הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אבחון מהיר של זיהום ב-Mycobacterium tuberculosis ועמידות לתרופות על סמך PCR פלואורסצנטי בזמן אמת

771 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68445

⸱

15 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Fifth Division Hospital of Xinjiang Production and Construction Corps, 2Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, מוצג פרוטוקול לאיתור Mycobacterium tuberculosis ועמידותו לתרופות באמצעות טכנולוגיית PCR כמותית פלואורסצנטית בזמן אמת (qPCR).

תקציר

שחפת היא בעיה בריאותית מרכזית הפוגעת באופן לא פרופורציונלי באוכלוסיות פגיעות. הופעתה והתפשטותה של שחפת עמידה לתרופות מהווים איום רציני על בריאות הציבור העולמית. לשיטות אבחון מסורתיות ל-Mycobacterium tuberculosis (MTB), כגון מיקרוסקופיה ותרבית, יש מגבלות משמעותיות ולעתים קרובות גורמות לעיכוב בטיפול הקליני. כדי להתמודד עם אתגר זה, פותחה תוכנית אבחון יעילה המבוססת על PCR פלואורסצנטי בזמן אמת. ניתן להפיק חומצות גרעין MTB איכותיות מדגימות בדיקה, ולזהות את מצב העמידות באתרי עמידות מרכזיים. בהשוואה לשיטות מסורתיות, גישה זו מפחיתה משמעותית את זמן הגילוי לשעות ספורות בלבד, ומאפשרת קביעת מצב זיהום ועמידות זמן קצר לאחר הביקור הראשוני של המטופל. רגישות הזיהוי עולה על 85%, והספציפיות מגיעה ל-95%. טכנולוגיה לא פולשנית זו לא רק ממזערת את אי הנוחות של המטופלים אלא גם תומכת באבחון מדויק במוסדות רפואיים עממיים בשל עלותה הנמוכה ויעילותה הגבוהה. בסך הכל, הגישה מייצגת שיפור משמעותי באבחון שחפת.

מבוא

שחפת (TB), מחלה זיהומית כרונית הנגרמת על ידי Mycobacterium tuberculosis (MTB), היא בין עשרת גורמי המוות העולמיים המובילים1. שחפת עמידה לתרופות (DR-TB) מהווה אתגר משמעותי למאמצי השליטה בשחפת. תוכנית הפעולה לבניית קהילות נקיות משחפת (2022-2027), שפורסמה על ידי המרכז הסיני לבקרת מחלות ומניעתן (China CDC), מדגישה את הצורך בבדיקה מוקדמת של עמידות לתרופות בכל חולי השחפת הריאתית המאומתים בקטריולוגית2. הוא תומך באימוץ טכנולוגיות אבחון מולקולאריות חדשות כדי לשפר את יכולות הזיהוי של DR-TB, לקצר את לוחות הזמנים לאבחון, למקסם את הזיהוי של מקרי DR-TB, להבטיח טיפול וניהול סטנדרטיים וליישם אמצעי בקרת זיהום נחוצים3. יתר על כן, ההודעה על חיזוק מניעה ופיקוח על DR-TB (מס' 4, 2023) מחייבת קידום כלל ארצי של טכניקות אבחון מתקדמות. הוא קורא לבדיקת עמידות בזמן לכל חולי השחפת המאומתים בקטריולוגית כדי להשיג סקר אוניברסלי, לשפר את הסטנדרטיזציה האבחנתית ולשפר את הנגישות לשירותי בריאות4.

DR-TB מתייחס למקרי שחפת העמידים לתרופה אחת לפחות נגד שחפת. הסיווגים הנוכחיים כוללים שחפת עמידה לריפמפיצין (RR), חד-עמידה, עמידה לרב-תרופות, עמידה לתרופות מרובות (MDR), עמידה לתרופות טרום-נרחבת (pre-XDR) ושחפת עמידה לתרופות (XDR). מטא-אנליזה גלובלית של אפידמיולוגיה של DR-TB מגלה שיעורי עמידות מדאיגים: MDR-TB ב-11.6%, עמידות לאיזוניאזיד ב-15.7%, עמידות לריפמפיצין ב-9.4% והתנגדות מונו-שחפת ב-11.8%. נתונים אלה מדגישים את כוח המשיכה והמורכבות של DR-TB5.

ריפמפיצין ואיזוניאזיד הן תרופות יסוד לטיפול בשחפת. עם זאת, ארגון הבריאות העולמי (WHO) מציין כי בעוד שקיימות טכנולוגיות אבחון מהירות לעמידות לריפמפיצין, חסרים כלים מקבילים לעמידות לאיזוניאזיד. פער זה מעכב אבחון בזמן של שחפת עמידה לתרופות מרובות (MDR-TB). ההגדרה הזמנית של "שחפת עמידה לריפמפיצין" משקפת מגבלה אבחנתית זו, ומדגישה את היכולת הבלתי מספקת לזהות במהירות עמידות לתרופות אחרות 6,7. ארגון הבריאות העולמי מעריך כי מקרי שחפת עמידים לאיזוניאזיד שכיחים פי שניים ממקרים עמידים לריפמפיצין. הסתמכות בלעדית על סיכוני סינון עמידות לריפמפיצין מתעלמת משחפת עמידה לאיזוניאזיד (Hr-TB)8. חולי HR-TB שלא זוהו שטופלו במשטר סטנדרטי עומדים בפני סיכון מוגבר לכישלון הטיפול, הישנות והתקדמות ל-MDR-TB9. עמידות לאתמבוטול מדאיגה גם היא. כתרופה קריטית לטיפול בשחפת וב-MDR-TB, סקר הבסיס של DR-TB בסין משנת 2017 דיווח על שיעורי עמידות לאתמבוטול של 4.9% במקרים חדשים ו-17.2% במקרים של טיפול חוזר10.

נכון לעכשיו, לאיתור עמידות לתרופות של שחפת שיורית, תרבית מלאכותית היא עדיין השיטה המועדפת במעבדות מסוימות, אך טכנולוגיית PCR פלואורסצנטית בזמן אמת עדיפה על שיטות קונבנציונליות לזיהוי עמידות לתרופות של שחפת: זיהוי וכימות: PCR פלואורסצנטי בזמן אמת מספק ניתוח כמותי מדויק באמצעות ניטור בזמן אמת של אותות פלואורסצנטיים, בעוד ששיטות קונבנציונליות חסרות דיוק זה. שיטות ניסוי מסורתיות גוזלות זמן ועבודה רבה, דורשות כוח אדם מיומן והן סובייקטיביות מאוד. להיפך, PCR בזמן אמת לוכד בדיקות ואותות פלואורסצנטיים על ידי מחשב, וממזער טעויות אנוש. שיטות ניתוח נתונים קונבנציונליות הן סובייקטיביות יותר, בעוד ש-PCR בזמן אמת משיג ניתוח מדויק ואובייקטיבי באמצעות עקומות הגברה, עקומות סטנדרטיות ושיטות ניתוח אחרות. התקדמות זו הופכת את ה-PCR הפלואורסצנטי בזמן אמת לשיטה המועדפת לזיהוי עמידות לתרופות של שחפת11.

לסיכום, שחפת עמידה לתרופות (DR-TB) התגלתה כמשבר עולמי. עמידות לתרופות מפתח - איזוניאזיד, ריפמפיצין ואתאמבוטול - מסבכת עוד יותר את מאמצי השליטה בשחפת. זיהוי בזמן ומדויק של עמידות לתרופות הוא חיוני להנחיית משטרי טיפול מותאמים אישית, לשיפור ההצלחה הטיפולית ולהפחתת איום השחפת.

כדי להתמודד עם אתגר האבחון, מחקר זה השתמש בערכה שיכולה לזהות Mycobacterium tuberculosis ולזהות מוטציות עמידות לתרופות תוך 3.5 שעות באמצעות דגימות כיח. זה הושג עם תמיכה של qPCR פלואורסצנטי בזמן אמת. השיטה פשוטה, חסכונית ומדויקת, מה שהופך אותה לכלי רב ערך במאבק נגד DR-TB.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים החמישי של חיל הייצור והבנייה של שינג'יאנג; מספר האתיקה הוא LLWYH2025001, ואין קונפליקט אתי. הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. איסוף דוגמאות

  1. השתמש בבקבוקי כיחה עם פקק הברגה בסטנדרטים בינלאומיים המומלצים על ידי ארגון הבריאות העולמי (WHO), או בקופסאות פלסטיק אטומות וקופסאות נייר שעווה, כדי לאסוף דגימות ליחה.
  2. סמן את מיכלי הליחה עם שם המטופל, מספר (מספר רצף אשפוז החוץ לחולים חדשים או מספר הרישום לחולי מעקב), פריטי בדיקה ומספרי רצף מיכלים 1, 2, 3 (1 = ליחה מיידית באותו יום, 2 = ליחה לילה, 3 = ליחה בבוקר למחרת). עבור חולים ללא ליחה, אסוף דגימות באמצעות איסוף ליחה המושרה על ידי אירוסול.
    הערה: על הצוות להעריך את איכות דגימות הליחה שנאספו. בדרך כלל יש לשמור על נפח הדגימה על 3-5 מ"ל. דגימות מוסמכות כוללות ליחה יבשה, ליחה חומה מוכתמת בדם, ליחה המכילה כמות קטנה של דם טרי או ליחה רירית. דגימות לא מוסמכות, כגון רוק, יש להגיש מחדש לבדיקה לאחר הנחיות נוספות.

2. עיבוד מקדים של כיח

  1. הוסף פי 1-2 מהנפח של תמיסת NaOH של 4% למיכל הליחה על סמך נפח הליחה שנאסף. לנער ולערבב את התכולה למשך 2 דקות.
  2. הניחו את המיכל בארון בטיחות ביולוגית בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, ונערו אותו מספר פעמים במהלך תקופה זו כדי להבטיח נזילות מלאה של הליחה.
    הערה: טפל ב-NaOH בזהירות בשל אופיו הקורוזיבי. אם הליחה אינה נוזלית לחלוטין, הגדל את זמן הטלטול. שלב זה חשוב במיוחד במהלך הניסוי.

3. הכנת ריאגנטים (אזור טרום PCR)

  1. הכנת ריאגנטים: הכן ריאגנטים באזור המיועד לפני PCR. הפשירו ריאגנטים קפואים לטמפרטורת החדר. מערבולת למשך 5-10 שניות. צנטריפוגה בטמפרטורה של 3000 × גרם למשך 5-10 שניות בטמפרטורת החדר.
    הערה: מגיב זה הוא מערכת כפולה (A/B) ויש להכין אותו בנפרד.
  2. הכנת תערובת מאסטר PCR
    1. מערבבים A: בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, שלבו (n + 3) × 19.6 מיקרוליטר של RIF PCR Mix A ו- (n + 3) × 0.4 מיקרוליטר של אנזים שחפת. מערבולת למשך 5-10 שניות. צנטריפוגה בטמפרטורה של 3000 × גרם למשך 5-10 שניות בטמפרטורת החדר (PCR Mix A: 60 מיקרוליטר).
    2. מערבבים B: בצינור מיקרו-צנטריפוגה נוסף של 1.5 מ"ל, שלב (n + 3) × 19.6 מיקרוליטר של RIF PCR Mix B ו- (n + 3) × 0.4 מיקרוליטר של אנזים שחפת. מערבולת וצנטריפוגה כאמור לעיל (PCR Mix B: 60 μL).
  3. אחסון ושימוש: אחסן את תערובות המאסטר המוכנות בטמפרטורה של ≤-18 מעלות צלזיוס. אם לא משתמשים בו מיד, יש להשתמש תוך 4 שעות.
    הערה: אותו פרוטוקול חל על ריאגנטים EMB ו-INH.
  4. ציטוט תערובת מאסטר PCR: הוצא 20 מיקרוליטר של PCR Mix A וערבב B לצינורות תגובה נפרדים בעלי דופן דקה. העבירו צינורות בשקיות אטומות לאזור החילוץ.

4. מיצוי חומצות גרעין וטעינת דגימות (אזור מיצוי)

  1. צנטריפוגה 1.2 מ"ל של ליחה נוזלית מלאה ב-15,058 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט ושמרו את הגלולה. אופציונלי: צנטריפוגה את כל הדגימה המעוכלת אם הציוד מאפשר זאת.
  2. השעו מחדש את הגלולה במי מלח של 1.2 מ"ל, מערבולת וצנטריפוגה בטמפרטורה של 15,058 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב כביסה זה שלוש פעמים.
  3. הוסף מאגר מיצוי של 250 מיקרוליטר TB לגלולה. מערבולת ולבצע ליזה תרמית ב-99 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מצננים לטמפרטורת החדר. צנטריפוגה ב-15,058 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ואוספים את הסופרנטנט (דגימה שחולצה).
    הערה: עבור דגימות צמיגות, הגדל את עוצמת הקול של מאגר הנזילות או הארך את זמן המערבולת. אם הדגימות מיועדות אך ורק למיצוי DNA, האריכו את זמן ההנזלה כדי להבטיח עיכול מלא.
  4. בעזרת מיקרופיפטה, הוסף 5 מיקרוליטר של דגימה שחולצה או בקרות שליליות/חיוביות לכל צינור תגובה דק דופן PCR. יש לאטום מיד את השפופרות ולתייג בהתאם.
  5. מערבולת העמיסה צינורות PCR למשך 5-10 שניות וצנטריפוגה לזמן קצר (5-10 שניות). העבר צינורות לאזור הגברת ה-PCR.

5. הגברת PCR (אזור הגברה)

הערה: תוכניות לזיהוי עמידות לריפמפיצין, אתאמבוטול ואיזוניאזיד נקבעו על מחזורי תרמי של הונגשי (טבלה 1, טבלה 2 וטבלה 3). תנאי רכיבה כלולים.

  1. הנח את צינורות התגובה הדקים של PCR הטעונים לתוך המחזורי התרמי לצורך הגברה.
  2. גש לממשק המחזור. לחץ על אשף הניסוי ובחר את סוג הניסוי כעקומת התכה סטנדרטית (כפי שמוצג באיור 1).
  3. לחץ על עורך הצלחות, בחר אופקית שתי בארות ריקות סמוכות, והקצה את תבנית התרופה המתאימה מהפאנל הימני כדי להגדיר דגימה אחת (כפי שמוצג באיור 2).
  4. קביעת תצורה של פקדים שליליים/חיוביים ומידע לדוגמה. לחץ על התחל כדי להפעיל את התוכנית. משך ההקרנה הוא שעתיים ו-22 דקות.
  5. בסיום, העבירו את צינורות התגובה דקי הדופן של PCR (אטומים) לשקית אטומה. אבטח את הסגירה וטפל כפסולת מסוכנת ביולוגית.
  6. לחץ על נתח במחזור התרמי כדי לעבד את הנתונים.
    הערה: מגבלות הזיהוי של שיטה זו הן כדלקמן: קבוצה מרוכבת: 10 חיידקים/מ"ל; ריפמפיצין: 20,000 חיידקים/מ"ל; איזוניאזיד: 10,000 חיידקים/מ"ל; אתאמבוטול: 10,000 חיידקים למ"ל. (נתוני גבול הזיהוי (LoD) נגזרים מהניתוח הסטטיסטי של 765 מקרים קליניים המסופקים במדריך הוראות הריאגנטים.)

6. פרשנות תוצאות

  1. קבע מוטציות על ידי השוואת הבדלי טמפרטורת ההיתוך (Tm) בין דגימות בדיקה לבקרות חיוביות.
    הערה: סוג בר (רגיש לתרופות): ערכי Tm של הדגימה תואמים את הבקרה החיובית בכל ארבעת הערוצים (סטייה ≤1 מעלות צלזיוס). מוטנטי (עמיד לתרופות): ערך Tm בכל ערוץ נמוך ב-≥2 מעלות צלזיוס מהבקרה החיובית (ΔTm ≥2 מעלות צלזיוס).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מחקר זה השתמש בניתוח PCR פלואורסצנטי בזמן אמת ועקומת התכה כדי לבדוק דגימות ליחה מ-17 חולי שחפת. בנוסף, 30 מטופלים עברו בדיקות עמידות לריפמפיצין , ו-20 נבדקו לעמידות לאיזוניאזיד ואתאמבוטול. שיטת ה-PCR הקרינה בזמן אמת הדגימה שיעור זיהוי חיובי של 88.2% עבור קומפלקס Mycobacterium tuberculosis .

שיעורי העמידות היו 13.3% לריפמפיצין ו-15.0% לאיזוניאזיד, מה שמצביע על עמידות פוטנציאלית לתרופות בחלק מהח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הופעתם של זנים עמידים לתרופות Mycobacterium tuberculosis (MTBC) בקנה מידה עולמי סיבכה משמעותית את הטיפול בחולי שחפת (TB). במיוחד, שחפת עמידה לתרופות מרובות (MDR) ועמידה לתרופות נרחבות (XDR) מהוות אתגרים אדירים לבקרת שחפת12. זיהוי מהיר של עמידות לתרופות הוא חיוני לתכנון משטרי טיפול מתאימים, מניעת כישלון טיפולי וצמצום התפשטות נוספת של זנים עמידים13,14. שיטות זיהוי מבוססות טכנולוגיית הגברת חומצות גרע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

מחקר זה מומן על ידי מענק מיוחד מפרויקט השחפת של החיל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צנטריפוגה
מאגר ליזהXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Mycobacterium tuberculosis Ethambutol עמידות לזיהוי מוטציות ערכת XiamenZhishan Biotechnology Co., Ltd.
Mycobacterium tuberculosis ערכת זיהוי מוטציות עמידות לאיזוניאזידXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Mycobacterium tuberculosis Rifampicin עמידות למוטציות איתור KiXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
SLAN-96P מערכת PCR בזמן אמתשנחאי הונגשי טכנולוגיה רפואית ושות', בע"מSLAN-96P
פתרון עיבוד כיחשיאמן Zhishan ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ
TopPette Pipettor
במהירות גבוהה2411070124030801240111012403100124110701

מקורות

  1. Salari, N., et al. Global prevalence of drug-resistant tuberculosis: A systematic review and meta-analysis. Infect Dis Poverty. 12 (1), 57(2023).
  2. Cai, X., Xu, X., He, G., Jiang, X., Wu, L. Drug resistance in drug-resistant tuberculosis patients with and without diabetes mellitus: A comparative analysis. BMC Infect Dis. 24 (1), 807(2024).
  3. Egan, K. A., et al. Compensatory evolution in NusG improves fitness of drug-resistant M. tuberculosis. Nature. 628 (8006), 186-194 (2024).
  4. Sulis, G., Pai, M. Isoniazid-resistant tuberculosis: A problem we can no longer ignore. PLoS Med. 17 (1), e1003023(2020).
  5. Perumal, R., et al. Regimens for drug-resistant tuberculosis. N Engl J Med. 388 (2), 189(2023).
  6. Menzies, D., et al. Effect of duration and intermittency of rifampin on tuberculosis treatment outcomes: A systematic review and meta-analysis. PLoS Med. 6 (9), e1000146(2009).
  7. Turkova, A., et al. Shorter treatment for nonsevere tuberculosis in African and Indian children. N Engl J Med. 386 (10), 911-922 (2022).
  8. Diagnosis of tuberculosis and detection of drug-resistance: rapid communication. , World Health Organization. https://www.who.int/publications/i/item/B09111 (2024).
  9. Xiang, X., et al. Mycobacterial ethambutol responsive genes and implications in antibiotics resistance. J Drug Target. 29 (3), 284-293 (2021).
  10. Deshpande, A., Likhar, R., Khan, T., Omri, A. Decoding drug resistance in Mycobacterium tuberculosis complex: Genetic insights and future challenges. Expert Rev Anti Infect Ther. 22 (7), 511-527 (2024).
  11. Sun, Q., et al. Mutations within embCAB are associated with variable level of ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from China. Antimicrob Agents Chemother. 62 (1), e01279-e01317 (2017).
  12. Noordhoek, G. T., et al. Sensitivity and specificity of PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis: A blind comparison study among seven laboratories. J Clin Microbiol. 32, 277-284 (1994).
  13. Lee, H., et al. Assessment of the quantitative ability of AdvanSure TB/NTM real-time PCR in respiratory specimens by comparison with phenotypic methods. Ann Lab Med. 34, 51-55 (2014).
  14. Murphy, S. G., et al. Direct detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis using targeted next generation sequencing. Front Public Health. 11, 1206056(2023).
  15. Araya, B. T., et al. Performance of the Abbott RealTime MTB and RIF/INH resistance assays for the detection of Mycobacterium tuberculosis and resistance markers in sputum specimens. PLoS One. 16, e0251602(2021).
  16. Motta, I., et al. Recent advances in the treatment of tuberculosis. Clin Microbiol Infect. 30 (9), 1107-1114 (2024).
  17. Zhang, X., et al. A new method for the detection of Mycobacterium tuberculosis based on the CRISPR/Cas system. BMC Infect Dis. 23 (1), 680(2023).
  18. Sam, I. K., et al. TB-QUICK: CRISPR-Cas12b-assisted rapid and sensitive detection of Mycobacterium tuberculosis. J Infect. 83 (1), 54-60 (2021).
  19. Park, Y. K., et al. Correlation of the phenotypic ethambutol susceptibility of Mycobacterium tuberculosis with embB gene mutations in Korea. J Med Microbiol. 61 (4), 529-534 (2012).
  20. Global tuberculosis report. , World Health Organization. https://www.who.int/teams/global-programme-on-tuberculosis-and-lung-health/tb-reports/global-tuberculosis-report-2023 (2023).
  21. Parsa, S., et al. Detection of isoniazid and rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from sputum samples by high-resolution melting analysis. Curr Microbiol. 79 (9), 257(2022).
  22. Plinke, C., et al. embCAB sequence variation among ethambutol-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates without embB306 mutation. J Antimicrob Chemother. 65 (7), 1359-1367 (2010).
  23. Xie, L., et al. Accurate and affordable detection of rifampicin and isoniazid resistance in tuberculosis sputum specimens by multiplex PCR-multiple probes melting analysis. Infection. 52 (6), 2371-2398 (2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

אבחון שחפתשחפת עמידה לתרופותPCR בזמן אמתהפקת חומצות גרעיןזיהוי עמידותמיקרוסקופיה של משטחשיטת תרביתרגישות אבחנתית

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.