מאמר שיטה

מעקב In Vivo מונחה תמונה של תאי אב אפיתל ריאה דיסטליים מושתלים לפיברוזיס ריאתי באמצעות הדמיית חלקיקים מגנטית

763 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68477

⸱

27 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 3Department of Pediatrics and Human Development, Michigan State University, 4Lyman Briggs College, Michigan State University, 5College of Social Science, Michigan State University, 6Department of Chemistry, Hunter College, 7Corewell Health Medical Group, 8Institute for Quantitative Health Science and Engineering (IQ), Michigan State University, 9Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

טיפול תאי מציע התערבות מבטיחה לפיברוזיס ריאתי על ידי שימוש בתאי אב לתיקון רקמות פגועות ושיפור תפקוד הריאות. מכיוון שהדמיה ממלאת תפקיד מרכזי במעקב אחר אינטגרציה של תאים, כאן, אנו מתארים הדמיה מונחית חלקיקים מגנטיים מעקב in vivo של טיפול תאי בפיברוזיס ריאתי במודל עכבר.

תקציר

פיברוזיס ריאתי (PF) היא מחלת ריאות מתקדמת וכרונית המאופיינת בפגיעה חוזרת ונשנית באפיתל המכתשית המובילה לשקיעת מטריצה חוץ-תאית מוגזמת, וכתוצאה מכך לעיבוי רקמות, הצטלקות ופגיעה בחילופי גזים, מה שמוביל לתפקוד לקוי של הנשימה. בארצות הברית מדווחים מדי שנה על כ-50,000 מקרים חדשים, כאשר חולים מתמודדים עם סיבוכים חמורים כמו פנאומוטורקס, יתר לחץ דם ריאתי, אי ספיקת נשימה וסיכון מוגבר לסרטן ריאות. האפשרויות הטיפוליות הנוכחיות מוגבלות ביעילותן ומטרתן העיקרית היא להאט את התקדמות המחלה. טיפול תאי התגלה כהתערבות מבטיחה, המציעה פוטנציאל לחדש רקמת ריאה פגועה, לווסת דלקת ולשפר את תפקוד הריאות. עם זאת, יעילותם של טיפולים אלה תלויה באופן משמעותי ביכולת לנטר את התפוצה, ההישרדות והאינטגרציה של תאים מושתלים בתוך הריאות המארח.

הדמיית חלקיקים מגנטיים (MPI) היא שיטת הדמיה פרה-קלינית חדשנית, לא פולשנית, המשתמשת בננו-חלקיקי תחמוצת ברזל סופר-פרמגנטיים (SPIONs) כעוקבים. MPI מציע רגישות גבוהה, ספציפיות וללא אות רקע, המאפשר מעקב כמותי בזמן אמת של תאים מסומנים in vivo. במחקר זה, חקרנו את השימוש ב-MPI לניטור תאי אב של אפיתל ריאה דיסטלי אנושי שהושתלו בריאות של עכברים מדוכאי חיסון. התאים סומנו בריכוזי SPION משתנים כדי לייעל את האות, שאושרו על ידי צביעה חיסונית וכימות ברזל. לאחר החדרה תוך-קנה הנשימה, נרכשו סריקות MPI דו-ממדיות כדי לעקוב אחר ההתפלגות המרחבית של תאים מושתלים. הדמיה אורכית במשך שבועיים אפשרה הדמיה של אינטגרציה ושימור תאים בתוך רקמת הריאה. החדרה מוצלחת הראתה אותות MPI הן בריאות שמאל והן בריאות ימין, אשר פחתו (~65%) עם הזמן. עכברים הוקרבו לאחר מכן לצורך אימות היסטולוגי. מחקר זה מדגים את התועלת של MPI למעקב לא פולשני ואורכי של טיפול תאי בפיברוזיס ריאתי, ומסתובב סביב הטכניקות המורכבות המשמשות במהלך ההליכים.

מבוא

טיפול תאי 1,2 מציע פוטנציאל התחדשות, מקדם תיקון רקמות, מפחית דלקת ומשפר את התוצאות במחלות כרוניות כמו לוקמיה ולימפומה 3,4 (תאי גזע המטופויאטיים), דלקת מפרקים ניוונית 5,6 (תאי גזע מזנכימליים), סוכרת מסוג 17 (השתלת תאי אי), פגיעות בחוט השדרה 8,9, מחלות ניווניות10,11,12 (תאי גזע עצביים), ופיברוזיס ריאתי 13,14,15,16 (תאי אב ריאתיים). טיפולים אלה מציעים פוטנציאל משמעותי, אם כי אתגרים כמו דחייה חיסונית ויעילות ארוכת טווח עדיין נותרו17,18. פיברוזיס ריאתי (PF) היא מחלת ריאות כרונית ומתקדמת המאופיינת בהצטלקות מוגזמת של רקמת הריאה, מה שמוביל לפגיעה בתפקוד הריאות19. טיפול תאי ב-PF נועד לחדש רקמת ריאה פגועה ולהפחית פיברוזיס על ידי החדרת תאים רגנרטיביים, כגון תאי גזע מזנכימליים או תאי אב ריאה דיסטליים, לריאות הפגועות20. לתאי אב ריאה דיסטליים, הכוללים אוכלוסיות כמו תאי בסיס, תאים מכתשית מסוג II, תאי גזע ברונכיואולרים ותאי אב רב-פוטנטיים אחרים, יש את היכולת לקדם תיקון רקמות, להפחית דלקת, לחדש רקמת ריאה פגועה ולהפוך חלק מהנזק לריאות תוך שחזור תפקוד ריאות תקין21. מספר מחקרים קליניים פרה-קליניים ושלבים מוקדמים הראו כי השתלת תאי אב ריאה לריאות פיברוטיות יכולה לסייע בחידוש מבנים מכתשית, לקדם עיצוב מחדש של רקמות ולהפחית דלקת 13,22,23. בנוסף, תאים אלה יכולים להפריש גורמי גדילה וציטוקינים שונים המווסתים את הסביבה הפיברוטית, ומקדמים עוד יותר את התיקון. למרות התוצאות המעודדות בשיפור תפקוד הריאות, נותרו אתגרים באופטימיזציה של אספקת תאים, כולל בידוד יעיל, הרחבה ושילוב של תאים אלה ברקמת הריאה הפגועה, הבטחת בטיחות לטווח ארוך ומניעת תופעות לוואי לא רצויות. יש צורך במחקר מתמשך כדי לחדד את הפרוטוקולים ולהעריך את הבטיחות והיעילות ארוכת הטווח של טיפולים בתאי אב לפיברוזיס ריאתי.

השתלת תאים לריאות לפיברוזיס ריאתי כרוכה במספר טכניקות, שכל אחת מהן נועדה לשפר את העברת התאים, ההישרדות והאינטגרציה ברקמת הריאה הפגועה. השיטות הנפוצות כוללות הזרקה תוך ורידית24,25, אספקה אנדוברונכיאלית26,27 והחדרה תוך קנה הנשימה 28,29,30,31, כל אחת עם יתרונות ואתגרים ספציפיים. מתן תוך ורידי של תאי גזע מעוכב על ידי ביות ריאתי לא אופטימלי, קיבוע באיברים מחוץ למטרה, כדאיות מוגבלת לאחר עירוי והסיכון לתגובות אימונוגניות. אספקה אנדוברונכיאלית, אם כי מקומית יותר, מוגבלת על ידי התפלגות תאים הטרוגנית, חסימה פוטנציאלית של דרכי הנשימה, תגובות דלקתיות ואתגרים פרוצדורליים בארכיטקטורת ריאות פיברוטית. באופן דומה, החדרה תוך-קנה הנשימה, למרות שהיא מאפשרת שקיעה ריאתית ישירה, עלולה להוביל לפיזור תאים לא עקבי, חדירה לא מספקת לריאות דיסטליות, גירוי מקומי ושונות באחידות המינון בין תאי הריאה. למרות שכל הטכניקות הללו שואפות לשפר את הישרדות התאים, האינטגרציה והיעילות בחידוש רקמת הריאה, הבחירה בטכניקה האופטימלית תלויה בגורמים כמו סוג התאים המושתלים, שלב הפיברוזיס ובריאותו הכללית של המטופל.

למרות האתגרים שלה, החדרה תוך קנה הנשימה נותרה אחת השיטות הנפוצות ביותר להעברת תאים ישירות לריאות, במיוחד בהקשר של פיברוזיס ריאתי. בטכניקה זו, תאים מוחדרים לריאה באמצעות קטטר המוחדר לקנה הנשימה32. לאחר מכן התאים מופקדים בחלל המכתשית, שם הם יכולים לתקן את רקמת הריאה הפגועה. שיטה זו היא זעיר פולשנית וקלה יחסית לביצוע בהשוואה לגישות אספקה אחרות כמו זלוף ריאות ex vivo . מכיוון שהתאים מופקדים ישירות לריאות, זה יכול לשפר את הסיכויים לאינטגרציה ותיקון יעילים. בניגוד להזרקה תוך ורידית, החדרה תוך קנה הנשימה מונעת זרימת דם מערכתית, ומפחיתה את הסיכון לתאים להילכד באיברים אחרים כמו הכבד או הטחול, מה שמוביל להשפעה טיפולית ממוקדת יותר בריאות. למרות היתרונות הללו, השיטה עדיין מתמודדת עם אתגרים מבחינת פיזור ושימור תאים לא אופטימליים, והישרדות בתוך הריאות, מה שעלול להגביל את היעילות הטיפולית. מחקר מתמשך פועל לחדד גישה זו לתוצאות קליניות יעילות יותר. חוקרים יכולים לקבוע אם החדרה תוך קנה הנשימה מתאימה ליישומים שלהם על ידי הערכת מספר גורמים. אלה כוללים את סוג התאים המועברים, יכולתם לשרוד ולהשתלב ברקמת הריאה, וחומרת מודל המחלה (כלומר, פיברוזיס ריאתי).

הדמיה היא כלי הכרחי למעקב אחר תאים, הערכת כדאיותם, תפוצתם והשפעותיהם, שיפור ניטור הטיפול התאי ואופטימיזציה של אסטרטגיות הטיפול33. חוקרים העריכו את יעילות המסירה באמצעות הדמיה וניתוח לאחר הלידה כדי לעקוב אחר התפלגות התאים ושימורם. טכניקות שונות כמו פלואורסצנטיות, הדמיית תהודה מגנטית (MRI), טומוגרפיה ממוחשבת (CT), טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET), טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטון בודד (SPECT) ואולטרסאונד שימשו למעקב אחר תאי גזע מסומנים לפיברוזיס ריאתי. עם זאת, הם מתמודדים עם מגבלות כמו חדירת עומק נמוכה (פלואורסצנטיות), רגישות ירודה (MRI), חשיפה לקרינה (CT, PET, SPECT) ורזולוציה נמוכה (אולטרסאונד)34. למרות שאופטימיזציה של ניגודיות הדמיה, רזולוציה ותאימות ביולוגית יכולה לעזור להתגבר על אתגרים אלה במידה מסוימת, חקר טכניקות הדמיה חדשות יותר יכול גם להתגלות כחיוני למעקב מדויק אחר תאי גזע בריאות. בשנים האחרונות, הדמיית חלקיקים מגנטיים (MPI) התגלתה כשיטת הדמיה מבטיחה ונטולת קרינה, המציעה הדמיה כמותית ברגישות גבוהה, בזמן אמת, עם ניגודיות גבוהה ללא הפרעות רקע.

MPI משתמש בננו-חלקיקי תחמוצת ברזל סופר-פרמגנטיים (SPIONs) להדמיה ישירה, ועקרון העבודה שלו מבוסס על תגובת המגנטיזציה הלא ליניארית של SPIONs אלה כאשר הם נחשפים לשדה מגנטי משתנה בזמן35,36. אלקטרומגנטים משמשים ליצירת אזור נטול שדה (FFR), שבו רק חלקיקים באזור זה מציגים מגנטיזציה לא ליניארית ומייצרים אות כאשר הם נרגשים על ידי שדה מגנטי מתנודד. מצד שני, המגנטיזציה של חלקיקים מחוץ ל-FFR זה רוויה, והם אינם משתתפים בהפקת אותות. על ידי הזזה שיטתית של ה-FFR לאורך נפח ההדמיה, MPI בונה מפות מרחביות של התפלגות הננו-חלקיקים והתמונות הבאות. MPI מציע מספר יתרונות על פני שיטות הדמיה מסורתיות37,38. בניגוד ל-MRI או CT, MPI מספק אות רק מהעוקב, וכתוצאה מכך אפס רעשי רקע וניגודיות יוצאת דופן. הוא מציע הדמיה בזמן אמת עם רזולוציה זמנית גבוהה, מה שהופך אותו לאידיאלי למעקב אחר תהליכים דינמיים כגון נדידת תאים או זילוף. בנוסף, MPI רגיש מאוד, ומאפשר גילוי כמויות קטנות של SPIONs ללא קרינה מייננת, בניגוד ל-PET או CT. יתר על כן, הוא גם מדגים כימות ליניארי מצוין, המאפשר הערכה מדויקת של ריכוז העוקב. בסך הכל, MPI משלב את נקודות החוזק של רגישות, בטיחות וכימות, מה שהופך אותו לכלי רב עוצמה להדמיה ביו-רפואית. MPI מבטיח למעקב אחר תאי גזע בריאות, ומאפשר ניטור מדויק של נדידת תאים, שימור והשפעות טיפוליות. הוא מספק ניגודיות מצוינת ללא הפרעות אות רקמה, ובכך מאפשר לוקליזציה מדויקת של תאי גזע מסומנים 39,40,41,42. הסעיפים הבאים מתארים את הפרוטוקולים שננקטו עבור מחקרים אלה, ומדגימים את השימוש בהחדרה תוך-קנה הנשימה כדי להעביר את התאים המסומנים לריאות העכבר ואישור באמצעות MPI.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים נבדקים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מישיגן סטייט (IACUC) ומעורבים נבדקים אנושיים אושרו על ידי Corewell Health IRB מס' 2017-198. כל המטופלים סיפקו הסכמה מדעת בכתב לפני ההשתתפות במחקר.

דגימות של ריאות אנושיות מחולי פיברוזיס ריאתי אידיופטי (IPF) שעברו השתלת ריאות נאספו מ-Corewell Health. לפני הליך ההשתלה, כל החולים עמדו בקריטריונים האבחנתיים לפיברוזיס ריאתי אידיופטי (IPF), המאופיין בהיפוקסמיה, קוצר נשימה ונפח ריאות מופחת43. ניתוח פתולוגי של רקמה שנלקחה מהקצה הדיסטלי של אונת הריאה אישר את קיומה של פיברוזיס.

עכברי NOD/SCID זכרים נרכשו בגיל 8 שבועות והורשו להתאקלם במשך שבוע ולאחר מכן התיישנו עד 12 שבועות לפני ההליך.

1. בידוד והרחבה של תאי אפיתל בדרכי הנשימה האנושיות

  1. הנח את דגימת הריאה המושתלת על קרח כדי לשמור על שלמות התא במהלך הדיסקציה. זהה את הסימפונות/דרכי הנשימה הגדולות הקיימות בדגימה; דרכי הנשימה הקטנות ממוקמות בחלקים הדיסטליים של דגימת הריאות, הרחוקות ביותר מדרכי הנשימה הגדולות. בעזרת מכשירים מעוקרים, כורתים את החלק הדיסטלי של דגימת הריאה ומעבדים לחלקים קטנים יותר כדי לסייע בעיכול הרקמה. שטפו את הדגימה בתמיסת מלח עם פוספט (DPBS) של Dulbecco כדי להסיר עודפי דם ונוזלים, ולאחר מכן עכלו את רקמת הריאה המושתלת המכילה את דרכי הנשימה הקטנות במאגר המורכב מפרוטאז מ-Streptomyces griseus, 1x פניצילין/סטרפטומיצין, DNase I ו-1x Gentamicin בצינור של 50 מ"ל. מניחים את הטישו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס כדי להתנדנד למשך כ-4 שעות, או עד שהרקמה מתעכלת מספיק.
  2. העבירו את תכולת הצינור של 50 מ"ל דרך מסננת תאים סטרילית של 100 מיקרומטר. שוטפים את הטישו פי 3 עם DPBS ומעבירים את הכביסה דרך המסננת. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 5 דקות, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מדיום תרבית על ידי פיפטינג של תרחיף התא פי 50 עם פיפט המוגדר ל-500 מיקרוליטר.
  3. הוסף את תרחיף התאים לבקבוק תרבית בגודל 75 ס"מ2 המכיל את מדיום הגידול האפיתל של דרכי הנשימה. תרבית התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך כשבועיים.

2. תיוג תאי אפיתל של דרכי הנשימה עם ננו-חלקיקים (עוקב תחמוצת ברזל)

  1. כאשר תרביות האפיתל מתכנסות ב-80%, סמן את התאים עם עוקב תחמוצת ברזל בריכוז סופי של 250 מיקרוגרם/מ"ל. הוסף את הנפח המתאים של עוקב תחמוצת ברזל ל-10 מ"ל של מדיום תרבית לכל בקבוק של תאי אפיתל ודגר למשך 48 שעות.
    הערה: ריכוזים שונים של עוקב תחמוצת ברזל (50, 100, 200 ו-250 מיקרוגרם/מ"ל) הוערכו עבור תיוג תאים ואחריו סריקות MPI דו-ממדיות שלהם (איור 1A). ריכוז של 250 מיקרוגרם/מ"ל, יחד עם 50,000 תאים להשתלה, הושלם למחקר זה.
  2. לאחר 48 שעות, שטפו את התאים פי 3 עם DPBS כדי להסיר עודפי ננו-חלקיקים.
  3. נתק את התאים באמצעות מגיב לניתוק תאים ודגר את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, או עד שהתאים מתחילים להתרומם מפני השטח של הבקבוק.
  4. אסוף את התאים לתוך צינור של 50 מ"ל המכיל 1 מ"ל של סרום בקר עוברי. שוטפים את הבקבוק פי 3 עם 5 מ"ל DPBS, ומוסיפים את השטיפות לצינור 50 מ"ל המכיל את התאים.
  5. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 400 × גרם למשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מדיום תרבית על ידי פיפטינג של תרחיף התא פי 50 עם פיפט המוגדר ל-500 מיקרוליטר.
  6. השתמש בהמוציטומטר כדי לקבוע את ריכוז התאים ולקבוע את נפח תרחיף התאים הנדרש להשתלת in vivo .
  7. יש לנקוט 100 מיקרוליטר של תרחיף התא ולתקן ב-4% פרפורמלדהיד.

3. צביעה אימונולוגית ומיקרוסקופיה במבחנה

  1. טען את הכמות של 100 מיקרוליטר של תרחיף התאים לתוך מחסנית ציטוספין המכילה שקופית ומסנן וסובב למשך 5 דקות ב-1,000 סל"ד.
  2. מתאר את התאים בשקופית באמצעות עט הידרופובי.
  3. שטפו את השקופיות למשך 2 x 15 דקות עם DPBS.
  4. לחדור לתאים בשקופית על ידי דגירה עם 0.1% טריטון X-100 ב-DPBS למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. שטפו את התאים למשך 2 x 2 דקות עם DPBS.
  6. חסום את השקופיות עם 5% אלבומין בסרום בקר (BSA)/1% סרום עיזים ב-DPBS למשך שעתיים.
  7. דגרו את השקופיות בנוגדנים ראשוניים (אנטי-דקסטרן) בסרום עיזים של 2.5% BSA/0.5% ב-DPBS למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
  8. הסר את הנוגדן העיקרי ושטוף את המגלשות 3 x 5 דקות ב-1x Tris-Buffered Sa עם Tween 20 (TBST).
  9. דגרו את השקופיות עם נוגדן משני של 1:1,000 בסרום עיזים של 2.5% BSA/0.5% ב-DPBS למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך.
  10. שטפו את המגלשות למשך 3 x 5 דקות עם 1x TBST.
  11. הוסף חומר צביעה גרעיני, 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), לשקופית בריכוז של 1:1,000 ב-DPBS ואפשר לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  12. שטפו את השקופיות 2 x 5 דקות עם 1x TBST. הסר עודף של 1x TBST מהשקופית.
  13. הוסף אמצעי הרכבה עם DAPI והנח כיסוי זכוכית מעל המגלשה, היזהר להימנע מבועות אוויר.
  14. לאחר שהמגלשה התייצבה, אטום את שולי הכיסוי בעזרת לק שקוף.
  15. דמיינו את השקופיות במיקרוסקופ קונפוקלי.

4. השתלת תאים באמצעות החדרה תוך קנה הנשימה

  1. הכנה
    1. שקלו את העכבר כדי לחשב את מינון הבלאומיצין (BLM) הנדרש עבור כל עכבר.
    2. בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.7 מ"ל, הכינו את תמיסת ה-BLM הרצויה (מדוללת במי מלח מעוקרים) בנפח שלא יעלה על 50 מיקרוליטר.
      הערה: ריכוז התרופה ישתנה בהתאם למטרות הניסוי. BLM במשקל 0.6 U/kg שימש להליך זה.
    3. טען את תמיסת ה-BLM בפיפטה. בנוסף, טען מראש מזרק עם 200 מיקרוליטר אוויר כדי להבטיח שכל נפח הנוזל ייפלט לקנה הנשימה.
      הערה: לאחר 72 שעות של טיפול ב-BLM, תרחיף התאים המסומן יינתן באופן דומה.
    4. השתמש בספירת התאים המתקבלת משלב 2.6 כדי לחשב את נפח תרחיף התאים, המכיל 50,000 תאים, שיש לנהל.
    5. יש להרדים את העכבר על ידי הנחתו בקופסת אינדוקציה המחוברת ליחידת ההרדמה המספקת איזופלורן (2.5-3%) עד להרגעה.
      הערה: העכברים מורדמים פעמיים במהלך כל ההליך: (1) ביום מתן BLM ו-(2) ביום החדרת תאים תוך קנה הנשימה, כלומר 72 שעות לאחר מינון ה-BLM.
    6. הגדר את ערכת אינטובציית אור הסיבים כפי שמוצג באיור 2A עם בדיקת הסיבים האופטיים העוברת דרך הגרון והצנתר.
      הערה: יש למקם את הקצה המואר של הסיב ממש מחוץ (1-2 מ"מ) לצינור הצנתר.
  2. החדרה תוך-קנה הנשימה
    1. אשר הרדמה על ידי בדיקת רפלקס הדוושה על ידי צביטת הבוהן באחת מהרגליים האחוריות. לאחר אישור הרדמה מספקת, השעו את העכבר על ידי החותכות שלו במצב שכיבה על מעמד אינטובציה זוויתי של מכרסמים (איור 2B-D).
    2. בעזרת מלקחיים קהים, אחוז בזהירות בלשון ובתנועה כלפי מעלה ושמאלה, מקם את הלשון כדי לקבל הדמיה נאותה של הגרון.
    3. הפעל את בדיקת הסיבים האופטיים והיכנס לפה כדי להתקרב לקנה הנשימה. השתמש בזכוכית המגדלת של הגרון להדמיה משופרת של הגרון ואתר את מיתרי הקול בפתח קנה הנשימה.
    4. הכנס את הקטטר לפתח קנה הנשימה ונתק בזהירות רבה את הגרון ומשוך אותו החוצה. הנח טיפה זעירה של מי מלח (20 מיקרוליטר) בקצה העליון של הצנתר.
      הערה: מפלס הנוזל ינוע למעלה ולמטה, מיושר עם קצב הנשימה של העכבר. זה יאשר את מיקום הקטטר בקנה הנשימה ולא בטעות בוושט.
    5. חבר מזרק עם 200 מיקרוליטר אוויר טעון מראש ודחף את הטיפה פנימה. הנח את מתלה התא (≤50 מיקרוליטר) בצנתר והחדיר אותו באמצעות המזרק הטעון באוויר כמו קודם.
    6. כדי למנוע מהנוזל המוחדר לברוח מקנה הנשימה, השאר את הקטטר במקומו למשך 5-7 שניות. לאחר מכן, משוך בעדינות את הצנתר.
    7. שמור את העכבר באותו מיקום על מעמד האינטובציה למשך 30 שניות לפחות.
    8. הסר את העכבר והכניס אותו לכלוב התאוששות המונח על כרית חימום. יש לעקוב עד להחלמה מלאה מההרדמה.

5. הדמיית חלקיקים מגנטיים

  1. יש להרדים את העכבר על ידי הנחתו בקופסת אינדוקציה המחוברת ליחידת ההרדמה המספקת איזופלורן (2-2.5%) עד להרגעה.
  2. הגדר את מיטת העכבר בסורק MPI כאשר קו ההרדמה עובר מתחת למיטה דרך חיבורים מתאימים.
  3. בזמן שהעכבר מורדם, הכן את סורק ה-MPI להדמיה. הפעל את התוכנה המקושרת והגדר שם תיקייה בפרויקט ואת הסריקה בדומיין שם הבחינה לזיהוי, והגדר את פרמטרי הסריקה בהתאם לדרישות. כדי לבצע הליך זה, השתמש בפרמטרי סריקה אלה: סוג סריקה: סריקה דו-ממדית; מצב סריקה: סטנדרטי; ערוצי שידור: רב ערוצי (איזוטרופי); ממוצעים לתחזית: 2.
  4. בדוק את ההרדמה כמתואר בשלב 4.2.1. הנח היטב את העכבר על מיטת ה-MPI כפי שמתואר באיור 2E.
    הערה: ודא שהחוטם מיושר כהלכה עם חרוט האף המובנה של המיטה לתחזוקה נאותה של ההרדמה במהלך הסריקה.
    התראה: הרדמה לא מספקת במהלך הסריקה עלולה לגרום לעכבר להתעורר בזמן שהסריקה פועלת.
  5. לאחר הנחת העכבר בסורק, דחוף את המיטה בתוך הקדח ולחץ על התחל סריקה.
  6. לאחר השלמת הסריקה, הוציאו את העכבר ממיטת ה-MPI והכניסו אותו לכלוב התאוששות המונח על כרית חימום. יש לעקוב עד להחלמה מלאה מההרדמה.
  7. נתח את התמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מחקר הפיילוט נערך עם שישה עכברים. מתוכם, רק עכבר אחד מת לפני השלמת המחקר, ביום העשירי. עוצמות אותות MPI דו-ממדיות עבור ריכוזי תיוג שונים הוערכו כפונקציה של מספר התאים (איור 1A). נצפה כי עוצמת האות עומדת ביחס ישר לריכוז העוקב אחר תחמוצת הברזל. לכן, הריכוז של 250 מיקרוגרם/מ"ל נחשב לריכוז התיוג האופטימלי ושימש למחקרים הבאים. תיוג תאים במבחנה אושר גם באמצעות צביעה חיסונית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית לאחר מכן (איור 1B). חשוב ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

החדרה תוך קנה הנשימה בעכברים היא טכניקה מדויקת להעברת חומרים ישירות לריאות. נדרשת תשומת לב זהירה במהלך מספר שלבים קריטיים לאורך הליך זה. החל מהקפדה על עומק הרדמה נכון למניעת אי נוחות ותנועה ומיקום העכבר בשכיבה עם צוואר מורחב כדי ליישר את דרכי הנשימה לגישה ברורה לפתח קנה הנשימה. שימוש במדכא לשון עשוי לסייע בשמירה על דרכי הנשימה פתוחות. יש לוודא שהקטטר מוחדר בזהירות ויש להחדיר את החומרים (כגון תאי גזע, תרופות, ננו-חלקיקים) לאט כדי למנוע ריפלוקס או אספירציה. לאחר ההחדרה, הקפידו על החלמה מלא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

המימון למחקר זה ניתן בחלקו על ידי מענק מ-R01HL153165-01A1 ל-X.P.L. ו-R21AI159928-01 ל-P.W.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.7 mL microcentrifuge tubeDOT ScientificRN1700-GMTלאיסוף תאים והכנת דילולים של BLM
Anti-Dextran antibdoySTEMCELL Technologies60026נוגדן ראשוני
BD Luer-Lok SyringeBecton, Dickinson309628להזרקות אוויר במהלך השתרשה תוך-קנה
Cytospin 3Thermo Shandon74010121GB
DNase IMillipore-Sigma10104159001
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS -/-) Gibco14190250
Fetal Bovine Serum ThermoFisher ScientificA5670701
Gentamicin Gibco15750060
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 568ThermoFisher ScientificA-11004נוגדן משני
Goat SerumMillipore-SigmaG9023
IsofluraneCovetrus11695067772הרדמה בגז
Isoflurane vaporizerSOMNI ScientificVS6002מכשיר הרדמה
MomentumMagnetic Insight Incסורק דימות חלקיקים מגנטיים פרה-קליני (MPI)
Mouse intubation kitOHANOhan-201ערכת אינטובציה מלאה עם כל האביזרים הנדרשים
NOD/SCID MiceJackson LaboratoryRRID:IMSR_JAX:001303מודל עכבר חסר חסינות
Penicillin/Streptomycin Gibco15140122
PneumaCult-Ex Plus Medium STEMCELL Technologies5040
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI InvitrogenP36962מדיום הרכבה לשקופיות צבועות אימונולוגית
Protease from Streptomyces griseus Millipore-SigmaP5147
Surgical kitמלקטות בקצה מעוגל לתפיסת לשון העכבר
Tris-Buffered Saline with Tween20 (TBST)ThermoFisher Scientific28360
TrypLE Express Enzyme ThermoFisher Scientific12604021
VivoTrax PlusMagnetic InsightMIVTP01מסלול תחמוצת ברזל לסימון תאים in vitro ולאחר מכן MPI

מקורות

  1. Biehl, J. K., Russell, B. Introduction to Stem Cell Therapy. J Cardiovasc Nurs. 24 (2), 98-103 (2009).
  2. Herberts, C. A., Kwa, M. S. G., Hermsen, H. P. H. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9 (1), 29(2011).
  3. Bair, S. M., Brandstadter, J. D., Ayers, E. C., Stadtmauer, E. A. Hematopoietic stem cell transplantation for blood cancers in the era of precision medicine and immunotherapy. Cancer. 126 (9), 1837-1855 (2020).
  4. Xuan, L., Liu, Q. Maintenance therapy in acute myeloid leukemia after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J Hematol Oncol. 14 (1), 4(2021).
  5. Zhu, C., Wu, W., Qu, X. Mesenchymal stem cells in osteoarthritis therapy: a review. Am J Transl Res. 13 (2), 448-461 (2021).
  6. Giorgino, R., et al. Knee osteoarthritis: Epidemiology, pathogenesis, and mesenchymal stem cells: What else is new? An update. Int J Mol Sci. 24 (7), 6405(2023).
  7. Jeyagaran, A., et al. Type 1 diabetes and engineering enhanced islet transplantation. Adv Drug Deliv Rev. 189, 114481(2022).
  8. Shinozaki, M., Nagoshi, N., Nakamura, M., Okano, H. Mechanisms of stem cell therapy in spinal cord injuries. Cells. 10 (10), 2676(2021).
  9. Zipser, C. M., et al. Cell-based and stem-cell-based treatments for spinal cord injury: evidence from clinical trials. Lancet Neurol. 21 (7), 659-670 (2022).
  10. Kim, S. W., et al. Neural stem cells derived from human midbrain organoids as a stable source for treating Parkinson's disease: Midbrain organoid-NSCs (Og-NSC) as a stable source for PD treatment. Prog Neurobiol. 204, 102086(2021).
  11. Nie, L., et al. Directional induction of neural stem cells, a new therapy for neurodegenerative diseases and ischemic stroke. Cell Death Discov. 9 (1), 215(2023).
  12. Yue, C., Feng, S., Chen, Y., Jing, N. The therapeutic prospects and challenges of human neural stem cells for the treatment of Alzheimer's Disease. Cell Regen. 11 (1), 28(2022).
  13. Kim, J. -H., et al. Human pluripotent stem cell-derived alveolar organoids for modeling pulmonary fibrosis and drug testing. Cell Death Discov. 7 (1), 48(2021).
  14. Cheng, W., Zeng, Y., Wang, D. Stem cell-based therapy for pulmonary fibrosis. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 492(2022).
  15. Milman Krentsis, I., et al. Lung cell transplantation for pulmonary fibrosis. Sci Adv. 10 (34), eadk2524(2024).
  16. Suezawa, T., et al. Disease modeling of pulmonary fibrosis using human pluripotent stem cell-derived alveolar organoids. Stem Cell Rep. 16 (12), 2973-2987 (2021).
  17. Madrid, M., Sumen, C., Aivio, S., Saklayen, N. Autologous induced pluripotent stem cell-based cell therapies: Promise, progress, and challenges. Curr Protoc. 1 (3), e88(2021).
  18. Balistreri, C. R., et al. Stem cell therapy: old challenges and new solutions. Mol Biol Rep. 47 (4), 3117-3131 (2020).
  19. Richeldi, L., Collard, H. R., Jones, M. G. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 389 (10082), 1941-1952 (2017).
  20. Tzouvelekis, A., Antoniadis, A., Bouros, D. Stem cell therapy in pulmonary fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 17 (5), 368-373 (2011).
  21. Rawlins, E. L. Lung epithelial progenitor cells. Proc Am Thorac Soc. 5 (6), 675-681 (2008).
  22. Han, M. -M., et al. Nanoengineered mesenchymal stem cell therapy for pulmonary fibrosis in young and aged mice. Sci Adv. 9 (29), eadg5358(2023).
  23. Averyanov, A., et al. First-in-human high-cumulative-dose stem cell therapy in idiopathic pulmonary fibrosis with rapid lung function decline. Stem Cells Transl Med. 9 (1), 6-16 (2019).
  24. Glassberg, M. K., et al. Allogeneic human mesenchymal stem cells in patients with idiopathic pulmonary fibrosis via intravenous delivery (AETHER): A phase I safety clinical trial. Chest. 151 (5), 971-981 (2017).
  25. Zhao, X., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cell therapy for reverse bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis. Sci Rep. 13 (1), 13183(2023).
  26. Tzouvelekis, A., et al. A prospective, non-randomized, no placebo-controlled, phase Ib clinical trial to study the safety of the adipose derived stromal cells-stromal vascular fraction in idiopathic pulmonary fibrosis. J Transl Med. 11 (1), 171(2013).
  27. Tzouvelekis, A., et al. Stem cell therapy for idiopathic pulmonary fibrosis: a protocol proposal. J Transl Med. 9 (1), 182(2011).
  28. Choi, S. M., et al. Classical monocyte-derived macrophages as therapeutic targets of umbilical cord mesenchymal stem cells: comparison of intratracheal and intravenous administration in a mouse model of pulmonary fibrosis. Respir Res. 24 (1), 68(2023).
  29. Llontop, P., et al. Airway transplantation of adipose stem cells protects against bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J Investig Med. 66 (4), 739-746 (2018).
  30. Gad, E. S., et al. The anti-fibrotic and anti-inflammatory potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells and nintedanib in bleomycin-induced lung fibrosis in rats. Inflammation. 43 (1), 123-134 (2020).
  31. Aal Porzionato,, et al. Intratracheal administration of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles reduces lung injuries in a chronic rat model of bronchopulmonary dysplasia. Am Jl Physiol Lung Cell Mol Physiol. 320 (5), L688-L704 (2021).
  32. Ortiz-Muñoz, G., Looney, M. R. Non-invasive Intratracheal Instillation in Mice. Bio Protoc. 5 (12), e1504(2015).
  33. Srinivas, M., et al. Imaging of cellular therapies. Adv Drug Deliv Rev. 62 (11), 1080-1093 (2010).
  34. Li, Z., Tong, L., Zhao, H., He, Z. Medical Imaging in Clinical Practice. Erondu, F. O. , IntechOpen. (2013).
  35. Knopp, T., Gdaniec, N., Möddel, M. Magnetic particle imaging: from proof of principle to preclinical applications. Phys Med Biol. 62 (14), R124-R178 (2017).
  36. Borgert, J., et al. Fundamentals and applications of magnetic particle imaging. J Cardiovasc Computed Tomogr. 6 (3), 149-153 (2012).
  37. Mohapatra, J., et al. Principles and applications of magnetic nanomaterials in magnetically guided bioimaging. Mater Today Phys. 32, 101003(2023).
  38. Pablico-Lansigan, M. H., Situ, S. F., Samia, A. C. S. Magnetic particle imaging: advancements and perspectives for real-time in vivo monitoring and image-guided therapy. Nanoscale. 5 (10), 4040-4055 (2013).
  39. Bulte, J. W. M., et al. Quantitative "hot-spot" imaging of transplanted stem cells using superparamagnetic tracers and magnetic particle imaging. Tomography. 1 (2), 91-97 (2015).
  40. Lemaster, J. E., Chen, F., Kim, T., Hariri, A., Jokerst, J. V. Development of a trimodal contrast agent for acoustic and magnetic particle imaging of stem cells. ACS Appl Nano Mater. 1 (3), 1321-1331 (2018).
  41. Shalaby, N., et al. Complementary early-phase magnetic particle imaging and late-phase positron emission tomography reporter imaging of mesenchymal stem cells in vivo. Nanoscale. 15 (7), 3408-3418 (2023).
  42. Wang, Q., et al. Artificially engineered cubic iron oxide nanoparticle as a high-performance magnetic particle imaging tracer for stem cell tracking. ACS Nano. 14 (2), 2053-2062 (2020).
  43. Li, X., et al. Extravascular sources of lung angiotensin peptide synthesis in idiopathic pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (5), L887-L895 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SPION

מאמרים קשורים