מיקרוסקופ ראמן רב-מודלי רחב-שדה בעל טרנספורמציה פורייה

סיכום

מיקרוסקופ פורייה בעל שדה רחב, המבוסס על אינטרפרומטר דו-שבירה קומפקטי ויציב במיוחד, מאפשר רכישת ספקטרום מקבילה לכל הפיקסלים בגלאי דו-ממדי. גישת תחום הזמן מאפשרת את הפרדת הפוטולומינצנציה ואותות רמאן, ומאפשרת מיפוי ראמן מהיר (~5 מילישניות לפיקסל) ברזולוציה מרחבית ~1 מיקרומטר ורזולוציה ספקטרלית של 23 ס"^מ-1 .

תקציר

מיקרוסקופיית רמאן היא טכניקה עוצמתית לקביעת ההרכב הכימי של דגימה. האתגר המרכזי של מיקרוסקופי ראמן ספונטניים מתקדמים, המבוססים על זיהוי תדרים בסריקה נקודתית, הוא רכישת מפות ראמן של שטחים נרחבים בשל זמני שהייה פיקסלים ארוכים בדרך כלל (0.1-1 שניות). מיקרוסקופ פורייה בעל שדה רחב (FT) המוצג כאן מאפשר מדידה מהירה של דגימות מורחבות ברזולוציה מרחבית ~1 מיקרון ורזולוציה ספקטרלית ~23 ס"^מ-1 . היא מבוססת על אינטרפרומטר דו-שביר משותף קומפקטי ויציב במיוחד, שנוסף לאורך מסלול הגילוי של מיקרוסקופ מסחרי, ומאפשר רכישת ספקטרום מקבילה לכל הפיקסלים בגלאי דו-ממדי, ומקצר משמעותית את זמן המדידה (פי 10-100 מהר יותר). גישת תחום הזמן מתמודדת ביעילות עם מגבלה נוספת של טכניקת תחום התדרים, שהיא ניתוק אות רמאן מרקע הפוטולומינסציה, שבו ניתן לקבור את אות רמאן. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע מדידות היפרספקטרליות עם מיקרוסקופ מסחרי משודרג: יישור סכמת האור, הקריטריונים לבחירת פרמטרי המדידה, וניתוח הנתונים לשליפה וחקירת ספקטרות.

מבוא

הדמיה ספקטרלית היא טכניקה המספקת גם מידע ספקטרלי וגם מרחבי, ויושמה בתחומים שונים, ממיקרוסקופיה¹ ועד חישה מרחוק². הדמיה רב-ספקטרלית והיפרספקטרלית מובחנת על פי האם נרשמו מספר פסים ספקטרליים נפרדים או ספקטרום רציף לכל פיקסל בחיישן דו-ממדי. הדמיית ראמן היא יישום מיוחד של הדמיה ספקטרלית.

מיקרוסקופ פיזור רמאן הוא טכניקה עוצמתית למדידת תדרי רטט ν_R של מערכת. מצבי רטט קשורים לקשרים הכימיים, ולכן ספקטרוסקופיית רמאן³ מאפשרת חקירת ההרכב הכימי של דגימות במדעי ביולוגיה⁴ ומדעי החומרים⁵. בספקטרוסקופיית ראמן ספונטנית, הדגימה מוארת בקרינה מונוכרומטית בתדר ν₀, הנקראת משאבה. חלק קטן מאור המשאבה, הפועל עם מצבי הרטט, עשוי לעבור פיזור לא אלסטי, מה שמוביל לפוטונים בתדרים ν_S (ν_AS)=ν₀-(+)_{ν R}, כאשר ν_R הוא תדר הרטט המולקולרי בתוך הדגימה. האור המפוזר בעל האנרגיה הנמוכה (ν_S) נקרא קרינת סטוקס, בעוד שהאור בעל האנרגיה הגבוהה יותר (ν_AS) הוא קרינת אנטי-סטוקס. בשיווי משקל תרמי, רוב המולקולות נמצאות במצבי אנרגיה נמוכים יותר, ולכן רכיבי האנטי-סטוקס חלשים משמעותית מאלו של סטוקס. מסיבה זו, מיקרוסקופיית פיזור רמאן בדרך כלל מזהה פוטונים של סטוקס. מכיוון שמולקולות ומוצקים בעלי מצבי רטט מרובים, ספקטרום רמאן מאופיין ברצועות מובחנות היוצרות יחד חתימה כימית ייחודית, המאפשרת זיהוי וניתוח חומר. האתגר העיקרי בגישה זו הוא החתך הנמוך מאוד של פיזור רמאן ספונטני, כאשר רק אחד מכל יותר^{מ-10 9-10} פוטונים עובר תהליך זה.

בתצורה סטנדרטית של מיקרוסקופ פיזור רמאן, אור העירור ממוקד היטב בנקודה אחת של הדגימה. לאחר דחיית פוטוני המשאבה המפוזרים אלסטית (בדרך כלל עם מסננים ספקטרליים), האור שנותר נאסף ומאופיין באמצעות ספקטרומטר תחום התדר (למשל, רשת פיזור); הרזולוציה הספקטרלית של מכשירים אלו יכולה להגיע ~0.5-1 ס"^מ-1. המדידה חוזרת על עצמה עבור כל נקודה (x,y) בשדה הראייה (FOV) של הדגימה באמצעות שיטה הנקראת סריקה נקודתית או רסטרית⁶. ישנן שתי סוגיות עיקריות בגישה זו: (1) החתך הנמוך של פיזור ראמן ספונטני בדרך כלל דורש זמני אינטגרציה ארוכים (0.1-1 שניות) כדי לאסוף מספיק פוטונים לכל פיקסל בספקטרומטר, ולכן מפת רמאן של דגימה מורחבת עשויה לדרוש זמני מדידה ארוכים; (2) ההתרגשות של אור המשאבה גם יוצרת פוטולומינסצנציה (PL), החופפת לאות הרמן הספונטני ולעיתים עלולה להשתלט עליו.

כדי להגדיל את מהירות הרכישה, ניתן לאמץ את גישת סריקת קו⁷ , שבה המשאבה ממוקדת לאורך קו שדה הראייה (למשל בקואורדינטה x) והאות שנאסף (פיזור PL או רמאן) מפוזר על ידי ספקטרומטר עם חיישן דו-ממדי, מה שמייצר עבור הקואורדינטה הנתונה x מערך נתונים דו-ממדי שבו ציר אחד מתאים לספקטרום והשני לקואורדינטות מרחביות y. למרות זאת, יישום זה עדיין סובל מההפסדים המשמעותיים שנוצרים על ידי חריץ הכניסה של הספקטרומטר, שרוחבו הצר מספק רזולוציה ספקטרלית טובה יותר, אך גם מגביל את כמות האור שנאספ.

תצורת שדה רחב יכולה להיות מספקת יותר לקיצור זמן המדידה: בשיטה זו, מואר שטח גדול מהדגימה והספקטרום נרכש עבור כל הפיקסלים של חיישן דו-ממדי בו-זמנית. במקרה זה, ניתן לאסוף מידע ספקטרלי באמצעות סט של מסנני פס⁸ או מסנן ספקטרלי⁹ שניתן לכוונן מול מצלמת הדמיה מונוכרומטית. כמו כן, שיטה זו מבוססת על גישת תחום התדרים, והיא רוכשת רק מספר דיסקרטי של רצועות ספקטרליות.

שיטה חלופית למדידת ספקטרום היא גישת טרנספורמציית פורייה (FT). זו טכניקה בתחום הזמן המבוססת על משפט וינר-קינצ'ין¹⁰, הקובע שצפיפות ספקטרום ההספק של אות היא טרנספורמציית פורייה של האוטוקורלציה בזמן שלו. באופטיקה, זה מושג בפועל על ידי יצירת שני העתקים מושהים של צורת הגל באמצעות אינטרפרומטר. ההפרעה שלהם נמדדת על ידי גלאי כפונקציה של העיכוב היחסי, מה שמוביל למה שנקרא אינטרפרוגרם¹¹. גישת FT משמשת באופן נרחב למדידת ספקטרום באזור הספקטרום האינפרא-אדום, שם היא נקראת ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום בטרנספורמציה פורייה (FTIR)¹². FTIR משמש באופן שגרתי למדידת ספקטרום הספיגה של מעברי רטט בטווח הספקטרלי של האינפרא-אדום האמצעי (~2.5−25 מיקרון).

גישת ה-FT בתחום הזמן מציעה יתרונות מסוימים בהשוואה לספקטרומטרים מפזרים קונבנציונליים: היא משיגה קצב תפוקה גבוה יותר בשל היעדר חריצים (יתרון האטנדו של ז'אקינו¹²); הוא מספק רזולוציה ספקטרלית גמישה, שתלויה רק בטווח הסריקה. יתרה מזאת, היא מתאימה היטב לתצורות שדה רחב: למעשה, כאשר משתמשים בגלאי דו-ממדי, השיטה מודדת אינטרפרוגרם אחד לכל פיקסל במקביל, ומאפשרת הקלטה סימולטנית של ספקטרום רציף בכל הפיקסלים. מצד שני, מערכת הדמיה FT חייבת לעמוד בשני דרישות מאתגרות: (1) יש לשלוט בהשהיה היחסית בין שני הרפליקים של האור לחלק קטן מהמחזור האופטי; (2) יש להגביל את הזזת הפאזה בין קרניים שמפריעות לפיקסל יחיד כדי להבטיח קוהרנטיות טובה ולכן ניגודיות גבוהה. הוצעו פתרונות מסוימים המבוססים על אינטרפרומטרים משותפים^13,14, או כמעט¹⁵, אך הם די מסורבלים או בעלי רזולוציית ספקטרלית גדולה מ-100 ס"^מ-1.

בעבודה זו מתוארת מיקרוסקופ שדה רחב חדשני, המאפשר רכישת תמונות פוטולומינציה ופיזור רמאן. הבלוק החדשני של מערכת זו הוא אינטרפרומטר דו-שבירה משותף קומפקטי ויציב במיוחד, הנקרא מערכת קידוד פולסים זהה מבוססת Translating-Wedges-based (TWINS)¹⁶. הוא מספק סריקות השהיה של מאות מחזורים אופטיים עם דיוק פאזה של חלק קטן מהמחזור האופטי עצמו ויציבות גבוהה. שני הרפליקים של האור בעלי קיטוב אורתוגונלי ונעים באותו מסלול משותף, ולכן הם אינם מושפעים מתנודות באורך המסלול, האופייניים לאינטרפרומטר עם קרן כפולה. הסכימה, המוצגת באיור 1, מורכבת משני בלוקים של גביש דו-שביר עם צירים אופטיים אורתוגונליים: אחד (B₂) באורך קבוע והשני (B₁) מחולק לשני טריזים שניתן להזיז לאורך כיוון ההיפוטונוס המשותף. האור הנכנס מקוטב על ידי P₁ ב-45° ביחס לציר האופטי של הגביש הדו-שביר, כך שחצי מהאנרגיה נמצאת לאורך הקיטוב הרגיל, וחצי לאורך הקיטוב המיוחד. במהלך התנועה לאורך הבלוקים הדו-שביריים, שני הרכיבים האורתוגונליים צוברים עיכוב יחסי שמכוון בעדינות על ידי שינוי העובי הכולל של בלוק B₁ על ידי שינוי הכנסת הטריז. המקצב השני P₂ מקרין את רכיבי השדה לקיטוב ליניארי משותף כדי לגרום להם להפריע. העיכוב τ בין הרפליקים תלוי בהזזת הטריז x לאורך ההיפוטונוס הנפוץ כ-(משוואה 1), עם c מהירות אור, α זווית הקצה של הטריזים, Δn= n _{e-n o} הפרש במדמי שבירה רגילים ויוצאי דופן (ביברינגנס). מכיוון שהרזולוציה הספקטרלית Δv פרופורציונלית הפוך לטווח הסריקה T=|T_{2-T 1}|, עם עיכוב התחלתי וסופי של T₁, T₂ של האינטרפרוגרמה, הרזולוציה הספקטרלית הגבוהה הנדרשת על ידי ספקטרוסקופיית רמאן דורשת ביבריפרנגנס גבוה ותרגומי טריז ארוכים. מבין הגבישים הדו-שבירים הנפוצים ביותר, YVO₄ (yttrium orthovanadate) מתאים במיוחד ל-Δn הגבוה שלו ולטווח השקיפות שלו באינפרא-אדום נראה-קרוב. הטריזים מעוצבים בזווית שיאית של 10°, ולכן, באורך סריקה של 15.3 מ"מ, האינטרפרומטר יכול לספק עיכוב של 2500 fs ב-600 ננומטר, ולקבל רזולוציה ספקטרלית של 23 ס"^מ-1, בכל טווח הספקטרום הרצוי (רגישות מצלמת הסיליקון היא הגבול העליון). עבודה זו תציג את האסטרטגיה לקביעת דגימת אינטרפרוגרמה נכונה (כלומר, טווח שלב וסריקה) להשגת הרזולוציה הספקטרלית הרצויה ולטיפול ברקע הפס הרחב, תוך הפרדת אות רמאן מהפוטולומינצנציה.

כפי שתיארו קנדאו ואח' ¹⁷, ניתן לשלב ספקטרומטר דו-שביר זה עם מיקרוסקופ אופטי מסחרי לביצוע מדידות היפרספקטרליות. הדרישות הן: גוף מיקרוסקופ אופטי שניתן לקונפיגורציה מחדש, אינטרפרומטר דו-שבירה TWINS, מצלמה מונוכרומטית בעלת רעש נמוך (למשל, CCD או sCMOS), ומקור לייזר צר-פס. באחרון, אורכי גל עירור טיפוסיים לרמן ולספקטרוסקופיית פלואורסצנציה הם 355 ננומטר, 488 ננומטר, 514 ננומטר, 532 ננומטר, 633 ננומטר ו-785 ננומטר. למרות שלייזרים בעלי טוהר ספקטרלי גבוה, כמו זה שמופיע בטבלת החומרים, הם הבחירה הטובה ביותר, ניתן להשתמש גם בלייזר ברוחב קו רחב יותר, למשל ~0.1 ננומטר, בהתחשב ברזולוציה הספקטרלית המוגבלת של המכשיר. המיקרוסקופ משודרג על ידי מיקום ה-TWINS במסלול הגילוי, בין עדשת הצינור לגלאי המונוכרומטי. תצורה זו מספקת עיכוב מסלול אחיד בשדה הראייה וניגוד ממוצע של 55%. מסלול העירור מתוכנן לקבל תאורה אחידה של הדגימה: בפועל, קצה היציאה של סיב רב-מצבי גדול מדומים על מישור הדגימה. באמצעות ערבוב מכני, המצבים מחוברים חזק בליבת הסיב, ויוצרים פרופיל שטוח במישור הדגימה. בנוסף, סליל קול רוטט ממוצע את דפוס הנקודות האופייני לקרינה מונוכרומטית. תיאור של תאורת הטופ-האט הזה מוצג באיור משלים 1. הקרן ממוקדת על הדגימה באמצעות אובייקטיב מתוקן לאינסוף, שאוסף גם אור רמאן מפוזר לאחור ואור זוהר לכיוון מסלול הגילוי. המסננים הנדרשים לדחיית תאורה יהיו מפורטים.

כדי להראות כיצד למדוד תכונות ספקטרליות רחב-פס וצר עם מיקרוסקופ היפרספקטרלי זה, נמדדים גם זוהר וגם פיזור רמאן עבור דגימת בדיקה שנבחרה במיוחד למטרות המחשה. הדגימה מורכבת מתערובת של שלושה פיגמנטים אבקתיים עם ספקטרום ראמן ידוע: שני פולימורפים של טיטניום לבן (TiO₂), כלומר רוטיל ואנטאז, וצהוב גופרית קדמיום (CdS). עם זאת, אותו הליך יכול לשמש במגוון רחב יותר של יישומים, ממדעי החומרים ועד ביולוגיה.

היקף מאמר זה הוא להמחיש את השלבים לביצוע מדידה היפרספקטרלית, בעוד שהרכבה ויישור האינטרפרומטר של TWINS מפורטים על ידי קנדאו ואחרים^. לכן, מתנסי מתעניין צריך להתחיל מאינטרפרומטר מורכב מראש המבוסס על טכנולוגיה זו.

הפרוטוקול מתחיל בהכנת הדגימה וכיצד להגדיר את המיקרוסקופ כדי לעורר ולאסוף את הפיזור של רמאן ופוטוני PL. לאחר מכן, פרמטרי הסריקה (אורך הסריקה, שלב הדגימה) ופרמטרי הרכישה (זמן חשיפה, חיתוך חומרה) נקבעים בהתאם לדרישות האות הנחקר. לבסוף, יוצג צינור העיבוד לאחר הטיפול, שיפרט את ההליך לשליפת הספקטרום בכל פיקסל (היפרקוביית ספקטרלית, איור 2B) מתוך מערך הנתונים הזמני שנרכש (היפרקוביה הזמנית, איור 2A), ויפרט את האלגוריתמים להפחתת רעש וניתוח ספקטרלי מתקדם. כל תהליך העבודה מוצג באיור 3.

פרוטוקול

הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת דגימה

אזהרה: לבשו כפפות לטקס במהלך ההכנה הזו, שכן פיגמנט CdS רעיל, במיוחד כאשר הוא נשאפ.

1. השתמש במגרד כדי להניח 20 מ"ג מכל אבקת פיגמנט על איזון מדויק, ולקבל יחס משקל של 1:1:1.
   הערה: נקו בזהירות את קצה המגרד לכל דגימה כדי למנוע זיהום צולב.
2. ערבבו את האבקות עם טיט כדי להסיר גושים.
3. שפוך את התערובת המתקבלת על מגלש מיקרוסקופ; השתמש בקצה המגרד כדי ללחוץ בעדינות ולקבל עובי כמעט אחיד של השכבה.
4. מרחי לק על קצוות כיסוי מיקרוסקופ. מניחים אותו על התערובת, כשהלק פונה כלפי מטה, ולחץ מספיק כדי לאטום אותו. תן לו להתייבש כמה שניות כדי להקשות את הלק.

2. הגדרת מיקרוסקופ

אזהרה: יש להרכיב משקפי בטיחות כאשר הלייזר פועל, שכן ההספק המקסימלי הניתן להשיג במישור הדגימה הוא 300 מ"וואט.

הערה: ביצועי לייזר המשאבה אינם מושפעים משינויים בטמפרטורה, כל עוד הוא מופעל בטווח הטמפרטורות שמצוין בגיליון הנתונים (למשל, 10-40 מעלות צלזיוס עבור הלייזר המדווח בטבלת החומרים).

1. יישר את האינטרפרומטר של TWINS לאורך מסלול הגילוי של המיקרוסקופ.
   הערה: כפי שפורט על ידי קנדאו ואח' ¹⁷, יש להוסיף את מודול האינטרפרומטר בין עדשת הצינור לגלאי, כדי להבטיח מרחק מתאים ביניהם. למיקרוסקופ שבו נעשה שימוש בעבודה זו, הדבר מובטח רק כאשר מודול העינית מוסר.
2. כדי להתאים את סכמת התאורה של קוהלר לגירוי לייזר, להסיר את מנורת העירור המובנית במיקרוסקופ ולהשתמש במטרה של מיקרוסקופ לאיסוף האור ביציאת סיב רב-מצבי גדול בליבה.
   הערה: ההגדלה האובייקטיבית קובעת את גודל דפוס התאורה כאשר קצה הסיב מחובר למישור הדגימה. בחירה אפשרית היא מטרה 10x/0.25-0.30.
3. בחר את אורך גל העירור ומקד את לייזר העירור בקלט של סיב רב-מצבי גדול בליבה. הפעל את המצלמה והפעיל תוכנת ויזואליזציה.
   1. חבר חלק אמצעי של הסיב לממברנה הרוטטת של סליל קול, שיסיר את הנקודה. מערבל מכנית את הסיב על ידי כיפופו הדוק כדי למזג את כל מצבי המרחב שלו. הפעל את הלייזר.
   2. הכינו דגימת בדיקה ליישור, לדוגמה, פסים אדומים פלואורסצנטיים על כיסוי מיקרוסקופ.
   3. כוונן את מיקום קצה הסיב ביחס למערכת האופטית של התאורה על ידי הזזת הסיב בשלב תרגום מדויק כדי לקבל נקודה בעוצמה אחידה וקצוות מוגדרים היטב במישור הדגימה.
      הערה: לייזר 532 ננומטר משמש לכל המדידות המדווחות. עם סיב בגודל ליבה של 400 מיקרון, קוטר הנקודה מכסה 82% מרוחב שדה הראייה של המצלמה.
4. השתמש בקבוצת מסננים למסלולי ההתרגשות והגילוי, תוך אימוץ הקריטריונים הבאים (איור משלים 2):
   1. השתמש במסנן פס צר ברוחב פס 532 ננומטר (2.0 ננומטר) כדי לנקות את קו הלייזר ולדחות כל רצוע צד של משאבה שנוצר מהרחבה לא ליניארית עקב התפשטות בסיב הסיב.
   2. השתמשו במראה דיכרואית (DM באיור 1) כדי להחזיר את אור הלייזר לעבר הדגימה ולשדר את הקרינה המפוזרת חזרה בהסטה אדומה שנאספה על ידי המטרה.
   3. השתמש במסנן מעבר ארוך (LPF באיור 1) ב-532 ננומטר כדי לדחות אור שאריתי.
   4. במהלך מדידת פיזור רמאן, יש להשתמש במסנן קצר-מעבר (SPF באיור 1) ב-600 ננומטר כדי לדכא פלואורסצנציה ברקע.
5. מדוד את ההספק במישור הדגימה עם מד כוח. החלשת קרן המשאבה כדי לקבל עוצמה בדגימה שאינה גורמת לנזק (בסדר גודל של 2 W/cm², כפי שמופיע בטבלה 1). השתמש בתריס ללייזר תוך כדי הגדרת פרמטרי המדידה האחרים.
   הערה: בשל החתך הנמוך של פיזור ראמן ספונטני, נדרשת צפיפות הספק גבוהה לשיפור איסוף האותות. עם זאת, יש לקחת בחשבון את סף נזק הדגימה. בניגוד למערכות סריקה נקודתית, מערכת שדה רחב מאירה שטח גדול, מה שהופך את פיזור הכוח לפחות יעיל ודורש ניהול צריכת חשמל זהיר למניעת נזק לדגימה.
6. שים את הדגימה על שלב המיקרוסקופ וכוון את הפוקוס.
   הערה: כדי למצוא את המיקוד בקלות, תחילה האירו את הדגימה עם מנורה לבנה בשידור או בהשתקפות. במקרה האחרון, ניתן היה להשתמש בנורה הממוקמת ליד המיקרוסקופ. מיקוד הדגימה יוכל לאחר מכן להיות אופטימלי באמצעות אור הלייזר של המשאבה.

3. פרמטרי מדידה

1. הדליקו את הדרייבר של המנוע שמבצע את תרגום הטריז. שלוט ברכיבי החומרה (מצלמה ומנוע) בו-זמנית לביצוע מדידות היפרספקטרליות (דוגמה לממשק המשתמש המוצג באיור משלים 3).
2. הגדר את פרמטרי רכישת המצלמה, זמן החשיפה וקישור החומרה לאופטימיזציה של עוצמת האות, תוך אימוץ ההוראות הבאות:
   1. מכיוון שיחס אות לרעש (SNR) גבוה באות הזמני מוביל ל-SNR גבוה בספקטרום שנשלף, יש להעדיף זמן חשיפה ארוך, שממלא טוב יותר את טווח הדינמיקה של החיישן.
      הערה: באותות נמוכים, כמו בפיזור רמאן, יש למצוא פשרה בין רמת האות לזמן המדידה הכולל: זמן החשיפה הארוך ביותר עשוי שלא להיות אפשרי.
   2. בחר ב-hardware bining כדי לאסוף מטען מפיקסלים נוספים לפני הקריאה.
      הערה: סכימת מטען וביצוע קריאה אחת נותנים ביצועי רעש טובים יותר מאשר קריאת כמה פיקסלים ואז סכימת האות שלהם בעיבוד לאחר מכן. הבחירה ב-binning מונעת גם על ידי הפחתה מקובלת ברזולוציה מרחבית.
3. בחר פרמטרי סריקה, אורך סך הסריקה ושלב הדגימה בהתאם לקריטריונים הבאים:
   1. כדי להשיג רזולוציה ספקטרלית גבוהה לפסגות רמאן, יש להגדיר הזזת טריז ארוכה אסימטרית (-2526 fs→ -36 fs). לעומת זאת, לבצע סריקה סימטרית סביב מיקום העיכוב האפס (-65 fs → 65 fs) כדי לאסוף תכונות ספקטרליות רחבות פס נוספות של אות PL.
   2. באמצעות משוואה 1 לעיכוב τ כפונקציה של העברת יתד x, בחר את שלב הדגימה כדי לעמוד בגבול נייקוויסט עבור רוחב הפס הספקטרלי הרצוי.
      הערה: בהינתן אורך הגל המינימלי של הספקטרום λ_{מינימום}, הטיל (משוואה 2).
      
      כאשר הביברפרינגנס Δn תלוי באורך גל (ראו משוואות סלמייר).
4. פתח את התריס כדי להאיר את הלייזר על הדגימה. אם נצפית ירידה בעוצמת האות, יש להמתין עד שהדגימה תגיע למצב סטטי (בדרך כלל כמה שניות).
   הערה: כדי לפצות על הירידה בעוצמת האות, כוונן את זמן החשיפה וההערכה כדי לשמור על SNR טוב.
5. התחל ברכישת תמונה מונוכרומטית לכל מיקום טריז, כלומר השהיה זמנית בין העתקים מכל נקודה של החיישן הדו-ממדי.
   הערה: תוכנת הרכישה אמורה לשמור שני משתנים: ההיפרקוביה הזמנית (קבוצת תמונות דו-ממדית) וקטור מיקומי המנוע שנקלטו על ידי המקודד במהלך הסריקה.
6. לאחר סיום המדידה, כבו את הלייזר והמשיכו בניתוח הנתונים.

4. עיבוד קוביית הנתונים שנרכשה

1. יצר את ההיפרקוביה הספקטרלית מתוך מאגר הנתונים שנרכש, בהתאם להוראות הבאות:
   1. טען את קובץ תיקון מיקומי המנוע עבור מנוע הצעד הספציפי (ראה את הדיון).
   2. טען את קובץ כיול התדר של האינטרפרומטר הספציפי כדי לקשר תדרים מרחביים נמדדים (פסאודו-תדרים) לתדרים אופטיים אמיתיים (ראו את סעיף הדיון).
   3. בחר את טווח התדרים של הספקטרום שיחושב על ידי טרנספורמציה של האינטרפרוגרמות של כל הפיקסלים.
   4. מבין פונקציות האפודיזציה^{הזמינות 12} לחלון האינטרפרוגרם הנמדד, בחר את זו שמציעה פשרה טובה בין הרחבת ספקטרום להפחתת ארטיפקטים בספקטרום שנשלף, כמו חלון Happ-Genzel (המינג).
   5. נוצר את ההיפרקוביה הספקטרלית על ידי טרנספורם פורייה של האינטרפרוגרמות האפודיזציה עבור כל הפיקסלים. שמור את זה בערכים מורכבים.
      הערה: הספקטרום המורכב מ-FT נושא מידע נוסף, שיהיה שימושי להסרת רעש מערך הנתונים ולחילוץ הספקטרום הממוצע של קבוצת פיקסלים נבחרים.
2. לאחר חישוב ההיפרקוביה הספקטרלית, יש לבצע מחקרים שונים, לדוגמה, השגת הספקטרום הממוצע באזורים נבחרים; לייצר תמונת RGB בצבע שקרי; פסגות ספקטרליות במפה; החסר רקע.
3. כדי להפחית רעש ספקטרלי, שעשוי להציף שיאים משמעותיים, במיוחד בספקטרום רמאן, יש ליישם את פירוק הערך הסינגולרי (SVD)¹⁸ על ידי ביצוע השלבים הבאים:
   1. עצב מחדש את ההיפרקוביה הטמפורלית למטריצה A עם אינטרפרוגרמות לאורך השורות.
   2. מבצעים את SVD של המטריצה, ומקבלים מטריצות U, S ו-V כך ש-A = USV^T.
      הערה: עמודות U הן ההתפלגויות המרחביות של הווקטורים העצמיים של V (עמודות), בעוד ש-S היא מטריצה אלכסונית עם ערכים סינגולריים (SVs) בסדר יורד.
   3. עצב מחדש כל עמודה ב-U למטריצה של פיקסלים ובצע את ה-FT הדו-ממדי שלה כדי לקבל את התדירויות המרחביות שלה.
   4. מכיוון שתדרים גבוהים קשורים לשינויים חדים מאוד במפה, יש להתייחס אליהם כרעש; הגדר אזור ריבועי שמרכזו במרחב פורייה המחושב שמפריד בין תדרים נמוכים (בעיקר אות) לתדרים גבוהים (בעיקר רעש).
      הערה: בחירה אפשרית לאזור זה היא עם צלע של 1/4 ביחס לגודל מרחב פורייה.
   5. חשב את יחס האות המרחבי (SSR) עבור כל SV על ידי חלוקת סכום עוצמות הפיקסלים (מודול מרוכב) בתוך הגבול בסכום העוצמות שמחוץ לגבול. שרטט את SSR כפונקציה של מספר SV.
   6. הגדר סף ל-SSR, כלומר מספר ה-SV המשמעותיים שיש לשמור כדי להפחית את תרומת הרעש במאגר הנתונים, ולמנוע ארטיפקטים.
      הערה: SSR בדרך כלל מציג מגמה יורדת שמתייצבת לרמת רמה ככל שמספר הערכים הסינגולריים עולה. כלל אצבע הוא לשמור על ערכים סינגולריים עד לנקודה שבה מתחיל הרמה.
   7. כוון את כל ה-SVs הנמוכים לאפס במטריצה האלכסונית S, ומקבל S_{ללא רעש,} וחשב היפרקוביית זמן מנוקה מהרעשים כ-V^T האמריקאי_.
      הערה: SVD הוא פירוק מטריציוני שניתן גם ליישם על ההיפרקוביה הספקטרלית המעוצבת מחדש (כאשר שורות המכילות ספקטרות במקום אינטרפרוגרמות).
4. חזור על השלבים 4.1-4.2 עם ההיפרקוביה הטמפורלית המנוקה לרעש כדי לשחזר את הספקטרום.
5. הורידו את התוכנית מהקישור ב-Reference¹⁹ כדי לבצע ניתוח מעמיק יותר של מערך הנתונים באמצעות אלגוריתם MCR-ALS (MCR-ALS) ברזולוציה של עקומות רב-משתניות.
   הערה: מפתחי תוכנה מספקים תיאור מפורט של האלגוריתם²⁰. זו שיטה איטרטיבית לפתרון בעיית ניתוח התערובת: כל ספקטרום מבוטא כשילוב ליניארי של פרופילים ספקטרליים טהורים. עם ייצוג מטריצה: B = C R^T+E, כאשר B הוא מערך הנתונים, C מכיל את הריכוזים לכל ספקטרום, עמודות R הן ספקטרום הייחוס של המרכיבים, ו-E מבטא את השגיאה.
   1. מעצבים מחדש את ההיפרקוביה הספקטרלית למטריצת_תדרים של N_פיקס x N, עם מספר פיקסלים כולל של N_{פיקסלים} ואורך וקטור_תדר N.
   2. בחרו את מספר המינים הצפויים בדגימה וטענו את ספקטרום הייחוס שלהם.
      הערה: ספקטרום ייחוס ניתן למדוד עבור כל פיגמנט בנפרד. אחרת, התוכנית תיצור SVD של מערך הנתונים ותשתמש במספר רכיבים עיקריים כמו הרכיבים שנבחרו לניחושים ראשוניים.
   3. בחר אילוצים: פרופילים ספקטרליים שנשלפו חייבים להיות לא שליליים ודומים ככל האפשר לספקטרום ייחוס.
   4. צייר את מפת הריכוז (עמודות מעוצבות מחדש של C) ואת הספקטרום (עמודות של R) עבור כל מין.
   5. ייצא את המפות הללו והשתמש בהן ליצירת תמונה בצבע שקרי (איור 4A), ומסיים את הניתוח.
      הערה: התוכניות ששימשו לקבלת התוצאות המוצגות כאן אינן זמינות לציבור, אך ניתן לקבל אותן מהמחברים לפי בקשה.

תוצאות

איור 4A מציג את מפת רמאן עבור אזור נבחר בתערובת האבקה. זהו ייצוג צבע שגוי של מפות השפע שנאספו באמצעות MCR-ALS, כפי שמתואר בשלב 4.5. הוא מספק מידע על הרכב הדגימה, שכן ניתן להבחין בבירור בשלושת המינים בתוך שדה ראיית הראייה. איור 4B מציג את הספקטרום הממוצע באזורים הנבחרים של המפה, עם רזולוציית ספקטרלית של 23 ס"^מ-1 המוגדרת על ידי אורך הסריקה שנבחר. קבוצת המסננים שנבחרה מאפשרת למדוד את הטווח 105-2130 ס"^מ-1 (

דיון

מיקרוסקופ רב-מודלי FT רחב שדה הוצג לרכישת תמונות פיזור וזוהר ספונטניות של רמאן, והוא רלוונטי למדעי החומרים. היישום לדגימות ביולוגיות מודגם על ידי קנדאו ואח' ¹⁷, שמציגים תמונת פלואורסצנציה היפרספקטרלית של תאים אנושיים מוצבעים. האתגר המרכזי במדידות פיזור רמאן בתחום זה הוא למנוע נזק פוטוגרפי הנגרם מפיזור חום לא יעיל מאזור מואר מאוד. פתרון אפשרי הוא להפחית את ספיגת ההספק על ידי שימוש באורכי גל של עירור ארוכים יותר (למשל, 785 ננומטר), עם החיסרון של הפחתת חתך הפיזור של ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אנאטסה	קרונוס	1200	פולימורף של TiO2 פיגמנט לבן
אבקת קדמיום סולפיד	קרמר פיגמנט GmbH & חברה.	21060	צהוב קדמיום, אינדקס צבע כהה/PY35
מצלמה	אנדור	לוקה ר'	מצלמת CCD עם כפלת אלקטרונים עם 1004x1002 פיקסלים של 8&מיקרו; m x 8µ m
מסנן ניקוי	סמרוק	LL01-532-12.5	Ø 1/2" 2.0 ננומטר - מסנן לייזר FWHM באורך 532 ננומטר
כיסויי כיסוי	ברנד GmbH & Co	4700 55	כיסויי זכוכית בורוסיליקט בגודל 22x22x0.15 מ"מ
מראה דיכרואית	סמרוק	Di02-R532-25x36	מפצל קרן לייזר דיכרואי חד-קצה 25.2x35.6 מ"מ באורך 532 ננומטר
סיבים אופטיים	Thorlabs	M74L05	400 ומיקרו; גודל ליבת m, סיב רב-מצבי NA 0.39
לייזר	פוטוניקה האבנר	קובולט סמבה 1000	לייזר משאב דיודה CW ב-532 ננומטר, הספק מקסימלי 1000 mW
מסנן מעבר ארוך	סמרוק	LP03-532RU-25	מסנן קצה ארוך-מעבר תלול במיוחד ב-532 ננומטר
מיקרוסקופ	לייקה	DMRBE	מיקרוסקופ מחקר טרינוקולרי
מטרה	לייקה	PL-FLUOTAR, 10x/0.30	מטרת עירור ואיסוף עם הגדלה של פי 10, 0.3 NA
מטרה	ניופורט	M-10X	עדשת אובייקטיבית במסלול ההארה, עם הגדלה פי 10, 0.25 NA
רוטיל	קרונוס	2900	פולימורף של TiO2 פיגמנט לבן
מסנן מעבר קצר	Thorlabs	FESH600	Ø מסנן קצר 25.0 מ"מ עם אורך גל חיתוך 600
שקופיות	מריאנפלד	1000612	שקופיות מיקרוסקופ בגודל 76x26x1 מ"מ