הקלטות מערך מולטי-אלקטרודות בצפיפות גבוהה של גלי רשתית באמצעות פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית

Summary

מערכי רב-אלקטרודות בצפיפות גבוהה (HD-MEAs) משמשים לחקר גלי רשתית ספונטניים, הממלאים תפקיד מכריע בהתפתחות מעגלים עצביים. פרוטוקול זה מתאר את השלבים להכנת רקמת רשתית של עכבר וביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות באמצעות HD-MEAs על פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית.

Abstract

גלי רשתית ספונטניים הם סימן היכר של פעילות רשת הרשתית במהלך ההתפתחות, וממלאים תפקיד מכריע ביצירת מערכת הראייה על ידי השפעה על עידון האקסונים, חדירות כלי הדם והבשלה כללית של מעגלים עצביים. גלים אלה נחקרים בדרך כלל בתכשירי רשתית ex vivo באמצעות מערכי רב-אלקטרודות (MEAs), המאפשרים רישום אלקטרופיזיולוגי של אוכלוסיות גדולות של פעילות תאי גנגליון ברשתית (RGC). אלקטרופיזיולוגיה מבוססת MEA הפכה לכלי רב עוצמה בשל קלות השימוש בה לאיסוף מהיר של נתונים בתפוקה גבוהה, ובכך הופכת אותה למתאימה באופן אידיאלי לחקר פעילות הרשתית במגוון תנאי ניסוי.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השלבים הקריטיים להכנת רקמת הרשתית לרכישת נתונים אלקטרופיזיולוגיים באמצעות MEA בצפיפות גבוהה (HD-MEA) על פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית. התהליך מתחיל בבידוד זהיר של רשתית שלמה מבעלי חיים יילודים בתנאים פיזיולוגיים. לאחר ההכנה, הרשתית מותקנת בזהירות על שבב HD-MEA, המורכב מרשת של 26,400 אלקטרודות המסוגלות לבצע הקלטות חוץ-תאיות בו זמנית מ-1,000 RGCs לפחות. ההקלטות יכולות להימשך עד מספר שעות. בסופו של דבר, גישה מתודולוגית זו מציעה יישומים חשובים בחקר התפתחות הרשתית, מחלות ומחקרים השוואתיים בין מינים, התורמים להתקדמות רחבה יותר במדעי המוח ובחקר הראייה.

Introduction

גלי רשתית ספונטניים הם התפרצויות מחזוריות של פעילות מתואמת שנצפו ברשתית המתפתחת לפני תחילת הראייה. בעכברים, המעגלים המתחילים ומפיצים גלי רשתית משתנים במהירות במהלך ההתפתחות, מתחילים בעובר ומסתיימים בפקיחת העיניים (יום 14 לאחר הלידה)¹. עם התפתחות מעגלי הרשתית, התכונות המרחביות-זמניות של גלי הרשתית משתנות באופן דרמטי ^2,3. מספר מחקרים תומכים בכך שתכונות מרחביות-זמניות ספציפיות אלה מדריכות את התפתחות מערכת הראייה: פעילות אסינכרונית בין העיניים מורה על הפרדה ספציפית לעין⁴, גודל שטח הגל מורה על עידון האקסונים הרטינוטופיים באזורי המוח ה....

Protocol

פרוטוקול זה מתאר את השלבים לבידוד והכנת רקמת רשתית מעכברים יילודים להקלטות MEA של גלי רשתית באמצעות פלטפורמת Maxwell Biosystems HD-MEA. ההליך נועד לשמר תנאים פיזיולוגיים, להבטיח שרקמת הרשתית תישאר שלמה מבחינה מבנית, נקייה מנזק ומוכנה כראוי למגע אלקטרודה אופטימלי. ניסויים אלה אושרו על ידי תוכנית הטיפול והשימוש בבעלי חיים של ונדרבילט, תחת פרוטוקול מספר M2200056-00. העכברים (בני 1-2 שבועות, שני המינים) שוכנו במחזור של 12 שעות יום/לילה וניזונו מתזונת צ'או רגילה.

1. הכנת רקמת רשתית

1. בידוד הרשתית
   הערה: עיין בטבלת החומרים לפרטים על החומרים, הציוד והריאגנטים המשמשים ב....

Results

הקלטות בתפוקה גבוהה וניתוח גלי רשתית עם HD-MEA
ביצענו הקלטת HD-MEA של גלי רשתית ספונטניים במשך שעה (איור 2). תרשים רסטר של פעילות עצבית מראה את הדפוס המובנה של גלי הרשתית, כאשר כל נקודה מייצגת פוטנציאל פעולה שזוהה מאלקטרודה בודדת (איור 2A, למטה). סיכום פעילות על פני אלקטרודות מביא לעקבה בודדת, מה שמקל על הדמיית תזמון הגלים במהלך ההקלטה של שעה אחת (איור 2A, למעלה). מפת חום שמייצגת.......

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה ניתנת לשחזור ותפוקה גבוהה להכנת רקמת רשתית וביצוע הקלטות HD-MEA, ומציע שיטה חזקה לחקר פעילות רשת הרשתית. טכנולוגיית HD-MEA מציעה יתרונות משמעותיים על פני טכניקות אלקטרופיזיולוגיות והדמיה מסורתיות, במיוחד בלכידת נתונים בתפוקה גבוהה. HD-MEA מספק הקלטות דיוק בזמן אמת בקנה מידה של אלפית השנייה של דינמיקת גלי רשתית ספונטנית, המאפשרת ייזום מדויק של גלים, התפשטות ואפיון סנכרון. בנוסף, HD-MEA עולה על שיטות מהדק תיקון בכך שהוא מאפשר הקלטות בו זמנית מאלפי תאי גנגליון.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
פיפטת העברה חד פעמית 3 מ"ל (עם קצה חתוך)	פישרברנד	13-711-9 ס"מ	מסייע בהזזת הרשתית בין צלחות פטרי.
נוזל מוחי מלאכותי (aCSF)			שומר על תנאים פיזיולוגיים לרקמת הרשתית; מורכב מ-NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, CaCl2, MgCl2, גלוקוז ומבעבע בקרבוגן.
CaCl2	Fisher Chemicals	C79-500	להכנת נוזל מוחי מלאכותי (aCSF)
אספקת קרבוגן (95% O2, 5% CO2)			משמש לחמצון aCSF ולשמירה על כדאיות הרקמות.
אזמל להב מעוקל (#10)	Integra	4-110	משמש לחיתוך רקמות בצורה מדויקת.
מיקרוסקופ דיסקציה (סטריאוסקופ)	Zeiss	Stemi 508	חיוני להדמיה וטיפול ברקמת הרשתית.
גלוקוז	פישר כימיקלים	BP350-1	להכנת נוזל מוחי שדרה מלאכותי (aCSF)
מחמם בשורה	מערכת רב ערוצית	TC02	מחמם aCSF ל 32-34 מעלות; C לתנאים אופטימליים.
Ismatec Perfusion System	Ismatec	ISM4208	שומרת על זרימה רציפה של aCSF מחומצן.
KCl	Fisher Chemicals	P271-500	להכנת נוזל מוחי שדרה מלאכותי (aCSF)
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5504-100g	להכנת נוזל מוחי שדרה מלאכותי (aCSF)
יחידת הקלטה MaxOne Maxwell	Biosystems	MX1-BRD	ממשק בין שבב MaxOne למערכת
MaxOne System MaxOne Biosystems		מערכת ליבה MX1-SYS	לרקודרים אלקטרופיזיולוגיים מבוססי MEA.
מחזיק רקמות MaxOne עם מיקרומניפולטור בעל 3 צירים ותוספות הניתנות להחלפה	Maxwell Biosystems	MX1-HLD	מבטיח מיקום מדויק של הרשתית על שבב MEA.
שבב MEA (MX1-S-CHP, MaxWell Biosystems)	מקסוול ביוסיסטמס	MX1-S-CHP	מערך מיקרו-אלקטרודות בצפיפות גבוהה לרישום פעילות עצבית.
MgCl2	Fisher Chemicals	M33-500	להכנת נוזל מוחי מלאכותי (aCSF)
NaCl	Fisher Chemicals	S271-1	להכנת נוזל מוחי שדרה מלאכותי (aCSF)
NaHCO3	Fisher Chemicals	S233-500	להכנת נוזל מוחי מלאכותי (aCSF)
מחט (30 G x ½)	BD Biosciences	305106	מסייע בביצוע חתכים בקרנית.
חיות יילודים (P1-P14; עכבר)			אורגניזמים מודלים כגון עכברים, חולדות או אחרים המשמשים למחקרי רשתית.
מחשב עם תוכנת MaxLab Live Scope	HP	Z4	משמש לאיסוף נתונים וניתוח הקלטות.
צלחת פטרי (35 מ"מ או 60 מ"מ)	Pyrex	3483E12	משמש כסביבת עבודה לדיסקציה.
מלקחיים של Roboz micro Adson (RS-5232, אורך 4.75 אינץ', 1 x 2 שיניים, קצה 0.5 מ"מ)	Roboz	RS-5232	מלקחיים מיוחדים לדיסקציה עדינה.
מספריים קפיציים של Roboz (RS-5671, קצה חיתוך 10 מ"מ, רוחב קצה 0.15 מ"מ, 3¾ " אורך כולל)	Roboz	RS-5671	מספריים מדויקים לחיתוך רקמות עדינות.
מברשת			מברשת צבע קטנה שהותאמה לשערה בודדת לטיפול ברקמות עדינות.
שני מלקחיים עדינים	Roboz	RS-5060	משמשים לטיפול עדין ברקמות.
ניירות סינון Whatman (# 1), חתוכים לחתיכות קטנות	GE Healthcare	1001-042	משמש לטיפול וייבוש רקמות רשתית.