הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

היפוקסיה משנה את רמות ה-miRNAs המעורבים בתורשה לא מנדלית של הפרעת הספקטרום האוטיסטי בעכברים

41.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68435

⸱

11 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Gevher Nesibe Genome and Stem Cell Institute, Erciyes University, 2Betül Ziya Eren Genome and Stem Cell (GENKÖK) Center, Erciyes University, 3Department of Medical Biology, Erciyes University, 4Department of Histology and Embryology, Yozgat Bozok University, 5Department of Physiology, Erciyes University, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 7University of Nice Sophia Antipolis, 8Department of Medical Genetics, Erciyes University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשראת היפוקסיה בעכברים יילודים על ידי מסירתם בסביבות מבוקרות עם ריכוזי חמצן משתנים. מודלים של עכברים שנחשפו לשינויי חמצן בלידה שינו לאורך זמן את הביטוי של miRNAs המעורבים באינדוקציה של שינויים פנוטיפיים התנהגותיים כגון אוטיזם.

תקציר

היפוקסיה יכולה להתרחש בדרגות שונות מסיבות שונות במהלך התקופה הסביב הלידה, ולהשפיע על ההתפתחות. אנו שואפים לבחון את ההשלכות של היפוקסיה קלה עד חמורה בילודים בעכברים, תוך התמקדות בקשר הפוטנציאלי שלה לתפקוד מוחי נוירודגנרטיבי של העובר הקשור להפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD).

גרמנו להיפוקסיה בעכברים יילודים על ידי מסירתם בסביבות מבוקרות עם ריכוזי חמצן משתנים. התוצאות הראו רמות גבוהות של HIF-1α (סמן להיפוקסיה) בקליפת המוח ובהיפוקמפוס, כמו גם ניוון עצבי מוגבר באזורים אלה. יתר על כן, ראינו ביטוי שונה של miRNAs הקשורים לאוטיזם (miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p ו-miR-499a-5p) בקבוצות היפוקסיות, בהתאם לתוצאות קודמות במודלים של ASD בבני אדם ובבעלי חיים. שינויים מולקולריים אלה לוו בשינויים התנהגותיים כגון ירידה בתנועה, מהירות, אינטראקציה חברתית והתנהגויות חוזרות, כמו גם נטייה מוגברת להפגין התנהגות מחפשת פינה בעכברים הנתונים לתנאים היפוקסיים. למרות ששינויים התנהגותיים ומולקולריים היו ניתנים לזיהוי בקבוצת 12% O2 (היפוקסיה קלה), השינויים הבולטים ביותר נצפו בקבוצות ההיפוקסיה החמורות יותר, ב-10% O2 ו-8% O2.

בסך הכל, התוצאות מצביעות על כך שהיפוקסיה בילודים יכולה לגרום לשינויים מולקולריים מתמשכים הקשורים למחלות ניווניות עם השלכות התנהגותיות. יתרה מכך, גם בלידה רגילה, חשיפה להיפוקסיה במהלך ההתפתחות המוקדמת עלולה לפגוע בזיכרון ובלמידה. התוצאות מדגישות את הצורך בגילוי מוקדם והתערבות ביילודים שנחשפו להיפוקסיה כדי למנוע בעיות נוירולוגיות ארוכות טווח. רמות ה-miRNA מווסתות במהלך ההתפתחות, והשינויים שלהן ברקמות, במיוחד בתאי נבט, מהווים גורם סיכון לדור הבא. הניתוחים מספקים בסיס לחקר המסלולים הרגולטוריים המשפיעים על שינויים תפקודיים והתנהגותיים תחת היפוקסיה.

מבוא

מוגדרת כמצב של מחסור בחמצן, היפוקסיה יכולה לעורר תגובות תאיות ומולקולריות ייחודיות שהן קריטיות להבנת תפקידה בפתולוגיות שונות. זה יכול לשבש רצפים התפתחותיים, מה שמוביל לשינויים ופציעות מולקולריים, תאיים ועצביים. יתר על כן, חשיפה מוקדמת להיפוקסיה קוטעת את התפתחות מערכת העצבים המרכזית (CNS), ופוגעת בקישוריות האקסונלית ובהתפתחות הסינפסות1.

בנוסף, למרות שהוכח כי להיפוקסיה יש השפעות שליליות על התפתחות מערכת העצבים המרכזית, היא עשויה גם למלא תפקיד פיזיולוגי קריטי בתנאים ספציפיים, כגון במהלך אמבריוגנזה. היפוקסיה פיזיולוגית תקינה מתייחסת למצב בו רמות החמצן נמוכות באופן טבעי במהלך ההתפתחות העוברית בצורה מועילה. תהליך זה מאפשר לתאים עובריים לייצר אנרגיה על ידי קידום חילוף חומרים אנאירובי, תומך בהתפתחות מערכת הדם על ידי האצת כלי הדם, מבטיח התפתחות תקינה של הלב והעצמות וממריץ את נדידת תאי הפסגה העצבית2. לעומת זאת, להיפוקסיה המתרחשת מחוץ להקשר הפיזיולוגי שלה עלולות להיות השפעות שליליות על ההתפתחות והבריאות הכללית, כולל התפתחות עוברית, שעלולה להוביל לפגות או אפילו לקטלניות עוברית1. לפיכך, זוהי בעיה חמורה של בריאות הציבור, שכן יילודים רבים חווים מצבים היפוקסיים במהלך לידה רגילה, לעתים קרובות ללא הכרה מיידית על ידי מטפליםאו צוות רפואי. בנוסף, חילופי קישוריות עצבית הקשורים להיפוקסיה קשורים להפרעות נוירו-התפתחותיות, כולל הפרעות בספקטרום האוטיסטי (ASD) ומוגבלות שכלית1.

מנקודת מבט מולקולרית, היפוקסיה יכולה להשפיע על התפתחות נוירולוגית על ידי שינוי ביטוי הגנים המווסתים את התפקודים הסינפטיים, ובכך לשבש את הקישוריות העצבית ולתרום להתפתחות הפרעות נוירו-התפתחותיות4.

מבחינה קלינית, היפוקסיה של ילודים משפיעה על התפתחות מערכת העצבים המרכזית באמצעות מסלולים הורמונליים ומטבוליים1. בתגובה להיפוקסיה חריפה, ההיפותלמוס משחרר במהירות את ההורמון המשחרר קורטיקוטרופין ואת ארגינין וזופרסין, אשר לאחר מכן מפעיל שחרור הורמון אדרנוקורטיקוטרופי מיותרת המוח הקדמית, ואחריו ייצור גלוקוקורטיקואידים בקליפת יותרת הכליה של העובר ומידת תגובה זו נמצאת בקורלציה עם עוצמת ומשך ההיפוקסיה. תגובה מהירה זו של ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-יותרת הכליה (HPA) למתח חריף מדגישה את התפקיד הקריטי של גלוקוקורטיקואידים בהגבלת ההשפעות הפיזיולוגיות של מתח ושמירה על הומאוסטזיס עוברי על ידי השפעה על ביטוי גנים קשורים, סינתזת חלבונים ומטבוליזם תאי 5,6.

ירידה ברמות החמצן התקינות מפעילות תגובות שונות להיפוקסיה, שרובן מווסתות על ידי גורמי שעתוק, גורמים המעוררים היפוקסיה (HIFs) וחיישני חמצן תאיים כגון פרוליל הידרוקסילאזים (PHDs)1. HIF-1, מווסת של הומאוסטזיס O2 כפי שמוצג במחקרי מבחנה 7, הוא הטרודימר המורכב מ-HIF-1α ו-HIF-1β8. בתנאים היפוקסיים, החלפת אטום המימן בקבוצת הידרוקסיל במתחם מצטמצמת, מה שמוביל להצטברות של HIF-1α, אשר לאחר מכן מתעמעם עם HIF-1β. כתוצאה מכך, הדימר HIF-1 עובר טרנסלוקציה לגרעין, שם הוא מפעיל שעתוק של מאות גנים1.

האופי התלוי בחמצן של נוירונים הופך אותם לרגישים במיוחד ללחץ היפוקסי. לכן, להיפוקסיה יכולה להיות השפעה משמעותית על הפיזיולוגיה של המוח, עם השלכות ארוכות טווח על תפקוד העצבים, על ידי פגיעה במציאת נתיב אקסונלי והתפתחות סינפסות9. שינויים אלה בקשרים עצביים יכולים להוות נטייה להפרעות נוירו-התפתחותיות שונות כגון ASD ומוגבלות שכלית 9,10.

חנק סביב הלידה מוגדר כמחסור בחמצן במהלך הלידה ויכול להתרחש כתוצאה מאירועים סביב הלידה כגון דימום אם-עובר, דחיסת חבל הטבור, סיבוכים בשליה, קרע ברחם, דיסטוציה בכתף או כישלון של היילוד לנשום את נשימתו הראשונה. אירוע חמור זה משפיע על כארבעה מיליון יילודים ברחבי העולם מדי שנה וגורם למיליון מקרי מוות של יילודים 11,12,13. למרות שרוב התינוקות שורדים אפיזודות של היפוקסיה, חלק מהחולים מפתחים אנצפלופתיה היפוקסית-איסכמית, שעלולה להוביל לבעיות נוירולוגיות קבועות כגון הפרעות פרכוסים, שיתוק מוחין, עיכובים קוגניטיביים וליקויים מוטוריים. בנוסף, חנק ואיסכמיה עלולים לגרום לתפקוד לקוי של איברים ומערכות שונות כגון מערכת העצבים המרכזית (28%), מערכת הלב וכלי הדם (25%), הכליות (50%) והריאות (23%)11.

בנוסף, חוסר בשלות של מערכת כלי הדם במוח וויסות עצמי לקוי הם גורמים המועדים ליילודים לסיכונים איסכמיים. בתהליכים כאלה, דלקת ומתח חמצוני הם המתווכים העיקריים של פגיעה היפוקסית-איסכמית בילודים ומנגנוני מוות תאים נלווים. אפופטוזיס לא תקין יכול לחשוף את המוח המתפתח לסיכונים להפרעות מוטוריות וקוגניטיביות14.

בהתחשב במורכבות של ASD, חיוני להבין את הגנטיקה הבסיסית שנראית כבעלת מבנה פוליגני, כמו גם את הגורמים הסביבתיים הקובעים את התפתחותה. בפרט, הבסיס הפוליגני של ASD מרמז על אטיולוגיה רב-גורמית, שבה נטיות גנטיות מקיימות אינטראקציה עם גורמים חיצוניים, כולל היפוקסיה. ההתאמה של 60%-92% שנצפתה בתאומים מונוזיגוטים מדגישה את חשיבותן של השפעות גנטיות, בעוד שחוסר ההתאמה מצביע על כך שגם גורמים סביבתיים משחקים תפקיד. שכיחות האוטיזם מוערכת ב-13 ל-10,000, ומאמינים כי שיעור זה עלה בשנים האחרונות15. מחקרים תומכים בהשערה כי חשיפה לגורמים סביבתיים במהלך ההריון עלולה להגביר את הסיכון לאוטיזם, אך תוצאות מחקרים אלה לרוב אינן עקביות בשל הבדלים בקריטריונים לאבחון, קבוצות השוואה, גודל המדגם ושיטות הערכת החשיפה15,16.

למרות שהממצאים הנוירופתולוגיים הייחודיים אינם ברורים, מחקרים חושפים חריגות מוחיות מיקרוסקופיות ותפקודיות. חריגות אלה מצביעות על כך שהתקופה הרלוונטית מבחינה אטיולוגית עשויה להיות ברחם וכי פתוגנזה עשויה להתחיל במהלך התקופה שלפני הלידה15. חשיפות במהלך ההריון הן המוקד העיקרי של המחקר האפידמיולוגי על גורמי סיכון פוטנציאליים לאוטיזם. בפרט, ההשערה שסיבוכים מיילדותיים עלולים להגביר את הסיכון לאוטיזם נתמכת על ידי מחקרים רבים, אך הגודל וההשלכות של השפעות אלה משתנים בין מחקרים17.

בנוסף לגורמים גנטיים, מנגנונים אפיגנטיים ממלאים תפקיד מפתח בוויסות ביטוי גנים בתנאים היפוקסיים. יש לציין כי miRNAs מציגים מנגנון ויסות מרכזי בתגובה התאית להיפוקסיה, כגון השפעתם על HIF. במהלך השלבים המוקדמים של היפוקסיה, שינויים ספציפיים ברמות ה-miRNA יכולים לתרום להצטברות של HIF-1 ולשמירה על רמות יציבות של HIF-2 ו-HIF-318. למרות שפרופיל הביטוי של miRNAs רבים משתנה בתנאים היפוקסיים ואיסכמיים, הוכח כי מספר מוגבל של miRNAs הקשורים להיפוקסיה ממלאים תפקיד פונקציונלי ומשפיעים על ביטוי HIF . זה מסביר מדוע רקמות אנושיות שונות נבדלות בתגובות היפוקסיות עקב ביטוי miRNA ספציפי לרקמה18.

נתונים חדשים מצביעים גם על כך ש-miRNAs ספציפיים היו מעורבים בפתולוגיה של ASD. בעבודתנו הקודמת, הראינו כי miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p ו-miR-499a-5p, הידועים כמווסתים את הישרדות התאים, התמיינות ותגובות לחץ בסרטן, מציגים ביטוי חריג בחולי ASD, מה שעלול להשפיע על תוצאות נוירו-התפתחותיות. לאחר מכן אישרנו את הממצאים הללו בדגימות דם, היפותלמוס וזרע ממודלים של עכברים של ASD, והראו קשר עקבי של שינויים בוויסות הגנים עם המחלה19. תוצאות אלה מצביעות על כך שהפחתת הוויסות של miRNAs אלה בשלבים מכריעים של גדילה והתפתחות עשויה להיות בעלת השפעה משמעותית על התפתחות מחלות כגון ASD. זה מדגים עוד יותר את ההשפעה העמוקה של היפוקסיה בילודים על מאפיינים מולקולריים והתנהגותיים.

במחקר זה, בדקנו את ההשפעה של היפוקסיה קלה עד בינונית בילודים על הסיכון לפתח אוטיזם בבגרות. לשם כך, עכברים יילודים נחשפו לרמות שונות של היפוקסיה. ואכן, עכברים שחוו היפוקסיה בלידה מציגים שינויים התנהגותיים בבגרותם, וחשוב מכך, ברמה המולקולרית, שינויים הקשורים לאוטיזם. לפיכך, התוצאות שלנו סיפקו מידע רב ערך על ההשפעות ארוכות הטווח של היפוקסיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת Erciyes (HAYDEK) ובוצעו תחת רישיון מספר 21/216.

1. נבדקים בעלי חיים

הערה: מחקר זה כלל עכברי Balb/c מהיחידה הטרנסגנית של מרכז הגנום ותאי הגזע Betül-Ziya EREN (GENKÖK) באוניברסיטת Erciyes.

  1. השתמש בעכברי Balb/c בני חודשיים במשקל ממוצע של 18-25 גרם. שמרו על העכברים בטמפרטורה של 20 ±-2 מעלות צלזיוס, עם לחות של 52 ±-3% במחזור אור/חושך של 12 שעות (6-18 שעות).
  2. האכילו את העכברים בכדורי עכבר סטנדרטיים, עם החלפת מצעים שבועית, ואפשרו גישה בלתי מוגבלת למזון ומים.
    הערה: מחקרים מולקולריים בוצעו במעבדות הגנומיקה וההיפוקסיה של GENKÖK ובמעבדה להיסטולוגיה ואמבריולוגיה של אוניברסיטת בוזוק. 'נקודת עצירה' מציינת היכן אתה יכול להשהות ולשמר את העבודה שלך בטמפרטורה שצוינה.

2. הקמת מודל היפוקסיה

  1. תכנן את הניסוי כך שיכלול 4 קבוצות, כולל 3 קבוצת ביקורת היפוקסית וקבוצת ביקורת מזויפת אחת.
  2. הזדווגו עכברים נקבות בריאות עם עכברים זכרים בריאים כדי ליצור עכברים בהריון בריאים, שבסופו של דבר יסווגו לקבוצות הבאות: היפוקסיה חמורה (8% O2) (n = 4), היפוקסיה בינונית (10% O2) (n = 4), היפוקסיה קלה (12% O2) (n = 4) ונורמוקסיה (21% O2) כקבוצת ביקורת דמה (n = 4).
  3. כדי לגרום להיפוקסיה, העבירו את העכברים ההרים למעבדת ההיפוקסיה והתחילו לעקוב אחריהם 72 שעות לפני היום E21.5.
  4. גלה את נקודת הלידה של העכברים ההרים בקבוצות ההיפוקסיות והניח אותם מיד בתאי היפוקסיה. התאם את רמות החמצן עבור כל תא כמתואר עבור כל קבוצה (מוצג בשלב 2.2.).
  5. שמור את היילודים בתנאים היפוקסיים למשך 5 דקות בלבד, ולאחר מכן העביר אותם מיד לתנאי דיור רגילים.
    הערה: החזקת נבדקים בתנאים היפוקסיים לתקופות ארוכות יותר עלולה לגרום לקטלניות.
  6. השתמש ב-2 יילודים (שנבחרו באופן אקראי) מכל קבוצה כדי לאשר נזק שנגרם מהיפוקסיה ולקבוע מין. החזיקו את הגורים הנותרים ליד אימותיהם בתנאי דיור רגילים עד סוף תקופת ההנקה לבדיקות מולקולריות והתנהגותיות נוספות לשלב הבגרות (ראו תכנון ניסוי באיור משלים 1).

3. קביעת מין להערכת הבדלים פוטנציאליים בהשפעות היפוקסיות בין מינים בשלב היילוד

  1. שקלו כל עכבר (שנבחר באופן אקראי (x2/קבוצה)) בנפרד כדי לחשב את המינון הנדרש של חומרי הרדמה. יש לתת קטמין במינון 100 מ"ג/ק"ג וקסילזין במינון 10 מ"ג/ק"ג תוך צפקית.
  2. לאחר שהעכבר מורדם במלואו, המשך בהמתת חסד באמצעות פריקת צוואר הרחם ואסוף מיד רקמות זנב בצינורות סטריליים של 1.5 מ"ל (נקודת עצירה, -80 מעלות צלזיוס)
  3. אסוף והעביר מיד את כל רקמות המוח לצינורות צנטריפוגה המכילים 10% פורמלדהיד להמשך ניתוח (נקודת עצירה, 25 מעלות צלזיוס).
  4. הכן רקמות למיצוי DNA.
    1. מכינים דגימות זנב ומפשירים ב-25 מעלות צלזיוס (במידת הצורך). הוסף לדגימות 300 מיקרוליטר של מאגר ליזה המכיל 1 M Tris, 0.5 M EDTA, 4% SDS, dH2O ופרוטאינאז K.
  5. הומוגניזציה של הדגימות.
    1. מערבבים היטב דגימות על ידי מערבולת ודוגרים למשך הלילה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס.
    2. למחרת, מוסיפים 100 מיקרוליטר אמוניום אצטט ומערבבים קצרות על ידי מערבולת. צנטריפוגה ב-12,000 גרם למשך 20 דקות ב-25 מעלות צלזיוס
  6. בצע הפרדת פאזה .
    1. העבירו בזהירות את השלב המימי הצלול לצינורות סטריליים חדשים המסומנים בנפח 1.5 מ"ל.
    2. מוסיפים 500 מיקרוליטר איזופרופנול ודוגרים למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס (נקודת עצירה, -20 מעלות צלזיוס). צנטריפוגה ב-12,000 גרם למשך 10 דקות ב-25 מעלות צלזיוס
  7. שוטפים את כדור ה-DNA.
    1. לאחר בדיקת הגלולה בתחתית הצינור, השליכו בזהירות את הסופרנטנט.
    2. הוסף 1000 מיקרוליטר של 70% אתנול והקש בעדינות על הצינור כדי לצוף את הגלולה. צנטריפוגה ב-7500 גרם למשך 10 דקות ב-25 מעלות צלזיוס
  8. טהר את ה-DNA.
    1. לאחר בדיקת הגלולה בתחתית הצינור, השליכו בזהירות את הסופרנטנט.
    2. השתמש במיקרופיפטה של 10 מיקרוליטר כדי להסיר שאריות אתנול ולאפשר לו להתייבש לחלוטין.
    3. הוסף 100 מיקרוליטר של מים ללא נוקלאז (NFW) כדי להשהות מחדש את הגלולה. דגירה בטמפרטורה של +4 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
  9. כמת ואחסן את ה-DNA.
    1. למדוד את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר. אחסן דגימות DNA בטמפרטורה של +4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. (נקודת עצירה).
  10. בצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR).
    1. תכנן SRY-F, SRY-R ופריימרים עקיפים PAX6-F, PAX6-R (ראה טבלה משלימה 1).
    2. הכן תערובת PCR באופן הבא (לכל דגימה): 5 מיקרוליטר של מאגר PCR (פי 10), 4 מיקרוליטר של MgCl2, 4 מיקרוליטר של dNTPs, 0.5 מיקרוליטר של כל אחד מארבעת הפריימרים, 31 מיקרוליטר של dH2O ו-0.5 מיקרוליטר של פולימראז Taq.
      הערה: יש להוסיף Taq פולימראז אחרון וממש לפני השימוש כדי להבטיח amplify אופטימלי.
    3. הכן את צינורות ה-PCR המסומנים והנח אותם על מתלה קירור של +4 מעלות צלזיוס. מחלקים 45 מיקרוליטר מהתערובת לצינורות.
    4. הקש בעדינות על הבלוק כדי לוודא שטיפות תערובת PCR נמצאות בתחתית הצינור.
    5. הוסף 5 מיקרוליטר של דגימות DNA ופיפטה קצרה. מערבולת קצרה ואז צנטריפוגה את הצינורות.
    6. הנח את הצינורות במכונת ה-PCR והגדר את התוכנית לתנאים הבאים: בתחילה, דגירה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 40 מחזורי דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, חישול ב-57 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. לאחר המחזורים, הארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריה החזקה ב-40 מעלות צלזיוס ללא הגבלת זמן.
  11. דמיין את דגימות התוצאה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 2%.
    הערה: דגימות המראות ששתי להקות הן זכרים, ואלה עם רצועה אחת בלבד הן נקבות.

4. אישור נזקי היפוקסיה בעכברים יילודים

  1. להעריך מיקרוסקופית רקמות מוח שנאספו מעכברים שהוקרבו כדי לאשר נזק היפוקסי ולבחון אימונוהיסטוכימית לבדיקת HIF-1α.
    1. תקן ופרפין להטמיע את הרקמה.
      1. שמרו על טישו בפורמלדהיד למשך 12 שעות, ולאחר מכן שטפו במים למשך 6 שעות.
      2. תקן רקמות על ידי התייבשות בסדרת אלכוהול אתילי למשך יום אחד לכל ריכוז: 70%, 80%, 90%, ואז 3 שעות ב-100% אלכוהול אתילי. יש להניח את הממחטות בקסילן למשך 15 דקות לניקוי.
      3. העבירו רקמות לסדרות פרפין I, II ו-III למשך שעה כל אחת. לאחר השעה השלישית, כוונו את דגימות המוח כראוי והטמיעו אותן בפרפין נקי.
      4. בעזרת מיקרוטום סיבובי חותכים קטעים בעובי 5 מיקרומטר מגושי הפרפין.
    2. הכן שקופיות.
      1. לכתמי המטוקסילין ואאוזין (HE), הניחו חלקים על שקופיות זכוכית רגילות.
      2. עבור אימונוהיסטוכימיה, הנח חלקים על שקופיות זכוכית טעונות חיובית.
        הערה: (נקודת עצירה), ניתן לאחסן שקופיות בשלב זה להערכה ועבודה נוספת.
    3. בצע צביעת HE.
      1. טבלו את הדגימות בתמיסת קסילן I למשך 10 דקות.
      2. טבלו את הדגימות בתמיסת קסילן II למשך 10 דקות נוספות.
      3. העבירו את הדגימות לסדרה של ריכוזי אלכוהול יורדים, כל אחד למשך דקה אחת: 100%, 96% ו-80%.
      4. שוטפים את הדגימות במים מזוקקים למשך 2 דקות.
      5. טבלו את הדגימות בהמטוקסילין למשך 8 דקות, ולאחר מכן שטפו אותן במים מזוקקים למשך 2 דקות.
      6. לאחר הכביסה יש לטפל בדגימות באלכוהול חומצי למשך שנייה אחת, ולאחר מכן שטיפה של דקה.
      7. מניחים את הדגימות במי אמוניה למשך 10 שניות, ואז חוזרים על הכביסה של דקה.
      8. מניחים את הדגימות ב-70% אלכוהול למשך 30 שניות.
      9. טבלו את הדגימות באאוזין למשך 10 דקות.
      10. העבירו את הדגימות בהדרגה על ידי הגדלת ריכוזי האלכוהול למשך דקה אחת כל אחת: 96%, 96% ו-100%.
      11. טבלו את הדגימות בתמיסות Xylene I, Xylene II ו-Xylene III למשך דקה אחת כל אחת.
      12. מכסים בכיסוי.
    4. בדוק באמצעות מיקרוסקופ.
      1. לאחר צביעת HE, בחנו את כל רקמות המוח של כל קבוצה תחת מיקרוסקופ אור.
      2. להעריך אזורים בהיפוקמפוס ובקליפת המוח לניוון עצבי ובצקת פרי-תאית / פרי-וסקולרית.
  2. בצע צביעת HIF-1α.
    1. דגירה של דגימות על מגלשות טעונות חיובית למשך הלילה בטמפרטורה של 67 מעלות צלזיוס בחממה כדי להבטיח קיבוע נאות.
    2. העבירו קטעים דרך תמיסות קסילן I וקסילן II כדי להשלים את הדפראפיניזציה.
    3. יש להחזיר לחות לחלקים על ידי הנחתם ברצף בתמיסות אתנול של 100%, 96%, 80% ו-70% למשך 5 דקות כל אחת, ולאחר מכן שטיפה במים מזוקקים למשך 5 דקות.
    4. הסר אפיטופים על ידי חימום במיקרוגל של קטעים בחומצת לימון של 0.01 M (pH 6.0) ב-665 W למשך שני מחזורים של 5 דקות.
    5. מצננים את החלקים בטמפרטורת החדר (RT) למשך 20 דקות.
    6. תוחם את היקף החלקים בעזרת עט הידרופובי, ואז שטוף את החלקים 3 פעמים ב- PBS למשך 5 דקות כל אחד.
    7. דגרו קטעים במי חמצן 3% במתנול למשך 10 דקות כדי לחסום פעילות פרוקסידאז אנדוגנית.
    8. שטפו חלקים שוב 3 פעמים ב-PBS למשך 5 דקות בכל פעם.
    9. כדי למנוע קשירת אימונוגלובולינים לא ספציפיים, דגרו קטעים עם מגיב חוסם UV למשך 7 דקות.
    10. דגרו חלקים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם הנוגדן הראשוני נגד HIF-1α (דילול 1:200).
    11. שטפו חלקים 3 פעמים ב-PBS למשך 5 דקות בכל פעם.
    12. מרחו נוגדן משני ביוטיניל על חלקים ודגרו ב-RT למשך 40 דקות.
    13. שטפו חלקים שוב 3 פעמים ב-PBS למשך 5 דקות בכל פעם.
    14. מרחו תמיסת סטרפטווידין על החלקים ודגרו למשך 30 דקות ב-RT.
    15. שטפו את החלקים 3 פעמים ב-PBS למשך 5 דקות בכל פעם.
    16. פתח את תגובת הצביעה על ידי מריחת 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) והתבוננות תחת מיקרוסקופ אור.
    17. צבעו את החלקים בתמיסת המטוקסילין Gill II שונה כדי להכתים את הגרעינים.
    18. ייבשו חלקים על ידי העברתם דרך ריכוזים הולכים וגדלים של אתנול (70%, 80%, 96% ו-100% אתנול).
    19. נקה את החלקים על ידי דגירה בתמיסות קסילן I וקסילן II למשך 10 דקות כל אחת.
    20. הרכיבו חלקים עם מדיום הרכבה וכיסוי.
    21. בחנו קטעים רכובים תחת מיקרוסקופ אור והעריכו אזורים בהיפוקמפוס ובקליפת המוח הקדם-מצחית.
    22. מדוד את רמות התגובתיות החיסונית באמצעות תוכנת עיבוד תמונה בקוד פתוח.

5. ניסויים התנהגותיים

  1. לאחר אישור היפוקסיה, אפשר לעכברים הנותרים להשלים את תקופת ההנקה עם אמהותיהם.
  2. בצעו קביעת מין ביום 21 לאחר הלידה על סמך מרחק אנוגניטלי, ולאחר מכן שיכנו את בעלי החיים בכלובים שונים על סמך מינם. כאשר העכברים בקבוצות הביקורת ההיפוקסיות והדמה מגיעים לגיל חודשיים, ערכו עליהם ניסויים התנהגותיים.
  3. לפני ביצוע בדיקות התנהגותיות, התאקלמו את הנבדקים בסביבת הבדיקה למשך 15-30 דקות לפני הבדיקה.
  4. הקפד לחטא את כל המכשירים/מכשירים בין נבדקים לניסויים באמצעות אתנול 70%.
  5. בצע בדיקת זיהוי אובייקטים חדשה (NOR).
    1. הגדר את המצלמה במיקום שבו ניתן לראות ולנטר את נושאי הצילום בבירור.
    2. התקן תוכנת מעקב וידאו מתאימה.
    3. הכינו את זירת הבדיקה (קופסה בגודל 60 ס"מ × 60 × ס"מ × 40 ס"מ) עם שני חפצים שאינם גדולים מהעכבר. ודאו ששני החפצים דומים בגודל ובצורה ונגישים בקלות (במרחק של 10 ס"מ ×-10 ס"מ מהקירות ובמקביל).
    4. יום 1: שלב ההיכרות:
      1. מקם את העכבר בזירה עם שני האובייקטים הזהים. אפשר לעכבר לחקור בחופשיות את האובייקטים למשך פרק זמן מוגדר (למשל, 10 דקות).
      2. במהלך הפעלה זו, התבונן ורשום את משך הזמן שהעכבר בילה עם כל אובייקט. כמו כן, רשום את מספר הפעמים שהעכבר הסתובב או קיים אינטראקציה עם כל אובייקט
    5. יום 2: הצגת אובייקט חדש:
      1. החלף את אחד האובייקטים המוכרים מהיום הראשון באובייקט חדש (שונה במראה, במרקם או בצורה).
      2. החזירו את העכבר לזירה, ואפשרו לו לחקור שוב בחופשיות למשך אותו פרק זמן כמו במפגש הראשון.
    6. רשום את הזמן הכולל שהעכבר בילה עם האובייקט המוכר (מהיום הראשון) והאובייקט החדש. רשום את מספר הפעמים שהעכבר הסתובב או קיים אינטראקציה עם כל אובייקט.
    7. חשב את מדד ההבחנה (DI) כדי להעריך את הזיכרון והלמידה של העכבר באמצעות הנוסחה:
      מדד הבחנה (DI) = {(זמן שהושקע עם אובייקט חדש − זמן שהושקע עם אובייקט מוכר)/(סה"כ הזמן שהושקע עם שני האובייקטים)} × 100.
      הערה: DI גבוה יותר מצביע על עניין רב יותר באובייקט החדש, מה שמרמז על זיכרון ויכולות למידה טובות יותר. DI קרוב ל-0 מצביע על היעדר העדפה, מה שמרמז על עניין שווה או זיכרון גרוע לאובייקט המוכר.
    8. השתמש ב-DI כדי להעריך באופן אובייקטיבי את יכולות הלמידה והזיכרון של העכבר, בהתבסס על הסקרנות הטבעית שלו ויכולתו לזהות ולהבדיל בין אובייקטים מוכרים לחדשים.
  6. בצע בדיקת מתלי זנב (TST)
    1. התקן את המצלמה במצב שבו העכברים נראים בבירור וניתן לנטר אותם. התקן תוכנת מעקב וידאו מתאימה.
    2. הכן את מערך הניסוי עם מקום להכיל 3 עכברים בו זמנית.
    3. השתמש בלוחות קרטון בגובה 25 ס"מ במרווחים של 20 ס"מ כדי לבודד את העכברים כך שלא יוכלו לראות זה את זה במהלך הבדיקה.
    4. חותכים רצועות סרט באורך 12 ס"מ ומחברים אותן בזהירות לזנב של כל עכבר, ומוודאים שהזנב מחובר היטב מבלי לגרום נזק. מקם את הסרט בקצה הזנב (2 ס"מ) כך שניתן יהיה לתלות את העכבר מבלי לפצוע את עצמו.
    5. הקלט את העכברים למשך 6 דקות בזמן שהם תלויים.
    6. בתום משך הזמן יש להפסיק את ההקלטה, להסיר את העכבר ולהחזיר אותו לכלוב הדיור. נתח את הסרטונים כדי לקבוע את משך התנועה הפעילה ואת משך חוסר התנועה.
      הערה: זה יספק תובנה לגבי תגובת הלחץ, מכיוון שחוסר תנועה מעיד לעתים קרובות על מצב של חוסר אונים או מתח נלמד. מידת חוסר התנועה משמשת בדרך כלל למדידת ייאוש התנהגותי או תגובת לחץ בעכברים, שעשויים להיות קשורים להשפעות של לחץ או מצבי דיכאון.
    7. בהתבסס על דפוסי התנועה וחוסר התנועה שנצפו, העריכו את המצב הרגשי ומנגנוני ההתמודדות עם הלחץ של עכברים בתגובה להשעיה הכפויה.
  7. בצע בדיקת קבורת שיש
    1. ממלאים כלוב ריק (20 ס"מ × 35 ס"מ × 15 ס"מ) בקלחי תירס בגובה 5 ס"מ. מסדרים 20 גולות ב -5 שורות עם 4 גולות כל אחת. ודא שהגולות מפוזרות באופן שווה על פני השטח.
    2. הנח את הנושא בפינת הכלוב, והבטיח גישה חופשית לכל הכלוב.
    3. תן לעכבר 20 דקות לחקור את הכלוב. במהלך תקופה זו, העכבר עשוי להפגין התנהגות קבורה מסוימת, בניסיון לכסות את הגולות בקלחי תירס. לאחר 20 דקות, הוציאו את העכבר מהכלוב.
    4. ספרו את המספר הכולל של גולות שהעכבר קבר מתחת לקלח התירס במהלך תקופה של 20 דקות. רשום את המספר הכולל של גולות שנקברו, מכיוון שזהו מדד ההתנהגות המרכזי.
      הערה: מספר הגולות הקבורות משמש בדרך כלל כאינדיקטור לחרדה, התנהגות כפייתית או ניאופוביה אצל מכרסמים. מספר גבוה יותר של גולות קבורות קשור לעתים קרובות לרמות גבוהות יותר של חרדה או נטיות כפייתיות.
    5. בהתבסס על המספר הכולל של גולות קבורות, העריכו התנהגויות הקשורות לחרדה ונטיות כפייתיות בעכברים, שניתן להשתמש בהן כדי להעריך את ההשפעות של טיפולים או תנאי ניסוי.
  8. בצע בדיקת אינטראקציה חברתית.
    1. התקן את המצלמה במצב שבו העכברים נראים בבירור וניתן לנטר אותם.
    2. חבר את המצלמה למחשב והגדר תוכנת מעקב וידאו מתאימה. הקימו קופסה מלבנית (60 ס"מ × 40 ס"מ × 25 ס"מ) עם שני קירות (40 ס"מ × 25 ס"מ) עם שתי דלתות (8 ס"מ) כדי להפריד בין שלושת החדרים.
    3. הניחו כלוב (15 ס"מ × 10 ס"מ) המכיל עכבר המוכר לנבדק הניסוי וכלוב נוסף (15 ס"מ × 10 ס"מ) המכיל עכבר שלא היה לו אינטראקציה קודמת עם נבדק הניסוי.
    4. התחל להקליט והנח את הנושא בתא האמצעי.
      הערה: עכברים המשמשים בבדיקה זו מלבד חיות הניסוי חייבים להיות מאותו מין ובריאים.
    5. עקוב אחר הנושא במשך 5 דקות והקלט אותו עם מצלמת הווידאו. בתום משך הזמן יש להפסיק את ההקלטה, להסיר את העכבר ולהחזיר אותו לכלוב הדיור.
    6. באמצעות תוכנת SIT, נתחו את זמן האינטראקציה החברתית ואת נטיות החידוש החברתי של העכברים והשוו אותם לקבוצת הביקורת המזויפת.
      הערה: יותר זמן המוקדש להתנהגויות חברתיות (למשל, טיפוח או רחרוח) ופחות זמן המוקדש להימנעות או הפגנת תוקפנות יכולים להתפרש כהפגנת חברותיות גבוהה. הימנעות מאינטראקציה, בילוי זמן רב יותר בבידוד או הפגנת תוקפנות מוגברת יכולים להצביע על חרדה, נסיגה חברתית או יכולת מופחתת לקיים אינטראקציה חברתית.
  9. בצע בדיקת שדה פתוח.
    1. מקם את המצלמה במקום בו ניתן לראות את העכברים בבירור ולפקח עליהם . חבר את המצלמה למחשב והגדר תוכנת מעקב וידאו מתאימה.
    2. הקימו את זירת הבדיקה (קופסה בגודל 60 ס"מ × 60 ס"מ × 40 ס"מ) וחלקו את הקופסה בקווים דמיוניים ליצירת 16 ריבועים.
    3. התחל להקליט והנח בזהירות את העכבר במרכז הזירה. התבונן ורשום את התנהגות העכבר למשך 5 דקות.
    4. בתום משך הזמן יש להפסיק את ההקלטה, להסיר את העכבר ולהחזיר אותו לכלוב הדיור.
    5. באמצעות תוכנת המעקב, מדוד את ההתנהגויות החיצוניות והפנימיות של הליכה, טיפוס, בריחה, טיפוח, חוסר תנועה, מעברים מוחלטים, עשיית צרכים ומתן שתן כדי להעריך את רמות החרדה, התנועה, הפעילות החקרנית והרגשית של הנבדקים.
  10. בצע את מבחן מבוך המים של מוריס (MWM).
    1. הכינו את מבוך המים בקוטר 120 ס"מ ובעומק 60 ס"מ במצב יציב במעבדה התנהגותית בטמפרטורה של 23 ± 1 מעלות צלזיוס.
    2. חלקו את המבוך לארבעה רבעים דמיוניים ותלו רמזים חזותיים שונים (בצורה ובצבע) במרכז כל רבע של קירות המבוך במרחק של כ-20 ס"מ מהבסיס. מקם פלטפורמה באורך 17 ס"מ ובקוטר 10 ס"מ במרחק 20 ס"מ מהקיר.
      הערה: המבוך, הרמזים והפלטפורמה לא צריכים לשנות מיקום או מיקום כדי שעכברים יוכלו לאמן במדויק את הזיכרון שלהם.
    3. מלאו את המבוך במים של 21-26 מעלות צלזיוס עד 1 ס"מ מתחת לפלטפורמה וצבעו אותו בצבע אקרילי שחור רב משטחים.
      הערה: במקרה של שימוש בזנים אחרים של עכברים, יש לצבוע את המים בצבע ניגודיות של העכברים כדי שיוכלו לפקח עליהם.
    4. הנח את המצלמה במיקום שמצלם את התמונה המלאה וחבר אותה לתוכנת MWM במחשב.
      הערה: יש להקצות את מקום הפלטפורמה בתוכנית ליום הניסיון של היום החמישי.
    5. המבחן נמשך 5 ימים עם ארבעה ניסיונות כל אחד. בארבעת הימים הראשונים, התחל להקליט ולהתחיל את הניסוי על ידי הצבת הנבדק בזהירות ברבע אחר בכל יום, כאשר פניו מופנות לכיוון קיר המיכל.
    6. הקצה את מיקום הפלטפורמה בלוח הזמנים של היום החמישי.
      הערה: פעולה זו מונעת מהנבדקים ליצור זיכרון אסוציאטיבי. מיקום זהיר של הנבדקים במים ושמירה על הטמפרטורה הנכונה חיוניים כדי למנוע הוספת לחץ חיצוני. גירסאות הניסיון נמשכות 5 דקות ומסתיימות באופן אוטומטי כאשר (i) הפלטפורמה מגיעה (ii) פג תוקף מגבלת הזמן של 5 דקות. במהלך הימים, הנבדקים צריכים ללמוד את מיקום הפלטפורמה ולמצוא אותה בפחות זמן.
    7. ביום החמישי, הסר את הפלטפורמה והניח בזהירות את העכברים בריבוע של המבוך כפי שתואר קודם לכן.
      הערה: תקופת הניסיון מסתיימת אוטומטית כאשר (i) העכבר מוצא את הפלטפורמה ועולה עליה, (ii) פג תוקף מגבלת הזמן של 5 דקות. נבדקים בריאים צריכים למצוא את המיקום של הפלטפורמה הקודמת. התוכנה תחשב אוטומטית את הזמן שלקח לעכבר למצוא את הפלטפורמה בכל ניסוי ותעזור להעריך את יכולות הזיכרון והלמידה לטווח הקצר והארוך של הנבדקים.

6. אישור נזקי היפוקסיה לעכברים בוגרים

  1. לאחר השלמת הבדיקות ההתנהגותיות, הקריבו את הנבדקים על ידי פריקת צוואר הרחם.
  2. אסוף דגימות רקמה ודם בהיפוקמפוס מ-6 עכברים מכל קבוצה, כולל קבוצת הביקורת הדמה, לניתוח מולקולרי (סעיף 7).
  3. מקמו את מוחותיהם של 4 העכברים הנותרים בתמיסת פורמלדהיד של 10% כדי לבחון את ההשפעות של חשיפה להיפוקסיה בתקופת היילוד על המורפולוגיה של המוח הבוגר.
  4. השתמש באותה טכניקה שהוסברה קודם לכן בסעיף 4 כדי לבצע ניתוח היסטולוגי של מוחות עכברים בוגרים.

7. בידוד RNA כולל מדגימות פאזה בוגרות

  1. הוסף 500 מיקרוליטר טריזול לכל דגימת רקמה ו-500 מיקרוליטר דם.
  2. עבור רקמת מוח, הומוגניזציה של הדגימות באמצעות מזרק.
  3. דוגרים את התערובת ב-RT למשך 5 דקות.
  4. הוסף 200 מיקרוליטר כלורופורם לכל צינור ודגירה למשך 5 דקות נוספות ב-RT.
  5. צנטריפוגה ב-12,000 גרם למשך 20 דקות ב-+4 מעלות צלזיוס.
  6. העבירו בזהירות את השלב המימי (RNA) לצינור סטרילי חדש.
  7. מוסיפים איזופרופנול (יחס של 1:1 לשלב הימי) ודוגרים את התערובת למשך הלילה. (נקודת עצירה/ -20 מעלות צלזיוס).
  8. למחרת, צנטריפוגה ב 12,000 גרם למשך 10 דקות ב +4 מעלות צלזיוס.
  9. השליכו בזהירות את הסופרנטנט והוסיפו 1000 מיקרוליטר של 75% אתנול לגלולה.
  10. צנטריפוגה ב-7,500 × גרם למשך 5 דקות ב-+4 מעלות צלזיוס.
  11. חזור על שלב שטיפת האתנול פעמיים.
    הערה: אם הכדור קטן מדי, מספיק שטיפה אחת.
  12. השליכו את הסופרנטנט והניחו לגלולה להתייבש באוויר ב-RT.
  13. לאחר ייבוש מלא, השעו מחדש את הגלולה עם 50 מיקרוליטר NFW ודגרו על קרח בטמפרטורה של +4 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
  14. למדוד את ריכוז ה-RNA באופן ספקטרופוטומטרי.
  15. אחסן דגימות RNA בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף.

8. סינתזת DNA משלימה (cDNA)

  1. עובדים על מתלה קירור +4 מעלות צלזיוס, מכינים את דגימות ה-RNA המבודדות מדם ורקמות מוח.
  2. הכן את צינורות ה-PCR המסומנים בתווית.
  3. מערבבים את ריאגנטים של ערכת הסינתזה cDNA לפי הוראות היצרן.
  4. הכינו בסך הכל 14 מיקרוליטר מתערובת התגובה לכל דגימה והפיצו אותה לצינורות.
  5. הוסף 6 מיקרוליטר של דגימת RNA לתערובת.
  6. בצע סינתזת cDNA במכשיר ה-PCR בהתאם לתנאי הטמפרטורה והזמן שצוינו על ידי היצרן.
    הערה: ניתן לאחסן את ה-cDNA המסונתז בשלב זה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
  7. לדלל את ה-cDNA המסונתז ביחס של 1:5.
  8. אחסן את ה-cDNA המדולל ב-80 מעלות צלזיוס לניתוח qPCR עתידי.

9. PCR כמותי בזמן אמת עבור ביטוי miRNA (miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p, miR-499a-5p ו-U6 RNA גרעיני קטן כבקרת נורמליזציה)

  1. תכנן את הפריימרים עבור כל miRNA (ראה טבלה משלימה 2 לרצפים).
  2. מכינים את תערובת תגובת ה-PCR לפי הוראות היצרן.
  3. הוצא 14 מיקרוליטר מתערובת התגובה לכל באר של צלחת PCR של 96 בארות.
  4. הוסף 6 מיקרוליטר של ה-cDNA המדולל 1:5 לכל באר לנפח תגובה כולל של 20 מיקרוליטר.
  5. בצע PCR בשכפול עבור כל דגימה כדי למזער את השונות על ידי ביצוע תוכנית זו: דנטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 120 שניות, 45 מחזורי דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, חישול והגברה ב-56 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, וניתוח עקומת התכה ב-60 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, ולאחר מכן ב-95 מעלות צלזיוס.
  6. נתח את התוצאות באמצעות ערכי Ct (סף מחזור) ונרמל את הנתונים בשיטת 2-ΔΔCt .

10. ניתוח סטטיסטי

  1. . להעריך את הנורמליות של הנתונים באמצעות היסטוגרמות, תרשימי Q-Q ומבחן שפירו-וילק לניתוח נתוני ביטוי miRNA.
    1. אם הנתונים מופצים בדרך כלל, השתמש ב-ANOVA חד-כיווני.
    2. אם הנתונים אינם מופצים בדרך כלל, החל את מבחן Kruskal-Walli, מבחן ה-t של התלמיד או מבחן Mann-Whitney U.
  2. בעת הערכת הבדלים מגדריים בתוך כל קבוצה, השתמש במבחן t של התלמיד או במבחן Mann-Whitney U, בהתאם להתפלגות הנתונים. מובהקות סטטיסטית נקבעת על ידי ערך p של <0.05.
    הערה: יש לבצע את כל הניתוחים באמצעות תוכנה סטטיסטית מתאימה. כאן משתמשים ב-GraphPad Prism 8.
  3. להעריך את הנורמליות של הנתונים באמצעות היסטוגרמות, תרשימי Q-Q ומבחן שפירו-וילק לניתוח תוצאות ניסויים התנהגותיים.
    1. אם הנתונים מופצים בדרך כלל, השתמש ב-ANOVA דו-כיווני.
    2. עבור נתונים שאינם מופצים בדרך כלל, בצע את מבחן Kruskal-Walli, מבחן Student's t או מבחן Mann-Whitney U.
    3. העריכו את ההבדלים המגדריים בתוך כל קבוצה באמצעות מבחן ה-t של התלמיד או מבחן Mann-Whitney U, בהתאם להתפלגות הנתונים. שוב, קחו בחשבון את התוצאות מובהקות סטטיסטית אם ערך ה-p הוא <-0.05.
  4. לאנליזות אימונוהיסטוכימיות, השתמש ב-ANOVA דו-כיווני ואחריו במבחן הפוסט-הוק של טוקי כדי להשוות בין קבוצות נקבות וגברים.
  5. כדי להשוות בין קבוצות נשים וגברים בכל מצב של היפוקסיה, השתמש במבחן הפוסט-הוק של סידק. מובהקות סטטיסטית נקבעת אם ערך ה-p הוא <-0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

במחקר זה, עכברי Balb/c בהריון נחשפו לתנאים היפוקסיים של 8% O2 (חמור), 10% O2 (בינוני) ו-12% O2 (קל) במהלך הלידה, והעכברים שזה עתה נולדו הוחזקו בתנאים היפוקסיים אלה במשך 5 דקות כדי לבסס מודלים של היפוקסיה קלה, בינונית וחמורה של יילודים. הקבוצה שהוגדרה כקבוצת ביקורת מזויפת הייתה נתונה לתנאי לידה נורמוקסיים (21% O2) ואז הורשתה לחיות בתנאי טיפול סטנדרטיים. זה עוזר לבודד את ההשפעה האמיתית של רמות חמצן שונות על עכברים, ומבטיח את תקפות תוצאות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

היפוקסיה סביב הלידה, בעיה בריאותית מרכזית בילודים, עלולה לגרום לשינויים מולקולריים, תאיים ועצביים על ידי שיבוש תהליכים התפתחותיים קריטיים וקשורה להפרעות נוירו-התפתחותיות שונות, כולל הפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD)1. בעוד שהיפוקסיה חמורה נחקרה רבות על השפעותיה המיידיות, ההשלכות ארוכות הטווח של היפוקסיה קלה עד בינונית במהלך התקופה סביב הלידה נותרו פחות מובנות. המחקר שלנו נועד למלא את הפער הזה על ידי בחינת התוצאות הנוירו-התנהגותיות והמולקולריות של היפוקסיה בילודים, וחש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

מחקר זה מומן על ידי מועצת המחקר המדעי והטכנולוגי של טורקיה (TÜBİTAK), והמחברים מודים ל-Celalettin Göktaş (מתקן לבעלי חיים טרנסגניים) ולביולוגית Selda Taşdemir (מעבדה התנהגותית).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(-20 & דרגות; ג) מקפיאסימנס KD86NAWE0N
(+4 ° ג) בלוקביוסיינס אנטגןhttps://antagen.net/product/384-well-pcr-plate-rack-cat-rkp384/
(+4 ° ג) מקררסימנס KD86NAWE0N
(-20 & דרגות; ג) בלוקקליבר סיינטיפיקhttps://www.cleaverscientific.com/electrophoresis-products/coolcube-storage-rack/
אתנול מוחלטמרק1070172511
אצטט אמוניוםסיגמא238074-500G
איזון אנליטי  אדם ציודLAB214i
כלורופורםמרק1024451000
חומצה ציטרית מרק100241
מחשבHPhttps://www.hp.com/us-en/shop/pdp/hp-all-in-one-24-cr1000t-238-9p2v3av-1
EDTAסיגמאE9884-1KG
Entellan מרק107961
אאוסיןמרק109844
אפנדורף (1.5 מ"ל)?solab078.03.021
מערכת אתווויז'ןנולדוסhttps://noldus.com/ethovision-xt
אטובNUVEEN 400/500 N/A
צינורות פלקון (15 מ"ל)מעבדת הבידוד078.02.001
פורמלדהידמרק104002
מצלמת חוםסמסונגSC2000
המטוקסיליןמרק105175
HIF-1 ו-alpha; נוגדןביולוגיהbs-20398R 
היפוקסיה צ'יימברס ביוספריקסחדר A
איזופרופונלימרק1096342511
לייט סייקלר 480 IIרוש5015278001
כלוב מבחן קבורת השישוישנו https://guide.labanimal.com/product/standard-housing-stainless-steel
צינורות מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל)גריינר616201
קצות מיקרופיפטות (100 ומיקרו; L)גריינר774353
קצות מיקרופיפטות (1000 ומיקרו; L)גריינר778353
מיקרופיפטות (10 ומיקרו; L)גילסוןFD10001
מיקרופיפטות (100 ומיקרו; L)גילסוןFD10004
מיקרופיפטות (1000 ומיקרו; L)גילסוןFD10003
טיפים למיקרופיפטות (10 ומיקרו; L)גריינר772353
מיקרופיפטות (2 ומיקרו; L)גילסוןGFAM00064
מיקרוסקופיהאולימפוסBx53
ערכת miRCURY LNA RT (ערכת סינתזת cDNA)קיאגן339340
מירקורי LNA Sybr Green PCRקיאגן339346
לוחות מולטיוולרוש4729692001
ספקטרופוטומטר ננושימאדזוC101-E112
זירת מבחן זיהוי אובייקטים נובלביוטכנולוגיה גלובלית137
אולם מבחני השדה הפתוחביוטכנולוגיה גלובלית117
Oxycycler ביוספריקסA42OC
Paraffin Leica 39602012
טאבלט PBSסיגמאP4417-50TAB
מכשיר PCRסנסוקווסטT3-0140
ספין לוחפקלאב91-PSPIN-P
פריזמהGraphPadhttps://www.graphpad.com/
פרוטאנאז KסיגמאP6556-10MG
QIAzol Lysis Reagent Isolation Reagentקיאגן79306
SDSסיגמא8170342500
נוגדן Seconder & nbsp;אבקאםA0545-1ML
שלושת החדרים במבחן האינטראקציה החברתיתביוטכנולוגיה גלובלית118
סיבובגילסוןPMC880
מזרק (2 מ"ל)בייביhttps://beybi.com.tr/urunler/medikal-urunler/medikal-sarf-malzemeleri/parcali-enjektorler
הגדרת מבחן מתלי הזנבבעצמך, אפשר למצוא דברים דומים ב-Harvard Apparatusב-SelfMade אפשר למצוא דומה ב-(https://www.harvardapparatus.com/tail-suspension-test.html)
תרמומיקסראפנדורף#5355
בסיס טריזמהסיגמא1503-1 ק"ג
מערבולתהיידולף541-10000-00-1
Xylenes Isolab 9,90,01,92,501

מקורות

  1. Bonkowsky, J. L., Son, J. -H. Hypoxia and connectivity in the developing vertebrate nervous system. Dis Model Mech. 11 (12), dmm037127(2018).
  2. Dunwoodie, S. L. The role of hypoxia in development of the mammalian embryo. Dev Cell. 17 (6), 755-773 (2009).
  3. Beck, S., et al. The worldwide incidence of preterm birth: a systematic review of maternal mortality and morbidity. Bull World Health Organ. 88 (1), 31-38 (2010).
  4. Milash, B., et al. Temporal dysynchrony in brain connectivity gene expression following hypoxia. BMC Genomics. 17 (1), 334(2016).
  5. Adachi, K., Umezaki, H., Kaushal, K. M., Ducsay, C. A. Long-term hypoxia alters ovine fetal endocrine and physiological responses to hypotension. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 287 (1), R209-R217 (2004).
  6. Imamura, T., Umezaki, H., Kaushal, K. M., Ducsay, C. A. Long-term hypoxia alters endocrine and physiologic responses to umbilical cord occlusion in the ovine fetus. J Soc Gynecol Investig. 11 (3), 131-140 (2004).
  7. Fajersztajn, L., Veras, M. M. Hypoxia: from placental development to fetal programming. Birth Defects Res. 109 (17), 1377-1385 (2017).
  8. Ruas, J. L., Poellinger, L. Hypoxia-dependent activation of HIF into a transcriptional regulator. Semin Cell Dev Biol. 16 (4-5), 514-522 (2005).
  9. Mukandala, G., Tynan, R., Lanigan, S., O'Connor, J. J. The effects of hypoxia and inflammation on synaptic signaling in the CNS. Brain Sci. 6 (1), 6(2016).
  10. Lee, S., et al. Gene networks associated with non-syndromic intellectual disability. J Neurogenet. 32 (1), 6-14 (2018).
  11. Fattuoni, C., Palmas, F., Noto, A., Fanos, V., Barberini, L. Perinatal asphyxia: a review from a metabolomics perspective. Molecules. 20 (4), 7000-7016 (2015).
  12. Locci, E., et al. Exploring perinatal asphyxia by metabolomics. Metabolites. 10 (4), 141(2020).
  13. De Haan, M., et al. Brain and cognitive-behavioural development after asphyxia at term birth. Dev Sci. 9 (4), 350-358 (2006).
  14. Armstrong-Wells, J., Bernard, T. J., Boada, R., Manco-Johnson, M. Neurocognitive outcomes following neonatal encephalopathy. NeuroRehabilitation. 26 (1), 27-33 (2010).
  15. Gardener, H., Spiegelman, D., Buka, S. L. Prenatal risk factors for autism: comprehensive meta-analysis. Br J Psychiatry. 195 (1), 7-14 (2009).
  16. Hicks, S. D., Middleton, F. A. A comparative review of microRNA expression patterns in autism spectrum disorder. Front Psychiatry. 7, 176(2016).
  17. Cassidy, F. C., Charalambous, M. Genomic imprinting, growth and maternal-fetal interactions. J Exp Biol. 221 (Suppl_1), jeb164517(2018).
  18. Serocki, M., et al. miRNAs regulate the HIF switch during hypoxia: a novel therapeutic target. Angiogenesis. 21 (2), 183-202 (2018).
  19. Ozkul, Y., et al. A heritable profile of six miRNAs in autistic patients and mouse models. Sci Rep. 10 (1), 9011(2020).
  20. Siniscalco, D., et al. Autism spectrum disorders: is mesenchymal stem cell personalized therapy the future. J Biomed Biotechnol. 2012, 480289(2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

היפוקסיה ניאונטליתהפרה של ויסות MicroRNAבדיקות התנהגותיותמבוך המים של מוריסזיהוי חפץ חדשמבחן קבורת גולותמבחן אינטראקציה חברתיתסממנים של ניוון עצביהתערבות מוקדמת
היפוקסיה משנה את רמות ה-miRNAs המעורבים בתורשה לא מנדלית של הפרעת הספקטרום האוטיסטי בעכברים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.