הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניהול לאחר השתלת כבד ואיסוף דגימות בסנאי קרקע דאוריאן לריצוף RNA חד-תאי

581 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68443

⸱

16 בספטמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hepatic Surgery and Liver Transplantation Center of the Third Affiliated Hospital, Organ Transplantation Institute, Sun Yat-sen University; Organ Transplantation Research Center of Guangdong Province, Guangdong Province Engineering Laboratory for Transplantation Medicine, 2Guangdong Key Laboratory of Liver Disease Research, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 3Collage of Life Science, Shenyang Normal University, 4Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology; Key Laboratory of Organ Transplantation, Ministry of Education, Chinese Academy of Medical Sciences, NHC Key Laboratory of Organ Transplantation, 5The School of Life Science, Peking University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר נהלים לאחסון קר מורחב בכבד והשתלה אורתוטופית בסנאי הקרקע Daurian (DGS; Spermophilus dauricus), תרדמת חורף עונתית טיפוסית. הוא כולל שיטות לקצירת שתלי כבד ודגימות דם להערכות פרוגנוסטיות ועיבודן למחקרים מבוססי תא בודד.

תקציר

התאוששות תפקודית של השתל ותאימות חיסונית למארח השתל מייצגים חששות פרוגנוסטיים עיקריים לאחר השתלת כבד. באופן קריטי, מודלים קונבנציונליים של מכרסמים המשתמשים בחולדות או בעכברים מציעים תובנה מוגבלת לגבי המנגנונים של פציעות השתל הנגרמות על ידי היפותרמיה במהלך השימור. פער זה מדגיש את הצורך במודלים חלופיים. מכיוון שהשתלות כבד מסנאי הקרקע דאוריאן המסתגל לקור (DGS; Spermophilus dauricus) יכול לשמור על שימור קור ממושך ולכן לתמוך בשרידות גבוהה ב-DGS לאחר ההשתלה, כתוצאה מכך, פרוטוקול זה מפרט את הטיפול החיוני בבעלי חיים לאחר הניתוח והניטור הפיזיולוגי הנדרש לנבדקים מושתלים. יתר על כן, הוא מספק נהלים סטנדרטיים להכנת דגימות השתלת כבד באיכות גבוהה לטכניקות אנליטיות במורד הזרם, כולל ריצוף RNA של תא בודד (scRNA-seq) לפרופיל טרנסקריפטומי ובדיקה היסטופתולוגית. יצירה מוצלחת של דגימות שתל DGS מוכנות היטב היא הצעד הראשוני המכריע ביישום מתודולוגיות מסורתיות ומתקדמות כאחד כדי לחקור את המודל הלא שגרתי אך הרלוונטי ביותר הזה. פרוטוקול זה מתייחס למידע המולטי-אומי עבור DGS, ובכך מקל על מחקר עתידי על התערבויות כירורגיות ומודלים של מחלות לא רק במכרסמים בתרדמת חורף אלא גם באורגניזמים מיוחדים אחרים.

מבוא

בשני העשורים האחרונים, יותר ויותר חוקרים הכירו בכך שיכולות ההסתגלות המעולות של מינים בתרדמת חורף מציעות הזדמנויות שלא יסולא בפז לחשוף מנגנונים חדשים בהסתגלות ביולוגית, ויכולות לעורר פריצות דרך בתחומים רפואיים שונים כגון שימור איברים ושיקום מטבולי 1,2,3,4,5,6,7,8 . הפרוטוקול הכירורגי המקיף הראשון לשימור קור ממושך בכבד והשתלה אורתוטופית בתרדמת חורף, סנאי הקרקע Daurian (DGS; Spermophilus dauricus), הוקם לאחרונה. ככל הנראה, האופי האדפטיבי לקור של ה-DGS מאפשר אחסון קר ממושך של השתלים התורמים והישרדות גבוהה לאחר ההשתלה של בעלי החיים המקבלים. לפיכך, יש צורך בפרוטוקול מעקב כדי לעקוב אחר התאוששות בעלי החיים לאחר הניתוח ולהכין דגימות למחקרים היסטופתולוגיים ואומיקס שונים.

בהתחשב בהבדלים הפיזיולוגיים המשמעותיים בין ה-DGS למודלים הסטנדרטיים של מכרסמים, והשינויים הפיזיולוגיים המורכבים והדינמיים לאחר השתלת כבד בבעלי החיים המקבלים, השגת דגימות באיכות גבוהה מהם היא חיונית לניתוחים בהמשך הזרם ומכאן להבנת הפיזיולוגיה של השתל-מארח לאחר ההשתלה. מלבד רכישה, עיבוד ובדיקה של דגימות דם ורקמות כבד בשיטות קונבנציונליות, דיסוציאציה מוצלחת של תאי הפרנכימלים בכבד שהם הפטוציטים, והתאים הלא-פרנכימליים (NPCs) הכוללים תאי אנדותל, תאי כוכב, תאי קופפר ותאי חיסון אחרים יאפשרו להבהיר את האינטראקציות התאיות והמולקולריות המורכבות לאחר הניתוח עם המולטי-אומיקס המבוסס על תא בודד המתפתח במהירות. לשם כך, השיטה הקלאסית המבוססת על זלוף קולגנאז פותחה מאז תחילת שנות ה-50 ושוכללה ללא הרף 9,10,11. עם זאת, המבנה האנטומי המובהק של כבד DGS, הידבקויות לאחר הניתוח הנגרמות על ידי שחזור כלי דם, והשינויים הפיזיולוגיים המופעלים על ידי ניתוח בשתלי הכבד דורשים כולם כוונון עדין של תנאי העקירה.

פרוטוקול זה מספק הנחיות מפורטות לניהול לאחר הניתוח ואיסוף דגימות ב-DGS לאחר השתלת כבד. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מאפשר בידוד של הפטוציטים משתלי כבד בעלי תפוקה גבוהה וכדאיות תאים, ומפרט את העיבוד הבא של הפטוציטים מבודדים לריצוף RNA של תא בודד (scRNA-seq).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית של אוניברסיטת פקין לטיפול ושימוש בבעלי חיים (LSC-WangSQ-2). ה-DGS ששימשו במחקר זה יוצרו במעבדה על ידי נשים הרות שנלכדו בערבות העיר ג'אנגג'יאקו. החיות היו בנות שנה עד שנתיים בזמן הניסוי. DGS, זכרים ונקבות, במשקל של בין 180 גרם ל-400 גרם, שימשו כתורמים ומקבלים. משקל המקבל היה מעט גדול מזה של התורם, עם הפרש של פחות מ-50 גרם. הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. טיפול לאחר ההשתלה

  1. אכלס את ה-DGS לאחר השתלת כבד בסביבה חמה ונקייה תחת מחזור אור/חושך של 12:12, עם צ'או מעבדה סטנדרטי ומים המסופקים אד ליביטום.
  2. עקוב אחר משקל הגוף מדי יום, העריך את החתך בבטן לאיתור דימום והתבונן במצבו הנפשי וברמות הפעילות של המקבל.
  3. מיד לאחר הניתוח, יש לתת זריקה תת עורית של צפורוקסים (16 מ"ג/ק"ג) ובופרנורפין (0.05 מ"ג/ק"ג) כל 12 שעות למשך 3 ימים.
  4. יש להזריק תוך שרירית טקרולימוס (1 מ"ג/ק"ג) מדי יום עד 24 שעות לפני קצירת הרקמות.
    הערה: מכיוון שה-DGS נגזרים בעיקר מדגים שנתפסו בטבע, הגורמים האימונולוגיים להשתלה נותרים לא זניחים. השתלה בין DGS נחשבת להשתלה אלוגנית (לא השתלה סינגנית). אם המחקר צריך לשלול גורמים אימונולוגיים, כגון דחייה, ודא כי טקרולימוס מתוקנן בתקופה שלאחר הניתוח.

2. הכנת דגימת השתלת כבד

  1. הכנת פתרונות ומכשירים
    1. הכן 50 מ"ל של HBSS עם 500 מיקרומטר EGTA (ללא Ca2+- ו- Mg2+; pH 7.4). יש לחמם מראש באמבט מים בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
    2. יש להמיס קולגנאז IV (0.4 מ"ג/מ"ל) ב-50 מ"ל של HBSS (עם Ca2+ ו-Mg2+) ולדגור באמבט מים בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    3. תמיסת פרקול: מערבבים פרקול עם 10× PBS ביחס של 9:1 (v/v), ומדללים עם 1× PBS ביחס של 9:1 (v/v) לצינור של 15 מ"ל. שמור את התמיסה על קרח.
      הערה: 5 מ"ל 90% תמיסת פרקול מספיקה לכל DGS.
    4. טבלו מכשירים כירורגיים ב-70% אתנול למשך 30 דקות לפני השימוש.
    5. הרכיבו את מערכת הזלוף הכוללת משאבה פריסטלטית עם מהירות מתכווננת, צינורות סילסטיים ואמבט מים. שטפו את הצינור במי מלח חמים כדי לטהר בועות אוויר, והצמידו מסנן סטרילי של 0.22 מיקרומטר לשקע הצינור.
      הערה: לפני טיהור בועות אוויר, יש צורך לשטוף את הצינור בשימוש חוזר על ידי הפעלת 70% אתנול ביסודיות למשך 15 דקות, ולאחר מכן שטיפה מלאה עם ddH2O למשך 15 דקות כדי לחסל שאריות אתנול.
  2. נוהל בעלי חיים
    1. להרדים את ה-DGS לאחר ההשתלה באמצעות הזרקה תוך-צפקית של 2.5% טריברומו-אתנול במינון של 1 מ"ל/100 גרם משקל גוף. בצע בדיקות לאובדן רפלקסים, כגון תגובה לצביטה בבוהן, כדי להבטיח הרדמה מלאה.
    2. לגלח את פרוות הבטן ולרסן את ה-DGS על לוח הניתוח כשהצד הגחוני פונה כלפי מעלה.
    3. רססו 70% אתנול על אזור הבטן של החיה ולאחר מכן פתחו את חלל הבטן על ידי ביצוע חתך צולב גדול של העור והצפק בעזרת מספריים חדים ומלקחיים משוננים.
    4. הזיזו בעדינות את המעיים ימינה מחוץ לחלל הבטן בעזרת צמר גפן עד ששתל הכבד, וריד השער (PV) והווריד הנבוב התחתון (IVC) נחשפים בבירור (איור 1A).
      הערה: עקב הידבקויות לאחר הניתוח בחלל הבטן לאחר השתלת כבד, נתח בעדינות את ההידבקויות באמצעות צמר גפן לח.
    5. הכניסו מזרק של 5 מ"ל לתוך ה-IVC מתחת לסטומה האנטומוטית כדי לאסוף 1-2 מ"ל דם, ומיד הפעילו לחץ קל על מקום הניקוב עם צמר גפן יבש כדי להשיג המוסטזיס לאחר הוצאת המחט מכלי הדם (איור 1B).
      הערה: כדי למזער דימום, ניתן להחליף את המחט באחת ממזרק של 1 מ"ל, שהם כ-30 גרם.
    6. עם כיוון השיפוע כלפי מעלה, נקב בעדינות את ה-PV באמצעות קטטר 22-G בזווית של 15° ביחס למשטח הכלי, ולאחר מכן החזר את המחט של הצנתר. לאחר אישור הניקוב המוצלח, קדם בעדינות את הצינורית 1-1.5 ס"מ נוספים דרך הכלי. אבטח את מיקום הצינורית באמצעות כלי דם clamp (איור 1C).
      הערה: אם הצינורית ממוקמת כהלכה, זרימה חוזרת של דם תיראה לעין. אם קנולציה PV נכשלת או נתקלת באתגרים טכניים, עבור לקנולציה של ה-IVC התת-הפטי והגדר את ה-PV כנתיב היציאה של הפרפוזה.
    7. הפעל את משאבת הזלוף במי מלח חמים בטמפרטורה של 6-8 מ"ל לדקה, ולאחר מכן חבר את המסנן של 0.22 מיקרומטר שהוזכר לעיל לצינורית.
    8. לאחר תחילת הזלוף באמצעות PV, בצע חתך ב- IVC כדי לאפשר ניקוז דם. 50-80 מ"ל של תמיסת מלח נדרשים לזלוף הולם (איור 1D).
      הערה: זלוף מוצלח מאושר כאשר הכבד המושתל עובר לצבע צהוב-לבן חיוור במהלך תהליך זה. כמה אזורים אדומים כהים של גודש עשויים להישאר על פני הכבד ולא ניתן לנקות אותם לחלוטין, ככל הנראה כתוצאה מטראומה בכבד תוך ניתוחית כגון פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה.
    9. לאחר זלוף מספיק עם 50-80 מ"ל מי מלח חמים, השהה את המשאבה.
    10. קשרו את האונה הצדדית השמאלית בבסיסה באמצעות תפר משי 2-0, ואחריו כריתה של האונה הדיסטלית לאתר הקשירה. באופן דומה, האונה החציונית נקשרת בבסיסה ונכרתת באותה שיטה (איור 1E,F).
      הערה: כריתת כבד חלקית מבוצעת כדי למקסם את ניצול הכבד המושתל למטרות ניסוי מרובות ולהפחית את צריכת בופר הקולגנאז תוך הקלה על עיכול יסודי של הכבד.
    11. חלקו את רקמת הכבד שנכרתה למספר חלקים: חלק אחד משמש לבידוד NPC ואחריו scRNA-seq, החלקים האחרים מקובעים ב-4% פרפורמלדהיד לחתך היסטולוגי, או מוקפאים בחנקן נוזלי לניסויים אחרים.
      הערה: שלב 2.2.11 יכול להתבצע על ידי אדם אחר במקביל לשלבים הבאים לחיסכון בזמן.
    12. בידוד NPCs. חותכים את הרקמות לכ-1-2 מ"מ3 חתיכות במדיום RPMI-1640, ומתעכלים אנזימטית עם עדין MACS בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). כדאיות התאים וריכוז התאים נקבעו באמצעות מונה תאים אוטומטי.
      הערה: שלב 2.2.12 ושלבים 2.2.13-2.3.5 ממשיכים במקביל.
    13. חותכים את הסרעפת ומהדקים את ה-IVC העל-הפטי (איור 1G).
    14. העבר את צינור הכניסה למאגר ה-EGTA שחומם מראש. הפעל מחדש את המשאבה בקצב של 6-8 מ"ל לדקה.
    15. מהדק מעת לעת את ה- IVC למשך 5-10 שניות כדי להקל על פיזור אחיד של תמיסת זלוף בכל הפרנכימה של הכבד. הכבד מתנפח באופן ניכר במהלך ההידוק ונרגע עם השחרור.
      הערה: זה קריטי להימנע מהפרעה ממושכת לניקוז, שכן חסימה ממושכת עלולה לקרוע את רקמת החיבור הדקה המקיפה את הכבד, לשבש את הזלוף או דינמיקת הנוזלים במיטת נימי הכבד. יתר על כן, חסימה מתמשכת עלולה לפגוע בכדאיות התאים ולהפחית את התפוקה עקב רגישות הפטוציטים לכוחות מכניים.
    16. לאחר זלוף עם 40-50 מ"ל של תמיסת EGTA, התחל את זלוף מאגר הקולגנאז בקצב של 4-6 מ"ל לדקה למשך 8-10 דקות. מהדקים בקצרה את כלי הדם הקולחין כמו בשלבים לעיל (איור 1H).
      הערה: לאחר 5-6 דקות של זלוף קולגנאז, הכבד הופך רך יותר באופן ניכר, ומופיעים סדקים על פני השטח. אם שינויים מורפולוגיים אלה נעדרים, הפחיתו את מהירות הזלוף ל-3-4 מ"ל/דקה והאריכו את זמן העיכול הכולל ל-12-13 דקות. עם השלמת זלוף קולגנאז של 50 מ"ל, הכבד מפגין עקביות פריכה, דמוית טופו, המהווה אינדיקטור לעיכול מספיק (איור 1I).
    17. עצור את המשאבה והסר את הצינורית. חותכים את הכבד מהגוף, מניחים אותו בכלי בגודל 5 ס"מ עם 10 מ"ל DMEM/F12 בינוני קר כקרח.
  3. טיהור הפטוציטים
    1. קרעו את הכבד כדי לשחרר תאים והעבירו את תמיסת התאים לחרוט של 50 מ"ל עם מסנן של 70 מיקרומטר המונח מעל.
    2. לאחר צנטריפוגה של תרחיף התא ב-50 x גרם למשך 3 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה עם 20 מ"ל 1× PBS. חזור על שלב זה 3 פעמים. השעו מחדש את גלולת התא עם מדיום DMEM/F12 של 5 מ"ל לאחר הצנטריפוגה האחרונה.
    3. מערבבים בעדינות את תרחיף התאים בנפח שווה של 90% תמיסת פרקול בצינור של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: לאחר צנטריפוגה של פרקול, התערובת נפרדת לשלוש שכבות נפרדות: השכבה העליונה (כ-0.5-1 מ"ל) מכילה תאים מתים, בעוד שהפטוציטים ברי קיימא מרוכזים בשכבה התחתונה (כ-0.5-0.8 מ"ל) (איור 2). תשואה של 5-8 ×-107 הפטוציטים ברי קיימא עם כדאיות של >80% מתקבלת בדרך כלל עם פרוטוקול זה. (איור 3A,B).
    4. שאפו את התאים המתים והסופרנטנט בזהירות, הימנעו מהפרעה נמרצת של השכבות, והשעו מחדש את התאים הקיימים עם מדיום DMEM/F12 של 10 מ"ל. צנטריפוגה ב-50 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    5. יש להשליך את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את הפטוציטים המטוהרים עם 1-5 מ"ל 1× PBS בתוספת סרום בקר עוברי 2% לריכוז סופי של 500-1200 תאים/מיקרוליטר.
    6. מערבבים את הפטוציטים וה-NPCs ביחס של 1:1 של כמות, כלומר, תרחיף התא הוכן על ידי ערבוב של 10,000 הפטוציטים ו-10,000 NPCs.
  4. ScRNA-seq
    הערה: שלבים 2.4.1-2.4.3 בוצעו על פי המדריך למשתמש של ערכת ההכנה לספריית ביטוי גנים של תא יחיד 3′ מבוססת טיפות12. נעשה שימוש בפלטפורמת המחיצה והברקוד של תא יחיד מיקרופלואידית מבוססת טיפות, הכוללת שלבים קריטיים של יצירת חרוזי ג'ל באמולסיות (GEM), בניית ספריית cDNA וריצוף Illumina בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים.
    1. כדי לבצע יצירת GEM וקידוד, השתמש בתרחיף תאים המכיל 20,000 הפטוציטים ו-NPC. יעילות לכידת התאים היא לא פחות מ -60%.
    2. ל-cDNA amplification, נקה את הדגימות שלאחר GEM-RT לפי המדריך למשתמש12.
    3. בניית ספרייה
    4. רצף ספריות RNA חד-תאיות באמצעות פלטפורמת ריצוף כדי להשיג עומק של 150 ג'יגה-בייט לדגימה; דמולטיפלקס קבצי קריאת בסיס גולמיים לקבצי FASTQ באמצעות Cell Ranger (v8.0.0).
    5. יישר קבצי FASTQ לגנום Ictidomys tridecemlineatus (הצטרפות NCBI: GCF_016881025.1) לכימות ביטוי, והשלמת זרימת העבודה הניסיונית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בדיקה היסטולוגית של שתלים שאוחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות והושתלו ב-DGS חשפה ארכיטקטורת אונות כבד תקינות עם סימנים מינימליים של דלקת, נמק או כולסטזיס בימים 3 ו-6 שלאחר הניתוח, בדומה לקבוצה שנותחה בדמה (איור 4A-C).

בידוד הפטוציטים ראשוניים מה-DGS לאחר הניתוח אורך כשעה אחת. באמצעות הפרוטוקול המתואר ניתן להשיג יותר מ-5 ×-107 הפטוציטים, עם כדאיות תאים של כ-80% (איור 3A,B

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בהתאם לפרוטוקול המתאר שימור והשתלת הצטננות בכבד תורם ב-DGS, הנהלים המתוארים כאן מפרטים את הניטור שלאחר הניתוח והניהול התרופתי המותאם של DGS שהושתלו בכבד המאוחסן בקור במשך 24 שעות לפחות. פרוטוקול זה מאפשר הישרדות של המושתל מעבר ל-7 ימים לאחר ההשתלה, ומציג יתרונות ברורים של תרדמת החורף כמודלים מחקריים לשימור איברים13,14 והשתלה על פני המודלים הסטנדרטיים של מכרסמים.

כאן, הליך זילוף הקולגנאז הדו-שלבי שונה כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי הפרויקט הלאומי למדע וטכנולוגיה (2023ZD0507600), מענקי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82170671, 92254301, 32230048, 82371794, 32301306), התוכנית הלאומית למו"פ (2024YFA0916804), וקרן הכישרונות של קרן החינוך של אוניברסיטת ג'ג'יאנג.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 ופעמים; PBSסרוויסביוG4202
10 פעמים; PBSסרוויסביוG4207
4% פרפורמלדהידביושארפBL539א
בופרנורפיןשאפיH12020276
צינורית (22 גרם)בבראוןברקוד 4254090ב
צפורוקסיםסלקE4838
צלחת תרבית תאים (60 מ"מ)קן705001
קולגנאז IVסיגמא-אולדריץ'C5138
צינור חרוטי (15 מ"ל)קן601052
צינור חרוטי (50 מ"ל)קן602052
צמר גפןחנות לציוד ביתי
ספירת תאים אוטומטית של Countstarרויוהרוזן ריגל S2
DMEM/F12ג'יביקוC11330500BT
א.ג.ט.א.סיגמא-אולדריץ'E4378
FBSג'יבקו10099-141
מסנן (0.22 μ m)מרק מיליפורSLGP033RB
מסנן (70 μ m)ביולוג'יקס15-1070
ג'נטלמאקמילטני130-093-235
HBSS (עם Ca2+ ו-Mg2+)סרוויסביוG4204
HBSS (ללא Ca2+ ו-Mg2+)סרוויסביוG4203
ערכת דיסוציאציה של NPCsמילטני130-096-730
פרקולציטיבה17-0891-09
משאבה פריסטלטיתיויאןBT100
RPMI-1640ג'יביקוC11875500BT
מלוחיםSRBSRB009
ברצףאילומינה NovaSeq X פלוס
צינורות סילסטייםטיגוןE-3603
תפר משיאתיקוןSA845G
מזרק (1 מ"ל)מדע הליגהLG05-124יהיה צורך רק במחט של מזרק
מזרק (2 מ"ל)מדע הליגהLG05-124יהיה צורך רק בחבית מזרק
טקרולימוססלקS5003
העברת פיפטביולוג'יקס30-0138א1
אלכוהול טריברומואתילסיגמא-אולדריץ'T48402
אמבט מיםגרנטSAP2

מקורות

  1. Ou, J., et al. IPSCs from a hibernator provide a platform for studying cold adaptation and its potential medical applications. Cell. 173 (4), 851-863 (2018).
  2. Zhang, X., et al. 5-aminolevulinate improves metabolic recovery and cell survival of the liver following cold preservation. Theranostics. 12 (6), 2908-2927 (2022).
  3. Zhang, X., et al. Cold-induced Foxo1 nuclear transport aids cold survival and tissue storage. Nat Commun. 15 (1), 2859(2024).
  4. Zhang, L., et al. Cross-species metabolomic profiling reveals phosphocholine-mediated liver protection from cold and ischemia/reperfusion. Am J Transplant. 24 (11), 1979-1993 (2024).
  5. Chen, L., et al. Synergy of 5-aminolevulinate supplement and cx3cr1 suppression promotes liver regeneration via elevated igf-1 signaling. Cell Rep. 42 (8), 112984(2023).
  6. Arnold, C. Hibernation science harnessed to treat obesity and modify metabolism. Nat Med. 30 (10), 2700-2703 (2024).
  7. Bao, Z., et al. Fatty acid metabolization and insulin regulation prevent liver injury from lipid accumulation in Himalayan marmots. Cell Rep. 42 (7), 112718(2023).
  8. Carey, H. V., Andrews, M. T., Martin, S. L. Mammalian hibernation: Cellular and molecular responses to depressed metabolism and low temperature. Physiol Rev. 83 (4), 1153-1181 (2003).
  9. Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-c14. J Exp Med. 94 (5), 431-453 (1951).
  10. Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic Cells. J Vis Exp. (64), e3917(2012).
  11. Breuer, E., Humar, B. Isolation of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice. J Vis Exp. (190), e64493(2022).
  12. User guides. , X Genomics. https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1725314293/support-documents/CG000731_ChromiumGEM-X_SingleCell3v4_UserGuide_RevB.pdf (2024).
  13. Hadj-Moussa, H., Storey, K. B. Bringing nature back: Using hibernation to reboot organ preservation. FEBS J. 286 (6), 1094-1100 (2019).
  14. Ratigan, E. D., McKay, D. B. Exploring principles of hibernation for organ preservation. Transplant Rev (Orlando). 30 (1), 13-19 (2016).
  15. Merriman, D. K., Lahvis, G., Jooss, M., Gesicki, J. A., Schill, K. Current practices in a captive breeding colony of 13-lined ground squirrels (Ictidomys tridecemlineatus). Lab Anim (NY). 41 (11), 315-325 (2012).
  16. Vaughan, D. K., Gruber, A. R., Michalski, M. L., Seidling, J., Schlink, S. Capture, care, and captive breeding of 13-lined ground squirrels, Spermophilus tridecemlineatus. Lab Anim (NY). 35 (4), 33-40 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.