פרוטוקול זה מאפשר בידוד של מספיק כונדרוציטים ראשוניים תוך 6-8 שעות, ומאפשר חקירות מעמיקות נוספות של ביולוגיה של סחוס ומנגנוני מחלת סחוס.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד ותרבות במבחנה של כונדרוציטים ראשוניים של עכברים לביולוגיה של סחוס
במאמר זה
סיכום
תקציר
הרס הסחוס המפרקי מוביל לשינוי בפעילות הכונדרוציטים, המהווה גורם סיבתי עיקרי במגוון מחלות סחוס, כולל דלקת מפרקים ניוונית (OA) ודלקת מפרקים שגרונית (RA). כסוג התאים הנפוץ ביותר בסחוס, מחקר מעמיק של התכונות הביולוגיות של כונדרוציטים חיוני לפיתוח אסטרטגיות יעילות לטיפול במחלות. בידוד ותרבות של כונדרוציטים ראשוניים מספקים חומרי ניסוי חשובים לחקירת מחלות סחוס ותורמים לחשיפת מנגנוני הפגיעה ותיקון הסחוס. פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של שיטות הבידוד והתרבות במבחנה עבור כונדרוציטים ראשוניים שמקורם בעכברים. על ידי שימוש בפרוטוקול קולגנאז II האופטימלי, ניתן להשלים בידוד כונדרוציטים תוך 8 שעות עבור דגימות סחוס מפרק הברך של עכברים יילודים. תפוקת התאים היא כ-1-2 ×-10³ תאים/מ"ג של רקמת סחוס, משתנה בהתאם לטריות הרקמה וצפיפות התאים הראשונית; התאים המבודדים מציגים >90% כדאיות. פרוטוקול זה משתמש בכונדרוציטים ראשוניים של עכברים כדוגמה, המציג את המאפיינים המורפולוגיים ומצב ההדבקה של תאים שגודלו במשך 1, 2 ו-5 ימים לאחר הבידוד. תגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק הפוך (RT-qPCR) וכתמים מערביים הראו כי טיפול באינטרלוקין-1β (IL-1β) הפחית את הקולגן מסוג II אלפא 1 (Col2a1) והגביר את ביטוי מטריקס מטאלופפטידאז 13 (Mmp13), מה שמאשר כי כונדרוציטים מבודדים מגיבים לגירויים דלקתיים. בהשוואה לשיטות קונבנציונליות, פרוטוקול זה משתמש בריכוז קולגנאז גבוה יותר כדי להפחית את ההשפעה של זמן בידוד ממושך על כדאיות התא, תוך הימנעות מנזק פוטנציאלי לתאים מטיפול בטריפסין. הכונדרוציטים הראשוניים המתקבלים הם טהורים וברי-קיימא, ומתאימים למחקרים מעמיקים על מנגנונים הקשורים לפגיעות סחוס, שיש להם השלכות חשובות על מחקר במבחנה ועל הטיפול הקליני במחלות סחוס.
מבוא
הרס סחוס מפרקי הוא גורם עיקרי למחלות סחוס שונות, כגון OA ו-RA 1,2. כונדרוציטים, סוג התאים השולט בסחוס, חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס ולהקלה על תיקון בתגובה לפציעה3. שינויים בפעילות הכונדרוציטים לא רק משפיעים על השלמות המבנית של הסחוס אלא גם גורמים לתגובות דלקתיות וניוון רקמות מתקדם4. לכן, חקירה מעמיקה של התכונות הביולוגיות של כונדרוציטים היא חיונית להבהרת האטיופתוגנזה של מחלות אלו.
בשנים האחרונות, תפקידם של כונדרוציטים בתגובות דלקתיות זכה לתשומת לב הולכת וגוברת. מחקרים הראו כי ציטוקינים דלקתיים, כגון IL-1β וגורם נמק גידול-α (TNF-α), פוגעים באופן משמעותי בתהליכים המטבוליים של כונדרוציטים, וכתוצאה מכך ביטוי מוגבר של אנזימים מפרקי מטריצה וירידה בסינתזת המטריצה 5,6,7. שינויים אלה מובילים בסופו של דבר לניוון הדרגתי של הסחוס ולתפקוד לקוי של המפרקים. לכן, חקירת השינויים הביולוגיים של כונדרוציטים בתנאים פתולוגיים בתוך מודלים במבחנה הפכה להכרחית במיוחד. בהתבסס על תרבות חד-שכבתית דו-ממדית מסורתית (2D), ההתקדמות האחרונה בתרבית כונדרוציטים תלת מימדית (3D) וטכנולוגיות אורגנואידים אומצו יותר ויותר במחקר הקשור לסחוס. מערכות מעודנות אלה מציעות מיקרו-סביבה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית ומספקות תובנות חשובות לגבי התנהגות כונדרוציטים בהקשרי מחלה8.
בחירת מקור התא קובעת באופן קריטי אם ממצאים במבחנה מסכמים במדויק את הפתופיזיולוגיה של המפרקים. בניגוד לקווי כונדרוציטים אימורטליים או צמחי סחוס, כונדרוציטים ראשוניים שומרים על הרקע הגנטי המקומי, מסלולי איתות סידן רגישים למכניקה ויציבות פנוטיפית של סחוס מפרקי, ובכך מציגים יכולת כונדרוגנית מעולה והתנהגויות ביולוגיות המשקפות יותר את אלה של תאי סחוס תושבים9. הבדלים שיטתיים במקורות איתות סידן ותעלות יונים מרכזיות ומסלולים במורד הזרם תועדו בין כונדרוציטים ראשוניים לקו התאיםATDC5 10. כתוצאה מכך, כאשר חוקרים פיזיולוגיה או פתולוגיה של המפרקים, יש לתת עדיפות לכונדרוציטים ראשוניים. לכן, אופטימיזציה של הבידוד והתרבות של כונדרוציטים ראשוניים חיונית למידול מדויק של ביולוגיה הקשורה למחלות ולחקר תרופות טיפוליות פוטנציאליות 11,12,13,14,15. עם זאת, השיטות הקיימות פוגעות בכדאיות התא או בשלמות הפנוטיפ עקב עיכול ממושך16,17.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבידוד ותרבות במבחנה של כונדרוציטים ראשוניים שמקורם ברקמת סחוס של עכבר, המניב במהירות מספיק תאים. בהשוואה לפרוטוקולי עיכול ממושכים קונבנציונליים בריכוז אנזימים נמוך, מחקר זה ייעל את תנאי עיכול האנזימים ושלבי הטיפול המקדים ברקמות. אופטימיזציה זו הפחיתה משמעותית את זמן העיכול ל-6-8 שעות תוך הימנעות מנזק פוטנציאלי לתאים מטיפול בטריפסין15,17. בשיטה זו ניתן להשיג כ-1-2 ×10-3 כונדרוציטים מכל מ"ג רקמת סחוס של עכבר. פרוטוקול זה מציע מדריך אמין לבידוד וטיפוח כונדרוציטים ראשוניים במבחנה, ומספק מודל חזק למחקרי מחלות סחוס.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים שיאן הונג-הווי (מס' 202309009), ונהלי הניסוי דבקו בקפדנות בעקרונות 3R של החלפה, הפחתה וליטוש לניסויים בבעלי חיים.
איור 1A ממחיש תרשים סכמטי של הכנת ריאגנטים וציוד. טבלת החומרים כוללת מידע על הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.
1. עכברי ניסוי
הערה: במחקר זה נעשה שימוש בארבעה עכברים בני 3 ימים מסוג C57BL/6J.
- שמרו על הכלובים בטמפרטורה קבועה של 25 מעלות צלזיוס ±-2 מעלות צלזיוס ולחות של 50%-60%, עם מחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות. לספק דיאטת עכברים סטריליים בדרגה נטולת פתוגנים ספציפיים (SPF) (מעוקרת על ידי 60Co irradiation) ומים סטריליים ad libitum.
- אסוף סחוס מפרק הברך (~10 מ"ג/עכבר) מארבעה עכברים בני 3 ימים לאחר המוות כדי לבודד כונדרוציטים ראשוניים.
2. איסוף ועיבוד דגימות סחוס
- עיבוד עכבר ודיסקציה של רקמות
- המתת חסד של עכברים יילודים תוך 3 ימים לאחר הלידה. עקר את פני הגוף על ידי ניגוב עם 75% אלכוהול רפואי.
- בודד את מפרקי הברך של העכבר בעזרת מכשירים כירורגיים סטריליים. הניחו אותם ב-PBS סטרילי 1x.
- כרתו בזהירות את השרירים, העצמות, הסינוביום ורקמות חיבור מתפשטות אחרות המקיפות את מפרק הברך בעזרת מכשירים כירורגיים סטריליים. שמור רק על רקמת הסחוס של מפרק הברך.
- שטפו את דגימות הרקמה פי 3 עם PBS סטרילי 1x. השליכו את הנוזל.
הערה: איור 1B ממחיש תרשים סכמטי פשוט של רכישת רקמת סחוס ועיבוד מקדים.
איור 1: זרימת עבודה פשוטה יותר של הכנת חומרים ועיבוד דגימות סחוס. (A) דיאגרמה סכמטית של הגדרת ריאגנטים וציוד, כולל ריאגנטים, חומרים מתכלים ומכשירים עיקריים. (B) פרוטוקול צעד-אחר-צעד לעיבוד רקמות סחוס ממפרקי ברכיים של עכברים. קיצורים: PBS = מי מלח חוצץ פוספט. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
3. בידוד ותרבות של כונדרוציטים ראשוניים
- העבירו את רקמת הסחוס המבודדת לצלחת תרבית תאים חדשה בת 6 בארות. בעזרת להב כירורגי סטרילי מס' 11, טוחנים את הרקמה לחתיכות קטנות בגודל של כ-0.25 מ"מ3 . יש לשטוף פעם אחת עם PBS סטרילי 1x מקורר מראש. השליכו את הנוזל.
- יש להוסיף 2 מ"ל של תמיסת עיכול שחוממה מראש (37 מעלות צלזיוס) המכילה קולגנאז II בריכוז גבוה (25 מ"ג/מ"ל, מומס בתערובת החומרים המזינים F-12 [DMEM/F12] הסטרילית של Dulbecco כדי לכסות את גוש הרקמות.
- דגרו את צלחת תרבית התאים בחממה לחה של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לעיכול אנזימטי. לאחר הדגירה יש להשליך את הנוזל.
- חזור על שלבים 3.2 ו- 3.3.
הערה: עיכול אנזימים בריכוז גבוה הוא שלב מקדים. מטרתו לעכל מראש את הרקמה, לפרק חלקית את המבנה שלה לעיכול טוב יותר לאחר מכן, ולהסיר הידבקויות מטריצה שעלולות להתקיים עקב חיתוך מהיקף הרקמות. - הוסף 2 מ"ל של תמיסת עיכול מחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) המכילה קולגנאז II בריכוז נמוך (5 מ"ג/מ"ל, מומס במדיום בסיסי סטרילי DMEM/F12) כדי לכסות את גוש הרקמות.
- דגרו את צלחת תרבית התאים בחממה לחה של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 6-8 שעות לעיכול וצפו בהתקדמות הפרדת התאים. מדי פעם בצע טלטול אופקי איטי (80-120 סל"ד) או פיפטינג עדין כדי לשפר את יעילות הליזיס.
הערה: עבור רקמת עכבר יילודים, שחרור התאים נראה בסביבות 3 שעות, עם בידוד מלא שניתן להשיג בין 6 ל-8 שעות. במהלך הטיפול בקולגנאז II של 6-8 שעות, יש להתבונן בליזה כל שעה ולהפסיק את העיכול כאשר אין גושי רקמה ברורים לעין בלתי ו-90% מהתאים חופשיים ובתרחיף תחת מיקרוסקופ. בתהליך העיכול ניתן לראות כונדרוציטים דמויי ואקואול מתנתקים בהדרגה ממסת רקמת הסחוס במיקרוסקופ אופטי. ניתן לחזור על שלב זה מספר פעמים כדי למזער את הנזק לכונדרוציטים הנגרם על ידי עיכול ממושך, וניתן להחליף את תמיסת העיכול בתמיסת עיכול קולגנאז II טרייה בריכוז נמוך כדי להגדיל את תפוקת התאים. - מסננים את כל מוצרי העיכול דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל.
הערה: השתמש במסננת תאים של 100 מיקרומטר כדי למנוע אובדן אגרגטים של כונדרוציטים ולהגדיל את התפוקה. שברי רקמה שאריות מוסרים במהלך חילופי מדיום. - שוטפים את צלחת תרבית התאים עם PBS סטרילי 1x. סנן שוב דרך מסננת התאים.
- אוספים את כל הסינון מהשלב הקודם בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. צנטריפוגה בטמפרטורה של 300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כשהבלם כבוי. השליכו את הסופרנטנט לאחר הצנטריפוגה.
- הוסף 2 מ"ל של PBS סטרילי 1x והשהה בעדינות את המשקעים על ידי נשיפה קלה ושאיפה בעזרת פיפטה. מעבירים לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל. צנטריפוגה בטמפרטורה של 300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כשהבלם כבוי. השליכו את הסופרנטנט לאחר הצנטריפוגה.
- השעו מחדש את המשקעים משלב 4.10 עם 2 מ"ל של מדיום שלם DMEM/F12 סטרילי טרי, המכיל 15% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% P/S. ספרו את תרחיף התאים שנקטפו באמצעות המוציטומטר, ולאחר מכן צלחו את התאים לתבנית תרבית סטרילית של 10 ס"מ ב-2-2.5 ×-105 תאים/ס"מ2. תוספת לנפח סופי של 10 מ"ל עם מדיום שלם.
הערה: צפיפות הזריעה של כונדרוציטים צריכה להיות 2-2.5 × 105 תאים/ס"מ2, שכן זריעה בצפיפות נמוכה או בינונית עלולה להוביל להסטה פנוטיפית של כונדרוציטים מפרקיים לעבר פיברובלסטים. ניתן להעריך את פעילות ההתפשטות והכדאיות של התאים הראשוניים המבודדים באמצעות מבחני MTT אופציונליים או צביעת אי הכללה כחולה של טריפן (שלב אופציונלי). - דגירה בחממה לחה של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- החלף במדיום שלם DMEM/F12 טרי (המכיל 10% FBS, 1% P/S) לאחר שהתאים נצפים כדבוקים לחלוטין לקיר תחת מיקרוסקופ אופטי.
- החלף את המדיום כל יומיים. המשך בתרבות עד שהמפגש יגיע ל -70%, ואז ניתן לבצע ניסויים עוקבים.
הערה: ניתן להגדיל את ריכוז הסרום במדיום התרבית ל-15% בהתאם למצב התא. איור 2 ממחיש תרשים סכמטי פשוט של עיכול רקמת סחוס, בידוד ותרבית של תאים ראשוניים.
איור 2: הליך פשוט עבור עיכול רקמת סחוס, בידוד תאים ראשוניים ותרבית. הסחוס נטחן ועוכל ברציפות עם תמיסת עיכול קולגנאז II בריכוז גבוה למשך 15 דקות, חזר על עצמו פעם אחת, ולאחר מכן עוכל עם תמיסת עיכול קולגנאז II בריכוז נמוך למשך 6-8 שעות כדי לבודד את התאים. לאחר מכן הרקמה המעוכלת סוננה, והפילטר נאסף וצנטריפוגה. כדור התא נשטף עם PBS 1x ותורבת במדיום DMEM/F12 עד שהמפגש הגיע ל-70%, ואז התאים היו מוכנים לניסויים הבאים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
4. אימות פונקציונלי של כונדרוציטים ראשוניים
- חילוף חומרים ושינויים של כונדרוציטים בתנאים דלקתיים.
- טפל בתאים עם 10 ננוגרם/מ"ל IL-1β למשך 24 שעות כדי לדמות מצבים דלקתיים.
- עבור RT-qPCR וכתמים מערביים, חלץ RNA כולל או חלבון כולל כדי לזהות את האינדיקטורים המטבוליים של מטריצת הכונדרוציטים החוץ-תאיים, כגון COL2A1, MMP13.
הערה: איור 3 ממחיש תרשים סכמטי של האימות התפקודי של כונדרוציטים ראשוניים וההליכים הניסיוניים הבאים. מידע הנוגדנים מסופק בטבלת החומרים. נהלים מפורטים עבור כתמים מערביים ו-RT-qPCR מסופקים בטבלה 1, טבלה 2, טבלה 3, טבלה 4 וטבלה 5. כל השיטות פעלו לפי פרוטוקולים סטנדרטיים11,18.
איור 3: דיאגרמה סכמטית של תוכנית האימות הפונקציונלי של כונדרוציטים ראשוניים. מצבים דלקתיים הנגרמים על ידי טיפול ב-IL-1β; השפעות על פנוטיפים הקשורים לסחוס שהוערכו על ידי RT-qPCR וכתמים מערביים. קיצורים: IL-1β = אינטרלוקין-1β; RT-qPCR = תגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק הפוך. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
| תנאי זרימת עבודה של Western Blotting | |
| צעד | מצב / מגיב |
| הכנת ג'ל SDS-PAGE | 8% (w/v) ג'ל הפרדה Tris-HCl |
| אלקטרופורזה בערימה | 80 וולט, 30-40 דקות |
| פתרון אלקטרופורזה | 120 וולט, 1–1.5 שעות |
| העברה | חצי יבש, 15 וולט, 30-60 דקות |
| חסימת | חוצץ חסימה מהיר, שעתיים בטמפרטורת החדר |
טבלה 1: תנאי זרימת עבודה של Western Blotting. סיכום תנאי הכתם המערבי, כולל הרכב SDS-PAGE, פרמטרים של אלקטרופורזה, הגדרות העברה והליך חסימה.
| תערובת תגובת שעתוק הפוך | |
| רכיב | נפח (μL) |
| 5× מאגר תגובת טרנסקריפטאז הפוך של טרנסקריפטור | 4 |
| תערובת דאוקסינוקלאוטידים (10 מ"מ כל אחד) | 2 |
| מעכב RNase מגן (40 U/μL) | 0.5 |
| טרנסקריפטור טרנסקריפטאז הפוך (20 U/μL) | 0.5 |
| מים ללא נוקלאז | עד 20 |
| נפח כולל | 20 |
טבלה 2: תערובת תגובת שעתוק הפוכה. הרכב תגובת שעתוק הפוך לסינתזת cDNA.
| מידע ראשוני עבור RT-qPCR של כונדרוציט ראשי של עכבר | ||||
| שם הגן | רצף (5'3 ') | טמפרטורת חישול (°C) | ||
| mGapdh | קדימה | TGGCCTTCCGTGTTTCTAC | 60 | |
| הפוך | GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA | |||
| mCol2a1 | קדימה | TGACCTCAACTACATGGTCTACA | 60 | |
| הפוך | CTTCCCATTCTCGGCCTTG | |||
| מממ13 | קדימה | CTTCTTCTTGTTGAGCTGGACTC | 60 | |
| הפוך | CTGTGGAGGTCACTGTAGACT | |||
טבלה 3: מידע ראשוני עבור RT-qPCR של כונדרוציט ראשוני של עכבר. רצפים וטמפרטורת חישול (60 מעלות צלזיוס) של פריימרים המשמשים לכימות תעתיקי Gapdh, Col2a1 ו-Mmp13 בכונדרוציטים ראשוניים של עכברים.
| תערובת תגובות RT-qPCR | |
| רכיב | נפח (μL) |
| 2 × SYBR ירוק qPCR מאסטר מיקס | 10 |
| תבנית cDNA מדוללת | 8 |
| פריימר קדמי (10 μM) | 1 |
| פריימר הפוך (10 μM) | 1 |
| נפח כולל | 20 |
טבלה 4: תערובת תגובות RT-qPCR. תערובת תגובה RT-qPCR (20 מיקרוליטר) עם תערובת מאסטר SYBR Green, תבנית ופריימרים.
| פרוטוקול רכיבה על אופניים RT-qPCR | ||
| צעד | טמפרטורה (°C) | זמן |
| דנטורציה ראשונית (×1) | 95 | 10 דק' |
| דנטורציה (×40) | 95 | 5 שניות |
| חישול / הארכה (×40) | 60 | 15 שניות |
| הארכה (×40) | 72 | 30 שניות |
| עקומת התכה (×1) | 95 55 95 | 60 שניות 30 שניות 30 שניות |
טבלה 5: פרוטוקול רכיבה על אופניים RT-qPCR. דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות, חישול/הארכה ב-60 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, וניתוח עקומת התכה סופי בוצעו במשך 40 מחזורים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כפי שמתואר באיור 1, איור 2 ואיור 3, ביצענו את הפרוטוקול ובודדנו בהצלחה כונדרוציטים ראשוניים ממפרקי ברכיים של עכברים. מכ-10 מ"ג של סחוס עכברים יילודים, קיבלנו כ-1 ×-10-4 תאים עם >90% כדאיות. ביום הראשון של תרבית במבחנה, כונדרוציטים ראשוניים של עכברים הפגינו מורפולוגיה מעוגלת, כאשר רוב התאים בתרחיף ועדיין לא נדבקו במלואם לתחתית צלחת התרבית. ביום השני, חלק מהתאים החלו להיצמד לצלחת התרבות והסתגלו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בידוד ותרבית של כונדרוציטים ראשוניים חיוניים להבהרת הפתופיזיולוגיה של מחלות סחוס22. בתרבית כונדרוציטים ראשונית, אופטימיזציה של ריכוז הקולגנאז וזמן העיכול היא קריטית, מכיוון שהיא מאזנת את הפירוק של המטריצה החוץ-תאית תוך הפחתת נזק תאי פוטנציאלי17. כאן, אנו מתארים שיטה אמינה וניתנת לשחזור לבידוד כונדרוציטים ראשוניים מרקמות סחוס של עכברים. בשיטה זו ניתן להשיג כ 1-2 × 103 כונדרוציטים מכל 1 מ"ג של רקמת סחוס עכבר. גישה זו מאפשרת בידוד מהיר של מספר מספיק של כונדרוציטים ר...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם ניגודי אינטרסים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 82370909). איור 1, איור 2 ואיור 3 נוצרו עם Figdraw.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1 ופעמים; אבקת PBS (2 ליטר) | סרוויסביו | G0002-2L | |
| צלחות תרבית תאים 100 מ"מ | סרוויסביו | CCD-100 | |
| 100 μ מסננת תא M | סנגון ביוטק | F613463-0001 | |
| צינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל (סטרילי, ללא אנזימים) | סרוויסביו | EP-1501-J | |
| צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל (סטרילי, ללא אנזימים) | סרוויסביו | EP-5001-J | |
| צלחת תרבית תאים 6 בארות | סרוויסביו | מק"ס-6H | |
| נוגדן רב-שבטי נגד COL2A1 ארנב | אימונוויי | YT1022 | נוגדנים ראשוניים; WB: 1/500 |
| נוגדן חד שבטי לעכבר נגד GAPDH | פרוטאינטק | 60004-1-IG | נוגדנים ראשוניים; WB: 1/2000 |
| נוגדן רב-שבטי נגד MMP13 ארנב | אימונוויי | YT2796 | נוגדנים ראשוניים; WB: 1/1000 |
| ספסל אספטי נקי במיוחד | תרמו פישר | 51029704 | |
| חממת תרבית תאים | תרמו פישר | 51033782 | |
| קולגנאז II | סולארביו | C8150 | |
| פריימרים מותאמים אישית (Gapdh, Col2a1, Mmp13) | סנגון ביוטק | מעוצב באמצעות Primer BLAST | |
| DMEM/F12 בינוני | שיקלון | SH30023.01 | |
| סרום בקר עוברי | אקססל | FCS500 | |
| נוגדן רב-שבטי HRP-עז נגד עכבר | אימונוויי | RS0001 | נוגדנים משניים; WB: 1/10000 |
| HRP-עז נגד ארנב נוגדן רב-שבטי | אימונוויי | RS0002 | נוגדנים משניים; WB: 1/10000 |
| מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך | אולימפוס | CKX53 | |
| מיקרופיפטה | תרמו פישר | ||
| צנטריפוגה מיניאטורית על ספסל | סונה | SN-TDL-6 | |
| להב כירורגי מס' 11 | סרוויסביו | QXJZ-11 | |
| תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין(100X) | ביוטיים | ג0222 | |
| סט מכשירי נתיחה לבעלי חיים קטנים | סרוויסביו | QXTZ01 |
מקורות
- Makris, E. A., Gomoll, A. H., Malizos, K. N., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Repair and tissue engineering techniques for articular cartilage. Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 21-34 (2015).
- Bierma-Zeinstra, S., Van Middelkoop, M., Runhaar, J., Schiphof, D. Nonpharmacological and nonsurgical approaches in OA. Best Pract Res Clin Rheumatol. 34 (2), 101564(2020).
- Urlic, I., Ivkovic, A. Cell sources for cartilage repair-biological and clinical perspective. Cells. 10 (9), 2496(2021).
- Murphy, M. P., et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells. Nat Med. 26 (10), 1583-1592 (2020).
- Zhao, K., Ruan, J., Nie, L., Ye, X., Li, J. Effects of synovial macrophages in osteoarthritis. Front Immunol. 14, 1164137(2023).
- Wang, B. W., et al. Aucubin protects chondrocytes against IL-1β-induced apoptosis in vitro and inhibits osteoarthritis in a mouse model. Drug Des Devel Ther. 13, 3529-3538 (2019).
- Kuswanto, W., Baker, M. C. Repurposing drugs for the treatment of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 32 (8), 886-895 (2024).
- Heywood, H. K., Thorpe, S. D., Jeropoulos, R. M., Caton, P. W., Lee, D. A. Modulation of sirtuins during monolayer chondrocyte culture influences cartilage regeneration upon transfer to a 3d culture environment. Front Bioeng Biotechnol. 10, 971932(2022).
- Piñeiro-Ramil, M., et al. Generation of human immortalized chondrocytes from osteoarthritic and healthy cartilage : A new tool for cartilage pathophysiology studies. Bone Joint Res. 12 (1), 46-57 (2023).
- Li, W., Zhou, Y., Han, L., Wang, L., Lucas Lu, X. Calcium signaling of primary chondrocytes and atdc5 chondrogenic cells under osmotic stress and mechanical stimulation. J Biomech. 145, 111388(2022).
- Zhao, Y., et al. Protein folding dependence on selenoprotein m contributes to steady cartilage extracellular matrix repressing ferroptosis via PERK/ATF4/CHAC1 axis. Osteoarthritis Cartilage. 33 (2), 261-275 (2025).
- Zhang, H., et al. Mechanical overloading promotes chondrocyte senescence and osteoarthritis development through downregulating FBXW7. Ann Rheum Dis. 81 (5), 676-686 (2022).
- Tang, H., et al. The IRF1/GBP5 axis promotes osteoarthritis progression by activating chondrocyte pyroptosis. J Orthop Translat. 44, 47-59 (2024).
- Bittner, N., et al. Primary osteoarthritis chondrocyte map of chromatin conformation reveals novel candidate effector genes. Ann Rheum Dis. 83 (8), 1048-1059 (2024).
- Ramser, A., Greene, E., Rath, N., Dridi, S. Primary growth plate chondrocyte isolation, culture, and characterization from the modern broiler. Poult Sci. 102 (1), 102254(2023).
- Mao, J., et al. Insufficiency of collagenases in establishment of primary chondrocyte culture from cartilage of elderly patients receiving total joint replacement. Cell Tissue Bank. 24 (4), 759-768 (2023).
- Lau, T. T., Peck, Y., Huang, W., Wang, D. A. Optimization of chondrocyte isolation and phenotype characterization for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 21 (2), 105-111 (2015).
- Pagani, S., et al. Rna extraction from cartilage: Issues, methods, tips. Int J Mol Sci. 24 (3), 2120(2023).
- Goldring, M. B., Otero, M., Tsuchimochi, K., Ijiri, K., Li, Y. Defining the roles of inflammatory and anabolic cytokines in cartilage metabolism. Ann Rheum Dis. 67 (Suppl 3), 75-82 (2008).
- Wang, G., et al. TGFbeta attenuates cartilage extracellular matrix degradation via enhancing FBXO6-mediated MMP14 ubiquitination. Ann Rheum Dis. 79 (8), 1111-1120 (2020).
- Pang, Y., Zhao, L., Ji, X., Guo, K., Yin, X. Analyses of transcriptomics upon IL-1β-stimulated mouse chondrocytes and the protective effect of catalpol through the NOD2/NB-κb/MAPK signaling pathway. Molecules. 28 (4), 1606(2023).
- Naranda, J., Gradisnik, L., Gorenjak, M., Vogrin, M., Maver, U. Isolation and characterization of human articular chondrocytes from surgical waste after total knee arthroplasty (TKA). PeerJ. 5, e3079(2017).
- Koyama, N., et al. Pluripotency of mesenchymal cells derived from synovial fluid in patients with temporomandibular joint disorder. Life Sci. 89 (19-20), 741-747 (2011).
- Lawrence, J. E. G., et al. Single-cell transcriptomics identifies chondrocyte differentiation dynamics in vivo and in vitro. Dev Cell. , (2025).
- Huang, C., et al. Single-cell transcriptomic analysis of chondrocytes in cartilage and pathogenesis of osteoarthritis. Genes Dis. 12 (2), 101241(2025).
- Wu, C. L., et al. Single cell transcriptomic analysis of human pluripotent stem cell chondrogenesis. Nat Commun. 12 (1), 362(2021).
- Zhang, H., Huang, J., Alahdal, M. Exosomes loaded with chondrogenic stimuli agents combined with 3d bioprinting hydrogel in the treatment of osteoarthritis and cartilage degeneration. Biomed Pharmacother. 168, 115715(2023).
- Mahapatra, C., Jin, G. Z., Kim, H. W. Alginate-hyaluronic acid-collagen composite hydrogel favorable for the culture of chondrocytes and their phenotype maintenance. Tissue Eng Regen Med. 13 (5), 538-546 (2016).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.