מאמר שיטה

Ookluc: קו פלסמודיום ברגהיי לזיהוי תרכובות חוסמות שידור

716 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68466

⸱

11 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Parasitology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo

במאמר זה

סיכום

התפתחות מינית של פלסמודיום מתרחשת במעי האמצעי של היתוש. התמקדות בשלבים המיניים של הטפיל היא אסטרטגיה מבטיחה לחסימת ההדבקה. פיתחנו את Ookluc, P. berghei טרנסגני המבטא ננו-לוציפראז לאחר היווצרות זיגוטה, המאפשר סינון בתפוקה גבוהה של תרכובות חוסמות העברה. מאמר זה מפרט את שיטות הבדיקה באמצעות Ookluc.

תקציר

המלריה נותרה אתגר בריאותי עולמי; בשנת 2023 דווח על 263 מיליון מקרים ו-597,000 מקרי מוות ברחבי העולם. מחזור החיים של הטפיל מורכב, ויש צורך בהתערבויות ממוקדות בשלבי התפתחות קריטיים כדי לשלוט ביעילות במחלה. אסטרטגיות חסימת העברה (TB) שואפות לקטוע את העברת הפלסמודיום על ידי התמקדות בווקטור היתוש או בשלבים המיניים של הטפיל באמצעות חיסונים ותרופות. התערבויות בשחפת יכולות להתמקד בגמטוציטים במארח האנושי או בצורות אחרות במעי האמצעי של היתושים, כגון גמטות, זיגוטים, אוקינטים ואוציטים.

פיתוח גישות חדשות לשחפת עומד בפני אתגרים משמעותיים. חקר השלבים המיניים של הטפיל הוא קשה מטבעו, ובדיקת תפוקה גבוהה (HTS) לתרכובות גמטוציטוצידידות מסתמכת בעיקר על תרביות P. falciparum . עם זאת, כלים חזקים במבחנה להערכת התערבויות כנגד שלבים מיניים מאוחרים יותר נותרו מוגבלים. כדי להאיץ את הגילוי של תרכובות שחפת, הקבוצה שלנו פיתחה בדיקת HTS חדשה להפעלה והפריה של גמטוציטים באמצעות P. berghei, מודל עכברי של זיהום פלסמודיום . הטפיל הטרנסגני, Ookluc, מבטא ננו-לוציפראז אך ורק לאחר היווצרות זיגוטה, עם זוהר שיא במהלך התפתחות האוקינט. בדיקה מבוססת זוהר זו מספקת קריאה כמותית של התמיינות גמט לזיגוטה וזיגוטה לאוקינטה, כאשר זוהר מוגבר נמצא בקורלציה ישירה עם היווצרות אוקינט. מאמר וידאו זה מציג את השיטות לסינון תרכובות שחפת מלריה באמצעות Ookluc.

מבוא

מלריה היא מחלה עתיקה שעיצבה עמוקות את ההיסטוריה האנושית. בשנת 2023 לבדה דווחו 263 מיליון מקרים ב-85 מדינות אנדמיות, וכתוצאה מכך 597,000 מקרי מוות1. המחלה נגרמת על ידי טפילי פרוטוזואים מהסוג פלסמודיום, השייכים לפילום אפיקומפלקסה. בין חמשת המינים המדביקים בני אדם - P. falciparum, P. vivax, P. knowlesi, P. ovale ו- P. malariae - P. falciparum ו- P. vivax מהווים את רוב המקרים. P. falciparum קשור למלריה קשה והוא דומיננטי באפריקה, בעוד של-P. vivax יש את התפוצה הגיאוגרפית הרחבה ביותר, והוא נפוץ יותר בדרום אמריקה ובאסיה2.

המורכבות של מחזור החיים של הפלסמודיום , הכוללת שלבי התפתחות מרובים על פני שני מארחים, מקלה על העברתו והתמדתו באזורים אנדמיים3. שלב קריטי במחזור זה הוא המעבר מבני אדם לווקטור היתושים, מה שהופך אותו ליעד מרכזי להתערבות. ההעברה מתחילה בתוך המארח האנושי, שם מתפתחים שלבי המין של פלסמודיום כאשר מרוזואיטים מתמיינים לגמטוציטים זכריים ונקביים. עם בליעה על ידי יתוש, רמזים סביבתיים מעוררים הפעלת גמטוציטים והיווצרות גמטות, מה שמוביל להפריה בלומן המעי האמצעי. הזיגוטה המתקבלת מתמיינה לאוקינטה נעה, הפולשת באופן פעיל לאפיתל המעי האמצעי ומתפתחת לביצית בתוך הלמינה הבסיסית. בתוך הביצית נוצרים אלפי ספורוזואיטים ומשתחררים לאחר מכן להמולימפה, מה שמאפשר להם לנדוד לבלוטות הרוק. שם, ספורוזואיטים פולשים לתאי האצינר ועוברים לבלוטת לומן, שם הם נשארים עד שהיתוש לוקח את ארוחת הדם הבאה שלו, ומעביר את הטפיל לעור האדם4.

החיפוש אחר אסטרטגיות חדשות לחסימת העברה (TB) הוא קריטי בהתחשב במגבלות התרופות הזמינות והעמידות הגוברת לתרופות נגד מלריה5. שיטות סינון מסורתיות - כגון זיהומי יתושים, ניתוח מיקרוסקופי ידני או שילוב היפוקסנטין רדיואקטיבי - הן עתירות עבודה, קשות לסטנדרטיזציה ואינן מתאימות ליישומים בעלי תפוקה גבוהה 6,7. גישות עדכניות יותר המשתמשות בזיהוי מבוסס פלואורסצנטי (למשל, צביעת DNA או מדווחי GFP) שיפרו את היעילות, אך נותרו אתגרים משמעותיים בהערכת תרכובות המכוונות לשלבי המין של הטפיל 6,7,8.

כדי להתמודד עם אתגרים אלה, פותח קו טרנסגני של P. berghei המבטא ננו-לוציפראז (nLuc), המכונה Ookluc,8. במערכת זו, הגן nLuc ממוקם תחת שליטת מקדם החלבון הקשור ל-P. berghei Circumsporozoite- ו-TRAP (CTRP) הספציפי לאוקינטים, המופעל בזיגוטות, מה שמוביל לייצור nLuc המתחיל כ-6 שעות לאחר הפעלת הגמטות ומגיע לשיא 24 שעות לאחר בדיקת ההמרה8. תכנון זה מאפשר כימות אוטומטי מבוסס לומינסנציה של כדאיות הטפיל זמן קצר לאחר ההפריה - מבטל את הצורך במניפולציה וקטורית ישירה - ומאפשר סינון תפוקה גבוהה של אלפי תרכובות8.

למרות שביטוי nLuc מתרחש ללא קשר לכדאיות האוקינט, מה שמגביל את הזיהוי של תרכובות המשפיעות באופן ספציפי על שלבים מאוחרים יותר כגון מורפוגנזה של אוקינט, Ookluc נשאר יעיל ביותר לזיהוי תרכובות שחפת המכוונות לגמטוגנזה, רקומבינציה מינית או הישרדות טפילים בתוך היתוש, כולל חומרים הגורמים לייצור מיני חמצן תגובתיים. מחקרים קודמים אימתו מערכת זו על ידי זיהוי מוצלח של תרכובות הידועות כמעכבות את השלבים המיניים של פלסמודיום 9,10,11,12,13,14,15. לפיכך, Ookluc מייצגת פלטפורמה חזקה וחדשנית לבדיקה בתפוקה גבוהה של שלבי המין של פלסמודיום, המאפשרת גילוי תרכובות שחפת חדשות וקידום המאמצים לחיסול המלריהבשנים הקרובות. פרוטוקול זה מתאר את היישום של מערכת Ookluc לסינון תרופות וקביעת ריכוז מעכב של 50% (IC50).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות האתיות ואושרו על ידי ועדת האתיקה לשימוש בבעלי חיים של המכון למדעים ביו-רפואיים באוניברסיטת סאו פאולו (CEUA-ICB/USP). בעלי החיים שוכנו ותוחזקו בהתאם לסטנדרטים שנקבעו על ידי ועדה זו. ניסויים שכללו טפילי פלסמודיום מהונדסים גנטית, כמו גם אחסונם בהקפאה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, נערכו בהתאם לתקנות שנקבעו על ידי ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית של המכון למדעים ביו-רפואיים, אוניברסיטת סאו פאולו (CIBio-ICB/USP). בסך הכל נעשה שימוש בשלוש עכברי BALB/c, בגילאי 3-5 שבועות, במחקר זה - שתיים נגועות ואחת לא נגועה.

1. חומרים וריאגנטים

  1. הכן את מדיום האוקינט על ידי השלמת RPMI 1640 עם 0.025 M HEPES, פניצילין-סטרפטומיצין-ניאומיצין (PSN), 50 מ"ג/ליטר היפוקסנטין ו-100 מיקרומטר חומצה קסנתורנית. התאם את ה-pH ל-8.3 8,16.
  2. הכן את פתרון העבודה לבדיקת הזוהר על ידי ערבוב נפח אחד של מצע עם 50 נפחים של מאגר הליזיס המסופק במערכת בדיקת הלוציפראז.
  3. הגדר חממה ל-21 מעלות צלזיוס.

2. זיהום ואיסוף דם טפילי

  1. להדביק שתי עכברי BALB/c נקבות (בגילאי 4-6 שבועות) ב-150 מיקרוליטר של זן Ookluc השמור בהקפאה באמצעות הזרקה תוך-צפקית (IP) (יום 0).
    הערה: בפרוטוקול זה, אנו ממליצים להשתמש בעכברי BALB/c בשל זמינותם והשימוש הנרחב שלהם במתקנים לבעלי חיים. עם זאת, כל זן עכבר מסוג בר הרגיש לזיהום P. berghei ותומך בגמטוציטוגנזה צריך להיות מתאים לשימוש.
  2. החל מהיום השלישי, העריכו טפילים וגמטוציטמיה על ידי בדיקה מיקרוסקופית של מריחות דם מוכתמות בגימסה.
  3. כאשר טפילים וגמטוציטמיה מגיעים לכ-5% ו-0.5%, בהתאמה (בדרך כלל ביום הרביעי), אספו דם באמצעות ניקור לב באמצעות מזרקים שעברו הפרין ואספו את הדם משני העכברים הנגועים.
    הערה: למרות שזהו קו טרנסגני של P. berghei, פרופיל הצמיחה והגמטוציטמיה שלו דומים לאלה שנצפו בזן ANKA. בהקשר זה, שיעור הגמטוציטים ביחס לסך הטפילים נמוך פי 10 בערך.
    הערה: באופן אידיאלי, צלחת התרכובת (ראה להלן) מוכנה לפני איסוף הדם הטפיל, כך שהדם מוזרם לצלחת מיד לאחר האיסוף. אם יש לאסוף את דם העכבר בחדר אחר, או שלא ניתן להזרים אותו מיד לצלחת התרכובת מכל סיבה אחרת, יש לשמור את הדם שנאסף בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ-30 דקות.

3. בדיקת המרה - הקרנה בצלחות 96 בארות

הערה: כדי להבטיח תוצאות עקביות, יש לחזור על הניסוי כולו שלוש פעמים בימים שונים כדי לאשר את הממצאים.

  1. הכן את דגימות התרכובת באמצעות מדיום אוקינט כמדלל (ריכוז סופי של 10 מיקרומטר). יש לדלל את מלאי התרכובת ל-1 מ"מ ולהכין דגימות עבודה על ידי דילול מלאי ה-1 מ"מ 1:100 v:v ב-Ookinete Medium. לבדיקה אחת בשכפול, הכינו נפח סופי של 200 מיקרוליטר של דגימת עבודה.
  2. אם התרכובת מדוללת בממס שאינו מים, כלול דגימת בקרה המכילה את הממס המדולל במדיום אוקינט באותה פרופורציה כמו בדגימת הבדיקה כדי להבטיח שכל עיכוב שנצפה מיוחס לתרכובת ולא לממס.
    הערה: כדוגמה, נסנן 90 תרכובות.
  3. בעזרת שתי צלחות של 96 בארות, הניחו 80 מיקרוליטר מהדגימות בכל באר, כדלקמן ומודגם באיור 1, בשכפול (שתי לוחות): בקרה חיובית: 80 מיקרוליטר של מדיום אוקינט; שליטה שלילית: 80 מיקרוליטר של מדיום אוקינט; בקרת ממס: 80 מיקרוליטר של מדיום אוקינט עם 1% DMSO; דגימות: 80 מיקרוליטר של 10 מיקרומטר מכל תרכובת במדיום אוקינט.

figure-protocol-1
איור 1: ייצוג סכמטי של פריסת לוחות של 96 בארות המתוכננת עבור סינון מורכב. פריסת הלוחות כוללת בקרה חיובית (C+), בקרה שלילית (C-), בקרה בתוספת ממס דילול (C+S) ו-90 תרכובות בדיקה (S1-S90). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. הוסף 4 מיקרוליטר של דם עכבר טפיל לכל באר של צלחת 96 הבארות ביחס של 1:20 v:v, למעט הבקרה השלילית (C-). הומוגניזציה עדינה על ידי פיפטינג.
    הערה: בהתחשב בהפסדים, אנו מחשבים את הצורך של ~400 מיקרוליטר של דם טפילי עבור כל צלחת.
  2. לבקרה השלילית, הוסף דם עכבר לא נגוע ביחס של 1:20 (v:v, דם:דגימה). הומוגניזציה עדינה.
  3. דגירה בטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות או 24 שעות.
    הערה: פעילות nLuc ניתנת לזיהוי עם 6 שעות דגירה ומגיעה לשיאה ב-24 שעות של הבדיקה8. הבדיקה אינה מסוגלת לזהות תרכובות בעלות פעילות לאחר היווצרות זיגוטה, כמו תרכובות המעכבות מורפוגנזה של אוקינטים, מכיוון שזיגוטות שנוצרו יצברו nLuc ללא קשר להשלמת המורפוגנזה. לכן, דגירה של 6 שעות מספיקה כדי לזהות את כל התרכובות שיחסמו את פעילות ה-nLuc על ידי עיכוב גמטוגנזה, רקומבינציה מינית, או שיש להן ציטוטוקסיות מוקדמת. עם זאת, בדרך כלל אנו מעדיפים דגירה של 24 שעות כדי לקבל אותות חזקים יותר ויחס אות לרעש טוב יותר.

4. בדיקת זוהר

  1. לאחר תקופת הדגירה, הומוגניזציה של דגימות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כדי להבטיח ערבוב יסודי של מדיום הדם.
  2. הכן את תערובת מאגר הליזיס/מצע לוציפראז מיד לפני השימוש ביחס של 1:50 (v:v, מצע: מאגר ליזה).
  3. מערבבים את תערובת המצע עם דגימות ביחס של 1:1 (v:v), ומבטיחים ערבוב עדין כדי למנוע בועות. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות.
    הערה: בדוגמה זו, הוספנו 84 מיקרוליטר של מאגר מצע:ליזה לכל באר.
  4. מעבירים דגימות לצלחת לבנה עם תחתית שטוחה עם 96 בארות. מדוד זוהר באמצעות קורא צלחות. השתמש בתצורת הפרמטרים הבאה: מסנן פליטה: עדשה; זמן מרווח מדידה: 1 שניות לבאר.

5. ניתוח נתונים - סינון

  1. לאחר בדיקת הזוהר, רשמו את הנתונים הגולמיים שמופיעים (איור 2).
    הערה: יחידות האור היחסיות (RLU) המתקבלות תלויות בלומינומטר המשמש. במקרה שלנו, ערכי RLU עבור הבקרה החיובית נעו בין 10,000 ל-500,000 בבדיקת דגירה של 24 שעות. זמני דגירה קצרים יותר (6 שעות) יביאו לערכי RLU נמוכים יותר.

figure-protocol-2
איור 2: תוצאות שהתקבלו מקריאה מדומה של בדיקת המרה לבדיקת תרכובות. התמונה מציגה קריאות זוהר מדומות מבדיקה שבוצעה לאחר המרה של אוקינטים בנוכחות פאנל של 90 תרכובות. ערכי יחידת אור יחסית נמוכים יותר מצביעים על היווצרות אוקינטים מופחתת. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. באמצעות גיליון אלקטרוני, חשב את הממוצע של כל מדידה באמצעות הנוסחה שלהלן. החלף את XX בכתובת של תא המדידה הראשון ואת YY בכתובת של תא המדידה השני. חזור על הנוסחה עבור כל הדוגמאות.
    =(ממוצע(XX:YY)
  2. המר את הנתונים ל-% עיכוב לניתוח טוב יותר של התוצאות. בגיליון האלקטרוני, השתמש בנוסחה הבאה. החלף את A בערך RLU לדוגמה ואת B בערך RLU הבקרה. חזור על הנוסחה עבור כל התרכובות שנבדקו:
    = 1 - (A/B) x 100
    הערה: הנתונים יופיעו כפי שמוצג באיור 3.

figure-protocol-3
איור 3: תוצאות שהתקבלו מקריאה מדומה של בדיקת המרה לבדיקת תרכובות מיוצגות כאחוז העיכוב עבור כל תרכובת. אחוז עיכוב ההמרה עבור כל תרכובת שנבדקה, מחושב כמתואר לעיל. הריבועים המודגשים מצביעים על תרכובות המקדמות יותר מ-95% עיכוב המרה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. זהה את התרכובות המציגות יותר מ-95% עיכוב.
    הערה: תרכובות אלו מציגות פעילות גבוהה כנגד שלבי מין בריכוז של 10 מיקרומטר. בדוגמה שלנו, מצאנו חמש תרכובות עם פעילות גבוהה כנגד שלבים מיניים.
  2. עבור התרכובות שזוהו, בצע קביעת IC50 כמתואר להלן.

6. בדיקת המרה - קביעת IC 50

  1. להדביק עכברים ב-Ookluc ולאסוף דם טפיל, כמתואר בסעיף 2.
  2. הכן את הדגימות באמצעות מדיום אוקינט כמדלל. השתמש בריכוז ראשוני בו נצפתה עיכוב של 100% של המרה על ידי התרכובת.
    הערה: מכיוון שהתרכובות הפעילות זוהו במסך עם ריכוז של 10 מיקרומטר, אנו משתמשים ב-20 מיקרומטר כריכוז ההתחלתי עבור עקומת המינון-תגובה הראשונה. לעקומת מינון-תגובה מדויקת, חשוב שהבדיקה שלך תכלול ריכוזים ראשוניים המביאים לעיכוב של 100% של המרה וריכוזים סופיים המובילים לעיכוב של 0%. גישה זו מבטיחה חישוב IC50 מדויק. עקומת המינון-תגובה הראשונה תודיע על הריכוזים הנמוכים ביותר של התרכובת עם עיכוב ~100%. בפרוטוקול זה נשתמש ב- PyAz90, שזוהה לאחרונה באמצעות Ookluc13, כדוגמה.
  3. בצלחת של 96 בארות, הוסף משולש (ראה איור 4): בקרה חיובית (C+): 80 מיקרוליטר של מדיום אוקינט; בקרה שלילית (C-): 80 מיקרוליטר של מדיום אוקינט; דילול ראשון לדוגמא (Cpd D1): 160 מיקרוליטר של תרכובת בריכוז ראשוני במדיום אוקינט המביא לעיכוב של 100% של ההמרה; בארות D2 עד D12: 80 מיקרוליטר של מדיום אוקינט.
  4. בצע דילול סדרתי כפול על ידי פיפטינג של 80 מיקרוליטר של באר D1 לתוך D2, הומוגניזציה, ופיפטה 80 מיקרוליטר של באר D2 לתוך D3 וכן הלאה. ודא שלכל הבארות יש 80 מיקרוליטר של נפח כולל, לכן השלך את 80 המיקרוליטר האחרונים שהוסרו מהבאר D12.
    הערה: בצע את הניסוי עם לפחות שלושה שכפולים עבור כל הדגימות, כפי שמצוין באיור 4. כדי להבטיח את האמינות והשחזור של התוצאות שלך, יש לחזור על הניסוי כולו בשלושה ימים נפרדים תוך שימוש בבעלי חיים שנדבקו לאחרונה בכל פעם.
    הערה: אם במסך הראשון, התוצאות אינן מראות השפעה של הממס בהמרה, אין צורך לכלול בקרות אלה בדילולים סדרתיים. אחרת, יש לכלול גם דילולים סדרתיים של הממס.

figure-protocol-4
איור 4: פריסת לוחות 96 בארות המתוכננת עבור קביעת תרכובת IC50 . פריסת הלוחות כוללת דילול בקרה חיובית (C+), בקרה שלילית (C-) ודילול מורכב (Cpd) (D1 עד D12). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. הוסף דם עכבר טפיל לצלחת 96 הבארות ב-1:20 v:v. הומוגניזציה עדינה על ידי פיפטינג.
    הערה: בסך הכל יתווספו 4 מיקרוליטר של דם טפילי לכל באר, למעט לבקרה השלילית (C-). בהתחשב בהפסדים, אנו מחשבים את הצורך של ~200 מיקרוליטר של דם טפילי עבור כל תרכובת שתיבדק.
  2. בבארות בקרה שליליות, הוסף דם עכבר לא נגוע ביחס של 1:20 (v:v, דם:דגימה). הומוגניזציה עדינה.
  3. דגירה בטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות או 24 שעות.
  4. בצע את בדיקת הזוהר, כמתואר בסעיף 4.

7. ניתוח נתונים - קביעת IC 50

הערה: IC50 מוגדר כריכוז של תרכובת הנדרשת לעיכוב 50% מהפעילות/עיכוב הביולוגי. בבדיקה זו, עיכוב מתייחס להפחתה בהמרת אוקינט. הנתונים מיוצגים כעקומת מינון-תגובה סיגמואידית, כאשר ציר ה-X מייצג ריכוז תרכובות (טרנספורמציה לוג) וציר ה-Y מייצג % עיכוב.

  1. חשב % עיכוב כמתואר בסעיף 5, שלב 5.3.
  2. פתח את התוכנה וצור טבלת XY.
  3. הגדר אפשרויות ציר Y ל - הזן 3 ערכי שכפול בעמודות משנה זו לצד זו.
  4. הדבק נתונים, כאשר X מייצג את ריכוז התרכובות ו-Y מייצג % עיכוב (איור 5A).
  5. בשורת התפריטים, לחץ על ניתוח ובחר רגרסיה לא ליניארית (התאמת עקומה) ולאחר מכן עקומות מינון-תגובה - עיכוב ו [מעכב] לעומת תגובה מנורמלת - שיפוע משתנה; לחץ על אישור.
  6. בחלונית השמאלית, התבונן בעקומת המינון-תגובה של הנתונים. החל את ההתאמה האישית הרצויה, כגון שינויי צבע ופורמטים של נקודות.
  7. אתר את טבלת ההתאמה של Nonlin כדי למצוא את ה-ICהמחושב 50 ו-95% רווח בר-סמך (95% CI) (איור 5B).

figure-protocol-5
איור 5: עקומת מינון-תגובה של PyAz90. אחוז העיכוב נמדד כפונקציה של ריכוז PyAz90 (מיקרומטר) בסולם לוגריתמי. העקומה הסיגמואידית מייצגת את הנתונים המותאמים ששימשו לקביעת ה-IC50, שהיה 0.013 מיקרומטר (רווח בר-סמך 95%: 0.012-0.014 מיקרומטר). נקודות נתונים מייצגות את הממוצע ± שגיאת התקן של הממוצע משכפולים ניסיוניים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

יצירת טפילי Ookluc מאפשרת להעריך מועמדים חדשים לתרופות לשחפת מנקודת מבט שאינה מוצעת על ידי מבחנים קיימים, במיוחד בהערכת ההשפעות של תרכובות על הפעלת גמטות, הפריה והיווצרות זיגוטה8. איור 2 ואיור 3 ממחישים את יכולתה של השיטה לסנן פאנל של תרכובות כנגד השלבים המיניים של הטפיל באופן בעל תפוקה גבוהה, מה שמקל על זיהוי המועמדים המבטיחים ביותר בבדיקה אחת (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

רוב שיטות ה-HTS המשמשות לפיתוח תרכובות שחפת חדשות מתמקדות בעיכוב גמטוציטוגנזה או בפעילות גמטוציטוצידלית. עד כה, פותחו רק שני מודלים של P. berghei המאפשרים להעריך את תפקוד הגמטוציטים, גמטוגנזה, היווצרות זיגוטה ומורפוגנזה של אוקינט5.

אחד המודלים הללו דומה ל-Ookluc, מכיוון שהוא משתמש במדווח פלואורסצנטי המקושר למקדם ctrp 17. עם זאת, Ookluc מציגה שיפורים מרכזיים, כגון השימוש ב-nLuc,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

פרויקט זה נתמך על ידי מענקים מ-Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2021/06769-0) ו-Instituto Serrapilheira (מענק G-1709-16618).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמא-אולדריץ'D8418
GraphPad Prism גרסה 10.0.0 עבור Windowsתוכנת GraphPad, בוסטון, מסצ'וסטס, ארה"ב
מלח נתרן הפרין מרירית מעי חזירסיגמא-אולדריץ'H3393
HEPES (1 מ')תרמו סיינטיפיק15630106
היפוקסנטיןסיגמא-אולדריץ'H9636
עכברים------נקבות עכברי BALB/c, בגילאי 3 עד 5 שבועות
מערכת בדיקת ננו-גלו לוציפראזפרומגהN1110
פניצילין ומינוס; סטרפטומיצין ומינוס; תמיסת ניאומיצין מיוצבתסיגמא-אולדריץ'עמ' 4083
POLARStar קורא אומגה מיקרופלייט ב.מ.ג. לאבטק----
RPMI 1640 בינוני, תוסף GlutaMAXתרמו סיינטיפיק61870036
חומצה קסנתורניתסיגמא-אולדריץ'D120804

מקורות

  1. World malaria report 2024: addressing inequity in the global malaria response. , World Health Organization. https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2024 (2025).
  2. Miller, L. H., Ackerman, H. C., Su, X., Wellems, T. E. Malaria biology and disease pathogenesis: insights for new treatments. Nature Med. 19 (2), 156-167 (2013).
  3. Tsoumani, M. E., Voyiatzaki, C., Efstathiou, A. Malaria Vaccines: From the Past towards the mRNA Vaccine Era. Vaccines. 11 (9), 1452(2023).
  4. Ménard, R., et al. Looking under the skin: the first steps in malarial infection and immunity. Nature Rev. Microbiol. 11 (10), 701-712 (2013).
  5. Appetecchia, F., et al. Transmission-blocking strategies for malaria eradication: Recent advances in small-molecule drug development. Pharmaceuticals. 17 (7), 962(2024).
  6. Baniecki, M. L., Wirth, D. F., Clardy, J. High-throughput Plasmodium falciparum growth assay for malaria drug discovery. Antimicrob Agents Chemother. 51 (2), 716-723 (2007).
  7. Delves, M., et al. The activities of current antimalarial drugs on the life cycle stages of Plasmodium: A comparative study with human and rodent parasites. PLoS Med. 9 (2), e1001169(2012).
  8. Calit, J., et al. Screening the pathogen box for molecules active against Plasmodium sexual stages using a new nanoluciferase-based transgenic line of P. berghei identifies transmission-blocking compounds. Antimicrob Agents Chemother. 62 (11), e01053-e01118 (2018).
  9. Calit, J., et al. Novel transmission-blocking antimalarials identified by high-throughput screening of Plasmodium berghei Ookluc. Antimicrob Agents Chemother. 67 (4), e0146522(2023).
  10. Lima, M. N. N., et al. Integrative multi-kinase approach for the identification of potent antiplasmodial hits. Front Chem. 7, 773(2019).
  11. Ferreira, L. T., et al. Computational chemogenomics drug repositioning strategy enables the discovery of epirubicin as a new repurposed hit for Plasmodium falciparum and P. vivax. Antimicrob Agents Chemother. 64 (9), aac.02041-aac.02119 (2020).
  12. Krishnan, K., et al. Torin 2 derivative, NCATS-SM3710, has potent multistage antimalarial activity through inhibition of P. falciparum phosphatidylinositol 4-kinase (Pf ACS Pharmacol). Transl Sci. 3 (5), 948-964 (2020).
  13. Calit, J., et al. Pyrimidine azepine targets the Plasmodium bc1 complex and displays multistage antimalarial activity. JACS Au. 4 (10), 3942-3952 (2024).
  14. Lima, M. N., et al. Chalcones as a basis for computer-aided drug design: Innovative approaches to tackle malaria. Future Med Chem. 11 (20), 2635-2646 (2019).
  15. Ferreira, L. T., et al. A novel 4-aminoquinoline chemotype with multistage antimalarial activity and lack of cross-resistance with PfCRT and PfMDR1 mutants. PLoS Pathog. 20 (10), e1012627(2024).
  16. Blagborough, A. M., et al. Assessing transmission blockade in Plasmodium spp. Methods Mol Biol. 923, 577-600 (2013).
  17. Azevedo, R., et al. Bioluminescence method for in vitro screening of Plasmodium transmission-blocking compounds. Antimicrob Agents Chemother. 61 (6), aac.02699-aac.02616 (2017).
  18. Gaitán, X. A., et al. Characterisation of the merozoite thrombospondin related anonymous protein (MTRAP) of Plasmodium berghei as a transmission-blocking antigen. Mem Inst Oswaldo Cruz. , 119(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

IC50

מאמרים קשורים