שיטת MALDI-ToF MS לאפיון פולימרים סינתטיים בעלי פיזור וקבוצות קצה משתנות

Ashley V. Miles; Amman Nadeem; Mahi Ahmad; Brennan J. Curole; Scott M. Grayson

doi:10.3791/68455

מאמר שיטה

שיטת MALDI-ToF MS לאפיון פולימרים סינתטיים בעלי פיזור וקבוצות קצה משתנות

DOI:

10.3791/68455

⸱

3 באוקטובר 2025

Ashley V. Miles¹ , Amman Nadeem¹ , Mahi Ahmad¹ , Brennan J. Curole¹ , Scott M. Grayson¹

¹Department of Chemistry, Tulane University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק הוראות מפורטות ודוגמאות להכנת דגימות, רכישת נתונים וניתוח נתונים לאפיון פולימרים סינתטיים עם פיזור וקבוצות קצה משתנות באמצעות ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה בלייזר בעזרת מטריצה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה בלייזר בעזרת מטריצה (MALDI-ToF MS) היא כלי אנליטי יעיל לאפיון פולימרים סינתטיים, המציע קביעת משקל מולקולרי מדויקת ותובנות מבניות כגון מסות יחידה חוזרות וזיהוי קבוצת קצה. פרוטוקול זה מפרט את השלבים לניתוח פולימרים, כולל הכנת דגימה עם בחירת מטריצה וקטיון מתאימה, רכישת נתונים ושיטת כיול כדי להבטיח מדידות מסה מדויקות. הוא מדגיש את הרבגוניות של MALDI-ToF MS בניתוח פולימרים, מחומרים חד-דיספרסיים ועד לחומרים בעלי פיזור גבוה, תוך התבוננות במגבלות בפתרון דגימות בפיזור גבוה. על ידי השוואת מסות תיאורטיות ונצפות, כולל דפוסים איזוטופיים, השיטה מאפשרת אישור בטוח של יחידות חוזרות וקבוצות קצה. הפרוטוקול תומך במשתמשים חדשים על ידי הצגת נתונים מייצגים על בחירת מטריצות, פרשנות ספקטרלית על פני טווחי פיזור ואפיון של פולימרים בעלי תכונות איזוטופיות ייחודיות או תצורות יונים מטה-יציבות. אסטרטגיות פתרון בעיות כוללות טיפול בבעיות כגון הפרעות מטריצה ודגימות המייננות ללא קטיון נוסף במהלך הכנת הדגימה. בסך הכל, מדריך זה משמש בסיס לשימוש ב-MALDI-ToF MS כטכניקה מהירה ואמינה לניתוח פולימרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה בלייזר בעזרת מטריצה (MALDI-ToF MS) היא טכניקה אנליטית יעילה ביותר לאפיון פולימרים סינתטיים 1,2,3,4. ניתן לאפיין פולימרים רבים בתהודה מגנטית גרעינית (NMR) כדי לאשר את מבנה היחידה החוזרת. עם זאת, רוב קבוצות הקצה הן חלק קטן משיאי היחידות החוזרות, אפילו עבור פולימרים בעלי משקל מולקולרי נמוך, וככל שהמשקל המולקולרי של פולימר עולה, נראה שקשה לכמת את אותות קבוצת הקצה ב-NMR⁵. עם זאת, נתוני MALDI-ToF MS מאשרים שמדובר בקבוצות הקצה, אפילו במשקלים מולקולריים גבוהים יותר. טכניקת ספקטרומטריית מסה זו ידועה ביכולת היינון הרך שלה ומייצרת בעיקר יוני פולימר טעונים בודדים עם פיצול מינימלי מאוד². זה מאפשר קביעת משקל מולקולרי מדויקת וניתוח מבני מפורט המספק תוצאות מהירות ומדויקות, ומספק מידע רב ערך כגון מסות יחידות חוזרות, זיהויים של קבוצות קצה, ועבור פולימרים בעלי פיזור נמוך, קביעת משקל מולקולרי ממוצע (M_n), משקל מולקולרי ממוצע (M_w) ופיזור (Đ)⁶.

MALDI-ToF MS יכול לנתח פולימרים עם פיזור משתנה, אך יש לו מגבלות בפיזור גבוה יותר. עבור פולימרים מונודיספרסיים כגון דנדרימרים, שיטה זו אידיאלית לאישור המסה שלהם ולזיהוי קבוצות קצה⁷. עבור פולימרים עם פיזור נמוך (1.01-1.09) וכמה פולימרים עם פיזור בינוני (Đ = 1.1-1.3), ניתן להשתמש ב-MALDI-ToF MS גם כדי לקבוע את מסת יחידת החזרה של הפולימר, מסת קבוצת הקצה, Đ, M_n ו-M_w⁸. עם זאת, עבור פולימרים מפוזרים מאוד (Đ = 1.3-10), זה הופך להיות מאתגר. עבור פולימרים בפיזור רחב, השברים הנמוכים מציגים עוצמה גבוהה בהרבה מאשר עמיתיהם בעלי המשקל המולקולרי הגבוה יותר, מה שמוביל לפיזור נמוך יותר באופן מלאכותי מטכניקות אפיון אחרות כגון כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC). זה מתואר כ"הטיית מסה נמוכה". ניתן לאשר את מסת יחידת החזרה הממוצעת וקבוצות הקצה מתוצאות המשקל המולקולרי הנמוכות יותר, אך אי אפשר לקבוע את ה-M_n, M_w ו-Đ האמיתיים עבור פולימרים בעלי פיזור גבוה מ-MALDI-ToF MS⁹. לכן, יש להוסיף SEC כטכניקת אפיון עבור פולימרים מפוזרים באופן רחב כדי לקבוע את ה-M_n, M_w ו-Đ האמיתיים.

אופטימיזציה של הכנת הדגימה חיונית לרזולוציית שיא איכותית בספקטרום מסה MALDI-ToF ^2,10. השלב הראשון כולל בחירת מטריצה מתאימה המבוססת על קוטביות פולימר. עבור פולימרים לא קוטביים, מטריצות כגון טרנס-2-[3-טרט-בוטילפניל)-2-מתיל-2-פרופנילידן] (DCTB), רדיקל חופשי גלווינוקסיל (GFR) ו-9-ניטרואנתרסן (9-NA) נמצאות בשימוש נפוץ ¹¹. פולימרים קוטביים מתאימים יותר למטריצות כמו חומצה α-ציאנו-4-הידרוקסיצינמית (CHCA), דיתרנול, 2-(4-הידרוקסיפנילאזו) חומצה בנזואית (HABA) וחומצה 2,5-דיהידרוקסיבנזואית (DHB)12,13,14. עבור פרוטוקול זה, DCTB נבחר כמטריצה העיקרית בשל יעילותו עם פולימרים לא קוטביים, ו-CHCA שימש לפולימרים קוטביים. גם בחירת קטיון ממלאת תפקיד חשוב, שכן מתכות אלקליות כמו נתרן ואשלגן מייננות פולימרים המכילים חמצן ביעילות, בעוד שמתכות מעבר כמו כסף מתאימות יותר לפחמימנים בלתי רוויים^10,14.

לאחר בחירת המטריצה והאנליט, נקבעים יחסי הקטיון:אנליט:מטריצה האופטימליים עבור תערובות תמיסת הדגימה. תערובת תמיסת דגימה זו תתווסף לצלחת המטרה בכמות של 1 מיקרוליטר. היעדר אחד או יותר מהיחסים הנכונים של בחירות הקטיון:אנליטה:מטריצה יכול להשפיע על הרגישות של רכישת הנתונים של MALDI-ToF MS. עבור הנתונים המייצגים שלהלן, הכנת הדגימה עברה אופטימיזציה לרזולוציה הטובה ביותר ^2,15.

לאחר הכנת תמיסת הדגימה והוספתה ללוחית היעד MALDI-ToF MS, דגימה זו מוכנסת למכשיר MALDI-ToF MS כדי להתחיל ברכישת נתונים. עבור מחקר זה, הנתונים נאספו אך ורק במצב יונים חיוביים, ונעשה שימוש בספקטרומטר מסה חדש יותר של MALDI-ToF, בהתבסס על עבודה קודמת של פיין ^{ואחרים.16}. ניתן לכוונן פרמטרים חשובים של MALDI-ToF MS, כגון עוצמת לייזר, קוטר קרן לייזר, רווח גלאי וזמן עיכוב מיצוי פועם, כדי לשפר את הרזולוציה במהלך הרכישה. שני אופנים זמינים עבור רכישת נתוני MALDI-ToF MS: ליניארי ורפלקטרון¹⁷. מצב רפלקטרון מועדף להשגת רזולוציית אות גבוהה יותר בהשוואה למצב ליניארי^18,19. במצב ליניארי, יונים מואצים עוברים ישירות דרך צינור הטיסה אל הגלאי. לעומת זאת, מצב רפלקטרון כולל מעבר דרך צינור הטיסה פעם אחת, ולאחר מכן החזרת היונים בחזרה דרך צינור הטיסה פעם שנייה לפני ההגעה לגלאי השני, מה שמכפיל בערך את נתיב הטיסה שלהם. גישה זו מאפשרת התמיינות של יונים בעלי מסות דומות אך מהירויות משתנות^20,21. כוח לייזר יכול להיות גם גורם בהגדלת יחס האות לרעש או בהפחתת הפיצול של פולימר²². עוצמת הלייזר הנמוכה ביותר האפשרית לביטול דגימה תשפר את יחס האות לרעש וגם תפחית את האפשרות לפיצול²². לאחר אופטימיזציה של רזולוציית האות ומקסום יחס האות לרעש, הרכישה יכולה לספק נתונים באיכות גבוהה עבור אנליט הפולימר הנבחר.

כיול חיוני למדידת מסה מדויקת ב-MALDI-ToF MS. נעשה שימוש בשתי שיטות עיקריות: כיול פנימי וחיצוני, שתיהן מסתמכות על קליברנטים בעלי מסות ידועות המכסים את הטווח הצפוי של האנליט⁶. עבור הפולימרים שנותחו בנתונים המייצגים, נבחרו קליברנטים של דנדרימרים מונו-דיספרסי לכיול על פני טווחי מסה רחבים²³. כיול פנימי, שבו הקליברנט מעורבב עם הקטיון, האנליט והמטריצה, משפר את דיוק המסה מכיוון שגם הקליברנט וגם האנליט חווים את אותם תנאים, וכל שינוי מסה של כיול משפיע עליהם באותה מידה. עם זאת, שיטה זו עלולה להוביל לחפיפה שיא עם אותות הפולימר המתקבלים, ולסבך את הניתוח²⁴. לעומת זאת, כיול חיצוני, המופעל בפרוטוקול זה, מונע חפיפת שיא על ידי הכנה ואיתור הקטיון:קליברנט:מטריצה בנפרד מהקטיון:אנליט:מטריצה על לוחית המטרה. עם זאת, אי דיוקים קלים במסה עלולים להיווצר עקב הבדלים קלים במיקום הדגימה ובתגובת המכשיר המקומי, כגון שינויים בעוצמת הלייזר או יעילות היינון על פני המטרה, כך שהקליברנט והאנליט צריכים להיות בסמיכות זה לזה²⁴. בנתונים המייצגים, הפרש המסה שנצפה בשיטת הכיול החיצוני היה פחות מ-0.100 Da מהערך התיאורטי.

לבסוף, עבור כל הפולימרים, ניתן לנתח את נתוני MALDI-ToF MS כדי לקבוע את מסת היחידה החוזרת ולבצע ניתוח קבוצת קצה של הפולימרים. ניתן לאשר את מסת היחידה החוזרת על ידי השוואת מסת יחידת החזרה התיאורטית באמצעות כלי תוכנה למסת היחידה החוזרת הנצפית בספקטרום המסה MALDI-ToF. אם הם תואמים, סביר להניח שלפולימר יהיה מבנה יחידת החזרה הצפוי (או איזומר). ניתוח קבוצת הקצה של MALDI-ToF MS עבור פולימרים מתחיל בחישוב המסה התיאורטית של האנליט. זה כולל את המסה המשולבת של יחידת החזרה, קבוצות הקצה והקטיון שנבחר מהכנת הדגימה. במקרה של מקרומולקולות מונו-דיספרס, החישוב כולל את המסה הכוללת של אנליט אחד יחד עם מסת הקטיון שנבחר. כלי תוכנה לשרטוט מבנים כימיים יכולים לסייע בחישובים אלה. לאחר מכן משווים את המסה התיאורטית מהתוכנה למסה הנצפית מספקטרום המסה MALDI-ToF כדי לוודא אם הפולימר תואם את המבנה המולקולרי הצפוי. עם זאת, אם מסת היחידה החוזרת שנצפתה תואמת בערך את הערך התיאורטי, אך המסה הכוללת של n-mer שצוין, כולל קבוצות קצה והקטיון, לא, הפער עשוי להצביע על נוכחות של קבוצות קצה בלתי צפויות. כדי לזהות קבוצות קצה לא ידועות, תנאי התגובה נבדקים כדי לקבוע מולקולות או ריאגנטים חלופיים שיכלו להגיב ליצירת קבוצות הקצה שנצפו. שלב זה חיוני לאפיון מדויק של כל מבנה הפולימר.

פרוטוקול זה מספק שיטה שלב אחר שלב לניתוח MALDI-ToF MS של פולימרים סינתטיים, שנועדה לסייע למשתמשים, במיוחד מתחילים, בהכנת דגימות, אופטימיזציה של שיטת מכשירים, רכישת נתונים וניתוח נתונים. נתונים מייצגים ממחישים את בחירת המטריצה עבור פולימר נתון; ספקטרום וניתוח של פולימרים בעלי פיזור משתנה, כולל דגימות חד-פיזוריות, פיזור בינוני ופיזור גבוה; ניתוח קבוצת הקצה של פולימרים, הכולל את אלה עם דפוסי רזולוציה איזוטופיים מובהקים (למשל, הלוגניים), ואלה המועדים להיווצרות יונים מטה-יציבים (למשל, עם סיום אזיד); ניתוח הנתונים של פולימרים באמצעות MALDI-ToF MS, הכולל השוואה בין מסות נצפות ותיאורטיות כדי לאשר מסת יחידה חוזרת ומסת פולימר כוללת, כולל קבוצות קצה ותוספות קטיונים; ודוגמה לפתרון בעיות להפרעות מטריצה של פולימרים בעלי מסה נמוכה ופולימרים מייננים עצמיים.

פרוטוקול זה לא רק מספק בסיס לאפיון פולימר MALDI-ToF MS אלא גם מציע הדרכה לגבי הכנת דגימה, אופטימיזציה של שיטת מכשירים צעד-אחר-צעד (איור 1), ופרשנות הספקטרום עבור פולימרים סינתטיים חדשים ומסחריים כאחד.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התראה: עיין בגיליונות נתוני הבטיחות (SDS) עבור כל הכימיקלים לפני השימוש. בצע את כל הכנת הדגימה והכנת צלחות MALDI-ToF MS במכסה אדים, ולבש ציוד מגן אישי מתאים (PPE), כולל משקפי בטיחות, מעיל מעבדה וכפפות.

1. הכנת מדגם

הכנת תמיסת מלאי מטריצה, קטיון, קליברנט ואנליט
1. הכן את תמיסת מלאי הקטיון האלקלי על ידי המסת 2 מ"ג מהקטיון הרצוי ב-1 מ"ל של ממס שנבחר בשל תאימותו לאנליט ולקטיון. עבור דגימה 1, 2 מ"ג של נתרן טריפלואורואצטט הומס ב-1 מ"ל של THF.
2. הכן את תמיסת מלאי המטריצה על ידי המסת 20 מ"ג מהמטריצה הרצויה ב-1 מ"ל של ממס תואם בהתבסס על מסיסות האנליט. דוגמה: עבור הנתונים המייצגים (מדגם 1), ממיסים 20 מ"ג DCTB ב-1 מ"ל של טטרהידרופוראן (THF).
3. הכן את תמיסת מלאי הקליברנט על ידי ביצוע הוראות הספק.
4. הכן את תמיסת האנליט על ידי המסת 10 מ"ג של האנליט ב-1 מ"ל של ממס מתאים. עבור דגימה 1, 10 מ"ג של האנליט מומס ב-1 מ"ל של THF.
הכנת לוחית מטרה MALDI-ToF MS
1. נקה את לוחית המטרה MALDI-ToF MS.
2. הכן את דגימת רכישת האנליט ואת פתרון דגימת הכיול. הוסף את פתרונות מלאי הקטיון, האנליט והמטריצה ביחס של 1:5:20 מיקרוליטר לתוך שפופרת A ומערבולת. לכיול חיצוני: הוסף את תמיסות הקטיון, הקליברנט והמטריצה ביחס של 1:5:20 מיקרוליטר לתוך צינור B ומערבולת.
3. הוסף את תערובת תמיסת הדגימה האנליטית והקליברנט ללוחית היעד MALDI-ToF MS. פיפטה 0.5 מיקרוליטר של הקטיון: אנליט: תערובת תמיסת דגימה מטריקס (צינור A) על לוחית המטרה MALDI-ToF MS בשיטת הטיפות המיובשות. פיפטה 0.5 מיקרוליטר של תערובת הקטיון: קליברנט: מטריצה (צינור B) על נקודה הסמוכה לאנליט על לוחית המטרה MALDI-ToF MS בשיטת הטיפות המיובשות. רשום את המיקום המדויק של כל נקודה (אות שורה ומספר עמודה) כדי לאתר בקלות את הדגימה והקליברנט במהלך רכישת הנתונים.

2. רכישת נתונים

הכנס את לוחית היעד MALDI-ToF MS ובחר שיטת רכישה
1. הכנס את לוחית המטרה MALDI-ToF MS למכשיר. הנח את לוחית המטרה על המחזיק בכיוון הנכון, ואל תדחוף את לוחית המטרה MALDI-ToF MS רחוק מדי פנימה.
2. עגן את לוחית המטרה MALDI-ToF MS על המכשיר באמצעות תוכנת בקרת המכשיר.
3. בחר ופתח שיטה file בתוכנת בקרת המכשיר. בחר בשיטת רפלקטור חיובי (RP) או חיובי ליניארי (LP) בטווח המסה של האנליט.
4. עקוב אחר תוכנת בקרת המכשיר כדי לוודא שלוחית המטרה הוכנסה והגדרת השיטה הושלמה.
  הערה: לפולימרים מייצגים אלה יש חמצן; לכן, נבחר מצב חיובי (לרוב התרכובות הושלמה רכישה במצב חיובי). עבור הנתונים המייצגים, נבחרה שיטת RP למצב הרפלקטור בכל הדגימות.
רכישת נתונים ראשונית
1. בתוכנת בקרת המכשירים, אתר את המצלמה המציגה את לוחית היעד MALDI-ToF MS ותרשים של הבארות עם אותיות העמודות ומספרי השורות המוצגים. לחץ על באר MALDI-ToF MS המכילה את תערובת הקטיון:אנליטה:מטריצה כדי לבחור לרכישת נתונים.
2. התאם את טווח זיהוי המסה בתוכנת בקרת המכשיר לטווח רחב של 500-20000 Da כדי להבטיח שהמסה הצפויה של האנליט נלכדת במלואה. השתמש בסמן כדי לכוונן את הטווח בערך פי 2 מתחת ומעל המסה הצפויה של האנליט לאחר רכישה ראשונית.
3. רכישת נתונים
  1. לחץ על כפתור התחל בתוכנת בקרת המכשיר כדי להתחיל ברכישת הנתונים MALDI-ToF MS.
  2. לחץ על עצור או אפשר לרכישת MALDI-ToF MS להסתיים באופן אוטומטי.
  3. נקישה הוסף כדי להוסיף את הספקטרום היחיד של MALDI-ToF MS למאגר ספקטרום הסכום.
    הערה: מאגר הספקטרום היחיד MALDI-ToF MS מאחסן ספקטרום מסה בודד של MALDI-ToF, ומאגר הספקטרום הסכום צובר נתונים מרכישות מרובות, מה שמגדיל את עוצמת האות.
  4. מקם מחדש את הלייזר MALDI-ToF MS על ידי view הזנת המצלמה ולחץ בכל מקום בתוך אותה באר שנבחרה כדי להעביר את הלייזר למיקום חדש.
  5. חזור על רכישות MALDI-ToF MS כדי להוסיף ספקטרום יחיד של MALDI-ToF MS למאגר הסכום. חזור על שלבים 2.2.3.1 עד 2.2.3.4 עד שתוצאות MALDI-ToF MS יהיו משביעות רצון.
  6. הערך את ספקטרום המסה MALDI-ToF עבור רזולוציה ורעש בסיסי. אם ספקטרום MALDI-ToF MS מציג רזולוציה גבוהה ורעש בסיסי מינימלי, המשך לשלב הכיול. אם לא, שקול לייעל את שיטת רכישת הנתונים (למשל, התאמת עוצמת לייזר, רווח גלאי או הגדרות חילוץ יונים פועם).
אופטימיזציה של רכישת נתונים (ראה איור 1)
1. כוונן את עוצמת הלייזר MALDI-ToF MS, רווח הגלאי וחילוץ יונים פועם בזה אחר זה כדי לשפר את הרזולוציה ו/או להפחית את רעשי הרקע
2. כדי לשכפל את שיטת MALDI-ToF MS, העתק והדבק את שיטת MALDI-ToF MS LP או RP תחת שם חדש. פתח את קובץ פעולת השירות MALDI-ToF MS המודבק שנוצר ושנה את שם הקובץ.
3. רכוש ספקטרום מסה ראשוני של MALDI-ToF על ידי ביצוע כל השלבים בסעיף 2.2 לרכישת הנתונים הראשונית, בסעיף רכישת הנתונים. התקרב לקבוצה של פסגות של MALDI-ToF MS בעוצמה הגבוהה ביותר כדי להעריך את הרזולוציה ורעש הבסיס בתוכנת בקרת המכשיר.
4. אופטימיזציה של רכישה
  1. כוונן את עוצמת הלייזר MALDI-ToF MS
    1. התחל בעוצמת לייזר MALDI-ToF MS נמוכה של ~ 4% ובצע את השלבים 2.2.3.1 ו-2.2.3.2 כדי שרכישת הנתונים הראשונית תתחיל ותפסיק את רכישת הנתונים.
    2. התבונן והשווה את הרזולוציה ורעש הבסיס של המאגר היחיד MALDI-ToF MS והספקטרום הראשוני במאגר הסכום.
    3. הגדל את עוצמת הלייזר MALDI-ToF MS במרווחים של 2%-10% כדי לשפר את היינון. בצע את השלבים 2.2.3.1 ו- 2.2.3.2 כדי שרכישת הנתונים הראשונית תתחיל ותפסיק את רכישת הנתונים לאחר כל תוספת.
    4. בחר את עוצמת הלייזר הנמוכה ביותר שתספק פסגות בעוצמה גבוהה עם רעש מינימלי.
      הערה: כאשר עוצמת הלייזר MALDI-ToF MS היא 50% ומעלה, קיימת אפשרות מוגברת לפיצול דגימה.
  2. אופטימיזציה של קוטר הלייזר MALDI-ToF MS
    1. בלשונית הגלאי, כוונן את קוטר הלייזר MALDI-ToF MS כדי לבדוק הגדרות בינוניות, גדולות ואולטרה. בצע את השלבים 2.2.3.1 ו- 2.2.3.2 כדי שרכישת הנתונים הראשונית תתחיל ותפסיק את רכישת הנתונים.
    2. התבונן והשווה את הרזולוציה ורעש הבסיס של המאגר היחיד MALDI-ToF MS והספקטרום הראשוני במאגר הסכום.
    3. בחר את קוטר הלייזר MALDI-ToF MS המספק רזולוציה אופטימלית עם רעש בסיסי מינימלי.
      הערה: קוטר הלייזר MALDI-ToF MS שולט בקוטר קרן הלייזר.
  3. התאם את הגבר גלאי MALDI-ToF MS
    1. במרווחים קטנים, הגדל או הקטן את רווח גלאי MALDI-ToF MS. בצע את השלבים 2.2.3.1 ו-2.2.3.2 עבור רכישת הנתונים הראשונית כדי להתחיל ולהפסיק את רכישת הנתונים עבור כל עלייה או ירידה ברווח גלאי MALDI-ToF MS.
    2. שים לב לעוצמת האות והרזולוציה של ספקטרום המסה MALDI-ToF בתוכנת בקרת המכשיר עם כל התאמה של המאגר היחיד MALDI-ToF MS והספקטרום הראשוני במאגר הסכום.
    3. שמור על רווח גלאי MALDI-ToF MS המספק את העוצמה הטובה ביותר ורזולוציית אות טובה.
  4. שנה את מיצוי היונים הפועם MALDI-ToF MS
    1. כוונן את מיצוי היונים הפועם MALDI-ToF MS במרווחים של 10 ns. בצע את השלבים 2.2.3.1 ו-2.2.3.2 כדי שרכישת הנתונים הראשונית תתחיל ותפסיק את רכישת הנתונים, עבור כל עלייה או ירידה ברווח הגלאי.
    2. הערך כיצד שינויי מיצוי היונים הפועמים משפרים את רזולוציית האות MALDI-ToF MS.
      הערה: מיצוי היונים הפועם MALDI-ToF MS מוגדר כעיכוב זמן בין יינון לייזר. על ידי הגדלה או הקטנה של מיצוי יוני הדופק, יונים בעלי אנרגיות שונות יישארו בשדה החשמלי לזמנים קצרים או ארוכים יותר. הזמן הארוך יותר עשוי לאפשר לאנליטים בעלי אותה מסה ויונים טעונים חיובית המתפרקים בזמנים מעט שונים להאיץ במלואם לאותה מהירות כמו יוני אנליטים מאותה מסה כאשר המתח מופעל. זה יכול לשמש כדי להגדיל את הרזולוציה ולהפחית את רעשי הרקע של האות²⁵.
5. לאחר השגת הרזולוציה האופטימלית ויחס האות לרעש הגבוה ביותר, שמור את קובץ שיטת MALDI-ToF MS האופטימלי לשימוש נוכחי ועתידי כאחד.
כיול MALDI-ToF MS
1. רכוש את ספקטרום המסה של הכיול MALDI-ToF על ידי בחירת הכיול דגימה על לוחית המטרה וביצוע כל השלבים בסעיף 2.2 לרכישת הנתונים הראשונית
  1. גש לנקודות הייחוס של הכיול. נווט אל לשונית הכיול בתוכנת בקרת המכשיר. פתח את רשימת בקרת המסה המתאימה לקליברנט המשמש.
2. התאם את שיאי כיול ספקטרום המסה של MALDI-ToF עם מסות הייחוס ברשימת בקרת המסה.
  1. ברשימת בקרת המסה, בחר את המסה המתאימה לשיא הכיול הראשון בספקטרום המסה MALDI-ToF. ספקטרום המסה של MALDI-ToF יתקרב אוטומטית לשיא הקליברנט שנבחר.
  2. הגדר את שיא הייחוס על ידי לחיצה משמאל לאות הקליברנט. השיא ייבחר.
  3. בחר החל כדי להגדיר את אות הקליברנט כמסת הייחוס ברשימת בקרת המסה.
  4. חזור על תהליך זה עבור כל שיאי הכיול הנוספים. בחר את המסה הבאה של עניין מרשימת בקרת המסה, יישר את שיא הקליברנט המתאים והחל את הגדרת הייחוס.
רכישת דגימת אנליט פולימרי מכויל
1. אתר ובחר את הבאר המכילה היטב את הקטיון:אנליט:תערובת מטריצה בתוכנת בקרת המכשיר.
2. בצע רכישת נתונים על ידי ביצוע כל השלבים בסעיף 2.2 כאשר השיטה האופטימלית והמכוילת פתוחה.
3. הוסף שם קובץ מתאים ושמור את ספקטרום המסה האנליטי המכויל MALDI-ToF להמשך ניתוח.
הסר את לוחית המטרה MALDI-ToF MS עם תוכנת בקרת המכשיר. נקה את לוחית המטרה MALDI-ToF MS

figure-protocol-1
איור 1: עץ החלטות עבור אופטימיזציה של שיטת המכשיר. מדריך זה נועד לסייע למשתמשים מתחילים באופטימיזציה שיטתית של פרמטרים של שיטת מכשירים. התחל עם הגדרות ברירת מחדל או הגדרות ראשוניות והתאם פרמטר אחד בכל פעם על ידי הגדלה או הקטנה בהתבסס על שיפורים שנצפו. לאחר מכן, המשיכו בכיוון המשפר (1) את עוצמת השיא, (2) את איכות הבסיס (רעש נמוך), ו-(3) מספק רזולוציית שיא ואיזוטופית צרה. גישה זו מסייעת בזיהוי תנאים אופטימליים לספקטרום אמין ואיכותי. אם דגימת הפולימר אינה מייננת או מייצרת ספקטרום שמיש במצב רפלקטור, עבור למצב ליניארי והשתמש באותו עץ החלטות כדי לייעל פרמטרים. שימו לב שמצב ליניארי מביא לרוב לפסגות רחבות יותר ולרזולוציה איזוטופית מוגבלת או ללא רזולוציה, אך הוא יכול להיות יעיל עבור פולימרים בעלי מסה גבוהה יותר או פולימרים שעלולים לאבד יינון במצב רפלקטור. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

3. ניתוח ופרשנות נתונים

פתח את תוכנת ניתוח הנתונים MALDI-ToF MS וטען את ספקטרום דגימת הניתוח MALDI-ToF MS.
בחר את שיטת העיבוד הנכונה של MALDI-ToF MS עבור דגימות האנליט. כאן, לכל הדגימות הייתה רזולוציה איזוטופית, והשיא הראשון נבחר עבור כל הפסגות עם שיטת העיבוד MALDI-ToF MS שנבחרה.
הערה: ניתן להתאים את פרמטרי העיבוד של MALDI-ToF MS עבור דגימות פולימר סינתטי. לדוגמה, שיטת עיבוד MALDI-ToF MS לפולימרים פותחה במהלך הכשרה טכנית על ידי טכנאי מכשירים MALDI-ToF MS. שיטת עיבוד מסה ממוצעת של MALDI-ToF MS נוצרה על ידי Payne et al. עבור יישומים ספציפיים¹⁶. צור קשר עם הצוות הטכני של יצרן הפולימרים MALDI-ToF MS לקבלת מידע וייעוץ לגבי עריכת שיטת העיבוד MALDI-ToF MS.
מצא פסגות באמצעות תוכנת הניתוח MALDI-ToF MS.
להשוות את מסת הפולימר התיאורטית והניסויית
1. רשום את מסת הפולימר התיאורטית. צייר את מבנה המקרומולקולות הצפוי, כולל הקטיון, בתוכנת ציור כימית. פתח את חלון הניתוח בתוכנת השרטוט הכימי ורשום את המסה התיאורטית.
  1. מקרומולקולות מונודיספרס: רשום את המסה והמשקל המולקולרי המדויקים של המקרומולקולה על ידי בחירת המבנה והקטיון יחד.
  2. פולימרים נמוכים, בינוניים ומפוזרים מאוד: עבור מסת יחידת חזרה, בחר את עמוד השדרה של הפולימר רק כדי לתעד את מסת יחידת החזרה. עבור המסה הכוללת של n-mer שצוין, הגדר את מספר היחידה החוזרת למסה בתוך טווח הספקטרום MALDI-ToF MS המוצג בתוכנת הניתוח MALDI-ToF MS. בחר את כל מבנה הפולימר, כולל קבוצות הקטיון והקצה, כדי לרשום את המסה של n-mer שצוין.
2. השווה את המסה התיאורטית המתועדת עם המסה הנצפית מספקטרום MALDI-ToF MS
  1. לחישוב מסה כוללת של מקרומולקולות מונודיספרס, בצע את השלבים המתוארים להלן.
    1. התקרב לשיא בעוצמה הגבוהה ביותר בספקטרום MALDI-ToF MS, וודא שהתצוגה כוללת טווח מסה של לפחות פי 2 מתחת ומעל המסה התיאורטית.
    2. השווה את המסה התיאורטית עם המסה הנצפית בספקטרום המסה MALDI-ToF. אם ההבדל הוא פחות מ-0.100 Da, סביר להניח שהמסה המקרומולקולית החד-דיספרסית הצפויה מדויקת.
    3. בדוק את ספקטרום MALDI-ToF MS עבור שיאים נוספים שיכולים להצביע על נוכחות של מבנים בלתי צפויים.
    4. אם מתגלים אי התאמות, הערך שינויים מבניים פוטנציאליים. סקור את תוכנית התגובה וחשב את המסות של מבנים חלופיים להשוואה.
  2. לחישוב חוזר של מסת יחידה של פולימרים נמוכים, בינוניים ומפוזרים מאוד, בצע את השלבים המתוארים להלן.
    1. בחר והתקרב לשתי פסגות המופרדות על ידי מסת יחידת החזרה בספקטרום MALDI-ToF MS המציגות את העוצמה הגבוהה ביותר.
    2. עבור כל זוג פסגות סמוכות, הפחיתו את המסה הנצפית של שיא המסה הגבוה משיא המסה הנמוכה יותר כדי לחשב את מסת היחידה החוזרת. חזור על תהליך זה עבור קבוצת הפסגות הבאה כדי לאשר את עקביות מסת היחידה החוזרת.
    3. השווה את מסת יחידת החזרה המחושבת עם מסת יחידת החזרה התיאורטית. אם הערכים הנצפים והתיאורטיים תואמים ומציגים הבדלי מסה עקביים, סביר להניח שמסת יחידת החזרה של הפולימר נכונה.
  3. עבור המסה הכוללת של n-mer שצוין של פולימרים נמוכים, בינוניים ומפוזרים מאוד, בצע את השלבים המתוארים להלן.
    1. התקרב לשיא בספקטרום המסה MALDI-ToF המתאים למסה הכוללת התיאורטית, כמו גם שיאים של יחידת חזרה אחת מעל ומתחת.
    2. השווה את המסה התיאורטית עם המסה הנצפית בספקטרום המסה MALDI-ToF. אם ההפרש קטן מ-0.100 Da, סביר להניח שקבוצות הקצה הצפויות מדויקות.
    3. בדוק את ספקטרום המסה של MALDI-ToF לאיתור שיאים נוספים שיכולים להצביע על מבנים בלתי צפויים.
    4. אם מזוהים אי התאמות, הערך קבוצות קצה חלופיות או וריאציות מבניות. סקור את תוכנית התגובה וחשב את המסות עבור קבוצות קצה חלופיות פוטנציאליות או מבנים מחזוריים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוגמה 1: טריס מונודיספרסי [G1](OH)₆
דור 1 של דנדרימר מונודיסטרי המורכב מליבת פרופאן 1,1,1-tris(hydroxymethyl)propane עם שלוש חומצה ביס(הידרוקסימתיל)פרופיונית מוגנת בנזילידן בפריפריה (Tris[G1]Bnz₃) הגיב עם Pd/C וגז H₂ במתנול:כלורופורם 1:1 כדי להסיר את קבוצות הבנזילידן והביא לדנדרמר עם 6 קבוצות הידרוקסיל ליצירת Tris[G1](OH)₆(איור 2A).

Tris[G1](OH)₆נותח באמצעות NaTFA כחומר הקטיון עם CHCA כמטריצה. נעשה שימוש ב-CHCA מכיוון שהוא יעיל מאוד עם תרכובות קוטביות ומקיים אינטראקציה עם קבוצות הידרוקסיל של Tris[G1](OH)₆ כדי לספק שכבה הומוגנית על לוחית המטרה. הכנת דגימת MALDI-ToF MS החלה על ידי הכנת תמיסות מלאי של NaTFA (1 מ"ג/מ"ל ב-THF), האנליט (5 מ"ג/מ"ל ב-THF) ו-CHCA (5 מ"ג/מ"ל ב-THF). לאחר יצירת פתרונות אלה, 1 מיקרוליטר של תמיסת קטיון Na⁺ , 5 מיקרוליטר של תמיסת האנליט ו-20 מיקרוליטר של תמיסת המטריצה שולבו בצינור מיקרו-צנטריפוגה ומערבולת (יחס של 1:25:100 קטיון: אנליט: מטריצה בסך הכל 26 מ"ל). לאחר מכן, 1 מיקרוליטר מתערובת זו הוצא מצינור המיקרו-צנטריפוגה ויובש על לוחית המטרה MALDI-ToF MS. דגימה זו נותחה במצב רפלקטור, והשיא אושר בספקטרום MALDI-ToF MS על ידי השוואת הערכים התיאורטיים והנצפים (איור 2B, אדום).

figure-results-1
איור 2: (A) סכימת תגובה לשינוי דגימה 1 ל-Tris[G1](OH)₆. קבוצות הבנזילידן הוסרו בתגובת Pd/C ו-H₂ ליצירת Tris[G1](OH)₆. נעשה שימוש ב-MALDI-ToF MS כדי לקבוע את השלמת התגובה. (B) ספקטרום מסה MALDI-ToF של דגימה 1, Tris[G1](OH)₆ וספקטרום מטריצה ריק, שכלל את המטריצה והמלח ([CHCA + Na]⁺). ספקטרום ה-MALDI-ToF MS המלא והזום של Tris[G1](OH)₆מראה ערך מסה נצפה עבור [Tris[G1](OH)₆+ Na⁺]⁺ הוא 505.239 Da ויש לו הבדל של +0.013 Da מהמסה התיאורטית של 505.226 Da. על ידי השוואת ספקטרום המטריצה הריק MALDI-ToF MS (שחור) עם ספקטרום Tris[G1](OH)₆ MALDI-ToF MS (אדום), ניתן להתעלם מכל הפסגות מלבד 505.26 Da. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

נצפתה תוספת Na⁺ עבור Tris[G1](OH)₆. ערך המסה התיאורטי של [Tris[G1](OH)₆+ Na]⁺ מורכב מהמסה של השיא המונואיזוטופי של Tris[G1](OH)₆(482.2362 Da) בתוספת המסה של קטיון הנתרן (22.9892 Da) שמניב מסה כוללת של 505.226 Da. ערך המסה הנצפה עבור [Tris[G1](OH)₆+ Na]⁺ הוא 505.239 Da, שתאם את הערך התיאורטי בהפרש של +0.013 Da.

כדי להבטיח הסרה מלאה של כל שלוש קבוצות הבנזילידן, ספקטרום MALDI-ToF MS נותח עוד יותר בין 505-769 Da. טווח מסה זה מאפשר זיהוי של כל קבוצות היקפיות שלא זוהו. תהיה נוכחות של שיא, [Tris[G1]Bnz₂(OH)₂+ Na]⁺, שיצביע על כך שבנזילידן אחד הוסר ב-681.289 Da ([Tris[G1]Bnz₃+ Na]⁺ 769.3194 Da - 88.0313 Da), ובשיא של 593.257 Da ([Tris[G1]Bnz₃+ Na]⁺ 769.3194 Da -176.0626 Da) עבור [Tris[G1]Bnz₁(OH)₄+ Na]⁺ שיצביע על כך ששתי קבוצות בנזילידן הוסרו מ-Tris[G1]Bnz₃ (איור 3). פסגות אלה ו-Tris[G1]Bnz₃ אינם קיימים; לכן, התגובה הגיעה לסיומה ו-Tris[G1](OH)₆סונתזה.

figure-results-2
איור 3: מבנים ומסות תיאורטיות של Tris[G1]Bnz₃, חומרי הביניים של Tris[G1]Bnz₂(OH)₂, Tris[G1]Bnz₁(OH)₄, ודגימה 1 Tris[G1](OH)_6.הנקודה השחורה מציינת את המוצר. מבנים ומסות תיאורטיות של קבוצת בנזילידן אחת ושתי קבוצות בנזילידן הוסרו וה-Tris[G1](OH)₆ אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

באזור המשקל המולקולרי הנמוך מתחת ל-900, קיימות פסגות מרובות שאינן מתיישרות עם המסה החד-דיסטרית Tris[G1](OH)₆. לרוב המטריצות יש בעיות רעש קלות מתחת ל-1000, ולכן כלול ספקטרום MALDI-ToF MS ריק כדי לאשר ש-Tris[G1](OH)₆טהור. המדגם הריק של המטריצה כלל את פתרונות מלאי המטריצה (CHCA) והקטיון (Na⁺). אותו קטיון: כמויות יחס ריכוז מטריצה מ-Tris[G1]OH₆ (1:100 מ"ג/מ"ל) שימשו לתערובת דגימת הניתוח. לאחר מכן, 1 מיקרוליטר מהתערובת נוספה לצלחת הדגימה ויובשה לניתוח.

רכישת הנתונים הראשונית, רכישת הכיול ורכישת הנתונים הושלמו כדי לרכוש ספקטרום מטריצת MALDI-ToF MS ריק. באיור 2B (שחור), המטריצה הריקה MALDI-ToF MS (שחור) וספקטרום Tris[G1](OH)₆(אדום) הונחו בניתוח גמיש כדי להשוות ולאשר אילו פסגות אינן קשורות למוצר. ניתן להתעלם מכל הפסגות שזוהו בספקטרום המטריצה הריק MALDI-ToF MS וב-Tris[G1](OH)₆, ולכן השיא היחיד הוא 505.226 Da, המתאים לדגימה 2. לדוגמה, פסגות 445.016 Da ו-656.141 Da בספקטרום Tris[G1](OH)₆MALDI-ToF MS (איור 2B אדום) ממוקמות גם בספקטרום המטריצה הריק MALDI-ToF MS (איור 2B שחור) ב-445.017 Da ו-656.144 Da ויש להן הבדל של +0.001 Da ו-+0.003 Da, בהתאמה. פסגות אלו לא ייכללו בניתוח מכיוון שהן תואמות ויש להן הבדלים דומים מהמטריצה הריקה וספקטרום Tris[G1](OH)₆MALDI-ToF MS. לכן, המסה של Tris[G1](OH)₆מאושרת באמצעות MALDI-ToF MS אך יהיה צורך בניתוח אחר כגון SEC ו-NMR כדי לאשר את טוהר הדגימה.

דוגמה 2: פולי (2,2-דימתילפרופנואט) עם כלוריד וקבוצת קצה פרוטונים
חומצה 3-כלורו-2,2-דימתילפרופנואית עברה פולימור באמצעות אשלגן פחמתי כבסיס (איור 4A). דגימה של פולי (2,2-dimethylpropanoate) (PDMP) עם כלוריד בקצה אחד ופרוטון בקצה השני (M_n= 980 Da) יוננה עם MALDI-ToF MS כדי לקבוע את הארכיטקטורות הפולימריות שנוצרו במהלך התגובה ולנתח את קבוצות הקצה השונות. הכנת דגימת MALDI-ToF MS החלה על ידי הכנת תמיסות מלאי של NaTFA (2 מ"ג/מ"ל ב-THF), האנליט (5-7 מ"ג/מ"ל ב-THF) ו-DCTB (20 מ"ג/מ"ל ב-THF). לאחר יצירת פתרונות אלה, 5 מיקרוליטר של תמיסת קטיון Na⁺ , 5 מיקרוליטר של תמיסת האנליט ו-10 מיקרוליטר של תמיסת המטריצה שולבו בצינור מיקרו-צנטריפוגה ומערבולת (יחס של 10:25:200 קטיון: אנליט: מטריצה בסך הכל 20 מ"ל). לאחר מכן, 1 מיקרוליטר מתערובת זו הוצא מצינור המיקרו-צנטריפוגה ויובש על לוחית המטרה MALDI-ToF MS. עבור המטריצה, DCTB נבחר מכיוון שהוא עובד עם פוליאסטרים רבים אחרים, עם זאת, נוסו מטריצות אחרות כגון CHCA, HABA, GFR ו-DHB. CHCA, HABA ו-GFR ייננו היטב את הדגימה, אולם DHB הוכיח את עצמו כלא מוצלח. יון NaTFA עבד טוב יותר בהשוואה לאשלגן טריפלואורואצטט (KTFA), צזיום טריפלואורואצטט (CsTFA), ליתיום טריפלואורואצטט (LiTFA) וכסף טריפלואורואצטט (AgTFA) מכיוון שהוא מתקשר טוב יותר עם החמצנים של קבוצות האסטר.

ספקטרום MALDI-ToF MS (איור 4B) אישר את התפלגות המשקל המולקולרי של PDMP עם קבוצת קצה כלוריד עבור דגימה 3 בטווח שבין 600 Da ל-1600 Da. המשמעות היא שלדגימה היה פיזור נמוך, מה שהוביל לכך שערכי M_n, M_w ו-Đ היו 980 Da, 1070 Da ו-1.09, בהתאמה, באמצעות תוכנת ניתוח MALDI-Tof MS. השיא המונואיזוטופי נפתר מספיק במצב רפלקטרון, מה שאיפשר שימוש בזיהוי מסה מדויק.

figure-results-3
איור 4: סכמת תגובה וספקטרום מסה MALDI-ToF MS של מדגם 2. (A). תוכנית תגובה לסינתזה של PDMP באמצעות חומצה 3-כלורו-2,2-דימתילפרופנואית. (B) ספקטרום מסה MALDI-ToF MS של מדגם 2. ספקטרום MALDI-ToF MS מלא זה מציג את ההתפלגות הכוללת של הדגימה של PDMP עם קבוצת קצה כלוריד (M_n= 980 Da) מיוננת עם Na⁺. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

כדי לאשר את מסת יחידת החזרה של הפולימר, חושב הפרש המסה בין שתי פסגות סמוכות. ליחידת החזרה של הפולימר יש משקל מולקולרי ממוצע נצפה של 100.056 Da וזה אושר על ידי לקיחת המסה הממוצעת של שמונה פסגות (התפלגות עיקרית) בטווח של 600 Da עד 1300 Da, שהוא רק +0.004 Da מתחת ליחידה החוזרת התיאורטית של PDMP (100.052 Da) ובנוסף, יש לו מסה של קבוצת קצה המתאימה למימן אחד (בקצה הקדמי) וכלוריד אחד (מאחור סוף).

ספקטרום MALDI-ToF MS חשף שלוש התפלגויות נפרדות, כל אחת מתאימה לפולימר שנוצר עם קבוצות קצה שונות. קבוצות קצה אלו זוהו ואושרו על ידי חישוב המסות התיאורטיות שלהן והשוואתם למסות הנצפות בספקטרום MALDI-ToF MS. כדי לזהות עוד יותר את קבוצות הקצה, נבחר n-mer בודד לניתוח (איור 5).

ההתפלגות העיקרית של PDMP הראתה שלפולימר יש מימן אחד (בקצה הקדמי) וכלוריד אחד (בקצה האחורי; כחול). ערך המסה התיאורטי של 8-mer של PDMP (איור 5) מורכב מהמסה של היחידות החוזרות (100.0524 Da x 8) בתוספת המסה של קבוצת הקצה Cl (+ 34.9689 Da) והמסה של קבוצת קצה המימן (+ 1.0078 Da) בתוספת המסה של קטיון הנתרן (+ 22.9892 Da) שמניבה מסה כוללת של 8-mer של 859.385 Da. ערך המסה הנצפה עבור 8-mer [H-PDMP_8-Cl + Na]⁺ הוא 859.426 Da, שהוא רק +0.041 Da שונה מהערך התיאורטי.

ההתפלגות הבאה (כתום) הראתה את הפולימר מחליף את הפרוטון בקצה הקדמי בנתרן וכלוריד בקצה האחורי. ערך המסה התיאורטי של ה-8-mer של ה-PDMP המנוטרל מורכב מהמסה של היחידות החוזרות (100.0524 Da x 8) בתוספת המסה של קבוצת הקצה Cl (+ 34.9689 Da) והמסה של שתי קבוצות נתרן (+ (22.9892 Da x 2)) שמניבה מסה כוללת של 8-mer של 881.367 Da. ערך המסה הנצפה עבור 8-mer [Na-PDMP_8-Cl + Na]⁺ הוא 881.413 Da, שהוא רק +0.046 Da שונה מהערך התיאורטי.

לבסוף, התפוצה השלישית (ירוקה) של PDMP אישרה את נוכחותם של מינים אוליגומריים מחזוריים. ערך המסה התיאורטי של 8-mer של PDMP מחזורי מורכב מהמסה של היחידות החוזרות (100.0524 Da × 8) בתוספת המסה של קבוצת נתרן אחת (+ 22.9892 Da), מה שמניב מסה כוללת של 8-mer של 823.409 Da. ערך המסה הנצפה עבור 8-mer המחזורי [PDMP8 + Na]+ הוא 823.448 Da, שהוא רק +0.039 Da שונה מהערך התיאורטי.

ניתן לזהות נוכחות של הלוגנים על הפולימר על ידי MALDI-ToF MS. לקבוצת הקצה על הפולימר הליניארי יש Cl אחד, המסומן על ידי יחס של כ-3:1 של פסגות [M⁺] ו-[M+2]⁺ . ההבדל בין הפסגות הנצפות והתיאורטיות [M⁺] ו-[M+2]⁺ הוצג בטבלה 1. אחוז השפע התיאורטי והנצפה עבור השיא השני ב-761.3 Da [M+2]⁺ הם 42.3% ו-42.2%, בהתאמה (כאשר השיא הראשון הוא 100%), מה שמאשר את נוכחותה של קבוצת Cl אחת בקבוצת הקצה הפולימרית. המין המחזורי נמצא כ-36 Da מתחת לתרכובת הסודית הליניארית, ו-58 Da מתחת לתרכובת המנותקת. בנוסף, לתרכובת המחזורית הזו לא היה יחס של 3:1 שיש למין מונוכלורי. כלוריד זה יכול היה להיות מוסר באמצעות התקפת_{S N}2 עם הקרבוקסילט בקצה הנגדי, מה שהוביל לסגירת הטבעת.

figure-results-4
איור 5: ספקטרום מסה MALDI-ToF MS של חזרה בודדת של דגימה 2. ספקטרום MALDI-ToF MS זה מציג את השיא העיקרי כ-PDMP עם קבוצות קצה מימן וכלוריד (M_n= 980 Da) מיוננות עם Na⁺. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: השוואה בין אחוז השיא הנצפה והתיאורטי של השפע והעוצמה האיזוטופית השיא של [M⁺] ו-[M+2]⁺ (עם [M⁺] = 100%) של ה-PDMP הליניארי עם קבוצת הקצה של מימן וכלוריד (M_n= 980 Da) מ-MALDI-ToF MS. לקבוצת הקצה על הפולימר הליניארי יש Cl אחד המעיד על יחס של כ-3:1 של פסגות [M⁺] ו-[M+2]⁺ . אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

דוגמה 3: פולי (2,2-דימתילפרופנואט) עם קבוצות קצה אמוניום ופרוטון רבעוניות.
חומצה 3-Bromo-2,2-dimethylpropanoic עברה פולימור באמצעות טריאתילאמין (TEA) כבסיס, אולם נקבע ש-TEA מחליף את Br בקבוצת הקצה (איור 6A). דגימה של PDMP עם אמוניום רבעוני בצד אחד ופרוטון בצד השני (M_n= 1410 Da) שימשה להשוואת ההתפלגות האיזוטופית עם אלה שיש להם קבוצת קצה Cl. הכנת דגימת MALDI-ToF MS החלה על ידי הכנת תמיסות מלאי של KTFA (2 מ"ג/מ"ל ב-THF), האנליט (5-7 מ"ג/מ"ל ב-THF) ו-DCTB (20 מ"ג/מ"ל ב-THF). לאחר יצירת פתרונות אלה, 5 מיקרוליטר של תמיסת קטיון K⁺ , 5 מיקרוליטר של תמיסת האנליט ו-10 מיקרוליטר של תמיסת המטריצה שולבו בצינור מיקרו-צנטריפוגה ומערבולת (יחס של 10:25:200 קטיון: אנליט: מטריצה בסך הכל 20 מ"ל). לאחר מכן, 1 מיקרוליטר מתערובת זו הוצא מצינור המיקרו-צנטריפוגה ויובש על לוחית המטרה MALDI-ToF MS. עבור המטריצה, DCTB נבחר מכיוון שהוא עובד עם פוליאסטרים רבים אחרים. קטיון האשלגן נוסף כדי לאשר אם הדגימה מייננת את עצמה.

הפולימר מכיל חנקן רבעוני (טעון חיובי) בקבוצת הקצה, שיכול ליינן את עצמו. זה אושר על ידי ספקטרום MALDI-ToF MS מכיוון שיחס המסה למטען (m/z) לא השתנה ללא קשר אם נעשה שימוש ב-K⁺ או Na⁺ בהכנת הדגימה. בנוסף, ספקטרום MALDI-ToF MS אישר את נוכחותו של אמוניום רבעוני טעון חיובי בקבוצת הקצה, מכיוון ש-Br היא קבוצת יציאה טובה.

ספקטרום MALDI-ToF MS אישר את התפלגות המשקל המולקולרי של PDMP עם קבוצת קצה אמוניום רבעונית בטווח שבין 600 Da ל-2200 Da (איור 6B). המשמעות היא שלדגימה היה פיזור נמוך, מה שהוביל לכך שערכי M_n, M_w ו-Đ היו 1410 Da, 1540 Da ו-1.08, בהתאמה באמצעות תוכנת הניתוח MALDI-Tof MS.

figure-results-5
איור 6: סכימת תגובה וספקטרום מסה MALDI-ToF MS של מדגם 3. (א) סכימת תגובה עבור מדגם 3. תוכנית תגובה לסינתזה של PDMP באמצעות חומצה 3-ברומו 2,2-דימתילפרופנואית עם טריאתילאמין כבסיס. (B) ספקטרום MALDI-ToF MS המלא הזה מראה את ההתפלגות הכוללת של ה-PDMP הליניארי עם קבוצת קצה אמוניום רבעונית (M_n= 1410 Da). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

כדי לאשר אם לפולימר הייתה אותה יחידת חזרה (מונומר), חושב ההפרש בין שתי פסגות סמוכות. ליחידת החזרה של הפולימר יש משקל מולקולרי ממוצע שנצפה של 100.0535 Da. זה אושר על ידי התבוננות בממוצע של שתים עשרה פסגות (התפלגות ראשית), שנע בין 900 Da ל-2300 Da, שהם רק +0.0011 Da מעל יחידת החזרה התיאורטית (100.0524 Da).

ספקטרום MALDI-ToF MS הציג שתי התפלגויות שונות. אחת ההתפלגויות הראתה שלפולימר יש חומצה קרבוקסילית ואמוניום רבעוני טעון חיובי כקבוצות הקצה (שחור), בעוד שההתפלגות השנייה (סגול) הראתה אובדן פרוטון מהחומצה הקרבוקסילית ותוספת של יון אשלגן. כדי לזהות עוד יותר את קבוצות הקצה, נבחר n-mer בודד לניתוח (איור 7).

ערך המסה התיאורטי של 12-mer של PDMP עם קבוצת קצה אמוניום רבעונית מורכב מהמסה של היחידות החוזרות (100.0524 x 12) בתוספת המסה של קבוצת קצה האמוניום הרביעונית (+ 101.1199) והמסה של קבוצת קצה המימן (+ 1.0078) שמניבה מסה כוללת של 12-mer של 1302.757 Da. ערך המסה הנצפה עבור 12-mer [H-PDMP_12-TEA]⁺הוא 1302.730 Da, שהוא רק -0.027 Da מתחת לערך התיאורטי.

ערך המסה התיאורטי של 12-mer של PDMP עם קבוצת קצה אמוניום רבעונית בצד אחד והחלפת הפרוטון ביון אשלגן אחר מורכב מהמסה של היחידות החוזרות (100.0524 × 12) בתוספת המסה של קבוצת קצה האמוניום הרבעונית (+ 101.1199) והמסה של קבוצת קצה האשלגן (+ 38.9637) שמניבה מסה כוללת של 12-mer של 1340.713 Da. ערך המסה הנצפה עבור 12-mer [K-PDMP_12-TEA]⁺ הוא 1340.700 Da, שהוא רק -0.013 Da מתחת לערך התיאורטי.

figure-results-6
איור 7: ספקטרום מסה MALDI-ToF MS של חזרה בודדת של דגימה 3. ספקטרום MALDI-ToF MS זה מציג את ההתפלגות העיקרית של ה-PDMP הליניארי עם קבוצת קצה אמוניום רבעונית (M_n= 1410 Da). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דוגמה 4: פולי ליניארי (אתילן ברסילט)
דגימת הפולימר הבאה המאופיינת ב-MALDI-ToF MS היא פולי ליניארי (אתילן ברסילט) (l-PEB). זה סונתז מהמונומר המקרוציקלי אתילן ברסילט, שיש לו טבעת בת שבעה עשר איברים המכילה שתי קבוצות אסטר (איור 8A). כדי להבין את הקבוצה הפונקציונלית והשינוי הארכיטקטוני בתוך המבנה הפולימרי, נחקרו ארבע טכניקות אפיון שונות: MALDI-ToF MS, ¹H-NMR, SEC וספקטרוסקופיה אינפרא אדום טרנספורמציה פורייה (FTIR). ¹H-NMR, SEC ו-FTIR מאשרים את הסרת הדיסטר המחזורי והיווצרות α-פרופרגיל-ω-הידרוקסי-PEB. עם זאת, טכניקות אלה לא זיהו שום סוג של היווצרות תוצרי לוואי. מצד שני, ספקטרום MALDI-ToF MS (איור 8B) של l-PEB מציג שלוש התפלגויות מסה שונות המצביעות על היווצרותם של שלושה PEBs שונים: α-hydroxy-ω-hydroxy-PEB (1), α-propargyl-ω-propargyl-PEB (2) ו-α-propargyl-ω-hydroxy-PEB (3), בהתאמה (איור 8B).

figure-results-7
איור 8: ספקטרום MALDI-TOF של l-PEBs עם Na⁺. (A) מבני פולי ליניארי (אתילן ברסילט). (1) α-הידרוקסי-ω-הידרוקסי-PEB (2) α-פרופרגיל-ω-פרופרגיל-PEB (3) α-פרופרגיל-ω-הידרוקסי-PEB. (B) זוהו שלוש התפלגויות, כולל α-hydroxy-ω-hydroxy-PEB (1), α-propargyl-ω-propargyl-PEB (2) ו-α-propargyl-ω-hydroxy-PEB (3). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דגימת ה-l-PEB נותחה על MALDI-ToF MS על ידי שימוש ב-DCTB כמטריצה לפולימרים לא קוטביים. הכנת דגימת MALDI-ToF MS החלה על ידי הכנת תמיסות מלאי של NaTFA (1 מ"ג/מ"ל ב-THF), האנליט (5 מ"ג/מ"ל ב-THF) ו-DCTB (20 מ"ג/מ"ל ב-THF). לאחר יצירת פתרונות אלה, 1 מיקרוליטר של תמיסת קטיון Na⁺ , 5 מיקרוליטר של תמיסת האנליט ו-20 מיקרוליטר של (4) תמיסת המטריצה שולבו בצינור מיקרו-צנטריפוגה ומערבולת (יחס של 1:25:400 קטיון: אנליט: מטריצה בסך הכל 26 מ"ל). לאחר מכן, 1 מיקרוליטר מתערובת זו הוצא מצינור המיקרו-צנטריפוגה ויובש על לוחית המטרה MALDI-ToF MS. ה-MWs שנצפו עבור כל התפלגות היו בסטייה של 0.03 Da מהמשקלים המולקולריים המדויקים של היונים [M + Na]⁺ .

ערך המסה התיאורטי עבור 6-mer של α-hydroxy-ω-hydroxy-PEB (1) מורכב מהמסה של היחידות החוזרות (270.1831 Da x 6), בתוספת המסה של קבוצת הקצה 2-hydroxyethoxy (+ 61.0290 Da), בתוספת המסה של קבוצת קצה המימן (+ 1.008 Da), בתוספת קטיון נתרן (+ 22.9892 Da) שמניב בסך הכל 1706.124 Da. ערך המסה הנצפה עבור 6-mer של α-hydroxy-ω-hydroxy-PEB (1) הוא 1706.133 Da, שהיה רק +0.009 Da מעל הערך התיאורטי.

ערך המסה התיאורטי עבור 5-mer של α-propargyl-ω-propargyl-PEB (2) מורכב מהמסה של היחידות החוזרות (270.1831 Da x 5), בתוספת המסה של אתילן ברסילט מינוס OCH₂CH₂O (+ 210.1620 Da), בתוספת המסה של שתי קבוצות קצה אתר פרופרגיל (+ 55.0184 Da x 2), בתוספת קטיון נתרן (+ 22.9892 Da) שמניב סך של 1694.103 Da. ערך המסה הנצפה עבור 5-mer של α-propargyl-ω-propargyl-PEB (2) הוא 1694.127 Da, שהיה רק +0.024 Da מעל הערך התיאורטי.

ערך המסה התיאורטי עבור 6-mer של α-propargyl-ω-hydroxy-PEB (3) מורכב מהמסה של היחידות החוזרות (270.1831 Da x 6), בתוספת המסה של קבוצת הקצה של אתר פרופרגיל (+ 55.0184 Da), בתוספת המסה של קבוצת קצה המימן (+ 1.008 Da), בתוספת קטיון נתרן (+ 22.9892 Da) שמניב בסך הכל 1700.113 Da. ערך המסה הנצפה עבור 6-mer של α-propargyl-ω-hydroxy-PEB (3) הוא 1700.139 Da, שהיה רק +0.026 מעל הערך התיאורטי.

מדגם 5: פולי ליניארי אזידיד (אתילן ברסילט)
יתר על כן, I-PEB (מדגם 6) תופקד עם חומצה 6-azidohexanoic באמצעות אסטריפיקציה של קבוצות הקצה של האלכוהול שלה (איור 9), מה שהניב l-PEB אזידיפיקציה (מדגם 7). המוצר שהתקבל נותח גם על MALDI-ToF MS (איור 10) על ידי שימוש בטכניקות הכנת הדגימה כפולימר האב (מדגם 6). ה-MWs שנצפו עבור כל התפלגות היו בסטייה של 0.04 Da מהמשקלים המולקולריים המדויקים של היונים [M + Na]⁺. לאחר האסטריפיקציה, יוני [M + Na]⁺ של l-PEBs עם שתי קבוצות קצה הידרוקסיות (1) מראים שינוי במסה בגלל ההמרה שלהם מ-(1) ל-α-azido-ω-azido-PEB (4). בנוסף, l-PEBs עם קבוצת קצה הידרוקסית אחת וקבוצת קצה פרופרגיל אחת (3) הומרו ל-α-propargyl-ω-azido-PEB (5). עם זאת, (2) נותר ללא תגובה עקב שתי קבוצות הקצה של האלקין שלו.

figure-results-8
איור 9: אסטריפיקציה של פולי ליניארי (אתילן ברסילט) עם קבוצת קצה אלכוהול באמצעות סכימת תגובה של חומצה 6-azidohexanoic. α-hydroxy-ω-hydroxy-PEB (1) ממיר ל-α-azido-ω-azido-PEB (4) ו-α-propargyl-ω-hydroxy-PEB ממיר (3) ל-α-propargyl-ω-azido-PEB (5). α-propargyl-ω-propargyl-PEB (2) נותר ללא תגובה עקב קבוצות הקצה של אלקין שאינן עוברות תגובת אסטריפיקציה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ערך המסה התיאורטי עבור 6-mer של α-propargyl-ω-azido-PEB (5) מורכב מהמסה של היחידות החוזרות (270.1831 Da × 6), בתוספת המסה של קבוצת הקצה של אתר הפרופרגיל (+ 55.0184 Da), בתוספת המסה של קבוצת הקצה של azidohexanoate (+ 140.0824 Da), בתוספת קטיון נתרן (+ 22.9892 Da) שמניב בסך הכל 1839.188 Da. ערך המסה הנצפה עבור 6-mer של α-propargyl-ω-azido-PEB (5) הוא 1839.184 Da, שהוא רק -0.004 Da מתחת לערך התיאורטי. יתר על כן, נוכחותם של שיאים של יון מטה-יציב (5-N₂) עבור (5) היא אינדיקציה נוספת לתפקוד אזיד, שכן יונים מטה-יציבים ייווצרו רק אם קיים אזיד במולקולה.

ערך המסה התיאורטי עבור 6-mer של השיא המטא-יציב (5-N₂ + Na⁺) הוא 1815.126 Da, אשר נקבע על ידי שימוש במשוואה מהתרשים של הפרש המסה של שיא מטה-יציב ופסגות α-azido-ω-hydroxy-PEG (איור 11). ערך המסה הנצפה עבור 6-mer של השיא המטא-יציב הוא 1815.089 Da, שהוא רק -0.031 Da מתחת לערך התיאורטי. התרשים מצביע על כך שבתוך טווח המסה של 1000 עד 2000 Da, ערך המסה התיאורטי של השיא המטא-יציב נמוך ב-24 עד 24.1 Da מזה של (5).

ערך המסה התיאורטי עבור 6-mer של α-azido-ω-azido-PEB (4) מורכב מהמסה של היחידות החוזרות (270.1831 Da × 6), בתוספת המסה של קבוצת הקצה 6-azidohexanoate (+ 140.0824 Da), בתוספת המסה של קבוצת הקצה 2-oxyethyl-6-azidohexanoate (+ 200.1035 Da), בתוספת קטיון נתרן (+ 22.9892 Da) שמניב סך של 1994.273 Da. ערך המסה הנצפה עבור 6-mer של α-azido-ω-azido-PEB (4) הוא 1994.296 Da, שהוא +0.023 Da מעל הערך התיאורטי.

figure-results-9
איור 10: ספקטרום MALDI-ToF של l-PEBs אזידיים עם Na⁺. אלה כוללים שלוש התפלגויות של α-propargyl-ω-propargyl-PEB (2), α-azido-ω-azido-PEB (4) ו-α-propargyl-ω-azido-PEB (5). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-10
איור 11: איור גרפי של הפרש המסה בין α-azido-ω-hydroxy-PEG והתרכובת המטא-יציבה שלו ביחס למסה של α-azido-ω-hydroxy-PEG (מסה ממוצעת 1700 Da). גרף זה נגזר מספקטרום MALDI-ToF של α-azido-ω-hydroxy-PEG. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דוגמה 6: פולימר מסרק מפוזר רחב
תוכנית התגובה הסופית היא פולימר מסרק בעל יחידות חוזרות של תיואתר עם שרשראות צד פולי (אתילן גליקול)⁹. דגימת פולימר המסרק עשויה מ-400 M_n מתיל אתר-PEG-propargyl ו-1,6-hexanedithiol (CP MeO-PEG-400 HDT; איור 12A) נותח באמצעות NaTFA. נתרן נבחר כיון הנגד מכיוון שאתרים ותיואתרים מייננים בקלות רבה יותר עם נתרן, ליתיום ואשלגן מאשר מתכות אדמה אלקליות גבוהות יותר כמו צזיום. דגימות אלה הופעלו עם מטריצה לא קוטבית, DCTB, אם כי מטריצות נוספות (CHCA ו-DT) נבדקו גם הן עם תוצאות גרועות. הכנת דגימת MALDI-ToF MS החלה על ידי הכנת תמיסות מלאי של NaTFA (1 מ"ג/מ"ל ב-THF), האנליט (5 מ"ג/מ"ל ב-THF) ו-DCTB (20 מ"ג/מ"ל ב-THF). לאחר יצירת פתרונות אלה, 1 מ"ל של תמיסת הקטיון, 5 מ"ל של תמיסת האנליט ו-20 מ"ל של תמיסת המטריצה שולבו בצינור מיקרו-צנטריפוגה ומערבולת (יחס של 1:25:400 קטיון: אנליט: מטריצה בסך הכל 26 מ"ל). לאחר מכן, 1 מ"ל מתערובת זו הוצא מצינור המיקרו-צנטריפוגה ויובש על לוחית המטרה MALDI-ToF MS. מכיוון ש-NaTFA נוסף לדגימה כיון נגד, ספקטרום המסה MALDI-ToF MS הציג את תוספות ה-Na⁺ הצפויות של הדגימה הידועה. בנוסף, נצפו גם עליות של כ-16 Da, 32 Da ו-48 Da מעל פסגות אלה ונדון בהמשך מאמר זה.

figure-results-11
איור 12: סכימת תגובה עבור מדגם 6 וספקטרום מסה MALDI-ToF של דגימה 6 (A) מבנה כימי ותנאי תגובה של פולימר מסרק מבוסס דיתיול-יין עם מספר מרווחי HDT ושרשראות צד 400 M_n PEG. (B) ספקטרום מסה MALDI-ToF של מדגם 6, CP MeO-PEG-400 HDT. יחידת חזרה מז'ור = 550.30 Da, יחידת חזרה מינורית = 44.02 Da אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

MALDI-ToF MS אישר את ההתפלגות הרחבה (פיזור לפי SEC = 2.88; איור 12B) של CP MeO-PEG-400 HDT. השיא המונואיזוטופי (הכולל אך ורק את האיזוטופים היסודיים הנפוצים ביותר, כלומר ¹²C, ¹H, ¹⁶O ^ו-32S) נפתר מספיק, מה שאיפשר שימוש בזיהוי מסה מדויק. כל חישובי המסה התיאורטיים נקבעו באמצעות מסות מונואיזוטופיות עבור כל יסוד. בשל הפיזור הרחב של הדגימה (2.88 על ידי SEC), לא ניתן היה להשתמש בספקטרום המסה MALDI-ToF כדי לחשב את M_n, M_w או Đ. MALDI-ToF MS מצטיין באפיון של פולימרים בפיזור צר (Đ < 1.3) אך יכול להיאבק באפיון מלא של פולימרים בפיזור רחב. כאשר מתארים פולימרים עם פיזור רחב, רק קצה המשקל המולקולרי הנמוך יותר של ספקטרום המסה יהיה פתור היטב ונראה עם MALDI-ToF MS, למעט מינים בעלי משקל מולקולרי גבוה יותר. תופעה זו מכונה הטיית מסה נמוכה. בשל התרחשות זו, לא ניתן להשיג אפיון מלא של פולימרי המסרק באמצעות MALDI-ToF MS בלבד. מסיבה זו, נעשה שימוש ב-SEC במקביל ל-MALDI-ToF MS כדי לקבל ערכי M_n, M_w ו-Đ מדויקים.

כדי לאשר את נוכחותו של פולימר המסרק, ננקטה גישה דומה לפולימר ליניארי או מחזורי סטנדרטי. כל יחידת חזרה של פולימר המסרק מכילה התפלגות צרה של שרשראות צד M_n = 400 PEG, ולכן יחידות החזרה של פולימר המסרק נחקרו כדי לקבוע את נוכחות המוצר המיועד בכל אחת מהן. בנוסף, נותרה כמות קטנה של חומר מוצא מהפילמור בתמיסת הריאקציה (300-700 Da) שאופיינה גם היא.

בספקטרום המלא של MALDI-ToF MS, ניתן לראות את ה-MW הנמוך והגבוה יותר עבור 6 עד 15 מעלות של ה-MeO-PEG-OH. במקור, בספקטרום MALDI-ToF MS של חומר ההתחלה MeO-PEG-propargyl, MeO-PEG-OH אלה לא נראו (איור 13; ספקטרום עליון). הופעת הפסגות הללו נובעת מהריכוז היחסי של ה-MeO-PEG-propargyl ל-MeO-PEG-OH. ככל שתגובת פולימר המסרק מתקדמת, ה-MeO-PEG-propargyl משולב במוצר. בגלל זה, היחס בין חומר ההתחלה של אלקין בהשוואה ל-MeO-PEG-OH מתחיל לרדת, מה שמראה MeO-PEG-OH לא פונקציונלי בספקטרום MALDI-ToF MS (איור 13; ספקטרום תחתון).

באשר להתפלגות מסת המוצר, נעשה שימוש בערכי מסה מדויקים לכל החישובים הבאים. ערך המסה התיאורטי של יחידת חזרה אחת של חומר המוצא [MeO-(PEG₁₀)-CH₂CCH + Na]⁺ הוא 44.0262 Da. מסת יחידה חוזרת זו כפול מספר יחידות החזרה, שיהיה 10 עבור כל שרשרת צד, (44.0262 Da x 10) בתוספת המסה של קבוצת הקצה α-מתוקסי (+ 31.0183 Da) והמסה של קבוצת הקצה ω-propargyl (+ 39.0235 Da) בתוספת מסת קטיון הנתרן (+ 22.9892 Da) מניבה מסה כוללת של 10-mer של 533.2932 Da. ערך המסה הנצפה עבור PEG + Na⁺ 10-mer הוא 533.239 Da, שהוא -0.054 Da מתחת לערך התיאורטי (איור 13). בספקטרום המלא של MALDI-ToF MS, יש את ה-6 עד 9-mer למטה ואת ה-11 עד 15-mer למעלה עבור סדרה זו. רצף הפסגות הקטנות יותר והאופסט בספקטרום המשקל המולקולרי הנמוך מתאים לחומר ההתחלתי MeO-PEG-OH הלא פונקציונלי שבו ערך המסה התיאורטי של ה-11-mer מורכב מהמסה של יחידות החזרה (44.0262 Da x 11) בתוספת המסה של קבוצת הקצה α-מתוקסי (+ 31.0184 Da) והמסה של קבוצת הקצה ω-מימן (+ 1.008 Da) והמסה של קטיון הנתרן (+ 22.9892 Da) שמניבה סך הכל 11-mer מסה של 539.304. ערך המסה הנצפה עבור 11-mer + Na⁺ הוא 539.252 Da, שהוא רק -0.052 Da מתחת לערך התיאורטי.

figure-results-12
איור 13: ספקטרום מסה MALDI-ToF (מוגדל מ-530-615 Da) של חומר מוצא (למעלה) ומיני משקל מולקולרי נמוך של דגימה 8 (למטה), CP MeO-PEG-400 HDT. היחס בין חומר ההתחלה של אלקין בהשוואה ל-MeO-PEG-OH (ספקטרום עליון ואדום) מתחיל לרדת, מה שמראה MeO-PEG-OH (ספקטרום תחתון וכחול) לא פונקציונלי בספקטרום המסה CP MeO-PEG-400 HDT MALDI-ToF (ספקטרום תחתון). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

באשר לפולימרי המסרק המחזוריים, ניתן להכפיל את המסות שלהם בדרגות פילמור שונות בחלקים הבודדים של ה-n-mer הרצוי. ערך המסה התיאורטי של ה-2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺ מורכב מהמסה של היחידות החוזרות של כל שרשרת PEG, מתוכן יש בערך 8 לכל שרשרת, (44.0262 Da x 16) בתוספת המסה של קבוצות קצה המתיל הסופיות של כל שרשרת PEG (+ 15.0235 Da x 2) בתוספת מסת הפחמנים שהיו פעם קבוצת הפרופרגיל וכעת הגיבו עם התיולים (+ 41.0391 Da x 2) בתוספת המסה של ה-HDT שהגיבה עם האלקינים (+ 148.0380 Da x 2) והמסה של קטיון הנתרן (+ 22.9892 Da) שמניבה מסת 2-mer כוללת של 1167.599 Da. ערך המסה הנצפה עבור 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺ הוא 1167.626 Da, שהוא +0.027 Da מעל הערך התיאורטי (איור 14). למרות שנצפו המבנים המחזוריים במשקל מולקולרי נמוך יותר, לא ניתן היה להבחין בתרכובות הליניאריות עם תיולים בשני הקצוות או קשרים כפולים בשני הקצוות.

פולימרים אלה המכילים תיואתר יכולים גם לעבור חמצון, ולהמיר את התיואתרים לסולפוקסידים⁹. זה מסביר תוספת של חמצנים מרובים (+ 15.9949 Da x n) בהתאם למידת החמצון; זה שונה מהתוספת K+, שהיא הבדל של +15.9739 Da מהתוספת Na⁺ . עבור החמצון היחיד של 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺^, ערך המסה התיאורטי הוא 1183.594 Da, בעוד שערך המסה הנצפה היה 1183.620 Da עם עלייה של +0.026 Da בלבד מהערך התיאורטי. עבור החמצון הכפול של 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺, ערך המסה התיאורטי הוא 1199.590 Da, בעוד שערך המסה הנצפה היה 1199.613 Da עם עלייה של +0.023 Da בלבד מהערך התיאורטי. לבסוף, עבור החמצון המשולש של 2-mer [CP-MeO-PEG16 HDT + Na]⁺, ערך המסה התיאורטי הוא 1215.585 Da, בעוד שערך המסה הנצפה היה 1215.617 Da עם עלייה של +0.032 Da בלבד מהערך התיאורטי.

figure-results-13
איור 14: ספקטרום מסה MALDI-ToF של מדגם 8, CP MeO-PEG-400 HDT. זום אין מ-1165-1254 Da מציג תוצרי פולימר מסרק 2-mer מחזוריים עם כמויות שונות של יחידות חוזרות של PEG מחוברות ודרגות שונות של חמצון תיואתר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתן לאשר חמצון עוד יותר על ידי ביצוע מחקר נגד יונים. זה כרוך בשימוש בקטיון מיינן אחר, כגון K⁺, והשוואת היסט הפסגות בספקטרום MALDI-ToF MS. דגימה של CP MeO-PEG-400 HDT הופעלה על ה-MALDI-ToF MS באמצעות KTFA ולא NaTFA (איור 15). זה מזיז את כל המסות של הפסגות למעלה ב-+15.9739 Da בגלל הפרש המסה בין Na⁺ ל-K⁺. לצורך הניתוח עם התוספת K⁺ , לא היה קיים פולימר לא מחומצן (1183.574 Da_Theo) בספקטרום MALDI-ToF MS. עבור החמצון היחיד של 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ ערך המסה התיאורטי הוא 1199.569 Da ואילו ערך המסה הנצפה היה 1199.567 Da (רק -0.002 Da), עבור החמצון הכפול של 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ ערך המסה התיאורטי הוא 1215.564 Da ואילו ערך המסה הנצפה היה 1215.572 Da המשתרע על הפרש (רק +0.008 Da), עבור החמצון המשולש של 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ ערך המסה התיאורטי הוא 1231.558 Da בעוד שערך המסה הנצפה היה 1231.563 Da (רק +0.005 Da), ועבור החמצון המרובע החדש שנוצר של 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ ערך המסה התיאורטי הוא 1247.553 Da בעוד שערך המסה הנצפה היה 1247.551 Da (רק -0.002 Da). יש לציין כי הפולימרים התחמצנו עוד יותר בין הפעלת התוספות Na⁺ ו-K⁺ , וכתוצאה מכך אובדן המוצר הלא מחומצן והיווצרות החמצון המרובע של CP MeO-PEG-400 HDT. ניתן גם לציין שבעוד שהפולימר אכן טס עם תוספות Na⁺ ו-K⁺ , האות לרעש גבוה משמעותית עבור תוספות Na⁺ ומדגיש את האפשרות להשתמש ב-Na⁺ לאפיון הראשוני.

figure-results-14
איור 15: ספקטרום מסה MALDI-ToF של מדגם 8, CP MeO-PEG-400 HDT. זום אין מ-1195-1254 Da מציג תוצרי פולימר מסרק 2-mer מחזוריים עם כמויות שונות של יחידות חוזרות של PEG מחוברות ודרגות שונות של חמצון תיואתר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MALDI-ToF MS היא טכניקה יעילה ביותר לאפיון פולימרים סינתטיים, המציעה מדידות מדויקות עם פיצול מינימלי בשל מנגנון היינון הרך שלה. בשיטה זו, המטריצה סופגת אנרגיה מלייזר ומעבירה אותה לאנליט²⁶. אנרגיה זו גורמת לפולימר להתאדות, ליינן באמצעות אינטראקציה עם חומר קטיונים ולספוג לתוך ואקום. האנליטים המיוננים עוברים דרך צינור הטיסה, שם הם מתגלים על סמך יחס המסה למטען שלהם (m/z)^26,27. שיטה זו מתאימה לקביעת המסה של מולקולות חד-דיספרסיות ויעילה באותה מידה עבור פולימרים בפיזור בינוני (Đ = 1.1-1.3) ופולימרים בעלי פיזור גבוה, שבהם ניתן לקבוע מסת יחידה חוזרת וקבוצות קצה. עבור פולימרים בפיזור בינוני, MALDI-ToF MS מספק גם פיזור (Ð), משקל מולקולרי ממוצע (M_n) ומשקל מולקולרי ממוצע (M_w).

עם זאת, יש לציין מספר מגבלות של הטכניקה. MALDI-ToF MS מציג הטיה של מסה נמוכה בעת ניתוח פולימרים בעלי פיזור גבוה (Đ > 1.3), כלומר פולימרים בעלי מסה נמוכה יותר בהתפלגות שולטים בספקטרום בעוד שמינים בעלי מסה גבוהה יותר הם שיאים בעוצמה נמוכה או נעדרים^28,29. בנוסף, הרזולוציה יורדת משמעותית עבור פולימרים מעל 10,000 Da, ופולימרים העולים על 15,000 Da יכולים להיות מנותחים טוב יותר במצב ליניארי. עם זאת, מצב ליניארי מקריב רזולוציית שיא איזוטופית בהשוואה למצב רפלקטור. יתר על כן, MALDI-ToF MS מסתמך על יכולתו של הפולימר ליינן ביעילות. פולימרים עם מערכות מצומדות או הטרואטומים מייננים בקלות רבה יותר מפחמימנים רוויים כמו פוליאתילן או פוליפרופילן, שלעתים קרובות דורשים שינויים כימיים כדי ליינן^30,31.

הכנת דגימה היא שלב מכריע להשגת תוצאות מוצלחות. אחד ההיבטים החשובים ביותר הוא בחירת המטריצה המתאימה לפולימר אנליט^11,32. לדוגמה, מטריצות כמו DCTB ו-GFR עובדות היטב עבור פולימרים לא קוטביים, בעוד שניתן להשוות DHB ו-CHCA עבור פולימרים קוטביים כדי לזהות איזו מטריצה מספקת את הפסגות הפתורים ביותר. בנוסף, בחירת ממס מתאים להמסת המטריצה והאנליט מבטיחה התגבשות משותפת נכונה, המשפרת את אבלציה בלייזר ומשפרת את הרזולוציה בספקטרום MALDI-ToF MS^המתקבל 33,34,35. באופן דומה, בחירת חומר הקטיונים המתאים חיונית למקסום יעילות היינון ולהפקת פסגות ברורות וניתנות להבחנה.

לאחר בחירת המטריצה וסוכן הקטיונים, ניתן לייעל את יחס המטריצה:אנליטה:קטיון. התחל בהכנת תמיסות מלאי של הקטיון שנבחר (1 מ"ג/מ"ל ב-THF), אנליט (5 מ"ג/מ"ל ב-THF) ומטריצה (20 מ"ג/מ"ל ב-THF). מומלץ יחס נפח התחלתי של 1:5:20 מיקרוליט (קטיון:אנליט:מטריצה), המתאים ליחסי ריכוז של כ-1:25:400 מ"ג/מ"ל בנפח כולל של 26 מיקרוליטר. אם תערובת ראשונית זו אינה מניבה ספקטרום שנפתר היטב, ניתן לבצע אופטימיזציה שיטתית באמצעות גישה מבוססת רשת (טבלה 2)^10,16. בהגדרה זו, נפח האנליט קבוע, בעוד שנפח המטריצה מוכפל בהדרגה ב-4 על פני העמודות, ונפח הקטיון מוכפל ב-4 במעלה השורות. רשת זו מאפשרת למשתמשים לזהות את היחס האופטימלי ליינון ורזולוציה. אם אחד מתנאי הרשת החיצונית מספק ביצועים משופרים, ניתן ליצור רשת חדשה שבמרכזה יחס זה, תוך המשך המכפיל של 4 התאמות לעידון נוסף. נקודת התחלה טובה היא להעריך אם הספקטרום מכיל שיאים בעוצמה גבוהה, רעש בסיסי נמוך ורזולוציה איזוטופית ברזולוציה טובה. תהליך זה יכול להיות גוזל זמן, במיוחד עבור פולימרים חדשים או מורכבים שעשויים לדרוש בדיקה של מספר מטריצות וקטיונים ברשת הכנה של 3 x 3.

טבלה 2: ניתן ליצור ולבדוק רשת שיטתית של יחסי ניסוי. יחס של 1:5:20 מיקרוליטר של קטיון, אנליט ומטריצה, בהתאמה, ישמש להתחלת (1:25:400 מ"ג/מ"ל) קטיון: אנליט: מטריצה בסך הכל 26 מ"ל. נפח האנליט קבוע על 5 מיקרוליטר (25 מ"ג/מ"ל). יחס המטריצה והקטיון מוכפלים בהדרגה ב-4 על פני העמודות ומעלה השורות, בהתאמה. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

לאחר יישום לדוגמה על לוחית המטרה MALDI-ToF MS, בשיטת הטיפות המיובשות, לוחית ה-MALDI-ToF MS נטענת לאחר מכן למכשיר MALDI-ToF MS. ניתן לכוונן פרמטרים של רכישת נתונים MALDI-ToF MS, כגון כוח לייזר, קוטר קרן לייזר, רווח גלאי וחילוץ יוני דופק, כדי להשיג רזולוציה גבוהה יותר והפרדת שיא ברורה יותר. ניתן לשנות אותם באופן שיטתי כדי לקבוע את עוצמת השיא, להקטין את רעש קו הבסיס ולשפר את רזולוציית השיא (איור 1).

אופטימיזציה של פרמטרים אינסטרומנטליים ויחסי הכנת דגימה אינה עוקבת אחר זרימת עבודה ליניארית לחלוטין. מפעילים עשויים להתחיל בשיטת הכנת דגימה מועדפת ולסנן במצב ליניארי כדי להעריך אם הפולימר מיינן, או שהם עשויים לכוונן תחילה את שיטת המכשיר (למשל, כוח לייזר, מיצוי דופק) לפני שינוי יחסי תערובת הדגימה באמצעות רשת ההכנה של 3 x 3. גמישות בזרימת העבודה נחוצה לעתים קרובות, במיוחד בעת ניתוח חומרים חדשים, לא ידועים או בעלי אפיון גרוע.

לאחר השלמת האופטימיזציה, ניתן לעשות שימוש חוזר בפרוטוקול הכנת דגימה, אם כי עדיין עלולה להתרחש שונות קלה בין מפעילים או בין ימים. ביצוע כיול עבור כל ריצת רכישה ממזער את השונות, וההבדלים במסת השיא נשארים בדרך כלל מתחת ל-0.1 Da כאשר מקפידים על פרוטוקולים עקביים. לכן, ניתן להשיג שחזור בין משתמשים וימים אם גם שיטת המכשיר וגם הכנת הדגימה נשארות זהות. אם הבעיות ממשיכות להימשך, טבלה עם בעיות נפוצות שמשתמש עשוי להיתקל בהן, ופתרונות מסופקים בטבלה 3.

טבלה 3: בעיות נפוצות ואסטרטגיות לפתרון בעיות המבוססות על ניסיון מעשי. הטבלה מסייעת בבעיות שנתקלים בהן במהלך הכנת המדגם, רכישת נתונים וניתוח נתונים. לפתרון בעיות ספציפי למכשיר, עיין במדריך היצרן של MALDI-ToF MS או בטכנאי מוסמך. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

כיול הוא שלב קריטי כדי להבטיח את הדיוק של מדידות המסה. ניתן להשתמש בכיולים חיצוניים ופנימיים כאחד, אך חיוני שהקליברנטים המשמשים ייכנסו לטווח המסה של הפולימר אנליט. כיול נכון מבטיח שמסת האנליט נקבעת כהלכה.

ניתוח הנתונים מבוצע במקום בו נפתח ספקטרום המסה של MALDI-ToF MS, וניתן לבחור קטיף שיא לניתוח נוסף. ניתן לאשר את המסה של מקרומולקולות מונו-דיספרסיות, כמו גם פולימרים נמוכים, בינוניים ומפוזרים מאוד של n-mer מוגדר, על ידי השוואת המסה הנצפית לערכים תיאורטיים המחושבים באמצעות תוכנת שרטוט כימית. השוואות אלו עוזרות לאמת את המסה הכוללת של מקרומולקולה מונו-דיספרסית או, במקרה של פולימרים נמוכים, בינוניים ומפוזרים מאוד של n-mer מוגדר, קבוצות הקצה מזוהות ומסת היחידה החוזרת מאושרת.

לסיכום, אופטימיזציה של המטריצה, תנאי הקטיונים ויחסי הניסוי היא קריטית להשגת נתוני MALDI-ToF MS ברזולוציה גבוהה. הכיול מבטיח מדידות מסה מדויקות. ניתוח נתונים באמצעות ליקוט שיא והשוואת מסה תיאורטית מאפשר אפיון יסודי של הפולימר, כולל זיהוי קבוצות קצה ומסת היחידה החוזרת. ניתן להשתמש בטכניקה זו עבור מקרומולקולות מונו-דיספרס, בתוספת פולימרים סינתטיים בפיזור נמוך, פיזור בינוני ופיזור גבוה. כיוונים עתידיים כוללים הרחבת האפיון של ארכיטקטורות פולימרים מורכבות כגון תערובות סרט דק פולימריות, פולימרים מחזוריים ופולימרים מסועפים באמצעות שיטות הכנת דגימות ללא ממס וספקטרומטריית מסה טנדם (MS/MS)36,37,38. שילובי מכשירים, כגון שימוש בכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) כדי לפצל דגימה, ואחריה MALDI-ToF MS לניתוח מבני, יכולים לשמש לזיהוי מבנים בעלי מסה נמוכה, קביעת פיזור חלקי ואפיון קבוצות קצה בדגימות פולימר בפיזור גבוה 39,40,41. בנוסף, גישות חדשות לניתוח נתונים, כולל קלט ידני או ייצור בעזרת תוכנה של עלילות פגמים במסה של קנדריק, מאפשרות המרה של ספקטרום מסה למפות דו-ממדיות, מה שמקל על זיהוי של קבוצות קצה מרובות בתוך מדגם ^2,42.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים יש אינטרסים כלכליים בקליברנטים הדנדריטיים ששימשו במחקר זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים בתודה על תמיכתם של ACS-Petroleum Research Fund 66398-ND7, פרופסור בוייר ואוניברסיטת טוליין. בנוסף קיבלנו MALDI-ToF MS חדש יותר באמצעות NSF MRI 2319960.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1-(3-דימתיל-אמינופרופיל)-3-אתילקרבודימיד הידרוכלוריד	כימיקלים TCI	D1601	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/D1601
1,1,1-טריס (הידרוקסימתיל) פרופאן	מיליפור סיגמא	148083	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/148083?srsltid=AfmBOoqaMzcy1xravp1h2QE 0myfY5gjuEBfOIv2o882Wb _xcB4Ol4CMW
1,5,7-טריאזאביציקלו[4.4.0]dec-5-ene	מיליפור סיגמא	345571	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/345571?srsltid=AfmBOooLQXIhWaMnO63nE xu-Y5MJoJID6RJiby0NXyu DHOxXYjle_kMT
1,6-הקסנדיתיול 98% (HDT)	TCI	H0334	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/H0334
2-(4-הידרוקסיפנילאזו)חומצה בנזואית) (HABA)	מיליפור סיגמא	H5126	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/h5126
2,2-ביס(הידרוקסימתיל)חומצה פרופיונית	מיליפור סיגמא	106615	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/106615?srsltid=AfmBOopCRoa1N_UiDK 56NKhDKdlAN8feUrMxVYhul Muz2en6NYEGIh4b
2,2-דימתוקסי-2-פנילאצטופנון 99% (DMPA)	סיגמא-אולדריץ'	196118	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/196118?srsltid=AfmBOoqVTif6KNwIr6A -bIgnXbkrvWKIUNH6qOsc RseQLNVKi0DMWPb-
2,5-חומצה דיהידרוקסיבנזואית (DHB)	מיליפור סיגמא	149357	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/149357
4-(דימתיל-אמינו)פירידין	מיליפור סיגמא	522821	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/522821?focus=products&page=1&perpage= 30& sort=רלוונטיות& term=522821 & type=product
6-חומצה ברומוהקסנואית	מיליפור סיגמא	150452	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/6-bromohexanoic-acid?focus=products&page=1<> & perpage=30& sort=רלוונטיות& term= 6-Bromohexanoic%20acid& type=product
בנזלדהיד דימתיל אצטל	מיליפור סיגמא	226076	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/226076?srsltid= AfmBOorbjP7zD9MO3g5Xk LL3rNZ02PhfkXoRfe3EjRK7 TrqJ-kEOrTCN
חומצה בנזואית	מיליפור סיגמא	242381	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/242381?srsltid=AfmBOook_iIcMnwuB3e _j-KetQyyHJ6Qq86jSK8 ZVxC3BorQgkO8Xg5I
ברוקר אולטרה-פלקסטרים	ברוקר דלטוניקס		https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/maldi-tof/ultraflextreme.html
כלורופורם	פישר סיינטיפיק	AA32614K7	https://www.fishersci.com/shop/products/chloroform-acs-99-8-thermo-scientific/AA32614K7 ?searchHijack=true& searchTerm= chloroform-acs-99-8-thermo-scientific & searchType=מהיר& matchedCatNo =AA32614M6
דיתרנול, BP, 98.5-101% (DT)	פישר סיינטיפיק	18-602-270	https://www.fishersci.com/shop/products/dithranol-bp-98-5-101-spectrum-chemical/18602270
אתילן ברסילט	מיליפור סיגמא	W354309	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/w354309?utm_source=google&utm_medium= CPC& utm_campaign=8692675663& utm _content=86098110623& gad_source= 1& gclid=CjwKCAiApY-7BhBjEiwAQMr rEdJTcKN5TEFkP1uHvRlVign3lwg2cj5 _spBUCrfi6exZ3Ur5sJkARxoCfWsQ AvD_BwE
גלוונוקסיל, רדיקלים חופשיים	מיליפור סיגמא	G307	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/g307?srsltid= AfmBOopoWGDMXtLk5Erf0rVyl 7j442uyg8rIWkfBjhHZ2z0dDktH3y8-
מתנול	פישר סיינטיפיק	א456	https://www.fishersci.com/shop/products/methanol-optima-lc-ms-grade-thermo-scientific/A4564
פלדיום, 10% על פחמן, סוג 487, יבש	פישר סיינטיפיק	AAA1201206	https://www.fishersci.com/shop/products/palladium-10-carbon-type-487-dry-thermo-scientific-1/AAA1201206#?keyword=palladium%20on%20carbon
פולי(אתילן גליקול) מונומתיל אתר 350 Mn (MeO-PEG-OH 360)	פישר סיינטיפיק	AA4156022	https://www.fishersci.com/shop/products/polyethylene-glycol-monomethylether-350-thermo-scientific/AA4156022
אשלגן טריפלואורואצטט (KTFA)	מיליפור סיגמא	281883	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/281883
אלכוהול פרופרגיל	פישר סיינטיפיק	A10295.0F	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A10295.0F?SID=srch-hj-A10295.0F
פרופרגיל ברומיד 97% (80% משקל/רוחב בטולואן מיוצב עם MgO)	פישר סיינטיפיק	AAL1059514	https://www.fishersci.com/shop/products/propargyl-bromide-97-80-w-w-toluene-stab-magnesium-oxide-thermo-scientific/AAL1059514#?keyword=Propargyl%20bromide%2097%%20(80%%20w/w%20in%20toluene%20stabilized%20with%20MgO)
נתרן אזיד	מיליפור סיגמא	S2002	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/s2002
נתרן הידריד 60% פיזור בשמן מינרלי	מיליפור סיגמא	452912	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/452912?srsltid= AfmBOooZhbCm_qtgKU99922Y91zI qEOWONlEGxjZn0mdSJF2L5hW1uVn
נתרן טריפלואורואצטט (NaTFA)	אוקווד	MFCD00013217	https://www.oakwoodchemical.com/ProductsList.aspx?CategoryID=-2&txt חיפוש=1549& ExtHyperLink=1
ערכת SpheriCal מסודרת לטווח נמוך (250 - 7,500 Da)	מפעל פולימרים	PFS-104	https://www.polymerfactory.com/product-page/spherical-low-range-kit-500-7-500-da
טטרהידרופוראן (THF)	פישר סיינטיפיק	טי 427	https://www.fishersci.com/shop/products/tetrahydrofuran-optima-fisher-chemical-3/T4274#?keyword=tetrahydrofuran%20optima
טרנס-2-[3-(4-טרט-בוטילפניל)-2-מתיל-2-פרופנילידן]מלונוניטריל (DCTB)	TCI	B3635	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/B3635
&אלפא;-ציאנו-4-חומצה הידרוקסיצינמית (CHCA)	TCI	ג. 1768	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/C1768

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mautjana, N. A., Pasch, H. Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry of synthetic polymers. Macromol Symp. 313-314 (1), 157-161 (2012).
Bin Sun, A., Li, S., Kou, X. Applications of MALDI-TOF-MS in structural characterization of synthetic polymers. Anal Meth. 15 (7), 868-883 (2023).
Hanton, S. D. Mass spectrometry of polymers and polymer surfaces. Chem Rev. 101 (2), 527-569 (2001).
Weidner, S. M., Trimpin, S. Mass spectrometry of synthetic polymers. Anal Chem. 82 (12), 4811-4829 (2010).
Cortez, M. A., Grayson, S. M. Application of time-dependent MALDI-TOF mass spectral analysis to elucidate chain transfer mechanism during cationic polymerization of oxazoline monomers containing thioethers. Macromolecules. 44 (6), 10152-10156 (2011).
Li, Y., Hoskins, J. N., Sreerama, S. G., Grayson, M. A., Grayson, S. M. The identification of synthetic homopolymer end groups and verification of their transformations using MALDI-TOFmass spectrometry. J Mass Spectrom. 45 (6), 587-611 (2010).
Redding, M. J., Grayson, S. M., Charles, L. Mass spectrometry of dendrimers. Mass Spectrom Rev. , 1-33 (2024).
Montaudo, G., Montaudo, M. S., Puglisi, C., Samperi, F. Characterization of polymers by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry: Molecular weight estimates in samples of varying polydispersity. Rapid Comm Mass Spectrom. 9 (5), 453-460 (1995).
Curole, B. J., Broussard, W. J., Nadeem, A., Grayson, S. M. Dithiol-yne Polymerization: Comb Polymers with Poly(ethylene glycol) Side chains. ACS Polymers Au. 3 (1), 70-81 (2023).
Wang, Z., Zhang, Q., Shen, H., Yang, P., Zhou, X. Optimized MALDI-TOF MS Strategy for Characterizing Polymers. Front Chem. 9, 2296-2646 (2021).
Macha, S. F., Limbach, P. A., Savickas, P. J. Application of nonpolar matrices for the analysis of low molecular weight nonpolar synthetic polymers by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. 11 (8), 731-737 (2000).
Wyatt, M. F., Stein, B. K., Brenton, A. G. Characterization of various analytes using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry and 2-[(2E)-3-(4-tert- butylphenyl)-2-methylprop-2-enylidene]malononitrile matrix. Anal Chem. 78 (1), 199-206 (2006).
De Winter, J., et al. MALDI-ToF analysis of polythiophene: Use of trans-2-[3-(4-t-butyl-phenyl)- 2-methyl-2-propenylidene]malononitrile - DCTB - as matrix. J Mass Spectrom. 46 (3), 237-246 (2011).
Gabriel, S. J., et al. Improved analysis of ultra-high molecular mass polystyrenes in matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry using DCTB matrix and caesium salts. Rapid Comm Mass Spectrom. 29 (11), 1039-1046 (2015).
Schlosser, G., et al. Matrix/analyte ratio influencing polymer molecular weight distribution in matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Comm Mass Spectrom. 23 (9), 1249-1254 (2009).
Payne, M. E., Grayson, S. M. Characterization of synthetic polymers via matrix assisted laser desorption ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. J Vis Exp. (136), e57174(2018).
Räder, H. J., Sclirepp, I. K. MALDI-TOF mass spectrometry in the analysis of synthetic polymers. Acta Polymerica. 49 (6), 253-318 (1998).
Mamyrin, B. A., Karataev, V. I., Shmikk, D. V., Zagulin, V. A. The mass-reflectron, a new nonmagnetic time-of-flight mass spectrometer with high resolution. Sov Phys JETP. 37 (1), 45-48 (1973).
Kaufmann, R., Spengler, B., Lützenkirchen, F. Mass spectrometric sequencing of linear peptides by product-ion analysis in a reflectron time-of-flight mass spectrometer using matrix-assisted laser desorption ionization. Rapid Comm Mass Spectrom. 7 (10), 902-910 (1993).
Hoskins, J. N., Grayson, S. M. Synthesis and Degradation Behavior of Cyclic Poly(ε-caprolactone). Macromolecules. 42 (17), 6406-6413 (2009).
Li, Y., Hoskins, J. N., Sreerama, S. G., Grayson, S. M. MALDI-TOF mass spectral characterization of polymers containing an azide group: Evidence of metastable ions. Macromolecules. 43 (14), 6225-6228 (2010).
Wetzel, S. J., Guttman, C. M., Girard, J. E. The influence of matrix and laser energy on the molecular mass distribution of synthetic polymers obtained by MALDI-TOF-MS. Int J Mass Spectrom. 238 (3 SPEC. ISS), 215-225 (2004).
Grayson, S. M., Myers, B. K., Bengtsson, J., Malkoch, M. Advantages of monodisperse and chemically robust “spherical” polyester dendrimers as a “universal MS Calibrant. J Am Soc Mass Spectrom. 25 (3), 303-309 (2014).
Xiang, B., Prado, M. An accurate and clean calibration method for MALDI-MS. J Biomol Tech. 21 (3), 116-119 (2010).
Kovtoun, S. V., Cotter, R. J. Mass-correlated pulsed extraction: Theoretical analysis and implementation with a linear matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometer. J Am Soc Mass Spectrom. 11 (10), 841-853 (2000).
Montaudo, G., Samperi, F., Montaudo, M. S. Characterization of synthetic polymers by MALDI-MS. Prog Poly Sci. 31 (3), 277-357 (2006).
Wesdemiotis, C., Williams-Pavlantos, K. N., Keating, A. R., McGee, A. S., Bochenek, C. Mass spectrometry of polymers: A tutorial review. Mass Spectrom Rev. 43 (3), 427-476 (2024).
Byrd, H. C. M., McEwen, C. N. The limitations of MALDI-TOF mass spectrometry in the analysis of wide polydisperse polymers. Anal Chem. 72 (19), 4568-4576 (2000).
McEwen, C. N., Jackson, C., Larsen, B. S. Instrumental effects in the analysis of polymers of wide polydispersity by MALDI mass spectrometry. Int J Mass Spectrom Ion Proc. 160 (1-3), 387-394 (1997).
Lin-Gibson, S., et al. Optimizing the covalent cationization method for the mass spectrometry of polyolefins. Macromolecules. 35 (18), 7149-7156 (2002).
Ji, H., et al. Characterization of polyisobutylene by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Macromolecules. 35 (4), 1196-1199 (2002).
Meier, M. A. R., Adams, N., Schubert, U. S. Statistical approach to understand MALDI-TOFMS matrices: Discovery and evaluation of new MALDI matrices. Anal Chem. 79 (3), 863-869 (2007).
Wu, T., et al. Solvent effect in polymer analysis by MALDI-TOF mass spectrometry. Int J Poly Anal Characterizat. 22 (2), 160-168 (2017).
Chen, H., Guo, B. Use of Binary Solvent Systems in the MALDI-TOF Analysis of Poly(methyl methacrylate). Anal Chem. 69 (21), 4399-4404 (1997).
Yalcin, T., Dai, Y., Li, L. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry for polymer analysis: Solvent effect in sample preparation. J Am Soc Mass Spectrom. 9 (12), 1303-1310 (1998).
Wang, S. F., Li, X., Agapov, R. L., Wesdemiotis, C., Foster, M. D. Probing surface concentration of cyclic/linear blend films using surface layer MALDI-TOF mass spectrometry. ACS Macro Lett. 1 (8), 1024-1027 (2012).
Hanton, S. D., Parees, D. M. Extending the solvent-free MALDI sample preparation method. J Am Soc Mass Spectrom. 16 (1), 90-93 (2005).
Williams-Pavlantos, K., Wesdemiotis, C. Advances in solvent-free sample preparation methods for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS) of polymers and biomolecules. Adv Sample Prep. 7, 100088(2023).
Veloso, A., Leal, G. P., Agirre, A., Leiza, J. R. Combining SEC & MALDI for characterization of the continuous phase in dispersion polymerization. Eur Poly J. 105, 265-273 (2018).
Esser, E., Keil, C., Braun, D., Montag, P., Pasch, H. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of synthetic polymers. 4. Coupling of size exclusion chromatography and MALDI- TOF using a spray-deposition interface. Polymer. 41 (11), 4039-4046 (2000).
Crotty, S., Gerişlioğlu, S., Endres, K. J., Wesdemiotis, C., Schubert, U. S. Polymer architectures via mass spectrometry and hyphenated techniques: A review. Anal Chim Acta. 932, 1-21 (2016).
Fouquet, T., Sato, H. Extension of the Kendrick Mass Defect Analysis of Homopolymers to Low Resolution and High Mass Range Mass Spectra Using Fractional Base Units. Anal Chem. 89 (5), 2682-2686 (2017).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Polymer Characterization Mass Spectrometry End Group Analysis Molecular Weight Determination Sample Preparation Matrix Selection Isotopic Patterns Polymer Dispersity

שיטת MALDI-ToF MS לאפיון פולימרים סינתטיים בעלי פיזור וקבוצות קצה משתנות

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים