הקלטות מערך מולטי-אלקטרודות בצפיפות גבוהה של גלי רשתית באמצעות פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית

Rishikesh Kumar Gupta; Natalie Clark; Kaylee Yeager; Alexander Fisch; Alexandre Tiriac

doi:10.3791/68493

מאמר שיטה

הקלטות מערך מולטי-אלקטרודות בצפיפות גבוהה של גלי רשתית באמצעות פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית

DOI:

10.3791/68493

⸱

24 ביוני 2025

Rishikesh Kumar Gupta^*¹ , Natalie Clark^*¹ , Kaylee Yeager¹ , Alexander Fisch¹ , Alexandre Tiriac¹^,²^,³

¹Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, ²Vanderbilt Brain Institute, Vanderbilt University, ³Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Vanderbilt University

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכי רב-אלקטרודות בצפיפות גבוהה (HD-MEAs) משמשים לחקר גלי רשתית ספונטניים, הממלאים תפקיד מכריע בהתפתחות מעגלים עצביים. פרוטוקול זה מתאר את השלבים להכנת רקמת רשתית של עכבר וביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות באמצעות HD-MEAs על פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גלי רשתית ספונטניים הם סימן היכר של פעילות רשת הרשתית במהלך ההתפתחות, וממלאים תפקיד מכריע ביצירת מערכת הראייה על ידי השפעה על עידון האקסונים, חדירות כלי הדם והבשלה כללית של מעגלים עצביים. גלים אלה נחקרים בדרך כלל בתכשירי רשתית ex vivo באמצעות מערכי רב-אלקטרודות (MEAs), המאפשרים רישום אלקטרופיזיולוגי של אוכלוסיות גדולות של פעילות תאי גנגליון ברשתית (RGC). אלקטרופיזיולוגיה מבוססת MEA הפכה לכלי רב עוצמה בשל קלות השימוש בה לאיסוף מהיר של נתונים בתפוקה גבוהה, ובכך הופכת אותה למתאימה באופן אידיאלי לחקר פעילות הרשתית במגוון תנאי ניסוי.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השלבים הקריטיים להכנת רקמת הרשתית לרכישת נתונים אלקטרופיזיולוגיים באמצעות MEA בצפיפות גבוהה (HD-MEA) על פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית. התהליך מתחיל בבידוד זהיר של רשתית שלמה מבעלי חיים יילודים בתנאים פיזיולוגיים. לאחר ההכנה, הרשתית מותקנת בזהירות על שבב HD-MEA, המורכב מרשת של 26,400 אלקטרודות המסוגלות לבצע הקלטות חוץ-תאיות בו זמנית מ-1,000 RGCs לפחות. ההקלטות יכולות להימשך עד מספר שעות. בסופו של דבר, גישה מתודולוגית זו מציעה יישומים חשובים בחקר התפתחות הרשתית, מחלות ומחקרים השוואתיים בין מינים, התורמים להתקדמות רחבה יותר במדעי המוח ובחקר הראייה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גלי רשתית ספונטניים הם התפרצויות מחזוריות של פעילות מתואמת שנצפו ברשתית המתפתחת לפני תחילת הראייה. בעכברים, המעגלים המתחילים ומפיצים גלי רשתית משתנים במהירות במהלך ההתפתחות, מתחילים בעובר ומסתיימים בפקיחת העיניים (יום 14 לאחר הלידה)¹. עם התפתחות מעגלי הרשתית, התכונות המרחביות-זמניות של גלי הרשתית משתנות באופן דרמטי ^2,3. מספר מחקרים תומכים בכך שתכונות מרחביות-זמניות ספציפיות אלה מדריכות את התפתחות מערכת הראייה: פעילות אסינכרונית בין העיניים מורה על הפרדה ספציפית לעין⁴, גודל שטח הגל מורה על עידון האקסונים הרטינוטופיים באזורי המוח הדו-עיניים ^5,6, וכיוון ההתפשטות של הגלים מעורב בהוראת מעגלי סלקטיביות הכיוון בקוליקולוס העליון³. מעבר למעגלים עצביים, גלי הרשתית אחראים להתפתחות החדירות של כלי הדם⁷. בנוסף, התגלה כי גלי הרשתית שלב II שולטים בצמיחה של אזורי שדה קליטה ומייצבים אותו בתאי גנגליון רשתית (RGCs)⁸. באופן קריטי, גלי רשתית חריגים במהלך ההתפתחות יכולים להיות הבסיס להפרעות נוירו-התפתחותיות שונות, ואכן, גלי רשתית אינם תקינים במודל עכבר של ניסטגמוס^{מולד 3}. בהתחשב בתפקידם הקריטי בהתפתחות מוקדמת של מערכת הראייה וההשלכות על מחלות, יש צורך לתעד את הדינמיקה המרחבית-זמנית של גלי הרשתית בכל גיל ובכל מודל של בעלי חיים.

מספר שיטות הופיעו לחקר גלי רשתית. גם אלקטרופיזיולוגיה של תא בודד ^9,10 וגם הדמיית סידן 11,12,13,14,15 הובילו לממצאים מכוננים על מעגלים ותפקוד גלי הרשתית. כאן, אנו מתמקדים בהקלטות מערך מרובות אלקטרודות (MEA), שיטה ששימשה מאז החקירה המוקדמת של גלי רשתית¹⁶ והמשיכה להשתפר כטכניקה². MEAs מאפשרים רישום חוץ-תאי בו זמנית של פוטנציאל פעולה ממאות עד אלפי RGCs, ומאפשרים לחוקרים לעקוב אחר התחלה, התפשטות וסיום גלים בדומה למה שאפשרי עם הדמיית סידן. מכיוון ש-MEAs מתעדים ישירות את פוטנציאל הפעולה מ-RGCs, ניתן להשתמש ב-MEAs כדי לחקור מודלים שונים של עכברים גנטיים או אורגניזמים שאינם מודלים ללא סיבוך נוסף של הכנסת אינדיקטור סידן. ניתן גם לתרבית רקמה ישירות ב-MEA, מה שמאפשר זמני רישום ארוכים מאוד. MEAs הם גם ניתנים להרחבה גבוהה, כאשר המוצרים הנוכחיים מאפשרים עד שישה MEAs פעילים בבת אחת, מה שיכול לאפשר הערכה מהירה של רשתית ולזרז גילוי תרופות. אולי החוזק הגדול ביותר של MEAs הוא היכולת שלהם לדגום תאים רבים בקצב דגימה גבוה, מה שמאפשר למעבדות ברחבי העולם להשיג במהירות מערכי נתונים עשירים אך דורש מומחיות בעיבוד שלאחר מכן.

המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לספק פרוטוקול מפורט וניתן לשחזור להכנת רקמת רשתית וביצוע רישומים אלקטרופיזיולוגיים באמצעות מערכת MEA בצפיפות גבוהה (HD-MEA) בעלת באר אחת לחקר גלי רשתית ספונטניים EX VIVO. שיטה זו מבטיחה איסוף נתונים בתפוקה גבוהה ולאורך זמן, מה שהופך אותה למתאימה למגוון רחב של מחקרים התפתחותיים וקשורים למחלות. מערכת HD-MEA המתקדמת החדשה מבוססת CMOS, המאפשרת >1,000 אתרי אלקטרודות בבת אחת, מציעה מספר יתרונות על פני גישות אלקטרופיזיולוגיות מסורתיות. מערך האלקטרודות בצפיפות גבוהה (26,400 אלקטרודות) מאפשר הקלטות חוץ-תאיות מדויקות ובו זמנית מעד 1,012 RGCs, ולוכד דפוסי פעילות מרחבית בקנה מידה עדין. עיצוב הבאר היחידה מספק תנאי הקלטה אחידים¹⁷. בנוסף, מערכת זו מאפשרת הקלטות ארוכות טווח הנמשכות מספר שעות, מה שמאפשר לחקור דינמיקת גלים בתנאים פיזיולוגיים ופרמקולוגיים שונים ללא פגיעה משמעותית באות¹⁸. על ידי מתן פרוטוקול, מחקר זה נועד להנגיש את טכנולוגיית HD-MEA לקהל רחב יותר של חוקרים במדעי המוח, רפואת עיניים ומדעי הראייה. שיטה זו מייצגת צעד משמעותי קדימה בחקר גלי הרשתית, ומציעה דרכים חדשות לחקר התפתחות מוקדמת של מערכת הראייה, מנגנוני מחלה והתערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את השלבים לבידוד והכנת רקמת רשתית מעכברים יילודים להקלטות MEA של גלי רשתית באמצעות פלטפורמת Maxwell Biosystems HD-MEA. ההליך נועד לשמר תנאים פיזיולוגיים, להבטיח שרקמת הרשתית תישאר שלמה מבחינה מבנית, נקייה מנזק ומוכנה כראוי למגע אלקטרודה אופטימלי. ניסויים אלה אושרו על ידי תוכנית הטיפול והשימוש בבעלי חיים של ונדרבילט, תחת פרוטוקול מספר M2200056-00. העכברים (בני 1-2 שבועות, שני המינים) שוכנו במחזור של 12 שעות יום/לילה וניזונו מתזונת צ'או רגילה.

1. הכנת רקמת רשתית

בידוד הרשתית
הערה: עיין בטבלת החומרים לפרטים על החומרים, הציוד והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה (ראה גם איור 1).
1. הכנת סביבת העבודה
  1. הכן נוזל מוחי מלאכותי (aCSF): 125 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 1.25 מ"מ NaH₂PO₄, 26 מ"מ NaHCO₃, 2 מ"מ CaCl₂, 1 מ"מ MgCl₂, 10 מ"מ גלוקוז, מבעבע בקרבוגן: 95% O₂/5% CO₂ (pH 7.4, אוסמולריות 290 ± 10 mOsm) ואחסן אותו ב-5 מעלות צלזיוס. שמור את ה-aCSF על קרח בזמן שהוא מחומצן במשך 10 דקות לפני הדיסקציה.
    הערה: יש להוסיף את ה-CaCl₂ אחרון, לאחר שהתמיסה מבעבעת בקרבוגן למשך 10 דקות.
  2. התחל לחמצן של aCSF טרי וקר כקרח (למשך 10 דקות לפחות).
  3. הגדר כלי דיסקציה ומיקרוסקופ.
2. המתת חסד של בעל החיים על פי הנחיות מוסדיות.
3. גרעין את העיניים באמצעות מספריים קפיציים מעוקלים-
  1. מכיוון שלגורים לאחר הלידה יש עיניים עצומות עד P11-13 (בעכבר) ויש לפתוח את העפעפיים בזהירות, השתמשו במלקחיים זעירים כדי לאחוז בעפעפיים ובמספריים קפיציים כדי להסיר אותם. הוצא בזהירות את העיניים בעזרת מספריים קפיציות, הימנע מנזק לעיניים.
  2. חתכו את עצב הראייה והניחו את העיניים ב-aCSF מחומצן. השתמש בפיפטה כדי להזיז בעדינות את העין בין צלחות הפטרי.
    הערה: לשאר פרוטוקול הדיסקציה, רענן עם aCSF מחומצן כל 10 דקות.
4. תחת מיקרוסקופ דיסקציה,
  1. בצע חתך קטן בקרנית באמצעות מחט תוך ייצוב העין בעזרת מלקחיים.
  2. נתח את הקרנית בצורה בוטה על ידי קריעה עדינה לאורך היקף הסקלרל.
  3. הסר את הקשתית והעדשה. אם הרשתית מחוברת לעדשה אצל בעלי חיים צעירים, הפרד אותה בעדינות באמצעות מלקחיים.
    הערה: אצל בעלי חיים צעירים, הרשתית מחוברת לפעמים לעדשה. השתמש במלקחיים כדי למשוך בעדינות את העדשה מהרשתית באמצעות זוג מלקחיים אחד כדי למשוך את העדשה והשני מונח על הקצוות החיצוניים של הרשתית כדי לשמור על הרשתית במקומה בזמן הסרת העדשה.
5. כוון את הרשתית.
  1. זהה את הצד הגחוני באמצעות רקמת הכורואיד (ראה Sondereker et ^al.19 לפרוטוקול מפורט על התמצאות) ומקם אותו מול החוקר כששכבת ה-RGC פונה כלפי מעלה.
  2. השתמש באזמל מעוקל כדי לבצע ייחוס לחתוך 45° נגד כיוון השעון מציר הגחון.
  3. בעזרת מלקחיים עדינים, יש להפריד בעדינות את הרשתית מהאפיתל הפיגמנטי של הרשתית (RPE) ומהסקלרה.
    הערה: בעכברים צעירים יותר, ה-RPE מתקלף בקלות מהרשתית. בעכברים מבוגרים יותר, ה-RPE מחובר יותר לרשתית. אם, לאחר הסרת ה-RPE מרוב הרשתית, ה-RPE עדיין מעוגן לרשתית דרך עצב הראייה, השתמש במספריים קפיציים כדי לנתק את הקשר הזה. זה מונע נזק לרקמת הרשתית ליד עצב הראייה.
6. לרשתית היילודים אין כמעט גוף זגוגית, אך לרשתית מבוגרת יותר יש (מופיע כחוט חום לאורך שפת הרשתית, אך הסיבים מתחברים זה לזה גם בתוך הזגוגית). בעזרת המלקחיים העדינים, הסר את רקמת הזגוגית שנמצאת מעל שכבת ה-RGC.
  הערה: שכבה סיבית זו יורדת לפעמים כאשר מסירים את העדשה. אם לא, חשוב להסיר כמה שיותר ממנו, אחרת זה ימנע מגע תקין של RGCs עם אלקטרודות.
7. בעזרת אזמל, ערוך ארבעה חתכי תבליט כדי לעזור לרשתית לשכב שטוחה בכלי. כדי לדעת ולשמור על התמצאות מאוחר יותר, חתוך את שתי הפינות של רביע הגחון בעזרת אזמל.

2. הרכבת הרשתית על שבב MEA

הרכבת הרשתית-
1. העבירו בעדינות את הרשתית מצלחת הפטרי לשבב MEA באמצעות פיפטת ההעברה כשהקצה חתוך. ודא שיש מספיק aCSF בשבב כדי לכסות את תחתית הבאר.
2. השתמש במברשת השיער היחיד כדי לתמרן בעדינות את הרשתית שתמוקם מעל האלקטרודות, שכבת RGC פונה לאלקטרודות.
3. בעזרת פיפטה של 10 מיקרוליטר, הסר בעדינות aCSF נוסף סביב רקמת הרשתית. הטה את השבב בזווית כדי להיפטר מ-aCSF נוסף.
  הערה: לעולם אל תיגע באלקטרודות או במגברים עם קצה הפיפטה. כאשר מסירים aCSF, הרשתית תשתטח יותר. אם חלק כלשהו של הרשתית מקופל מתחת לעצמו, השתמש במברשת השיער הבודד כדי לגרוף בעדינות מתחת לעלון הרצוי כדי לפרוש אותו. כדי למנוע מהרשתית לזוז תוך כדי פתיחת חלק כלשהו של העלעלונים, ניתן להשתמש במברשת שנייה לשיער יחיד כדי להפעיל לחץ עדין במרכז הרשתית, היכן שהעצב האופטי מתחבר.
4. יבש את הבאר ככל האפשר על ידי הטיית השבב בזווית של 45° והסרת אחרון ה-aCSF שמצטבר בחלק המוטה של השבב.
  הערה: זה יגדיל את החיבור בין הרשתית לאלקטרודות.
5. השתמש בנייר סינון כדי לטפוח בעדינות ולייבש את קצוות הרשתית. הנח את שבב ה-MEA בתא הקלטה.
שיפור מגע האלקטרודה-
1. השתמש בתוספת מחזיק רקמות להחלפה כדי לדחוף בעדינות את הרשתית על האלקטרודות, להבטיח מגע אופטימלי ולשפר את יחס האות לרעש.
  הערה: יש להפסיק להוריד את תוספת מחזיק הטישו ברגע שהיא יוצרת מגע עם הרשתית ("נקודה רטובה" ברורה תיראה בנקודת המגע). הורדה נוספת של מחזיק האלקטרודה עלולה לפגוע ברקמת הרשתית. מעבר מהיר משלב 2.1.4 ל-2.2.1 כדי למזער את משך הזמן שבו הרשתית נשארת ללא aCSF מחומצן; שלב זה הוא קריטי ויש להשלים אותו במהירות האפשרית. חשוב לנוע מהר בעת השטחת הרשתית על השבב, עם זאת, חשוב גם שרוב ה-aCSF מהדיסקציה יתייבש כך שהרשתית תיצור מגע טוב עם האלקטרודה. הליכה מהירה מדי כדי להכניס את הרשתית לחמצון מסתכנת בחוסר מגע טוב עם אלקטרודות הקלטה, והליכה איטית מדי מסתכנת בתאי הרשתית להיות היפוקסיים ולמות. אנו מוצאים ש-30-60 שניות מובילות למגע טוב ולרשתית בריאה (כלומר, אנו צופים בגלי רשתית טיפוסיים).
2. באמצעות מערכת הזילוף המוזכרת, התחל למלא היטב את שבב MEA ב-aCSF מחומצן בקצב זרימה של 2 מ"ל/דקה.
  הערה: מומלצת מערכת זלוף פתוחה, מכיוון שהרעש החשמלי נשאר נמוך והיא מספקת aCSF טרי לרשתית. ודא שמערכת חימום מקוונת מחוברת למערך הזלוף כדי לחמם את ה-aCSF לתנאים פיזיולוגיים.
3. הפעל את התנור המובנה של מערכת הזילוף כדי לחמם את ה-aCSF ל-32-34 מעלות צלזיוס.

3. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות

הקלטות חוץ-תאיות-
1. הפעל את מערכת ההקלטה.
2. במחשב הרכישה, לחץ פעמיים תחילה על סמל השרת ולאחר מכן על היקף כדי לפתוח אותו.
3. לחץ על סמל האתחול בממשק ההיקף והזן את מזהה השבב MEA כדי להתחיל הקלטות חוץ-תאיות באמצעות מערכת MEA.
4. לחץ על סמל היסט בממשק ההיקף כדי להגדיר את ההיסט.
5. התאם את הגדרות הרווח והמסנן כדי לייעל את זיהוי האות. השתמש בהגדרות ברירת המחדל של רווח 512 ומעבר גבוה של 300 הרץ; הגדר את קצב הדגימה על 20 קילו-הרץ.
6. בחר את תצורת ההקלטה המתאימה. השטח הפעיל הכולל שניתן לדגום הוא 3.85 x 2.1 מ"מ². התוכנה מאפשרת למשתמשים לבחור כיצד להגדיר את מרווח האלקטרודות; כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש בהגדרת ברירת המחדל שמפזרת באופן שווה את אלקטרודות ההקלטה על פני השטח הפעיל המרבי, מכיוון שזו דוגם על פני כמה שיותר מהרשתית. זה מוביל למרווח של 87.5 מיקרומטר לכל אלקטרודת הקלטה.
7. אפשר לרשתית להתאקלם בתא ההקלטה למשך 60 דקות.
8. התחל הקלטות פעילות ספונטניות מ-RGCs על-ידי ניווט לכרטיסייה Assay ובחירה בסמל Create New Assay . בחר את סוג בדיקת הרשת , הקצה שם קובץ מתאים ולחץ על אישור כדי לשמור את התצורה. הגדר את משך הזמן הרצוי להקלטה על ידי התאמת הפרמטר זמן הקלטה (שניות). הפעל את האפשרות רק ספייק להתמקד בנתוני ספייק, ולאחר מכן לחץ על הפעל את סמל הבדיקה כדי להתחיל את סשן ההקלטה.
  הערה: להקלטות של גלי רשתית של 10 דקות ומעלה, אנו ממליצים להשתמש בהגדרת הקוצים בלבד , השומרת רק את חותמות הזמן של פוטנציאל הפעולה באמצעות כלי מובנה לזיהוי ספייק במקום העקבות האלקטרופיזיולוגיות הגולמיות המלאות לכל ערוץ. הסיבה לכך היא שהקלטה ממושכת (>10 דקות) על פני 1,024 ערוצים עלולה לגרום בקלות לקבצי נתונים בגודל TB שמאתגרים מבחינה טכנית לניתוח ולהאט באופן דרסטי את התקדמות המחקר. אישרנו שנתונים גולמיים המשתמשים בזמני ספייק משכפלים רק את התכונות המרחביות-זמניות הידועות של גלי הרשתית: עבור גלי שלב II, אנו צופים בגלים גדולים המכסים את רוב הרשתית ומתרחשים בתדרים התואמים לדיווחים קודמים (ראה איור 2). אנו מציינים שאם פרויקט המחקר דורש ניתוח מעמיק יותר של צורות גל ספייק, אז רישום העקבות האלקטרופיזיולוגיים הגולמיים הוא הכרחי.
9. עקוב מעת לעת אחר ההקלטה השוטפת כדי לוודא שאיסוף הנתונים מתקדם כצפוי והמערכת פועלת כראוי.

4. נוהל ניקוי

לאחר השלמת ההקלטה ושמירת הנתונים, כבה את תנור החימום המקוון ולאחר מכן כבה את מערכת הזילוף.
הסר בזהירות את תוספת מחזיק הרקמות וחלץ את שבב ה-MEA. נקו את השבב על ידי שטיפה תחילה עם 70% אתנול, ולאחר מכן מים נטולי יונים (DI).
כדי למנוע סתימת הצינור, יש לשטוף את מערכת הזילוף במי DI למשך 15 דקות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקלטות בתפוקה גבוהה וניתוח גלי רשתית עם HD-MEA
ביצענו הקלטת HD-MEA של גלי רשתית ספונטניים במשך שעה (איור 2). תרשים רסטר של פעילות עצבית מראה את הדפוס המובנה של גלי הרשתית, כאשר כל נקודה מייצגת פוטנציאל פעולה שזוהה מאלקטרודה בודדת (איור 2A, למטה). סיכום פעילות על פני אלקטרודות מביא לעקבה בודדת, מה שמקל על הדמיית תזמון הגלים במהלך ההקלטה של שעה אחת (איור 2A, למעלה). מפת חום שמייצגת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה ניתנת לשחזור ותפוקה גבוהה להכנת רקמת רשתית וביצוע הקלטות HD-MEA, ומציע שיטה חזקה לחקר פעילות רשת הרשתית. טכנולוגיית HD-MEA מציעה יתרונות משמעותיים על פני טכניקות אלקטרופיזיולוגיות והדמיה מסורתיות, במיוחד בלכידת נתונים בתפוקה גבוהה. HD-MEA מספק הקלטות דיוק בזמן אמת בקנה מידה של אלפית השנייה של דינמיקת גלי רשתית ספונטנית, המאפשרת ייזום מדויק של גלים, התפשטות ואפיון סנכרון. בנוסף, HD-MEA עולה על שיטות מהדק תיקון בכך שהוא מאפשר הקלטות בו זמנית מאלפי תאי גנגליון...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נתמך על ידי מענקי NIH R00EY030909 ל-A.T.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פיפטת העברה חד פעמית 3 מ"ל (עם קצה חתוך)	פישרברנד	13-711-9 ס"מ	מסייע בהזזת הרשתית בין צלחות פטרי.
נוזל מוחי מלאכותי (aCSF)			שומר על תנאים פיזיולוגיים לרקמת הרשתית; מורכב מ-NaCl, KCl, NaH₂PO₄, NaHCO₃, CaCl₂, MgCl₂, גלוקוז ומבעבע בקרבוגן.
CaCl₂	Fisher Chemicals	C79-500	להכנת נוזל מוחי מלאכותי (aCSF)
אספקת קרבוגן (95% O₂, 5% CO₂)			משמש לחמצון aCSF ולשמירה על כדאיות הרקמות.
אזמל להב מעוקל (#10)	Integra	4-110	משמש לחיתוך רקמות בצורה מדויקת.
מיקרוסקופ דיסקציה (סטריאוסקופ)	Zeiss	Stemi 508	חיוני להדמיה וטיפול ברקמת הרשתית.
גלוקוז	פישר כימיקלים	BP350-1	להכנת נוזל מוחי שדרה מלאכותי (aCSF)
מחמם בשורה	מערכת רב ערוצית	TC02	מחמם aCSF ל 32-34 מעלות; C לתנאים אופטימליים.
Ismatec Perfusion System	Ismatec	ISM4208	שומרת על זרימה רציפה של aCSF מחומצן.
KCl	Fisher Chemicals	P271-500	להכנת נוזל מוחי שדרה מלאכותי (aCSF)
KH₂PO₄	Sigma Aldrich	P5504-100g	להכנת נוזל מוחי שדרה מלאכותי (aCSF)
יחידת הקלטה MaxOne Maxwell	Biosystems	MX1-BRD	ממשק בין שבב MaxOne למערכת
MaxOne System MaxOne Biosystems		מערכת ליבה MX1-SYS	לרקודרים אלקטרופיזיולוגיים מבוססי MEA.
מחזיק רקמות MaxOne עם מיקרומניפולטור בעל 3 צירים ותוספות הניתנות להחלפה	Maxwell Biosystems	MX1-HLD	מבטיח מיקום מדויק של הרשתית על שבב MEA.
שבב MEA (MX1-S-CHP, MaxWell Biosystems)	מקסוול ביוסיסטמס	MX1-S-CHP	מערך מיקרו-אלקטרודות בצפיפות גבוהה לרישום פעילות עצבית.
MgCl₂	Fisher Chemicals	M33-500	להכנת נוזל מוחי מלאכותי (aCSF)
NaCl	Fisher Chemicals	S271-1	להכנת נוזל מוחי שדרה מלאכותי (aCSF)
NaHCO₃	Fisher Chemicals	S233-500	להכנת נוזל מוחי מלאכותי (aCSF)
מחט (30 G x ½)	BD Biosciences	305106	מסייע בביצוע חתכים בקרנית.
חיות יילודים (P1-P14; עכבר)			אורגניזמים מודלים כגון עכברים, חולדות או אחרים המשמשים למחקרי רשתית.
מחשב עם תוכנת MaxLab Live Scope	HP	Z4	משמש לאיסוף נתונים וניתוח הקלטות.
צלחת פטרי (35 מ"מ או 60 מ"מ)	Pyrex	3483E12	משמש כסביבת עבודה לדיסקציה.
מלקחיים של Roboz micro Adson (RS-5232, אורך 4.75 אינץ', 1 x 2 שיניים, קצה 0.5 מ"מ)	Roboz	RS-5232	מלקחיים מיוחדים לדיסקציה עדינה.
מספריים קפיציים של Roboz (RS-5671, קצה חיתוך 10 מ"מ, רוחב קצה 0.15 מ"מ, 3¾ " אורך כולל)	Roboz	RS-5671	מספריים מדויקים לחיתוך רקמות עדינות.
מברשת			מברשת צבע קטנה שהותאמה לשערה בודדת לטיפול ברקמות עדינות.
שני מלקחיים עדינים	Roboz	RS-5060	משמשים לטיפול עדין ברקמות.
ניירות סינון Whatman (# 1), חתוכים לחתיכות קטנות	GE Healthcare	1001-042	משמש לטיפול וייבוש רקמות רשתית.

לשיער יחיד

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ford, K. J., Feller, M. B. Assembly and disassembly of a retinal cholinergic network. Vis Neurosci. 29 (1), 61-71 (2012).
Maccione, A., et al. Following the ontogeny of retinal waves: Pan-retinal recordings of population dynamics in the neonatal mouse. J Physiol. 592 (7), 1545-1563 (2014).
Ge, X., et al. Retinal waves prime visual motion detection by simulating future optic flow. Science. 373 (6553), eabd0830(2021).
Zhang, J., Ackman, J. B., Xu, H. P., Crair, M. C. Visual map development depends on the temporal pattern of binocular activity in mice. Nat Neurosci. 15 (2), 298-307 (2011).
Xu, H. P., et al. An instructive role for patterned spontaneous retinal activity in mouse visual map development. Neuron. 70 (6), 1115-1127 (2011).
Wong, R. O. L. Retinal waves: Stirring up a storm. Neuron. 24 (3), 493-495 (1999).
Biswas, S., et al. Glutamatergic neuronal activity regulates angiogenesis and blood-retinal barrier maturation via norrin/beta-catenin signaling. Neuron. 112 (12), 1978-1996.E6 (2024).
Sernagor, E., Grzywacz, N. M. Influence of spontaneous activity and visual experience on developing retinal receptive fields. Curr Biol. 6 (11), 1503-1508 (1996).
Blankenship, A. G., Feller, M. B. Mechanisms underlying spontaneous patterned activity in developing neural circuits. Nat Rev Neurosci. 11 (1), 18-29 (2010).
Ford, K. J., Felix, A. L., Feller, M. B. Cellular mechanisms underlying spatiotemporal features of cholinergic retinal waves. J Neurosci. 32 (3), 850-863 (2012).
Tiriac, A., Smith, B. E., Feller, M. B. Light prior to eye opening promotes retinal waves and eye-specific segregation. Neuron. 100 (5), 1059-1065.e4 (2018).
Voufo, C., et al. Circuit mechanisms underlying embryonic retinal waves. Elife. 12, e81983(2023).
Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
Burbridge, T. J., et al. Visual circuit development requires patterned activity mediated by retinal acetylcholine receptors. Neuron. 84 (5), 1049-1064 (2014).
Gribizis, A., et al. Visual cortex gains independence from peripheral drive before eye opening. Neuron. 104 (4), 711-723.e3 (2019).
Meister, M., Wong, R. O., Baylor, D. A., Shatz, C. J. Synchronous bursts of action potentials in ganglion cells of the developing mammalian retina. Science. 252 (5008), 939-943 (1991).
Rathbun, D. L., Jalligampala, A., Zrenner, E., Hosseinzadeh, Z. Improvements for recording retinal function with microelectrode arrays. MethodsX. 12, 102543(2024).
Muller, J., et al. High-resolution CMOS MEA platform to study neurons at subcellular, cellular, and network levels. Lab Chip. 15 (13), 2767-2780 (2015).
Sondereker, K. B., Stabio, M. E., Jamil, J. R., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Where you cut matters: A dissection and analysis guide for the spatial orientation of the mouse retina from ocular landmarks. J Vis Exp. (138), e57861(2018).
Fiscella, M., et al. Recording from defined populations of retinal ganglion cells using a high-density cmos-integrated microelectrode array with real-time switchable electrode selection. J Neurosci Methods. 211 (1), 103-113 (2012).
Frega, M., et al. Neuronal network dysfunction in a model for Kleefstra syndrome mediated by enhanced NMDAR signaling. Nat Commun. 10 (1), 4928(2019).
Berdondini, L., et al. Active pixel sensor array for high spatio-temporal resolution electrophysiological recordings from single cell to large scale neuronal networks. Lab Chip. 9 (18), 2644-2651 (2009).
Gollisch, T., Meister, M. Eye smarter than scientists believed: Neural computations in circuits of the retina. Neuron. 65 (2), 150-164 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MEA

הקלטות מערך מולטי-אלקטרודות בצפיפות גבוהה של גלי רשתית באמצעות פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים