הנחתת פרופטוזיס עצבית על ידי עיכוב RKIP בעקבות דימום תוך מוחי ספונטני באמצעות הפעלת מסלול NRF2/HO-1

דימום תוך מוחי ספונטני (ICH) הוא מצב כלי דם מוחי המאופיין בדימום עקב נזק לכלי הדם התוך גולגולתיים, נמק וקרע בכלי הדם, המשפיע בדרך כלל על גרעיני הבסיס ומייצג תת-סוג עיקרי של שבץ דימומי¹. שיעור התמותה בקרב חולים המאובחנים עם ICH הוא כ-50%, וחלק ניכר מהמחלימים חווים אובדן עצמאות חמור². אפשרויות הטיפול הנוכחיות ב-ICH ספונטני מוגבלות, כאשר לא הוכח כי טיפולים קיימים מפחיתים משמעותית את התמותה או משפרים באופן ניכר את התוצאות הנוירולוגיות לאחר ICH.

פרופטוזיס, צורה תלויה בברזל של מוות תאי מתוכנת, מוגדרת על ידי חמצון שומנים, הצטברות יונים ברזליים ודלדול גלוטתיון, מה שמבדיל אותו מצורות אחרות של מוות תאי מתוכנת במונחים גנטיים, מורפולוגיים וביולוגיים³. עדויות הולכות וגדלות מדגישות את תפקידו של פרופטוזיס עצבי בפתולוגיה של ICH. חלבון מעכב קינאז של Raf (RKIP), הידוע גם בשם חלבון קושר פוספטידיל-אתנולמין 1 (PEBP1), מעורב בהתפתחות העצבית ויוצר את קומפלקס 15LOX/PEBP1 באמצעות קשירתו ל-15-ליפוקסיגנאז (15LOX), מווסת מרכזי של פרופטוזיס⁴. עם זאת, התפקיד והמנגנונים הספציפיים של RKIP בפרופטוזיס הקשורים להתקדמות של ICH ספונטני נותרו לא נחקרים.

מחקר זה בחן את ההשפעות האנטי-פרופטוזיס של עיכוב RKIP על נוירונים, והראה כי עיכוב ביטוי RKIP יכול לדכא פרופטוזיס עצבי בעקבות ICH, פוטנציאלית באמצעות הפעלת מסלול פקטור 2/heme oxygenase-1 הקשור לגורם הגרעיני E2 (NRF2/HO-1). ממצאים אלה משמעותיים לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות המכוונות לפתוגנזה של ICH.

תרבית של תאי PC12
קו התאים PC12 הופץ במכון רוזוול פארק ממוריאל 1640 (RPMI-1640) מדיום גידול המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין, עם תחזוקה שוטפת בתנאי תרבית סטנדרטיים (37 מעלות צלזיוס, 5% אטמוספירה לחה CO₂). עבור פרוצדורות ניסיוניות, תאים דבקים צופו על כלי תרבית ואפשרו להם להתרבות עד להשגת חד-שכבות כמעט מתכנסות (כ-90% כיסוי פני השטח). דיסוציאציה תאית הושגה באמצעות טיפול אנזימטי באמצעות תמיסת טריפסין-EDTA של 0.25%, ואחריה שלושה מחזורי תת-תרבות עוקבים כדי להבטיח יציבות אוכלוסייה. תאים מעובדים הוקצו לאחר מכן ליישומים ניסיוניים במורד הזרם ולהערכות אנליטיות.

מבחני כדאיות תאים
כדאיות התאים הוערכה כדי להעריך את הציטוטוקסיות של המין ולוקוסטטין על תאי PC12, בהתאם להוראות שסופקו על ידי יצרן ערכת הבדיקה. תאי PC12 נזרעו באופן אחיד בצלחות של 96 בארות ותרבו עם המין או לוקוסטין במשך 24 שעות. לאחר שטיפה עם מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS), התאים הודגרו במדיום RPMI-1640 המכיל תמיסת מלח טטרזוליום 10% למשך 90 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ערכי הצפיפות האופטית (OD) נמדדו לאחר מכן ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות.

תגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק הפוך (RT-qPCR)
סך ה-RNA הופק מתאי PC12 באמצעות מגיב מיצוי RNA. ראשית, הדגימה הומוגנית במגיב המיצוי, מה שמבטיח ליזה יסודית. כלורופורם נוסף לתערובת, ניער במרץ וצנטריפוגה כדי להפריד בין השלבים (12,000 × גרם, 15 דקות, 4 מעלות צלזיוס). השלב המימי המכיל את ה-RNA נאסף, וה-RNA הושקע על ידי הוספת איזופרופנול (שלב מימי: iPrOH = 1:1) ודגירה בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה נעשתה כדי לגלול את ה-RNA (12,000 × גרם, 10 דקות, 4 מעלות צלזיוס), 1 מ"ל של 70% אתנול נוסף להסרת זיהומים, ולבסוף, כדור ה-RNA הומס במים נטולי RNase לאחסון ב-80 מעלות צלזיוס. תבניות DNA משלימות (cDNA) נוצרו על ידי שעתוק הפוך עם RT Master Mix. התבניות שהתקבלו דוללו לאחר מכן ביחס של 1:5 ועברו PCR כמותי בזמן אמת במכשיר PCR בזמן אמת. כל דגימה הוגברה בשלוש עותקים, והכמות היחסית של תוצר ה-PCR הייתה ממוצעת. הפריימרים המשמשים מפורטים בטבלה 1, כאשר β-אקטין משמש כגן משק הבית. ריכוז ה-mRNA היחסי נקבע באמצעות הנוסחה E = 2^−ΔΔCt, וערך מחזור הסף הקריטי (CT) נרשם עבור כל תגובה.

מבחני מיני חמצן תגובתיים תוך-תאיים (ROS) והידרופרוקסיד שומנים (LPO)
רמות ROS ו-LPO נמדדו באמצעות ציטומטריית זרימה. תאי PC12 טופלו בהמין (80 מיקרומטר), לוקוסטין (5 מיקרומטר) ו-ML385 (5 מיקרומטר) במשך 24 שעות ונשטפו 3 פעמים עם PBS בכלים. לאחר מכן התאים הודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 40 דקות בנוכחות 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), בדיקת ROS, ו-BODIPY 581/591 C11, בדיקה LPO. לאחר שטיפות PBS להסרת בדיקות עודפות, עוצמת הקרינה נמדדה על ידי ציטומטריית זרימה. אסטרטגיית שער עקבית יושמה על פני כל הדגימות: ראשית, תאים היו מגודרים על FSC-A לעומת SSC-A כדי לא לכלול פסולת, לאחר מכן, תאים בודדים נבחרו על ידי שער FSC-A לעומת FSC-H. תאים לא מוכתמים ותאים שטופלו בהמין בלבד שימשו כבקרות שליליות וחיוביות לקביעת פיצוי הקרינה והשערים. הנתונים נותחו באמצעות התוכנה המקושרת.

מיצוי חלבון וכתם מערבי
מיצוי חלבון כולל
הסופרנטנט של תאי PC12 שטופלו הושלך, ואחריו שלוש שטיפות עם PBS קר כקרח. התאים נקצרו באמצעות טריפסין וצנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 5 דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט, גלולת התא הומוגנית במאגר ליזה קר של בדיקת רדיו-אימונו-משקעים (RIPA) המכיל 10% מעכב פרוטאז ו-10% מעכב פוספטאז. לאחר דגירה של 30 דקות על קרח, הליזאט צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הסופרנטנט השקוף עורבב עם חוצץ העמסה (4:1) וחומם ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לנטרל חלבונים. דגימות חלבון אוחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש לאחר מכן.

ניתוח כתמים מערביים
החלבונים הופרדו על ידי SDS-PAGE באמצעות ג'ל ערימה וג'ל פירוק, עם דגימות שהועמסו לבארות. אלקטרופורזה בוצעה ב-80 וולט עבור ג'ל הערימה ו-120 וולט עבור הג'ל הפתרון. חלבונים הועברו לקרום פלואוריד פוליווינילידן (PVDF) (מופעל מראש במתנול למשך דקה) באמצעות מערכת העברה בזרם קבוע של 300 mA למשך 1-2 שעות. הממברנה נחסמה עם חלב דל שומן 5% ב-TBST למשך שעתיים בטמפרטורת החדר כדי למנוע קשירה לא ספציפית. לאחר שלוש שטיפות עם TBST (10 דקות כל אחת), הממברנה הודגרה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם הנוגדנים העיקריים הבאים מדוללים ב-TBST: ארנב נגד ACSL4 (1:1,000), ארנב נגד GPX4 (1:1,000), ארנב נגד HO-1 (1:2,000), ארנב נגד NRF2 (1:1,000), ארנב נגד RKIP (1:1,500) ועכבר נגד β-אקטין (1:5,000). הממברנה נשטפה במשך 3 x 10 דקות עם TBST והודגרה בנוגדנים משניים מצומדים ל-HRP למשך שעתיים בטמפרטורת החדר: IgG נגד עכבר עז (1:1,000) עם תווית HRP, IgG נגד ארנב עז (1:1,000). לאחר שטיפות TBST נוספות במשך 3 x 5 דקות, אותות חלבון הודגמו באמצעות ערכת ECL Western Blot וכומתו באמצעות תוכנת ImageJ.

צביעה אימונופלואורסצנטית
תאים נזרעו על כיסויים שהונחו מראש בצלחות תרבית ואפשרו להם להידבק. לאחר טיפולים ניסיוניים, הסופרנטנט הושלך, והתאים נשטפו פי 3 עם PBS. התאים נקבעו עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שלוש שטיפות PBS. לאחר מכן, התאים עברו חדירה עם 0.1% Triton X-100 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ונשטפו 3x עם PBS. קשירה לא ספציפית נחסמה על ידי דגירה עם אלבומין 3% בסרום בקר (BSA) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הנוגדנים הראשוניים הופעלו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס: ארנב נגד HO-1 (1:500), ארנב נגד NRF2 (1:500). לאחר שלוש שטיפות PBS למחרת, התאים הודגרו עם נוגדנים משניים פלואורסצנטיים בחושך למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר: Alexa Fluor 488 עם התווית Goat Anti-Rabbit IgG (1:500). לאחר השטיפות הסופיות, הדגימות הורכבו עם מדיום הרכבה המכיל 4',6-דיאמידינו-2'-פנילינדול (DAPI) לצביעה נגדית גרעינית. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

ניתוח סטטיסטי
נתוני המדידה בוטאו כממוצע ± סטיית תקן (S.D). נתונים כמותיים המייצגים תוצאות משלוש בדיקות שכפול בלתי תלויות נלקחו לניתוח. עבור השוואות בין שתי קבוצות, יושם מבחן t, בעוד שניתוח שונות חד כיווני (ANOVA) שימש להשוואות בין מספר קבוצות, ואחריו מבחן הפוסט הוק של טוקי להשוואות מרובות. ערך p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

המין יכול לגרום לנזק לקרום הפלזמה, ולכן הוא משמש לעתים קרובות לבניית מודלים של תאים במבחנה של ICH. מחקר זה חקר את ההשפעות של טיפול בהמין בריכוזים ומשכים משתנים על כדאיות תאי PC12, תוך ניתוח דינמיקת ביטוי חלבון RKIP בתנאי ניסוי מתאימים באמצעות ניתוח כתמים מערביים (איור 1A). כדאיות התאים הופחתה משמעותית בריכוזי המין של 60 מיקרומטר ומעלה (איור 1B), והפחתה זו התרחשה באופן תלוי מינון עם עלייה בריכוזים. יתר על כן, ציטוטוקסיות המין הייתה תלוית זמן, והגיעה לשיאה בתוך 24 השעות הראשונות של החשיפה לפני שירדה בהדרגה (איור 1C). ניתוח כתמים מערביים הצביע על כך שביטוי חלבון RKIP היה מוגבר באופן משמעותי ב-80 מיקרומטר המין (איור 1D,E) והגיע לשיאו ב-24 שעות לאחר הגירוי (איור 1F,G). בהתבסס על ממצאים אלה, בחרנו 80 מיקרומטר המין ותקופת טיפול של 24 שעות לניסויים הבאים כדי להבהיר את המנגנונים הבסיסיים ומסלולי האיתות המעורבים.

כדי לחקור את תפקידו של RKIP בפרופטוזיס עצבי בעקבות ICH, השתמשנו בלוקוסטטין כדי לעכב ביטוי RKIP (איור 2A). לוקוסטטין נקשר ל-RKIP, משבש את האינטראקציות בין RKIP הן ל-Raf-1 קינאז והן ל-GRK2, ובכך מחליש את ההשפעות התפקודיות של RKIP להשגת המטרה המעכבת. במחקר זה, השתמשנו בלוקוסטין כמעכב RKIP כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים הקשורים 5,6. הציטוטוקסיות של לוקוסטטין הוערכה לראשונה בטווח ריכוזים של 0-40 מיקרומטר באמצעות בדיקת הכדאיות. התוצאות לא הראו ציטוטוקסיות משמעותית ב-≤5 מיקרומטר, מה שקובע טווח ריכוזים בטוח לניסויים הבאים (איור 2B). אישרנו עוד את ההשפעה המעכבת של 5 מיקרומטר לוקוסטין על ביטוי RKIP באמצעות ניתוחי Western Blotting ו-RT-qPCR. הכתם המערבי חשף ירידה משמעותית ברמות חלבון RKIP (איור 2C,D), בעוד ש-RT-qPCR הראה ירידה ברמות ה-mRNA של RKIP (איור 2E). ממצאים אלה מדגימים את היעילות של 5 מיקרומטר לוקוסטין בעיכוב ביטוי RKIP.

במחקר זה, פותח מודל תאי PC12 המושרה על ידי המין של דימום תוך מוחי (ICH) כדי לתאר את הפונקציה הרגולטורית של RKIP בפרופטוזיס. התוצאות שלנו הצביעו על כך שגירוי המין הגדיל משמעותית את ביטוי RKIP תוך הפחתת כדאיות התאים. בהתבסס על מחקרים קיימים, שיערנו כי מוות תאים המושרה על ידי המין עשוי להיות קשור קשר הדוק לפרופטוזיס, תהליך חמצון שומנים מזורז ברזל המסומן על ידי שקיעת ברזל פתולוגית בתוך תאים תאיים ורמות גבוהות של מיני חמצן תגובתיים (ROS).

כדי לחקור עוד יותר את הקשר בין RKIP לפרופטוזיס, טיפלנו בתאי PC12 מגורים על ידי המין עם לוקוסטטין. ניתוח כתמים מערביים גילה כי הביטוי של acyl-CoA synthetase long-chain family 4 (ACSL4), מניע מרכזי לפרופטוזיס, גדל באופן משמעותי בקבוצה שטופלה בהמין (איור 3A,B). ACSL4 הוא גן פרו-מוות קריטי בפרופטוזיס, המקדם את האסטריפיקציה של חומצות שומן רב בלתי רוויות (PUFAs) ובכך מגביר את הרגישות התאית לפרופטוזיס. בנוסף, הביטוי של גלוטתיון פרוקסידאז 4 (GPX4), מעכב פרופטוזיס, ירד באופן משמעותי בקבוצה שטופלה בהמין (איור 3A,C). GPX4 הוא מווסת מרכזי של פרופטוזיס המעכב חמצון שומנים על ידי ניקוי פרוקסידים של שומנים, ובכך מגן על התאים מפני נזק חמצוני. תוצאות אלו מצביעות על כך שגירוי המין מגביר את הפרופטוזיס בתאי PC12. עם זאת, בהשוואה לקבוצת ההמין, עיכוב פרמקולוגי של RKIP עם לוקוסטטין הפך את השינויים הללו, מה שמצביע על כך שדיכוי ביטוי RKIP עיכב את הפרופטוזיס בתאי PC12. תוצאות עקביות נצפו גם ברמת ה-mRNA (איור 3 F,G).

חקרנו גם את הביטוי של מולקולות מסלול הקשורות לפרופטוזיס. מסלול NRF2/HO-1 הוכח כממלא תפקיד מפתח בפרופטוזיס. בהתבסס על זה, שיערנו שעיכוב RKIP עשוי לדכא פרופטוזיס עצבי על ידי הפעלת מסלול NRF2/HO-1. כדי לבחון את ההשערה הזו, תחילה גירינו תאי PC12 עם המין, ומצאנו שהביטוי של חלבון NRF2 גדל באופן משמעותי (איור 3A,D), יחד עם עלייה משמעותית בתוצר שלו במורד הזרם HO-1 (איור 3A,E). ממצאים אלה מצביעים על כך שפרופטוזיס המושרה על ידי המין מפעיל את מסלול NRF2/HO-1, המפעיל אפקט מגן על התאים. כמווסת עיקרי של תגובות נוגדות חמצון תאיות, NRF2 משפר את יכולת נוגדי החמצון התאיים על ידי ויסות הביטוי של גני מטרה במורד הזרם כגון HO-1, ובכך מעכב פרופטוזיס. לאחר מכן, הטיפול בלוקוסטין הגדיל עוד יותר את הביטוי של HO-1 ו-NRF2 בהשוואה לקבוצה שטופלה ב-hemin (איור 3A,D). תוצאות עקביות נצפו גם ברמת ה-mRNA (איור 3I,J), מה שמאשר עוד יותר כי העיכוב של RKIP מדכא פרופטוזיס בתאי PC12 מגורים על ידי המין על ידי אפנון NRF2 והמולקולה במורד הזרם HO-1.

יש לציין כי מעכב פרופטוזיס אחר, שרשרת כבדה פריטין 1 (FTH1), הראה ביטוי מוגבר עם גירוי האמין, והביטוי שלו היה מוגבר עוד יותר כאשר RKIP עוכב (איור 3H). FTH1 הוא מרכיב עיקרי של פריטין, האחראי על אחסון וחמצון ברזל. הוא ממיר יוני ברזל לצורה יציבה יותר, ומפחית מתח חמצוני המושרה על ידי ברזל חופשי. הוויסות המוגבר של FTH1 עם גירוי המין עשוי לייצג תגובה מפצה לעומס יתר של ברזל, שכן תאים מנסים לאגור עודפי ברזל כדי למנוע נזק חמצוני. העלייה הנוספת בביטוי FTH1 לאחר הטיפול בלוקוסטין מצביעה על רמות ברזל חופשי מופחתות ויכולת נוגדת חמצון מוגברת, מה שמחזק את המסקנה כי עיכוב RKIP מדכא פרופטוזיס המושרה על ידי המין בתאי PC12.

רמות ROS והידרופרוקסיד שומנים (LPO) בתאי PC12 הוערכו באמצעות ציטומטריית זרימה. הטיפול ב-Hemin הוביל לעלייה משמעותית ברמות ROS ו-LPO, שהתהפכה לאחר מתן Locostatin. הממצא הזה מצביע על כך שעיכוב RKIP עשוי לסייע בדיכוי פרופטוזיס בתאי עצב (איור 4A-D).

לסיכום, מינון המושרה על ידי המין והפחתה תלוית זמן בכדאיות תאי PC12, במקביל לעלייה ניכרת ברמות חלבון RKIP . תהליך זה היה קשור לרמות גבוהות של ACSL4 ולדיכוי ביטוי של GPX4. במקביל, נצפתה הצטברות משמעותית של סמני נזק חמצוני (ROS ו-LPO), כאשר שניהם משמשים כמניעי ליבה של פרופטוזיס על ידי תיווך מתח חמצוני והפרעה בקרום השומנים. יתר על כן, ויסות מוגבר של חלבון אחסון הברזל FTH1 הצביע על תגובה תאית מפצה לעומס יתר של ברזל. באופן קריטי, עיכוב פרמקולוגי של RKIP על ידי לוקוסטטין הפך את השינויים הללו וביטל את הפרופטוזיס המושרה על ידי המין (איור 1, איור 2, איור 3 ואיור 4).

תוצאות הבדיקות הצביעו על כך שעיכוב RKIP דיכא ביעילות את הפרופטוזיס העצבי והסדיר את ביטוי NRF2/HO-1 . בהתחשב בכך שמסלול NRF2/HO-1 ממלא תפקיד מפתח בפרופטוזיס, הועלתה השערה כי דיכוי הפרופטוזיס העצבי שנצפה עם עיכוב RKIP עשוי להיות מתווך באמצעות גירוי של מסלול זה. כדי לבחון את ההשערה הזו, נערכו ניסויים נוספים (איור 5A).

נעשה שימוש ב-ML385, מעכב NRF2 סלקטיבי, והתוצאות אישרו שביטוי NRF2 הופחת ביעילות הן ברמות החלבון (איור 5B,C) והן ברמות ה-mRNA (איור 5E). בנוסף, הביטוי של HO-1, מולקולה במורד הזרם של NRF2, הוערך. הממצאים הצביעו על כך שבעוד שעיכוב RKIP הגדיל בתחילה את ביטוי HO-1, השפעה זו התהפכה בעקבות עיכוב NRF2 (איור 5B,D,F). תוצאות אלו מצביעות על כך שעיכוב RKIP עשוי להחליש את הפרופטוזיס העצבי על ידי הפעלת מסלול NRF2/HO-1. צביעה אימונופלואורסצנטית תמכה עוד יותר בממצאים אלה, שכן טרנסלוקציה גרעינית של NRF2 נצפתה בעקבות עיכוב RKIP (איור 5G-J).

לאחר מכן, הערכנו עוד את רמות ה-ROS וה-LPO בתאי PC12 באמצעות ציטומטריית זרימה. מצאנו כי עיכוב של NRF2 עם ML385 הפך את הירידה הנגרמת על ידי לוקוסטטין ברמות ROS ו-LPO. ממצאים אלה מצביעים על כך שדיכוי RKIP עשוי לעכב פרופטוזיס עצבי על ידי הפעלת מסלול NRF2/HO-1 (איור 6A-D).

זמינות נתונים:
מערכי הנתונים שנוצרו במהלך המחקר הנוכחי כלולים בקובץ משלים 1.

איור 1: בניית מודל מחלה במבחנה על ידי תאי PC12 מגורים על ידי המין. (A) איור סכמטי של בניית מודל תאי PC12 מגורה על ידי המין. (ב) קביעת ריכוז המין אופטימלי להקמת מודל דימום תוך מוחי במבחנה באמצעות בדיקת כדאיות התא להערכת כדאיות התא. (C) בדיקת כדאיות תאים עם תאי PC12 שטופלו בהמין (80 מיקרומטר) לנקודות זמן שונות. (ד,ה) ניתוח כתמים מערביים מייצג והערכה כמותית של רמות ביטוי RKIP בתאי PC12 שטופלו בריכוזי המין שונים (24 שעות). (ו,ז) ניתוח כתמים מערביים מייצג והערכה כמותית של רמות ביטוי RKIP בתאי PC12 שנחשפו למין (80 מיקרומטר) לפרקי זמן משתנים. כל הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 3). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. קיצורים: CCK8 = ערכת ספירת תאים-8; WB = כתם מערבי; RKIP = חלבון מעכב ראף קינאז. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: השפעת לוקוסטין על ביטוי RKIP בתאי PC12 מגורים עם המין. (A) המחשה סכמטית של ההליך הניסיוני לטיפול בלוקוסטין בתאי PC12. (B) כדאיות התאים של תאי PC12 שטופלו בריכוזים שונים של לוקוסטטין הוערכה באמצעות בדיקת כדאיות התא. (ג,ד) ביטוי RKIP בתאי PC12 שטופלו בהמין (80 מיקרומטר, 24 שעות) ו/או לוקוסטטין (5 מיקרומטר, 24 שעות) נותח על ידי Western Blot, עם כתמים מייצגים וניתוח סטטיסטי. (E) ביטוי mRNA RKIP בתאי PC12 שטופלו בהמין (80 מיקרומטר, 24 שעות) ו/או לוקוסטטין (5 מיקרומטר, 24 שעות) נמדד באמצעות RT-qPCR. כל הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n=3). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. קיצורים: CCK8 = ערכת ספירת תאים-8; WB = כתם מערבי; RT-qPCR = תגובת שרשרת כמותית של שעתוק הפוך-פולימראז; ROS = מיני חמצן תגובתיים; LPO = חמצון שומנים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: השפעת עיכוב RKIP על פרופטוזיס בתאי PC12 לאחר גירוי המין. (A-E) ניתוח כתמים מערביים של שינויים בביטוי חלבונים ב-ACSL4, GPX4, NRF2 ו-HO-1 בתאי PC12 שטופלו בהמין (80 מיקרומטר, 24 שעות) ו/או לוקוסטין (5 מיקרומטר, 24 שעות). (פ-י) ניתוח RT-qPCR של רמות ביטוי mRNA של ACSL4, GPX4, NRF2, HO-1 ו-FTH1 בתאי PC12 שטופלו בהמין (80 מיקרומטר, 24 שעות) ו/או לוקוסטין (5 מיקרומטר, 24 שעות). כל הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n=3). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. קיצורים: WB = כתם מערבי; RT-qPCR = תגובת שרשרת כמותית של שעתוק הפוך-פולימראז; RKIP = חלבון מעכב קינאז ראף; ACSL4 = משפחת השרשרת ארוכת השרשרת של Acyl-CoA סינתטאז 4; GPX4 = גלוטתיון פרוקסידאז 4; NRF2 = גורם גרעיני E2 הקשור לגורם 2; HO-1 = Heme oxygenase-1; FTH1 = שרשרת כבדה פריטין 1. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: השפעת עיכוב RKIP על מתח חמצוני בתאי PC12 לאחר גירוי המין. (A,C) ניתוח ציטומטריית זרימה של ייצור מיני חמצן תגובתיים בתאי PC12 שטופלו בהמין (80 מיקרומטר, 24 שעות) ו/או לוקוסטין (5 מיקרומטר, 24 שעות). (ב,ד) ניתוח ציטומטריית זרימה של חמצון שומנים בתאי PC12 שטופלו בהמין (80 מיקרומטר, 24 שעות) ו/או לוקוסטין (5 מיקרומטר, 24 שעות). כל הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 3). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. קיצורים: ROS = מיני חמצן תגובתיים; LPO = חמצון שומנים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תפקידו של NRF2 בהשפעות אנטי-פרופטוטיות המתווכות על ידי עיכוב RKIP. (A) המחשה סכמטית של הליך הניסוי לטיפול בתאי PC12 בתנאים שונים. (ב-ד) ניתוח כתמים מערביים של שינויים בביטוי חלבונים ב-NRF2 ו-HO-1 בתנאי טיפול שונים בתאי PC12 עם המין (80 מיקרומטר, 24 שעות) ו/או לוקוסטין (5 מיקרומטר, 24 שעות) ו/או ML385 (5 מיקרומטר, 24 שעות). (ה,ו) ניתוח RT-qPCR של רמות ביטוי mRNA של NRF2 ו-HO-1 בתאי PC12 שטופלו בהמין (80 מיקרומטר, 24 שעות) ו/או לוקוסטטין (5 מיקרומטר, 24 שעות) ו/או ML385 (5 מיקרומטר, 24 שעות). (ג-ג') ניתוח אימונופלואורסצנטי של ביטוי NRF2 ו-HO-1 וכימות עוצמת הקרינה הממוצעת בתאי PC12 שטופלו בהמין (80 מיקרומטר, 24 שעות) ו/או לוקוסטין (5 מיקרומטר, 24 שעות) ו/או ML385 (5 מיקרומטר, 24 שעות). פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. כל הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 3). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. קיצורים: WB = כתם מערבי; RT-qPCR = תגובת שרשרת כמותית של שעתוק הפוך-פולימראז; צביעת IF = צביעה אימונופלואורסצנטית; NRF2 = גורם גרעיני E2 הקשור לגורם 2; HO-1 = Heme oxygenase-1. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: תפקידו של NRF2 בדיכוי מתח חמצוני המתווך על ידי עיכוב RKIP.(א,ג) ניתוח ציטומטריית זרימה של ייצור מיני חמצן תגובתי בתאי PC12 עם המין (80 מיקרומטר, 24 שעות) ו/או לוקוסטטין (5 מיקרומטר, 24 שעות) ו/או ML385 (5 מיקרומטר, 24 שעות). (ב,ד) ניתוח ציטומטריית זרימה של חמצון שומנים בתאי PC12 שטופלו בהמין (80 מיקרומטר, 24 שעות) ו/או לוקוסטטין (5 מיקרומטר, 24 שעות) ו/או ML385 (5 מיקרומטר, 24 שעות). כל הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 3). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. קיצורים: ROS = מיני חמצן תגובתיים; LPO = חמצון שומנים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: ייצוג סכמטי של עיכוב RKIP המחליש פרופטוזיס עצבי בעקבות ICH ספונטני על ידי הפעלת מסלול NRF2/HO-1. הממצאים שלנו מראים כי עיכוב RKIP מקדם ביעילות טרנסלוקציה גרעינית של NRF2, מדכא הצטברות ROS של שומנים, וכתוצאה מכך מגן מפני פרופטוזיס המושרה על ידי המין ומתח חמצוני. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: פריימרים לשעתוק הפוך כמותי-PCR.

קובץ משלים 1: נתונים כמותיים גולמיים ומעובדים התומכים בששת האיורים הראשונים, כולל מבחני CCK-8, כתם מערבי, RT-qPCR וניתוחי זרימה ציטומטרית. הנתונים מאורגנים לפי לוחות משנה של איורים וכוללים את כל ערכי השכפול המשמשים לניתוחים סטטיסטיים. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

המחברים מצהירים כי לא ידוע על אינטרסים פיננסיים מתחרים או קשרים אישיים שיכולים היו להשפיע על העבודה המדווחת במאמר זה.