Method Article

מודל רקמות תלת מימדי בעל יכולת תפוקה גבוהה לכימות ספי אלקטרופורציה

DOI:

10.3791/68494

⸱

August 19th, 2025

 ,  ,  , 
1North Carolina State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה משתמש במודלים חישוביים כדי לכמת ספי אלקטרופורציה הפיכים ובלתי הפיכים באמצעות התפלגות מרחבית של תאים שעברו טרנספטציה בתוך חיקוי רקמה תלת מימדי לניתוח תפוקה גבוהה של פרוטוקולי אלקטרופורציה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אלקטרופורציה היא טכנולוגיה מבטיחה המשתמשת בפולסים חשמליים להעברת מקרומולקולות ואבלציה של רקמות רכות, עם יישומים הכוללים טיפול מונע מהדור הבא וטיפול במחלות גנטיות כגון סרטן. מחקר זה מדגים מודל תרבית רקמה תלת מימדית בעל יכולת תפוקה גבוהה לכימות סף האלקטרופורציה ההפיך והבלתי הפיך עבור פרוטוקול אלקטרופורציה נתון. על ידי שימוש בשדה חשמלי לא אחיד וניתוח ההתפלגות המרחבית של תאים שעברו טרנספטציה, ניתן לזהות ספים הפיכים ובלתי הפיכים בתוך דגימה בודדת, מה שמגדיל את היעילות שבה ניתן לאפיין פרוטוקולי אלקטרופורציה, במיוחד עבור תרגום in vivo . כדי להראות יכולת זו, חיקויי רקמות תלת מימדיים המכילים תאי HEK293 הועברו באמצעות אלקטרודת טבעת וסיכה כדי לספק פלסמיד מקודד GFP. לאחר מכן נגזרו ספי אלקטרופורציה על סמך תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של הדגימות שהועברו מחדש. מודל זה מדגים פוטנציאל לשימוש כאמצעי להערכה בתפוקה גבוהה של פרוטוקולי אלקטרופורציה, יתרון מרכזי על פני השיטות הנוכחיות להערכת ספים אלה, הנוטים להיות עתירי זמן ופחות מייצגים תנאי in vivo .

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אלקטרופורציה הפיכה (RE) היא מתודולוגיה מבוססת היטב להעברת מגוון תרכובות ומולקולות אטומות בדרך כלל לממברנה לתאים 1,2,3. כאן, שדות חשמליים פועמים (PEFs) משמשים להשגת עוצמת שדה חשמלי קריטית הגורמת לננו-נקבוביות חולפות ומקומיות לאורך חלקים של קרום התא. RE שימש להעברת מגוון מולקולות ותרכובות החל מצבעים וחומצות גרעין ועד כימותרפיה ותרופות אחרות 4,5,6,7,8,9,10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת תאים

  1. בארון בטיחות ביולוגית, צלחת 1 × 105 תאים/מ"ל של קו תאים HEK293 בנפח של 10 מ"ל לכל בקבוק תרבית רקמה T75 במדיום החיוני המינימלי של Eagle's בתוספת 10% (v/v) סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
  2. דגירה של תאי HEK293 בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם סביבת 5% CO2 .
  3. קצור תאים לניסויים יומיים לאחר הזריעה על ידי הסרת אמצעי התרבית וטיפול בתאים עם 4 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA.
  4. דגירה של תאים וטריפסין למשך 3-5 דקות בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מע....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אלקטרודת הטבעת והסיכה העבירה בהצלחה פלסמיד DNA המקודד חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לרקמת קולגן תלת מימדית המחקה תאי HEK293. כימות סף RE מוצלח הושג על ידי מדידת הרדיוס החיצוני של האזור הטרנספטנטי והפקת עוצמת השדה המתאימה מהמודל החישובי של מערך הניסוי, כפי שניתן לראות באיור 2. סף ה-IRE כומת באופן דומה על ידי מדידת הרדיוס הפנימי של האזור המשתנה. איור 3A-C מדגיש את ספי ה-RE וה-IRE המתקבלים (מתוארים ב.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשיטה זו ניתן לזהות ספי אלקטרופורציה הפיכים ובלתי הפיכים ללא צורך בבדיקת דגימות מרובות במתחים בדידים. השימוש בשדה חשמלי לא אחיד מאפשר כימות על סמך ההתפלגות המרחבית של תאים שעברו טרנספטציה במודל. עם זאת, ישנן מגבלות הקשורות להתפלגות לא אחידה זו. בראש ובראשונה, ספי ה-RE וה-IRE המתוארים כאן הם הספים לטרנספקציה מוצלחת ומוות תאי, בהתאמה, שעשויים שלא להיות מדידות ישירות של היקף האלקטרופורציה. לדוגמה, ייתכן שתאים מסוימים עשויים לעבור אלקטרופורציה, אך הנקבוביות אינן מספיקות לטרנספקציה, או שתאים .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין גילוי נאות.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו בוצעה באוניברסיטת צפון קרוליינה ומומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01CA272550).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% טריפסין-EDTAג'יבקו25200056
1000 קצות פיפטה uLפישר סיינטיפיק13-811-164
צינור חרוטי 15 מ"לפישר סיינטיפיק14-959-70ג
200 קצות פיפטה uLפישר סיינטיפיק13-811-139
304 מחטי קצה קהה מנירוסטהמקמאסטר קארברקוד 75165A753
316 צינורות נירוסטהמקמאסטר קארברקוד 89785K319
אקריליקמקמאסטר קארברקוד 8505K754
ארון בטיחות ביולוגיתפישר סיינטיפיק13-261-312
תוכנת CADדאסו מערכותסולידוורקס
צנטריפוגהנואירNU-C200R
אלקטרופורטורהביו45-0662במחקר זה נעשה שימוש במכשיר שנבנה בהתאמה אישית ומערכת BTX ECM 830
EMEMפישר סיינטיפיקMT10009CVזה עשוי להשתנות  אם אתה משתמש בקו תאים שאינו HEK293
Falcon 12-well צלחת תרבית תאים מולטי-באר מטופלת ב-TC, עם מכסהקורנינג353043ניתן להשתמש בכל צלחת 12 בארות, רק ודא שמידות הבאר נלקחות בחשבון בעת ייצור מחזיק האלקטרודה.
FBSפישר סיינטיפיקA5670701
בדיקת טמפרטורת סיבים אופטייםמיקרונור בע"מTS5-20 מ"מ-02
GFP-פלסמידאלדברוןgWiz-GFP
תאי HEK293ATCCCRL-1573ניתן להשתמש בקווי תאים אחרים, רק ודא שנעשה שימוש במדיום התרבית הנכון
פלטה חמהתאגיד קירור תרמו-אלקטרי אמריקהAHP-301CPV
אמבט קרח או חרוזים בקירורפישר סיינטיפיק10-876-001
תוכנה לניתוח תמונותלייקהלאס X
אינקובטורפישר סיינטיפיק15-015-2633
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוךלייקהDMi8
חותך לייזרמקמאסטר קאר7344N11
פניצילין-סטרפטומיציןפישר סיינטיפיק15140122
ערכת פיפטהפישר סיינטיפיק14-388-100
תוכנת סימולציהCOMSOLקומסול מולטיפיזיקה 6.2
בקבוק T75פישר סיינטיפיק156499
תמיסת קולגן בקר מסוג Iביומטריצה מתקדמת50053 מ"ג/מ"ל

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sano, M. B., Fan, R. E., Xing, L. Asymmetric waveforms decrease lethal thresholds in high frequency irreversible electroporation therapies. Sci Rep. 7 (1), 40747(2017).
  2. Batista Napotnik, T., Polajžer, T., Miklavčič, D. Cell death due to electroporation - A review.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Electroporation ThresholdsThree Dimensional TissueHigh Throughput ModelTissue ElectroporationReversible ElectroporationIrreversible ElectroporationElectric Field DistributionHEK293 CellsFluorescent MicroscopyPlasmid Transfection

Related Articles