat.
3. בחר את הדגם עם השטח הגבוה ביותר מתחת לעקומת ROC (AUC). מודל היער האקראי נבחר על סמך ציון ה-AUC המעולה שלו.
4. החל את המודל שנבחר על תאים לא מסווגים באמצעות פונקציית החיזוי מחבילת RandomForest R. מזג את הסיווגים החזויים עם מערכי נתונים שהוערו בעבר ב-Seurat באמצעות מיזוג.
5. אמת סיווגים על-ידי הדמיה של ביטוי גנים של סמן באמצעות FeaturePlot ו - VlnPlot. כדי להבטיח את העקביות של זהויות התאים החזויות, הערך את ההעשרה של קבוצת הגנים של הסמן החופפת לפני ואחרי הוספת התאים המסווגים עם מבחן סטטיסטי מתאים (למשל, המבחן המדויק של פישר).

13. ניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי של מיקרוגליה

1. בצע ניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי (DEG) בין שתי קבוצות ספציפיות של עניין באמצעות פונקציית Seurat "FindMarkers", כאשר ident.1 מייצג את קבוצת העניין ו-ident.2 מייצג את קבוצת הייחוס.
   הערה: הפלט מפרט גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי ב-ident.1 ביחס ל-ident.2. בהקשר זה, גנים מווסתים הם אלה עם ביטוי גבוה יותר בזהות.1 בהשוואה לזהות.2, בעוד שגנים מווסתים מראים ביטוי נמוך יותר בזהות.1. ההשוואות שלהם משמשות ליצירת עלילות הר געש ולפירוש שינוי שעתוק ספציפי למצב.
2. זהה גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי (DEGs) עם ערך P מותאם≤ 0.05. להשוואה בין שתי קבוצות ספציפיות, השתמש בפונקציה FindAllMarkers עם הקריטריונים הבאים: גנים המתבטאים בלפחות 10% מהתאים (min.pct = 0.1) וסף שינוי קיפול log2 של 0.25 (logfc.threshold=0.25). עבור השוואות מרובות קבוצות בכל המיקרוגליה, השתמש בפונקציה FindAllMarkers עם אותם פרמטרים. גנים עם ערך P מותאם ≤ 0.05 נחשבים לביטוי דיפרנציאלי משמעותי. כדי להמחיש דפוסי ביטוי DEG, צור תרשים הר געש באמצעות הפונקציה המובנית במארז EnhancedVolcano (איור 4).
3. השווה את תוצאות ציטומטריית הזרימה על ידי בחינת סמני הציטומטריה המשמשים למציאת מיקרוגליה, במיוחד CD45⁺ ו-CD11b⁺, התואמים לגנים Ptprcו-Itgam. אשר את ביטוי הגנים באמצעות פונקציות FeaturePlot ב-Seurat.
4. להעריך את הסמנים הקשורים בדרך כלל למצבי מיקרוגליה מובחנים, כולל CD80ו-NOS2, כמו גם Mrc1, Arg1, Fcgr1 ו-CD163. השתמש בפונקציות Seurat FeaturePlot ו- DotPlot כדי להציג באופן חזותי את הביטוי שלהן באשכולות תאים.
5. צור תרשים נקודות באמצעות הפונקציה DotPlot ב-Seurat כדי לסכם ביטויי סמן ולאמת את סיווג האוכלוסייה.

Results

פרוטוקול זה מנצל ביעילות את ציטומטריית הזרימה כדי לאפיין אוכלוסיות תאי מיקרוגליה בדגימות מוח של עכברים, בהתבסס על ביטוי של סמנים נבחרים על פני השטח ותוך התאים. הסעיפים הבאים מפרטים את התוצאות המתקבלות משלבי המפתח של זרימת העבודה, תוך הדגשת ההתפלגות וההטרוגניות של תת-קבוצות מיקרוגליה בתגובה לתנאי הניסוי.

אימות אסטרטגיית תגמול ושער
חרוזי פיצוי שימשו לכיול אותות פלואורסצנטיים ולתיקון חפיפה ספקטרלית בין פלואורוכרומים. אוכלוסיות חיוביות ושליליות עבור כל פלואורוכרום הופרדו בבירור, מה שאפשר יצירת מטריצת פיצוי מדויקת. ספי השער אומתו בתחילה באמצעות בקרת פלואורסצנציה מינוס אחד (FMO) במהלך אופטימיזציה של הפאנל כדי להבחין בין אות אמיתי לרקע, במיוחד עבור סמנים גרועים או חופפים. לאחר מכן נעשה שימוש חוזר בספים אלה בניסויים תוך שימוש באותם לוחות צביעה והגדרות ציטומטר כדי להבטיח עקביות. בקרות איזוטיפ נכללו כדי לנטר קשירה לא ספציפית פוטנציאלית, במיוחד עבור סמנים תוך-תאיים, אך לא שימשו להחלטות שער.

זיהוי תאי מיקרוגליה
אסטרטגיית שער התאים החיים/מתים (Amcyan) הוציאה בהצלחה תאים מתים. אסטרטגיית השער בודדה ביעילות אוכלוסיות תאי מיקרוגליה על סמך ביטוי CD45 (AF700) ו-CD11b (FITC). הפרמטרים של פיזור קדימה (FSC) ופיזור צד (SSC) היו ממוטבים (FSC = 300, SSC = 200) כדי למרכז את אוכלוסיית המיקרוגליה בתוך תרשים הנקודות (איור 5).

פנוטיפ תאי מיקרוגליה
ניתוח תרשים נקודות איפשר זיהוי של תת-אוכלוסיות מיקרוגליה על סמך ביטוי דיפרנציאלי של סמנים פני השטח והתוך-תאיים. באמצעות אסטרטגיות שער ספציפיות בתוכנת FlowJo, זוהתה תת-קבוצה של תאי מיקרוגליה המבטאים CD80 (Super Bright 436), CD86 (PE) ו-iNOS (PE-eFluor 610) (איור 6A). שער כפול שימש גם להגדרת תת-קבוצות המבטאות CD206 (APC) ו-Arg1 (PE-Cy7) (ראה איור 6B). אוכלוסיות נוספות אופיינו בביטוי משותף של CD86 (PE) ו-CD64 (PerCP-eFluor 710), כמו גם CD163 (Super Bright 600) ו-CD206 (APC) (איור 6C,D). פרופילים פנוטיפיים אלה משקפים הטרוגניות המוגדרת על ידי סמן בתוך אוכלוסיית המיקרוגליה ומדגימים את יכולתו של פרוטוקול זה להבחין בין תת-קבוצות מובחנות מרובות מבחינה שעתוק ואימונולוגית מבלי להסיק מצבים תפקודיים קבועים.

ניתוח תא בודד מיקרוגליה
קירוב והקרנה של סעפת אחידה (UMAP) שימשו להמחשת הטרוגניות תאית וזיהוי אשכולות תאי המיקרוגליה בין סוגי תאי מוח אחרים. כל נקודה מייצגת תא בודד, והאשכול מקודד בצבע בהתבסס על דמיון שעתוק (איור 2).

ניתוח ביטוי דיפרנציאלי בוצע בתוך אשכול המיקרוגליה כדי לזהות גנים המווסתים בתנאי ניסוי. גנים עם ערך P מותאם ≤ 0.05 נחשבו לביטוי דיפרנציאלי.

תרשים הר געש נוצר כדי להמחיש את הגנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי של תאי מיקרוגליה, תוך הדגשת אלה עם שינוי קפלים גבוה ומובהקות סטטיסטית (איור 4).

כדי להשוות את תוצאות התאים הבודדים הללו לנתוני זרימה ציטומטרית, נבדק הביטוי של סמני מיקרוגליה CD45 ו-CD11b (Ptprc ו-Itgam). UMAP מראה את הביטוי שלהם בתוך אוכלוסיות תאים שונות (איור 7).

לבסוף, הביטוי של סמנים נבחרים הקשורים למערכת החיסון הוערך כדי לאפיין הטרוגניות שעתוק בקרב תאי מיקרוגליה. תרשים כינור מציג את הביטוי של גנים כגון CD80 ו-NOS-, כמו גם Mrc1, Arg1, Fcgr1 ו-CD163 ברמת התא הבודד (איור 8). דפוסי ביטוי סמנים אלה מאפשרים השוואה עם פרופיל מבוסס ציטומטריית זרימה ומדגישים את המגוון המולקולרי של תת-קבוצות מיקרוגליה על פני תנאי ניסוי.

איור 1: בקרת איכות של נתונים טרנסקריפטומיים של תא בודד. (A) התפלגות תכולת הרנ"א המיטוכונדריאלי בין התאים. תאים עם >30% RNA מיטוכונדריאלי לא נכללו כדי להסיר תאים שעלולים להיות לחוצים או גוססים. (B) תאים עם log10GenesPerUMI > 0.75 סוננו החוצה כדי להבטיח יחס גן ל-UMI עקבי ולהפחית רעש מספריות בעלות מורכבות נמוכה. (C) תאים עם פחות מ-500 תעתיקים שזוהו (nUMI) או יותר מ-300 גנים שזוהו (nGENE) לא נכללו גם הם כדי לחסל תאים באיכות ירודה או מרובים. (D) תרשים מתאם של NUMI לעומת nGene הממחיש את ההשפעה של ספי סינון. כפילים שזוהו הוסרו. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הדמיית UMAP של טרנסקריפטומים חד-תאיים. תרשים UMAP המציג את התפלגות התאים הבודדים על סמך פרופילים טרנסקריפטומיים שהתקבלו משני בעלי חיים בודדים. כל נקודה מייצגת תא אחד, מקודד בצבע על ידי זהות אשכול. אשכול תאי המיקרוגליה מזוהה בקרב אוכלוסיות תאים אחרות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: עקומת ROC של מסווג יער אקראי המוערכת על ידי אימות צולב. עקומת מאפיין הפעלה של מקלט (ROC) הממחישה את הביצועים של מודל היער האקראי המשמש להבחנה בין מיקרוגליה לסוגי תאי מוח אחרים על סמך פרופילי ביטוי גנים. המודל אומן על קבוצה של ~1000 תאים עם תוויות ידועות והוערך באמצעות אימות צולב פי 10. מבין חמשת המודלים הסטטיסטיים שנבדקו (יער אקראי, רגרסיה לוגיסטית, בייס נאיבי, מכונת וקטור תמיכה ועץ החלטות), מודל היער האקראי השיג את ביצועי הסיווג הגבוהים ביותר. השטח שמתחת לעקומה (AUC) משקף את דיוק המודל. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי בתאי מיקרוגליה. תרשים הר געש המייצג את השינוי בקפל log2 לעומת ערך ה-P המותאם עבור גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי במיקרוגליה בין שתי קבוצות הניסוי (ביקורת לעומת פגיעה מוחית מוחית). גן מווסת מתבטא יותר בקבוצת העניין (ident.1), וגנים מווסתים מראים ביטוי מופחת בהשוואה לקבוצת הייחוס (ident.2). גנים מרכזיים המתבטאים באופן דיפרנציאלי משמעותי מסומנים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: אסטרטגיית שער לזיהוי מיקרוגליה על ידי ציטומטריית זרימה. (A) אסטרטגיית שער מיושמת על תאי מוח קטן מעכבר ביקורת ביום 3 לאחר הלידה (P3). (ב) סינגלטים נבחרו כדי לא לכלול כפולות. (C) תאים ברי קיימא זוהו באמצעות צבע בר-קיימא; אירועים עם FSC-A נמוך לא נכללו כדי להסיר פסולת ולהבטיח ניתוח של תאים שלמים. (D) מיקרוגליה זוהו כ-CD45⁺ ו-CD11b⁺ עם שתי אוכלוסיות נפרדות: CD45 נמוך-CD11b^int עבור מיקרוגליה שקטה ו-CD45^int -CD11b^גבוה עבור מיקרוגליה מופעלת. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6. אפיון פרופילי ביטוי סמני מיקרוגליה על ידי ציטומטריית זרימה. (A) שער רציף של תאי CD45⁺ CD11b⁺ בהתבסס על ביטוי CD80, CD86 ו-iNOS. (ב) זיהוי של תת-קבוצה המבטאת CD206, ואחריה שער המבוסס על ביטוי Arg1. (ג) זיהוי תת-קבוצה המבטאת CD86, ואחריה שער המבוסס על ביטוי CD64. (ד) זיהוי של תת-קבוצה המבטאת CD163, ואחריה שער המבוסס על ביטוי CD206. אסטרטגיות שער אלו ממחישות את ההטרוגניות הפנוטיפית של אוכלוסיות מיקרוגליה על סמך ביטוי סמנים פני השטח והתוך-תאי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: אישור זהות מיקרוגליה באמצעות ביטוי Itgam ו-Ptprc בנתוני ריצוף RNA של תא יחיד. UMAP מציג את נוף השעתוק של תאי המוח הקטן ב-P15, עם ביטוי גנים של Itgam ו-Ptprc על פני אשכולות. ביטוי משותף של סמנים מיאלואידים קנוניים אלה תומך בזיהוי אוכלוסיות מיקרוגליה ומיישר קו עם סמנים המשמשים בציטומטריית זרימה, ומספק אימות צולב בין ניתוחים טרנסקריפטומיים לניתוחים ברמת החלבון. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: פרופילי ביטוי של גנים נבחרים הקשורים למערכת החיסון בתאי מיקרוגליה שזוהו על ידי ריצוף RNA של תא בודד. עלילות כינור מציגות את התפלגות ביטוי הגנים עבור CD80, NOS2, Mrc1, Arg1, Fcgr1 ו-CD163 על פני תאי מיקרוגליה בודדים. סמנים אלה קשורים בדרך כלל לתהליכים הקשורים למערכת החיסון וממחישים את ההטרוגניות השעתוק שנצפתה באוכלוסיית המיקרוגליה. נתונים מוצגים הן עבור מצבי בקרה והן עבור פגיעה מוחית מוחית (CBI). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הרכב התמיסות המשמשות לבידוד וצביעה של תאים עצביים. טבלה זו מספקת הרכב מפורט של התמיסות הנדרשות לבידוד תאים וצביעה, כולל הריכוזים והמרכיבים שלהם. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 2: ריכוזי תערובת נוגדנים לצביעה חוץ-תאית. טבלה זו מפרטת את ריכוזי הנוגדנים והתמיסה החיה/מתה המשמשת לצביעה חוץ-תאית, ומציינת את הנפחים והדילולים הנדרשים עבור כל נוגדן בתערובת הצביעה עבור דגימה אחת. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 3: ריכוזי תערובת נוגדנים לצביעה תוך תאית. טבלה זו מפרטת את ריכוזי הנוגדנים המשמשים לצביעה תוך תאית, ומציינת את הנפחים והדילולים הנדרשים עבור כל נוגדן בתערובת הצביעה עבור דגימה אחת. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

Discussion

מחקר זה מציג פרוטוקול מפורט ואופטימלי המשלב זרימה ציטומטרית וריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) לבידוד ואפיון של תאי מיקרוגליה במהלך התפתחות המוח המוקדמת לאחר הלידה. בעוד שציטומטריית זרימה נותרה טכניקה חסכונית ונגישה, השילוב שלה עם טרנסקריפטומיקה של תא בודד מספק תובנות משלימות על ידי קישור ביטוי סמן ברמת החלבון עם פרופילי שעתוק ברמת הגן. הפרוטוקול מתייחס לאתגרים הטכניים הספציפיים לרקמת מוח לא בשלה, כולל דיסוציאציה יעילה, הסרת פסולת ומיאלין, ואסטרטגיות צביעה חיסוניות אופטימליות, כדי להבטיח שחזור ואמינות בניתוח אוכלוסיות מיקרוגליה על פני נקודות זמן התפתחותיות מרכזיות.

ציטומטריית זרימה שימשה לזיהוי תת-קבוצות מיקרוגליה על סמך ביטוי של סמנים פני השטח והתוך-תאיים שנבחרו. במקום להסיק מצבים פונקציונליים, תת-קבוצות נבדלו על ידי פרופילי ביטוי הסמנים שלהן, כגון CD80⁺/CD86⁺/iNOS⁺ ; CD206⁺/Arg1⁺ ; פנוטיפים CD86⁺/CD64⁺ או CD163⁺/CD206⁺ . אוכלוסיות אלה המוגדרות על ידי סמנים משקפות הטרוגניות מולקולרית בתוך תא המיקרוגליה ומספקות גישה מעשית לאפיון תפוקה גבוהה. בעוד שסיווגים מבוססי סמני פני שטח אלה עשויים שלא ללכוד את המורכבות המלאה של מגוון מיקרוגליה, הם נשארים אינפורמטיביים, במיוחד בהקשרים שבהם כלים מולקולריים בעלי מימדים גבוהים עשויים שלא להיות זמינים. סיווגים בינאריים כגון פרדיגמת M1/M2 נמנעו במכוון, מתוך הכרה באופי דמוי הספקטרום, תלוי ההקשר של פנוטיפים של מיקרוגליה, כפי שמתואר בספרות האחרונה¹².

תצפיות אלה עולות בקנה אחד עם מחקרים קודמים המדגישים את תפקיד המיקרוגליה הן בהתבגרות מוחית תקינה והן בתגובה לגירויים סביבתיים או פתולוגיים^13,14. היכולת להבדיל בין הטרוגניות של מיקרוגליה מציעה תובנות חשובות לגבי האופן שבו קיטוב תאי מיקרוגליה עשוי לתרום להפרעות נוירו-התפתחותיות^15,16.

למרות שריצוף RNA של תא בודד מציע רזולוציה גבוהה יותר ומאפשר זיהוי של תת-אוכלוסיות תאי מיקרוגליה נפרדות מבחינת שעתוק, עלותו ומורכבותו האנליטית מגבילים את הנגישות שלו. במערך הנתונים הנוכחי שנאסף ביום ה-15 לאחר הלידה לאחר פגיעה סביב הלידה, שיא התגובה הדלקתית נפתר במידה רבה, וכתוצאה מכך מספר נמוך של מיקרוגליה מופעלת. כתוצאה מכך, טכניקות הפחתת מימדים כגון UMAP לא שחזרו תת-אשכולות מיקרוגליאלים מופרדים היטב, וניתוח שעתוק ברמת האשכול לא נכלל בכתב היד של פרוטוקול זה.

חידוש משמעותי של פרוטוקול זה הוא האופטימיזציה שלו לבידוד ואפיון תאי מיקרוגליה מהמוח הקטן בשלבים המוקדמים שלאחר הלידה (P3 עד P30). אזור זה והקשר ספציפי לגיל מציבים אתגרים ברורים, כולל תפוקת תאים נמוכה, תכולת מיאלין ושבריריות רקמות מוגברת. כדי להתמודד עם אילוצים אלה, הפרוטוקול משלב זרימת עבודה מותאמת של דיסוציאציה, הסרת פסולת ומיאלין יעילה, ותנאי צביעה חיסוניים מכווננים בקפידה המתאימים לרקמת מוח קטן בנפח. למרות ההכרה הגוברת במיקרוגליה מוחית כנבדלת מבחינה תפקודית ושעתוק מאלה באזורי מוח אחרים, הפרוטוקולים המפורטים לבידודם וניתוחם נותרו מוגבלים. השיטה הנוכחית מציעה זרימת עבודה אמינה ונגישה, המותאמת במיוחד למחקרים התפתחותיים של מיקרוגליה מוחית.

המטרה העיקרית של כתב היד הזה היא לספק מסגרת מתודולוגית ניתנת לשחזור והתאמה ולא לדווח על תגליות ביולוגיות ספציפיות. זרימת העבודה מתאימה להתאמה לשלבי התפתחות אחרים או למודלים ניסיוניים שבהם מצבי מיקרוגליאה מובחנים מבחינת שעתוק עשויים להיות בולטים יותר. בהקשרים כאלה, ציטומטריית זרימה נותרה כלי רב ערך, במיוחד כאשר היא משולבת עם מבחנים משלימים.

אחת מנקודות החוזק העיקריות של פרוטוקול זה היא יכולת ההסתגלות שלו בשלבי התפתחות שונים, החל מהיום השלישי שלאחר הלידה (P3) ועד ליום ה-30 שלאחר הלידה (P30). זה מאפשר ניתוח אורך של פנוטיפ מיקרוגליה עם התקדמות התבגרות המוח. השימוש המשולב בזרימה ציטומטרית ו-scRNA-seq מאפשר לחקור לא רק סמני פני השטח, אלא גם מסלולי איתות תוך-תאיים וגורמי שעתוק המעורבים בתאי מיקרוגליה.

עם זאת, עיכול אנזימטי עשוי להשפיע על הביטוי של סמנים מסוימים על פני השטח, מה שמחייב אופטימיזציה זהירה של תנאי העיכול למטרות ניסוי ספציפיות^17,18. בנוסף, לא ציטומטריית זרימה ולא ריצוף תא בודד מספקים נתונים ברמת האוכלוסייה, שעשויים שלא ללכוד במלואם ניואנסים מרחביים ותפקודיים של אינטראקציות תאי מיקרוגליה בסביבתם המקורית. שילוב טכניקות מרחביות של תא בודד יכול לעזור לטפל במגבלה זו על ידי שימור ההקשר המרחבי של תאי מיקרוגליה. מחקרים עתידיים המשלבים פרוטוקול זה עם טכניקות הדמיה, כגון אימונוהיסטוכימיה, הדמיה in vivo, כתם מערבי או טרנסקריפטומיקה מרחבית של תא בודד, יכולים להציע תובנות משלימות לגבי דינמיקה של תאי מיקרוגליה.

שיטה זו פותחת אפיקים חדשים לחקירת האופן שבו עלבונות בגיל צעיר, כגון דלקת, היפוקסיה או גורמי לחץ סביבתיים, משפיעים על פנוטיפים של תאי מיקרוגליה ותורמים לתוצאות נוירו-התפתחותיות ארוכות טווח. על ידי מתן אפשרות לאפיון מדויק ואמין של מצבי הפעלת תאי מיקרוגליה, הוא מקל על זיהוי מטרות טיפוליות לווסת תגובות מיקרוגליה בתחילת החיים, במטרה למנוע או להפחית הפרעות נוירו-התפתחותיות.

לסיכום, פרוטוקול זה מציע מסגרת חזקה ונגישה לחקר מגוון תאי מיקרוגליה במהלך התפתחות המוח המוקדמת. השילוב של זרימה ציטומטרית וריצוף RNA של תא בודד מאפשר יישום גמיש בשלבי התפתחות שונים ומודלים ניסיוניים, מה שמקל על חקירה מעמיקה יותר של ביולוגיה של מיקרוגליה בהקשרים פיזיולוגיים ופתולוגיים כאחד.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
140 ומיקרו; מסנן רשת מתכת M	סיגמא-אולדריץ'	S3895
צינור 15 מ"ל	סרשטדט	62.554.205
צינור 5 מ"ל	סרשטדט	55.526.006
צלחת באר 96 עם תחתית חרוטית	סרשטדט	82.1583.001
ארגינאז 1 - מצומד Pecy7 - שיבוט : A1exF5	תרמו פישר סיינטיפיק	25-3697-82
ריאגנטים פלואורסצנטיים יציבים על השולחן	Invitrogen	א49905
CD11b - Conjugate Fitc - שיבוט : M1/70	ב.ד. פארמינגן	553310
CD163 - מצומד SB600 - שיבוט : TNKUPJ	תרמו פישר סיינטיפיק	63-1631-82
CD206 - נגמ"ש מצומד - שיבוט : C068C2	ביולג'נד	141708
CD45 - מצומד A700 - שיבוט : 30-F11	ב.ד. פארמינגן	560510
CD64 - מצומד  PerCP-eF710 - שיבוט : X54-5 / 7.1	תרמו פישר סיינטיפיק	46-0641-82
CD80 - מצומד SB436 - שיבוט : 16-10A1	תרמו פישר סיינטיפיק	62-0801-82
CD86 - מצומד Pe - שיבוט : GL-1	ביולג'נד	105008
קולגנאז ד	סיגמא– אולדריץ'	11088866001
דנאס א	סיגמא– אולדריץ'	10104159001
סרום בקר עוברי (FBS)	סיגמא– אולדריץ'	F1051
HBSS (תמיסת המלח המאוזנת של האנק) פי 10	Wisent Bioproducts	311506CL
המוציטומטר	VWR בינלאומי	82030-470
הפס	Wisent Bioproducts	330.050.אל
iNOS - מצומד PE- eF610 - שיבוט : CXNFT	תרמו פישר סיינטיפיק	61-5920-82
KCl	תרמו פישר סיינטיפיק	BP366-500
KH2PO4	תרמו פישר סיינטיפיק	BP362-500
חי/מת Amcyan	תרמו פישר סיינטיפיק	L34957
מדיה של תרבית תאי מיקרוגליה	טכנולוגיות חיים	A12475-01
Na2HPO4	תרמו פישר סיינטיפיק	BP332-500
NaCl	תרמו פישר סיינטיפיק	BP358-212
פרפורמלדהיד	סיגמא– אולדריץ'	עמ' 6148
עכברוש נגד עכבר CD16/CD32	BD ביוסיינס	553142
ספונין	סיגמא– אולדריץ'	S7900
ספריות scRNAseq	פי 10 גנומיקה	1000121
מדיום קולואידי מבוסס סיליקה	תרמו פישר סיינטיפיק	45001747
נתרן אזיד	תרמו פישר סיינטיפיק	BP922I-500
טריפאן כחול	ג'יבקו	1525006