מודל רקמות תלת מימדי בעל יכולת תפוקה גבוהה לכימות ספי אלקטרופורציה

Summary

פרוטוקול זה משתמש במודלים חישוביים כדי לכמת ספי אלקטרופורציה הפיכים ובלתי הפיכים באמצעות התפלגות מרחבית של תאים שעברו טרנספטציה בתוך חיקוי רקמה תלת מימדי לניתוח תפוקה גבוהה של פרוטוקולי אלקטרופורציה.

Abstract

אלקטרופורציה היא טכנולוגיה מבטיחה המשתמשת בפולסים חשמליים להעברת מקרומולקולות ואבלציה של רקמות רכות, עם יישומים הכוללים טיפול מונע מהדור הבא וטיפול במחלות גנטיות כגון סרטן. מחקר זה מדגים מודל תרבית רקמה תלת מימדית בעל יכולת תפוקה גבוהה לכימות סף האלקטרופורציה ההפיך והבלתי הפיך עבור פרוטוקול אלקטרופורציה נתון. על ידי שימוש בשדה חשמלי לא אחיד וניתוח ההתפלגות המרחבית של תאים שעברו טרנספטציה, ניתן לזהות ספים הפיכים ובלתי הפיכים בתוך דגימה בודדת, מה שמגדיל את היעילות שבה ניתן לאפיין פרוטוקולי אלקטרופורציה, במיוחד עבור תרגום in vivo . כדי להראות יכולת זו, חיקויי רקמות תלת מימדיים המכילים תאי HEK293 הועברו באמצעות אלקטרודת טבעת וסיכה כדי לספק פלסמיד מקודד GFP. לאחר מכן נגזרו ספי אלקטרופורציה על סמך תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של הדגימות שהועברו מחדש. מודל זה מדגים פוטנציאל לשימוש כאמצעי להערכה בתפוקה גבוהה של פרוטוקולי אלקטרופורציה, יתרון מרכזי על פני השיטות הנוכחיות להערכת ספים אלה, הנוטים להיות עתירי זמן ופחות מייצגים תנאי in vivo .

Introduction

אלקטרופורציה הפיכה (RE) היא מתודולוגיה מבוססת היטב להעברת מגוון תרכובות ומולקולות אטומות בדרך כלל לממברנה לתאים ^1,2,3. כאן, שדות חשמליים פועמים (PEFs) משמשים להשגת עוצמת שדה חשמלי קריטית הגורמת לננו-נקבוביות חולפות ומקומיות לאורך חלקים של קרום התא. RE שימש להעברת מגוון מולקולות ותרכובות החל מצבעים וחומצות גרעין ועד כימותרפיה ותרופות אחרות 4,5,6,7,8,9,10. עם זאת, אם עוצמת השדה החשמלי מוגברת מספיק, היא יכולה לעמוד בסף קריטי גבוה יותר, מה שמביא לירידה מהירה בכדאיות התא 1,2,11,12. תהליך זה ידוע בשם אלקטרופורציה בלתי הפיכה (IRE) ונחקר עבור אבלציה של רקמות רכות, כולל כטיפול בגידולים שאינם ניתנים לניתוח והפרעות קצב לב 11,12,13,14,15,16. כדי להבין את תוצאות הטיפול וליידע על טיפולים עתידיים, כימות של ספי RE ו-IRE אלה הוא פרקטיקה נפוצה במחקר אלקטרופורציה 12,17,18,19,20. עם זאת, ספי RE ו-IRE משתנים בהתאם לגורמים רבים, כולל סוג התא, מתח מופעל, משך הדופק, מספר הפולסים וקצב אספקת הדופק 1,17,18,21,22.

לפרוטוקולי אלקטרופורציה יש מספר פרמטרים המביאים לספי RE ו-IRE מגוונים 1,17,18,21,22. מתחי טיפול וצורות גל אופטימליים נחקרו זה מכבר. רוב טכנולוגיות האלקטרופורציה הזמינות מסחרית משתמשות בפרוטוקולים עם PEFs חד-קוטביים בסדר גודל של 100 μs-10 ms²³. בעוד שהפרוטוקולים הללו משיגים תוצאות רלוונטיות מבחינה קלינית, הם גורמים להתכווצויות שרירים אינטנסיביות in vivo 24,25,26. בשל כך, פולסים קצרים יותר של מיקרו-שניות דו קוטביים, המקלים על גירוי זה, הפכו לנושא עניין לאחרונה ^1,11,24. עם זאת, פולסים אלה מציגים גורמים חדשים המשפיעים על ספי RE ו-IRE, כולל סימטריית דופק, משך פרץ ותלות בטמפרטורה 1,17,22,27. בנוסף, סוג התא ותכונות הרקמה הוכחו גם כמשפיעים באופן משמעותי על תוצאות RE ו-IRE 19,28,29. ככל שהתחום ממשיך להתפתח, יש צורך לאפיין עוד יותר כיצד גורמים אלה והאינטראקציות שלהם זה עם זה וגורמים סביבתיים אפשריים אחרים משפיעים על ספי RE ו-IRE, מה שהופך את זה להכרחי יותר ויותר לשפר את יעילות הניסוי כדי לאפשר ניסויים בתפוקה גבוהה יותר.

ניסויי אלקטרופורציה אופייניים במבחנה בודקים פרוטוקולים על ידי טיפול בתאים בקובט עם לוחות מוליכים מקבילים, מה שמביא לפיזור שדה חשמלי אחיד בתוך הקובט במהלך הטיפול 19,30,31,32,33,34. כאמור, יש צורך לזהות את ספי ה-RE ו/או ה-IRE של פרוטוקול כדי לזהות מתח מופעל אופטימלי לטיפול נתון. כדי להשיג זאת במחקרי קובטה, יש לטפל במספר קובטות, כל אחת עם מתחים נפרדים. זה דורש מספר משמעותי של דגימות שיש להכין, לטפל ולנתח בנפרד, מה שמגביל את תפוקת הניסוי. כדי לשפר תהליך זה, פותחו גם מודלים של תרבית 2D^35,36 וגם 3D 13,20,27,37,38,39 כדי להעריך רצף של עוצמות שדה בדגימה בודדת באמצעות אלקטרודות היוצרות התפלגויות שדה לא אחידות 13,20,27,37^,38,39. ספי RE ו-IRE נגזרים לאחר מכן ממודלים חישוביים של התפלגות השדה החשמלי 13,20,27,37,38. זה מקטין מאוד את מספר הדגימות הדרושות, ומאפשר גישה בעלת תפוקה גבוהה יותר לכימות סף.

מאמר זה נועד להדגים גישה זו לכימות שדה RE ו-IRE במודל תלת מימדי במבחנה כדי להדגים את הפוטנציאל שלה כאמצעי להערכה יעילה של פרוטוקולי אלקטרופורציה במספר סביבות (למשל, סוגי תאים, פרמטרים לטיפול, מולקולות שיסופקו).

Protocol

הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת תאים

1. בארון בטיחות ביולוגית, צלחת 1 × 10⁵ תאים/מ"ל של קו תאים HEK293 בנפח של 10 מ"ל לכל בקבוק תרבית רקמה T75 במדיום החיוני המינימלי של Eagle's בתוספת 10% (v/v) סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
2. דגירה של תאי HEK293 בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם סביבת 5% CO₂ .
3. קצור תאים לניסויים יומיים לאחר הזריעה על ידי הסרת אמצעי התרבית וטיפול בתאים עם 4 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA.
4. דגירה של תאים וטריפסין למשך 3-5 דקות בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם סביבת 5% CO₂ או עד שהתאים מתנתקים משטח התרבית.
5. השבת את הפעילות האנזימטית של טריפסין על ידי הוספת 4 מ"ל של מצע התרבית.
6. תאי גלולה על ידי צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-180 × גרם והשעיה מחדש במדיום תרבית לריכוז סופי של 8 × 10⁶ תאים/מ"ל.

יצירת מודל רקמות 2. 3D

הערה: השתמש בפיפטינג הפוך עבור שלבים אלה כדי למנוע הכנסת בועות אוויר לתערובת.

1. בארון בטיחות ביולוגית, ערבבו היטב את תרחיף התאים המוכן של 8 × 10⁶ תאים/מ"ל עם תמיסת קולגן בקר מסוג I (3 מ"ג/מ"ל) ביחס של 1:1. מניחים על קרח או באמבט חרוזים קר כדי למנוע פילמור מוקדם בזמן העבודה עם התערובת.
2. פיפטה 500 מיקרוליטר של התמיסה המשולבת לציפוי תחתית כל באר של צלחת בת 12 בארות. ודא שהג'ל מצפה את החלק התחתון באופן שווה על ידי התחלת הוצאת התמיסה במרכז הבאר ולאחר מכן ספירלה בעדינות כלפי חוץ.
3. סובבו בעדינות את הצלחת כדי להבטיח ששולי הג'ל ייגעו בדפנות הבאר.
4. דגרו את הג'לים בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם סביבת 5% CO₂ למשך 6 שעות או עד שהג'לים הופכים יציבים ואינם זזים בעת הטיית הצלחת.
5. הטה את צלחת הבאר והוסף בעדינות 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית לכל באר על ידי מתן אפשרות להחליק במורד דופן הצלחת לפחות שעה אחת לפני הטיפול. יש לטפל בג'לים תוך 48 שעות מרגע היצירה.

3. ייצור אלקטרודות

1. הסר את חיבור הפלסטיק Luer על שתי מחטי מזרק קהות מנירוסטה 1.64 מ"מ 304. הניחו מחט אחת בצד כדי לשמש כאלקטרודת הסיכה. עבור המחט השנייה, שטח את 5 המ"מ האחרונים של קצה אחד.
2. צור את אלקטרודת הטבעת על ידי חיתוך קטע של צינור נירוסטה בקוטר חיצוני 19 מ"מ 316 ארוך מספיק כדי לשבת צמוד לתחתית צלחת הבאר.
3. תכנן מחזיק אלקטרודה כפי שניתן לראות באיור 1 עם תוכנת CAD. ודא שלמחזיק יש חור מרכזי לאלקטרודת הסיכה, חריץ לאלקטרודה הטבעתית וחור החוצה את החריץ כך שניתן יהיה להכניס את המחט השטוחה כדי ליצור התאמת לחיצה המחזיקה את אלקטרודת הטבעת במקומה.
   1. כמו כן, ודא שלמחזיק יש שפה שתוכננה להתאים היטב לצלחת של 12 בארות ולמרכז את אלקטרודות הטבעת והסיכה בבאר כך שהאלקטרודות והבאר יהיו כולן קואקסיאליות³⁸.
4. ייצור מחזיק האלקטרודה מאקריליק באמצעות טכניקות חיתוך לייזר מבוססות⁴⁰.
5. הרכיבו את האלקטרודה על ידי התאמת אלקטרודות הטבעת והסיכה למחזיק האלקטרודה.
6. אבטח את אלקטרודת הטבעת על ידי לחיצה על המחט עם קצה שטוח לתוך המחזיק.

4. טיפול במודל רקמות תלת מימד עם אלקטרופורציה

1. בארון בטיחות ביולוגית, הטה את הצלחת ושאף 400 מיקרוליטר של מדיית תרבית מכל באר. הקפד לא ליצור קשר עם הג'ל. יש להשאיר 100 מיקרוליטר של מדיה בכל באר שאיבה כדי לשמור על לחות הג'ל. אם יש פחות מ-400 מיקרוליטר נוזל לשאיבה (פיפטה לא משאירה נוזל/שואבת אוויר), הוסף 100 מיקרוליטר מדיום תרבית.
2. הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת פלסמיד GFP של 5 מיקרוגרם/מיקרוליטר לבארות השאיבה הללו (לנפח כולל של 120 מיקרוליטר לבאר) על ידי הטיית הצלחת והוספת המגיב לנוזל המצטבר על הדופן של כל באר. יש לסובב בעדינות כדי להבטיח שהוא מתפזר באופן שווה על פני הג'ל.
3. דגרו את הג'לים בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם סביבת 5% CO₂ למשך 10 דקות.
4. הכנס את בדיקת טמפרטורת הסיב האופטי לאלקטרודת הסיכה והתחל לקרוא את הטמפרטורה.
5. חבר את הכבל החיובי של האלקטרופורטור לאלקטרודת הסיכה ואת הכבל השלילי למחט המאבטחת את אלקטרודת הטבעת.
6. מדליקים את הפלטה החמה ומחממים את הג'לים כך שישמרו על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
7. הכנס את אלקטרודת הטבעת והסיכה עם בדיקת טמפרטורת סיבים אופטיים בסיכה לבאר. ודא שהסיכה מאונכת לצלחת וששתי האלקטרודות נוגעות במלואן בג'ל.
8. ודא שהג'ל נמצא ב-37 מעלות צלזיוס.
9. לספק טיפול אלקטרופורציה.
10. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיה לכל ג'ל שנראה יבש.
11. חזור על שלבים 4.7-4.10.
12. לאחר השלמת כל הטיפולים, דגרו את הג'לים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם סביבת 5% CO₂ למשך 10 דקות.
13. הטה את צלחת הבאר והוסף בעדינות 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית לכל באר על ידי מתן אפשרות להחליק במורד דופן הצלחת.
14. דגרו את הג'לים בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם סביבת 5% CO₂ למשך 24 שעות.

5. כביסה והדמיה

1. הטה את הצלחת ושאף את אמצעי התרבות מכל באר. הקפד לא ליצור קשר עם הג'ל.
2. הטה את הצלחת והוסף בעדינות 500 מיקרוליטר של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) לכל באר על ידי מתן אפשרות להחליק במורד דופן הצלחת.
3. דגרו את הג'לים בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם סביבת 5% CO₂ למשך 5 דקות.
4. הטה את הצלחת ושאף את ה- PBS מכל באר. הקפד לא ליצור קשר עם הג'ל.
5. הטה את הצלחת והוסף בעדינות 500 מיקרוליטר של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) לכל באר על ידי מתן אפשרות להחליק במורד דופן הצלחת.
6. סובבו בעדינות את הצלחת, הטו אותה ושאבו את ה- PBS מכל באר. הקפד לא ליצור קשר עם הג'ל.
7. הוסף 100 מיקרוליטר PBS טרי כדי לשמור על לחות הג'לים להדמיה.
8. צלחת תמונה בטכניקות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות סטנדרטיות. זה אמור להניב תמונות של ג'לים עם אזור ירוק מובהק בצורת טורוס שבו ספי השדה החשמלי ההפיך והבלתי הפיך תוחמים את הקצוות החיצוניים והפנימיים של האזור, בהתאמה.
9. הטה את צלחת הבאר והוסף בעדינות 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית לכל באר על ידי מתן אפשרות להחליק במורד דופן הצלחת.
10. דגרו את הג'לים בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם סביבת 5% CO₂ למשך 24 שעות.
11. חזור על שלבים 5.1-5.10 עבור כל נקודת זמן.

6. יצירת מודלים חישוביים

1. פתח תוכנת סימולציה פיזיקלית וצור מודל צירי סימטרי דו-ממדי חדש המשתמש בזרמים חשמליים, מעברי חום במוצקים ופיזיקה של חימום אלקטרומגנטי.
2. צור פרמטרים עבור המתח, טמפרטורת הסביבה, טמפרטורת הפלטה החמה, נקודת הגדרת הטמפרטורה, קצב אספקת הדופק, המינון החשמלי המשולב והמידות של אלקטרודות הטבעת והסיכה, הג'ל וצלחת הבאר של מערך הניסוי.
3. צור גיאומטריות תחום המייצגות חתך רדיאלי של אלקטרודות הטבעת והסיכה, הג'ל וצלחת הבאר של מערך הניסוי כפי שניתן לראות באיור 2A.
4. הנח נקודת בדיקה בתוך האלקטרודה המרכזית במחצית מגובה הג'ל כדי לייצג את בדיקת טמפרטורת הסיבים האופטיים המשמשת במהלך ניסויים במבחנה.
5. צור פונקציה חלקית המשתמשת בטמפרטורה כארגומנט הקלט שלה.
6. הגדר את הפונקציה כך שהערך שלה יהיה 1 כאשר הטמפרטורה נמוכה מפרמטר נקודת הגדרת הטמפרטורה שהוגדר בשלב 6.2, ו-0 אחרת.
7. החל תנאי גבול מתח על המשטח העליון ביותר של גיאומטריית התחום המייצגת את אלקטרודת הפין והגדר את ערך המתח לפרמטר המתח המוגדר בשלב 6.2 כפול הפונקציה החלקית משלב 6.6 המוערכת בטמפרטורה של נקודת הבדיקה שנוצרה בשלב 6.4.
8. החל תנאי גבול קרקע על המשטח העליון ביותר של גיאומטריית התחום המייצגת את אלקטרודת הטבעת.
9. החל תנאי גבול בידוד חשמלי על כל גבולות התחום הנותרים.
10. צור פונקציה רציפה המשתמשת בטמפרטורה.
11. הגדר את הפונקציה באמצעות מודל^{מבוסס 27} של המוליכות תלוית הטמפרטורה של ג'ל הקולגן כ-0.8277 + 0.0323*T.
12. הגדר חומר מותאם אישית והגדר את המוליכות החשמלית לפונקציה הרציפה המוגדרת בשלב 6.11. מרחו חומר זה על תחום הג'ל.
13. הגדר חומרים או השתמש בברירות מחדל של תוכנה אם זמינות כדי להקצות 304 ו-316 חומרי נירוסטה לתחומי האלקטרודות של הפין והטבעת, בהתאמה, ופוליסטירן לתחומי לוחית הבאר.
14. החל תנאי גבול טמפרטורה על בסיס הדגם והגדר את ערך הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס.
15. החל תנאי גבול של קרינת סביבה על פני השטח על כל קצוות התחום האחרים שאינם מתממשקים עם תחום אחר והגדר את הפליטות ל-0.97, 0.9 ו-0.075, תלוי אם התחום היה חלק מהלוח, הג'ל או האלקטרודה, בהתאמה²⁷.
16. הוסף רשת משולשת חופשית לדגם. הגדר את גודל הרכיב לעדין יותר.
17. אם אתה מעריך מגוון רמות פרמטרים, צור סריקה פרמטרית המפרטת את כל הערכים שבהם יש להעריך פרמטר.
18. הפעל את הסימולציה על ידי לחיצה על כפתור המחשוב .
19. בסיום, צור תרשים דו-ממדי של השדה החשמלי בקטע התוצאות.
20. הגדר את קו החיתוך שיעבור מאלקטרודת הסיכה לאלקטרודה הטבעתית דרך אמצע תחום הג'ל. זה אמור לגרום לדעיכה אקספוננציאלית מקצה אלקטרודת הסיכה לקצה האלקטרודה הטבעתית.
21. ייצא את נתוני ההתוויה כקובץ .csv או .xlsx כדי ליצור טבלת בדיקת מידע.

7. גזירת סף

1. בעזרת תוכנת המיקרוסקופ, מודדים את קוטר הקצוות החיצוניים והפנימיים של האזור בצורת טורוס לאורך הצירים האנכיים והאופקיים. אם לתוכנה אין יכולת זו, השתמש ב-ImageJ כדי לעשות זאת.
2. ממוצע את הקוטר החיצוני והפנימי, בהתאמה, וחלקו בשניים כדי לחשב את הרדיוסים החיצוניים והפנימיים של האזור בצורת טורוס. הרדיוס החיצוני מסמן את סף ה-RE. הרדיוס הפנימי מסמן את סף ה-IRE.
3. באמצעות טבלת החיפוש שנוצרה בשלב 6.21, גזרו את עוצמת השדה החשמלי ברדיוסים הנמדדים.

Results

אלקטרודת הטבעת והסיכה העבירה בהצלחה פלסמיד DNA המקודד חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לרקמת קולגן תלת מימדית המחקה תאי HEK293. כימות סף RE מוצלח הושג על ידי מדידת הרדיוס החיצוני של האזור הטרנספטנטי והפקת עוצמת השדה המתאימה מהמודל החישובי של מערך הניסוי, כפי שניתן לראות באיור 2. סף ה-IRE כומת באופן דומה על ידי מדידת הרדיוס הפנימי של האזור המשתנה. איור 3A-C מדגיש את ספי ה-RE וה-IRE המתקבלים (מתוארים ב...

Discussion

בשיטה זו ניתן לזהות ספי אלקטרופורציה הפיכים ובלתי הפיכים ללא צורך בבדיקת דגימות מרובות במתחים בדידים. השימוש בשדה חשמלי לא אחיד מאפשר כימות על סמך ההתפלגות המרחבית של תאים שעברו טרנספטציה במודל. עם זאת, ישנן מגבלות הקשורות להתפלגות לא אחידה זו. בראש ובראשונה, ספי ה-RE וה-IRE המתוארים כאן הם הספים לטרנספקציה מוצלחת ומוות תאי, בהתאמה, שעשויים שלא להיות מדידות ישירות של היקף האלקטרופורציה. לדוגמה, ייתכן שתאים מסוימים עשויים לעבור אלקטרופורציה, אך הנקבוביות אינן מספיקות לטרנספקציה, או שתאים ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% טריפסין-EDTA	ג'יבקו	25200056
1000 קצות פיפטה uL	פישר סיינטיפיק	13-811-164
צינור חרוטי 15 מ"ל	פישר סיינטיפיק	14-959-70ג
200 קצות פיפטה uL	פישר סיינטיפיק	13-811-139
304 מחטי קצה קהה מנירוסטה	מקמאסטר קאר	ברקוד 75165A753
316 צינורות נירוסטה	מקמאסטר קאר	ברקוד 89785K319
אקריליק	מקמאסטר קאר	ברקוד 8505K754
ארון בטיחות ביולוגית	פישר סיינטיפיק	13-261-312
תוכנת CAD	דאסו מערכות	סולידוורקס
צנטריפוגה	נואיר	NU-C200R
אלקטרופורטור	הביו	45-0662	במחקר זה נעשה שימוש במכשיר שנבנה בהתאמה אישית ומערכת BTX ECM 830
EMEM	פישר סיינטיפיק	MT10009CV	זה עשוי להשתנות  אם אתה משתמש בקו תאים שאינו HEK293
Falcon 12-well צלחת תרבית תאים מולטי-באר מטופלת ב-TC, עם מכסה	קורנינג	353043	ניתן להשתמש בכל צלחת 12 בארות, רק ודא שמידות הבאר נלקחות בחשבון בעת ייצור מחזיק האלקטרודה.
FBS	פישר סיינטיפיק	A5670701
בדיקת טמפרטורת סיבים אופטיים	מיקרונור בע"מ	TS5-20 מ"מ-02
GFP-פלסמיד	אלדברון	gWiz-GFP
תאי HEK293	ATCC	CRL-1573	ניתן להשתמש בקווי תאים אחרים, רק ודא שנעשה שימוש במדיום התרבית הנכון
פלטה חמה	תאגיד קירור תרמו-אלקטרי אמריקה	AHP-301CPV
אמבט קרח או חרוזים בקירור	פישר סיינטיפיק	10-876-001
תוכנה לניתוח תמונות	לייקה	לאס X
אינקובטור	פישר סיינטיפיק	15-015-2633
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך	לייקה	DMi8
חותך לייזר	מקמאסטר קאר	7344N11
פניצילין-סטרפטומיצין	פישר סיינטיפיק	15140122
ערכת פיפטה	פישר סיינטיפיק	14-388-100
תוכנת סימולציה	COMSOL	קומסול מולטיפיזיקה 6.2
בקבוק T75	פישר סיינטיפיק	156499
תמיסת קולגן בקר מסוג I	ביומטריצה מתקדמת	5005	3 מ"ג/מ"ל