מאמר שיטה

ניתוח התנהגותי של תפקוד לקומוטורי ב-Drosophila melanogaster כקריאה לרעילות עצבית

DOI:

10.3791/68517

⸱

18 ביולי 2025

 ,  ,  ,  , 
1Center of Biotechnology of Azores (CBA), University of the Azores, 2Mesosystem Investigação & Investimentos by Spinpark

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מציג שיטה בעלת תפוקה גבוהה וחסכונית להערכת רעילות עצבית בזבוב הפירות באמצעות כימות תפקוד לקומוטורי כחלופה למודלים מסורתיים של יונקים. מטרתו להעריך את ההשפעות הנוירוטוקסיות של תרכובות פרמצבטיות, גורמים סביבתיים או שינויים גנטיים באמצעות מודל רגיש, ניתן לשחזור וחיובי מבחינה אתית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג שיטה בעלת תפוקה גבוהה וחסכונית להערכת רעילות עצבית בזבוב הפירות (Drosophila melanogaster) על ידי כימות תפקוד לקו-מוטורי. מודלים מסורתיים של יונקים, למרות שהם יעילים, הם עתירי משאבים ומוגבלים מבחינה אתית, מה שמדגיש את הצורך במודלים חלופיים in vivo . הגישה הנוכחית משלבת את מבחן הטיפוס הקלאסי עם פלטפורמת ניטור בזמן אמת כדי ללכוד ליקויים מוטוריים בזבובים בודדים. מערכת משולבת זו משפרת את הרגישות, האוטומציה ויכולת השחזור, ומספקת אסטרטגיה ניתנת להרחבה לסינון נוירוטוקסיקולוגי. צעדים פרוצדורליים קריטיים כוללים תנאי גידול סטנדרטיים, הרדמה וטיפול זהירים כדי למזער תמותת זבובים או שינויים התנהגותיים, וכיול נכון של המערכת. הזנה מבוססת מיקרו-נימי מאפשרת שילוב אופציונלי של כימות בליעה, משלימה את הניתוח התנועתי ומאפשרת הערכה של צריכת תרכובות בעת הצורך. השיטה תומכת בניטור התנהגותי בזמן אמת וארוך טווח, מפחיתה את הטיית הצופים ומאפשרת הערכת התקדמות יומיומית מבלי להפריע לניסוי. ניתן לשלב בדיקת העדפת אור באמצעות מדידות ישירות. הפלטפורמה מספקת יתרונות משמעותיים ברזולוציה התנהגותית, תפוקה ועקביות נתונים. למרות שהוא חסר יכולות פלואורסצנטיות בזמן אמת שנמצאות בכמה מערכות חלופיות, הוא נשאר יעיל מאוד עבור סינון התנהגותי בקנה מידה גדול. פרוטוקול זה חשוב במיוחד עבור מעבדות שמטרתן להעריך את ההשפעות הנוירוטוקסיות של תרכובות פרמצבטיות, חומרים סביבתיים או שינויים גנטיים באמצעות מודל in vivo רגיש, ניתן לשחזור וחיובי מבחינה אתית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכת רעילות עצבית היא קריטית להערכת ההשפעות השליליות הפוטנציאליות של תרכובות סביבתיות ותרופות על מערכת העצבים המתפתחת1. בדיקות נוירוטוקסיות מסורתיות מסתמכות על מודלים של יונקים, כגון מכרסמים, שהם יקרים, גוזלים זמן ומוגבלים מבחינה אתית2. כתוצאה מכך, יש צורך במודלים חלופיים המאפשרים סינון מהיר ותפוקה גבוהה של חומרים נוירוטוקסיים3. מחקרים מדגישים כי זבוב הפירות התגלה כאורגניזם מודל רב עוצמה לחקר רעילות עצבית בשל הגנטיקה המאופיינת היטב שלו, מסלולים נוירו-התפתחותיים שמורים ומחזור חיים קצר 4,5. מבין נקודות הקצה ההתנהגותיות, תפקוד מוטורי משמש כסמן ביולוגי רגיש וניתן לכימות של ליקוי נוירו-התפתחותי, המאפשר זיהוי מוקדם של השפעות נוירוטוקסיות שעשויות להיות בקורלציה עם הפרעות נוירולוגיות אנושיות6.

בדיקות תנועה בזבובים מספקות מדד ניתן לכימות של רעילות עצבית ומאפשרות הערכות מינון-תגובה, מה שהופך אותן לרלוונטיות להפחתת הסיכון לנוירוטוקסיות אנושית7. בדיקת הגיאוטקסיס השלילית (טיפוס) היא גישה נפוצה שבה זבובים מטפסים באופן אינסטינקטיבי לאחר שהקישו אותם לתחתית הבקבוקון, מה שמשקף את רמת ההתפתחות המוטורית, הקואורדינציה ושיווי המשקל שלהם 8,9. בעוד ששיטה זו פשוטה, חסכונית ושימושית להערכת הפרעות תנועה חמורות והפרעות גלויות, היא מספקת רק הערכה חד-ממדית של התנועה ועשויה להיות חסרת רגישות באיתור ליקויים מוטוריים עדינים, שינויים מעודנים וניטור התנהגותי ארוך טווח של תסמינים הנגרמים על ידי נוירוטוקסינגים8. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, פותחו טכנולוגיות מתקדמות יותר למעקב אחר תנועה, כגון מערכת Ethoscope,10. מערכת הקלטה אוטומטית זו היא מכשיר מעקב וידאו בעל תפוקה גבוהה שתוכנן במיוחד כדי לנתח את התנהגות הזבובים בדיוק גבוה ויכולת שחזור11. בניגוד למבחני תנועה קונבנציונליים, מערכת זו מספקת ניטור רציף בזמן אמת של התנועה, ולוכדת חריגות התנהגותיות עדינות שבדיקות טיפוס מסורתיות עשויות להתעלם מהן 11,12,13. הטכנולוגיה כוללת מעקב וידאו אוטומטי באמצעות מערכת מצלמות מוארת אינפרא אדום המתעדת באופן רציף תנועות זבובים ברזולוציה גבוהה, מבטלת את הטיית הצופה ומשפרת את יכולת השחזור הניסויי13. בנוסף, הוא מזהה מיקרו-תנועות, מבדיל בין הליכה, מנוחה ותנועות עדינות כגון טיפוח, האכלה או עוויתות, ומספק ניתוח מפורט יותר של התנהגות מוטורית13. ניטור התנהגותי ארוך טווח אפשרי, המאפשר מעקב רציף לאורך תקופות ממושכות, מה שהופך אותו לאידיאלי להערכת השפעות נוירוטוקסיות מתקדמות10. יכולת ההרחבה והתפוקה הגבוהה של מערכת הקלטת הווידאו מאפשרות מעקב מקביל אחר זבובים מרובים, מה שמקל על סינון של תרכובות נוירוטוקסיות מרובות ומצבים גנטיים בו זמנית10. יתר על כן, המערכת משלבת תוכנת קוד פתוח, המאפשרת לחוקרים להתאים אישית צינורות ניתוח על סמך צרכים ניסיוניים, כולל מחזורי שינה-ערות, מקצבים צירקדיים ומדדי תנועה מפורטים10,14. התקדמות אחרונה, כגון שילוב של אתוסקופיה, מסגרת מבוססת פייתון, שיפרה את ניתוח הנתונים, שיפרה את הנגישות והשחזור במחקרים התנהגותיים14. מסגרת זו מאפשרת לחוקרים לבצע ניתוחי תנועה מורכבים יותר תוך הפחתת חסמים עבור משתמשים שאינם מומחים. מעבדת האתוסקופ, סביבה מבוססת Jupyter, מאפשרת עוד יותר עיבוד נתונים חלק, מקדמת מחקר שיתופי ומבטיחה שחזור ניסיוני14.

על ידי מינוף פלטפורמת מעקב הווידאו בעלת התפוקה הגבוהה לצד מבחני טיפוס מסורתיים, מחקר זה מספק הערכה מקיפה ורגישה של תפקוד מוטורי בעקבות חשיפה לנוירוטוקסינגים התפתחותיים. היכולת לנתח פגמים תנועתיים בקנה מידה עדין הופכת אותו לכלי רב עוצמה לסינון תרכובות המשבשות את ההתפתחות העצבית ואת הקואורדינציה המוטורית. השימוש בזבובי פירות לסינון נוירוטוקסיות מציע מספר יתרונות, כולל עלות-תועלת ויכולת תפוקה גבוהה, בהשוואה למודלים של בעלי חוליות, שבהם הקרנות בקנה מידה גדול מוגבלות לרוב בשל אילוצי עלות15. מודל הזבוב מאפשר מניפולציות גנטיות מהירות כדי לחקות מצבי מחלה ולזהות מסלולים מולקולריים המושפעים מנוירוטוקסינים16. למרות שהם פשוטים יותר ממערכות העצבים של יונקים, הזבובים שומרים על מסלולים שמורים מרכזיים המעורבים בהתפתחות עצבית ובשליטה מוטורית17. שיטות מעקב ברזולוציה גבוהה כגון מערכת מקליט וידאו בזמן אמת משפרות את דיוק הנתונים ואת יכולת השחזור, ומאפשרות זיהוי בשלב מוקדם של ליקויים מוטוריים הנגרמים מחשיפה לחומרים רעילים11.

השילוב של טכנולוגיית מעקב ומבחני טיפוס מסורתיים איפשר ניטור התנהגותי רציף ברזולוציה גבוהה, ומספק שיטה חזקה וניתנת להרחבה לאיתור ליקויים מוטוריים עדינים הנגרמים מחשיפה לחומרים נוירוטוקסיים. השילוב של כלים גנטיים, מחזור חיים קצר וניתוח התנהגותי מתקדם מציב את זבוב הפירות כחלופה רבת עוצמה למודלים של בעלי חוליות לבדיקת רעילות עצבית, ובסופו של דבר תורם לפיתוח תרופות בטוח יותר ולהערכות סיכונים סביבתיים משופרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדוגמה, פרוטוקול זה שימש להערכת הפוטנציאל הנוירוטוקסיק של מקטע הארס Physalis physalis . קבוצת הביקורת קיבלה רק את המאגר הפיזיולוגי ותמיסת הסוכרוז ללא תרכובת הבדיקה. כל הניסויים בוצעו על זן W118 . אישור אתי אינו נדרש לניסויים בדרוזופילה, מכיוון שהם אינם מכוסים על ידי תקנות הטיפול בבעלי חיים.

1. ריאגנטים והכנת דגימות

  1. הכן מאגר ביולוגי כגון PBS (10 מ"מ, pH 7.0) או HEPES (10 מ"מ, pH 7.0), בהתאם לדרישות הבדיקה הספציפית, ותמיסת מלאי של 10 מ' של סוכרוז. חשב את נפח הדגימה על סמך מספר השכפולים ומשך הניסוי.
  2. מדללים את הדגימה לריכוז הרצוי באמצעות מאגר ביולוגי, בתוספת תמיסת סוכרוז עד לריכוז סופי של 1 M. אם הדגימה שקופה, ניתן להוסיף צבע מאכל מתאים (למשל, 0.1 מ"ג/מ"ל צבע כחול או אדום) כדי להעריך את התנהגות האכילה באופן חזותי. במחקר הנוכחי, חלק הארס של Physalia physalis דולל באמצעות PBS לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מיקרוליטר והוסיף לו תמיסת סוכרוז וצבע מאכל.
  3. הכינו תמיסת בקרה שלילית המכילה רק את המאגר והשלימו את התמיסה עם סוכרוז לריכוז סופי של 1 מ ', וצבע מאכל. במחקר הנוכחי, PBS בתוספת סוכרוז וצבעי מאכל שימש כתמיסת בקרה שלילית.
  4. עבור מדיה של זבוב הפירות, עקוב אחר הפרוטוקול המסופקב-18.

2. תחזוקת חומרים ביולוגיים

  1. העבירו זבובים בוגרים בריאים ובוגרים מינית לבקבוק המכיל מדיום מזון טרי. כדי להמשיך, הקש על הזבובים לתחתית הבקבוק, פתח אותו והעביר אותם בהיפוך בקבוק לבקבוק חדש המכיל מדיום זבוב. הנח את הבקבוק באינקובטור המוגדר ל-25 מעלות צלזיוס עם מחזור אור/חושך של 12 שעות ו-50% לחות. אפשרו לזבובים להטיל ביצים למשך הלילה (כ-16-22 שעות) כדי לאסוף מספיק ביצים מסונכרנות.
  2. לאחר הטלת הביצים, השתמש בבקבוק חדש המכיל 70% אתנול כדי להשליך את הזבובים הבוגרים. זה מונע הטלת ביצים נוספת ומבטיח סנכרון בגיל, שהוא חיוני להשגת קבוצה של מבוגרים עם שונות גיל מינימלית.
  3. כדי לתמוך בהתפתחות אחידה, שמור על הבקבוקים באותם תנאים מבוקרים (25 מעלות צלזיוס, מחזור אור/חושך של 12 שעות, 50% לחות). בוגרים מתחילים להופיע בסביבות היום ה-9 או ה-10. מעקב אחר ההתקדמות ההתפתחותית יכול לעזור לחזות את עיתוי הופעת הבוגר.
  4. שמור על הזבובים שנאספו באותם תנאים מבוקרים עד שיגיעו לגיל הרצוי לבדיקה. השתמש בהם תוך 24-48 שעות לאחר ההופעה. תהליך הזדקנות מבוקר זה מבטיח מזעור השונות ושיפור האמינות של תוצאות הניסוי.

3. בדיקת גיאוטקסיס שלילית

הערה: ייצוג סכמטי של מבחן הגיאוטקסיס השלילי מוצג באיור משלים 1.

  1. ביום הניסוי העבירו בעדינות את הזבובים לבקבוק ריק.
  2. יש להרדים זבובים לזמן קצר על קרח לפני ההעברה כדי למזער את התנועה ואת לחץ הטיפול. למטרה זו, הניחו את הבקבוק המכיל את הזבובים בתוך קופסת קרח, המכסה את הבקבוק כולו.
  3. לאחר דקה אחת, הקש בעדינות על הבקבוק כדי לוודא שכל הזבובים מורדמים. החזיקו אותם על הקרח למשך דקה אחת נוספת כדי להבטיח הרדמה מלאה מבלי לגרום ללחץ או להשפיע על יכולת הטיפוס שלהם.
    הערה: שים לב שחומרי הרדמה מסוימים, כגון CO2, יכולים להשפיע על התנהגויות עוקבות, כולל התנהגות טיפוס לקויה, ולהשפיע על תוצאות בדיקת הגיאוטקסיס השלילית.
  4. בזמן שהזבובים מורדמים, הכינו מיכל קטן יותר מלא בקרח והניחו צלחת פטרי או משטח שטוח ונקי על גבי הקרח כדי ליצור פלטפורמה צוננת. הגדרה זו מסייעת בשמירה על הרדמה במהלך המיון וממזערת את תנועת הזבובים לאחר ההתאוששות.
  5. העריכו את ההרדמה על ידי אישור קיבוע מוחלט של הזבובים לאחר 2 דקות על הקרח. לאחר הרדמה מלאה, העבירו בעדינות את הזבובים על ידי היפוך הצינור על צלחת פטרי צוננת והקשה עדינה עליהם כדי לשחרר אותם. המשטח הקר יעזור לשמור על הזבובים משותקים במהלך הטיפול.
  6. בעזרת מכחול עדין ותחת סטריאומיקרוסקופ (בהגדלה של פי 10 ו-20x, אם זמין), הפרד בעדינות בין זבובים זכרים ונקבות על סמך מאפיינים ייחודיים, כגון גודל ודפוסי פיגמנטציה. הזכרים בדרך כלל קטנים יותר עם פסים שחורים רחבים, בעוד שהנקבות גדולות יותר עם בטן בהירה ומוארכת יותר. בצע שלב זה במהירות האפשרית כדי למזער את השפעת ההרדמה על זבובים.
    הערה: אם ההבחנה בין המינים אינה נחוצה לניסוי, השמיט את שלב ההפרדה. צמצמו את זמן החשיפה וטפלו בזבובים בעדינות כדי להפחית מתח ושינויים התנהגותיים פוטנציאליים.
  7. העבירו בזהירות את הזבובים הממוינים לבקבוקונים ריקים עם הקצאה מתאימה. אפשר להם להתאושש מההרדמה למשך כ-30 דקות בסביבה מבוקרת (25 מעלות צלזיוס, מחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות, 50% לחות) לפני שתמשיך בבדיקה.
  8. להכנת הזנה מיקרו-נימית, השתמש בפיפטה כדי לטעון ידנית 10 מיקרוליטר מתמיסת הבדיקה לכל צינור מיקרו-נימי. ודא שהנפח עקבי בכל הדגימות כדי לתקנן את תנאי האכלה.
  9. בעזרת פיפטה, הוסף 3-5 מיקרוליטר שמן מינרלי לקצה הפתוח של המיקרו-נימי. זה מונע מהדגימה להתאדות ולדלוף במהלך הניסוי.
  10. הכנס את המיקרו-נימים הממולאים מראש דרך חורים בתקעי בקבוקון הכותנה, וודא שהם ממוקמים היטב. במידת הצורך, השתמש בקצוות שנחתכו בעבר כדי להתאים את הכותנה בחוזקה מבלי לחסום את זרימת האוויר.
  11. הנח את הבקבוקונים המכילים את הזבובים באינקובטור המוגדר ל-25 מעלות צלזיוס עם מחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות. השאירו אותם למשך הניסוי והחליפו ידנית את המיקרו-נימים במזון טרי שהוכן מדי יום כדי להבטיח חשיפה עקבית. תקופת החשיפה תלויה ברעילות ובאופי הדגימה ונמשכת בדרך כלל בין 2 ל-7 ימים.
  12. במרווחים של 12 שעות, העבירו את הזבובים לבקבוקון נקי וריק כדי להעריך את הפעילות התנועה.
  13. מודדים ומסמנים קו 7 ס"מ מתחתית הבקבוקון באמצעות טוש קבוע. גובה זה ישמש כיעד טיפוס.
  14. מקם מצלמה או טלפון במיקום יציב כדי לתעד את התנהגות הטיפוס. הקפידו על תאורה נאותה ורקע שקוף לניתוח. ודא שההגדרה הניסיונית תואמת לשדה הראייה של המצלמה.
  15. יש להקיש בעדינות על הבקבוקון כדי להביא את הזבובים לתחתית, ואז להתחיל מיד בהקלטה. הימנע מכוח מופרז שעלול לפצוע או לבלבל את הזבובים.
  16. סקירת ההקלטות ומדידת הזמן שלוקח לכל זבוב להגיע לקו המסומן של 7 ס"מ. הגדר מגבלת זמן מקסימלית (למשל, 30 שניות); הקצו את הזמן הזה לכל זבוב שלא מצליח להגיע לקו.
  17. שימו לב היטב לכל התנהגויות חריגות, כגון תנועה לא מתואמת, התחלה מאוחרת של טיפוס או דפוסי טיפוס לא סדירים. סימנים אלה עשויים להצביע על ההשפעות הנוירוטוקסיות של התרכובת שנבדקה.
    הערה: להנחיות מפורטות על הכנת הזנה, עיין בפרוטוקול בדיקת מזין נימי (CAFE)19. שיטה זו מספקת הנחיות מדויקות להכנת מקורות מזון נוזליים לזבובי פירות, מבטיחה כימות מדויק של צריכת המזון ומזעור השונות בניסויי האכלה.

4. בדיקות ניטור בזמן אמת

הערה: להגדרה, כולל הייצוג הסכמטי של רכיבי מערכת המעקב ופרוטוקול הכיול, אנא עקוב אחר פרסומים קודמים11,12. סקירה כללית של הניסויים מוצגת באיור משלים 2.

  1. בדיקת תנועה בזמן אמת (בדיקת מעקב)
    1. חזור על שלבים 3.8-3.9 כדי להכין את המיקרו-נימי ההזנה עם הדגימה וחותם השמן המינרלי.
    2. הכן תאי תנועה בודדים באמצעות קשיות פלסטיק שקופות, כל אחת באורך של כ -6 ס"מ. קשיות אלו משמשות כמארזים חסכוניים ושקופים המתאימים להקלטות. הצינורות צריכים להיות תואמים לזירת השינה11, המכילה 20 צינורות למחקרי התנהגות בתפוקה גבוהה.
    3. אטמו קצה אחד של כל קשית בסרט שקוף, והבטיחו סגירה אטומה. בסמוך לקצה האטום, צור חור קטן כדי להכיל את החדרת המיקרו-נימי ההזנה. ודא שהחור גדול מספיק כדי להחזיק היטב את המיקרו-נימי מבלי לגרום לדליפות או לתנועה במהלך הבדיקה.
    4. חזור על שלבים 3.1-3.6 כדי להרדים, אופציונלי להפריד ולהניח בעדינות זבוב מורדם אחד לכל צינור באמצעות מברשת עדינה. אטום את הקצה הפתוח של כל צינור עם סרט שקוף או פקק כותנה, מה שמבטיח זרימת אוויר ובלימת זבובים.
    5. הנח את הצינורות המורכבים בזירה, וודא שכל מיקרו-נימי נשאר נגיש בחוץ להחלפה יומיומית. הכנס מיקרו-נימי מילוי מראש לכל צינור. אפשר לזבובים להתאושש ולהתאקלם במשך כ-30 דקות לפני תחילת הבדיקה.
    6. הנח את המכשיר בתא עם תנאי סביבה מבוקרים (למשל, 25 מעלות צלזיוס, מחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות, 50% לחות). חבר את המכשיר לרשת או למערכת מעקב מקומית.
    7. גש לפלטפורמה ואתר את המכשיר שהוקצה לניסוי. ודא שהמערכת עוקבת במדויק אחר כל זבוב, כפי שמצוין על ידי הסמנים. הזן את כל המטא נתונים הניסויים הרלוונטיים והתחל להקליט את הבדיקה. לניתוח נתונים מתקדם, השתמש במסגרת Rethomics, חבילת R המיועדת לניתוח נתונים התנהגותיים בתפוקה גבוהה11,12.
    8. החלף מזון במיקרו-נימים מדי יום בתמיסות טריות. בדוק ויזואלית כל זבוב מדי יום כדי להבטיח הישרדות והתנהגות נכונה לאורך תקופת הניסוי הנמשכת בדרך כלל בין 3 ל-5 ימים.
  2. הערכת שעון ביולוגי
    1. כדי לחקור את השעון הביולוגי של זבובים ואת השינויים הפוטנציאליים שלהם, ודא שהניסוי מתחיל בסנכרון עם מחזור אור/חושך מוגדר. שמור על תקופת אור של 12 שעות / חושך של 12 שעות לאורך כל שלב ההקלטה כדי למנוע הפרעות במקצבים אנדוגניים. לאחר קביעת התנאים, חזור על שלבים 4.1.1-4.1.8, וודא שכל ההליכים מבוצעים באופן עקבי על פני שלבי האור/חושך.
  3. הערכת התנהגות העדפת אור/חושך
    1. חזור על שלבים 3.1-3.11 להכנת זבובים והאכלת מיקרו-נימים.
    2. לאחר הכנת בקבוקוני האכלה, הנח אותם בחממה כדי לאפשר לזבובים להאכיל את דגימת הבדיקה למשך שעתיים (או משך זמן אחר כפי שנקבע על ידי נתוני פעילות תנועה קודמים).
    3. כדי להעריך את התנהגות העדפת האור, הכינו תאי תנועה בודדים המכסים 50% מכל צינור בנייר אלומיניום ליצירת אזור כהה מוגדר. הקפידו על כיסוי עקבי בכל הצינורות כדי לאפשר השוואה סטנדרטית.
    4. חזור על שלבים 4.1.2-4.1.4 כדי להעביר זבובים בנפרד לתאי תנועה, תוך השמטת החדרת מיקרו-נימים.
    5. הנח את הצינורות המוכנים לזירה ואפשר לזבובים להתאקלם במשך כ-30 דקות.
    6. חזור על שלבים 4.1.6-4.1.7 ורשום את התנהגות הזבובים למשך 60 דקות. צינורות שבהם נרשמת תנועה מופחתת עשויים להצביע על העדפה כהה, מכיוון שמערכת המעקב אינה מזהה את הזבובים הממוקמים באזור המכוסה בנייר כסף כדי לאותת על חסימה.

5. ניתוח נתונים

  1. הכן את תבנית המטא נתונים על ידי הכללת כל המידע הדרוש כגון מזהה, טיפול, פרטי תרכובת, משך הבדיקה ומשתנים רלוונטיים אחרים. דוגמה לתבנית וצינור עיבוד הנתונים המתאים כלולים בטבלה משלימה 1.
  2. שמור את קובץ המטה-נתונים שהושלם בתבנית CSV. כדי להבטיח תאימות, פתח את קובץ ה- CSV בעורך טקסט כדי לוודא שהוא אינו מכיל תווים מיותרים או בעיות עיצוב. הסר תווים זרים אם קיימים.
  3. לפני שתמשיך בניתוח הנתונים, צור גיבוי של הנתונים. פתח מסוף ובצע את הפקודה הבאה: sudo python backup_tool.py. שלב זה מגן על הנתונים מפני אובדן או פגיעה פוטנציאליים במהלך הניתוח.
  4. זהה ורשום את המיקום של קבצי הנתונים המתאימים לניסוי. ודא שקבצים אלה נגישים לניתוח.
  5. ניתוח נתונים באמצעות Rethomics. פתח את RStudio וטען את חבילות Rethomics הדרושות לניתוח נתונים התנהגותיים. הוראות מפורטות והדרכות זמינות באתר Rethomics: https://rethomics.github.io/scopr.html

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדוגמה, פרוטוקול זה שימש להערכת הפוטנציאל הנוירוטוקסיק של מקטע הארס Physalis physalis . הקבוצה המטופלת כללה זבובים שניזונו ממאגר פיזיולוגי בתוספת תמיסת סוכרוז (עד לריכוז סופי של 1 M) ומקטע ארס הבדיקה. קבוצת הביקורת קיבלה רק את המאגר הפיזיולוגי ותמיסת הסוכרוז ללא תרכובת הבדיקה. כל הניסויים בוצעו על זן W118 .

בשיטה המתוארת, זבובים לא מטופלים, קבוצת הביקורת, הפגינו התנהגות תנועה וטיפוס אופיינית (פנוטיפ שלילי), בעוד שזבובים שנחשפו לשברים רעילים ייצגו את הקבוצה המטופלת (פנוטיפ ח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בראש ובראשונה, קביעת מינון לא קטלני (תת-קטלני) היא צעד ראשוני קריטי לביצוע ניסויי נוירוטוקסיות. זה מבטיח שהזבובים יישארו ברי קיימא לאורך כל המחקר, מה שמאפשר התבוננות בהשפעות התנהגותיות ותנועתיות ללא גורם התמותה המבלבל. במחקר שלנו, המינון התת-קטלני של מקטע הארס Physalia physalis נקבע כ-10 מיקרוגרם/מיקרוליטר. כדי להבטיח תוצאות חזקות וניתנות לשחזור, מומלץ לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים לכל קבוצת טיפול, כל אחד מורכב מעשרה זבובים ולפחות שלושה שכפולים טכניים. זה מתאים למינימום של 30 זב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסופרת זוזנה טומקילסקה הועסקה על ידי Mesosystem S.A., והסופרת אנה קאסאס קשורה גם היא ל-Mesosystem S.A. שאר המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים כלשהם שיכולים להתפרש כניגוד אינטרסים פוטנציאלי.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי פרויקט מענקי ה-EEA MOD. פ.נ. FRM.059.PT.V03 – Physalia physalis: מקור חדשני ולא מנוצל למוצרי קוסמטיקה בעלי ערך מוסף גבוה; על ידי "Pacto da Bioeconomia Azul" (פרויקט מס' C644915664-00000026) בתוך WP5 – Algae Vertical, במימון הקרן האירופית של האיחוד האירופי לדור הבא ותוכנית ההתאוששות והחוסן הפורטוגלית (PRR); ועל ידי Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) באמצעות CBA (UIDB/05292/2020 ו-UIDP/05292/2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
רדיד אלומיניום --
צבע כחול   ריינר-צבע כחול ריינרס 28 מ"ל
מודול מצלמה 2 NoIRפטל Pi 096-4062מסופק על Mauser.pt
כותנה משוטטתסיגמא-אולדריץ'BR28205
בקבוקי מלאי של דרוזופילהVWRVWRI734-1249זבוב בקבוק עגול 60Z
בקבוקוני דרוזופילהVWRWRI734-2255
צלחת פטרי מזכוכיתסיגמא-אולדריץ'BR455701
מיקרו המטוקריט נימיסיגמא-אולדריץ'BR749321
כרטיס MicroSD--Producent ממליץ להשתמש בכרטיס SD עם לפחות 32GB של אחסון עבור התקנות Raspberry Pi OS
ספק כוח מיקרו-USBפטל Pi 096-4585מסופק על Mauser.pt
שמן מינרלי ביו-ראד#1632129
מברשת צבע--
סלאין חוצץ פוספט (PBS)רכיבים שמקורם בחברות שונות-בופר המשמש להכנת מזון לקבוצת הביקורת ומשמש לדילול דגימה; 10 מ"מ pH 7
תקעים לבקבוקונים ובקבוקים של דרוזופילהVWRVWRI734-2875
תקעים לבקבוקונים ובקבוקים של דרוזופילהVWRVWRI734-2673
סרט איטוםסיגמא-אולדריץ'HS234526C
מחשב לוח יחיד  (3 דגם ב')פטל Pi 096-5700מסופק על Mauser.pt
סוכרוזסיגמא-אולדריץ'S9378
קש פלסטיק שקוף--כל מה שתואם לזירת שינה אתוסקופית (6,5 ס"מ על 0,5 ס"מ)

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
  2. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nat Rev Neurosci. 11 (7), 514-522 (2010).
  3. Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 74-83 (2010).
  4. Gupta, S. C., et al. Chlorpyrifos induces apoptosis and DNA damage in Drosophila through generation of reactive oxygen species. Ecotoxicol Environ Saf. 73 (6), 1415-1423 (2010).
  5. Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. Lancet Neurol. 13 (3), 330-338 (2014).
  6. Bal-Price, A., et al. International STakeholder NETwork (ISTNET): creating a developmental neurotoxicity testing roadmap for regulatory purposes. Arch Toxicol. 89 (2), 269-287 (2015).
  7. Cabrita, R., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541(2022).
  8. Mendes, C. S., Bartos, I., Akay, T., Márka, S., Mann, R. S. Quantification of gait parameters in freely walking wild-type and sensory deprived Drosophila melanogaster. Elife. 2, e00231(2013).
  9. Dubovický, M., et al. Evaluation of developmental neurotoxicity: some important issues focused on neurobehavioral development. Interdiscip Toxicol. 1 (3-4), 206-210 (2008).
  10. Pereira, T. D., Shaevitz, J. W., Murthy, M. Quantifying behavior to understand the brain. Nat Neurosci. 23 (12), 1537-1549 (2020).
  11. Geissmann, Q., et al. Ethoscopes: an open platform for high-throughput ethomics. PLoS Biol. 15 (10), e2003026(2017).
  12. Geissmann, Q., Garcia Rodriguez, L., Beckwith, E. J., Gilestro, G. F. Rethomics: an R framework to analyse high-throughput behavioural data. PLoS One. 14 (1), e0209331(2019).
  13. Blackhurst, L., Gilestro, G. F. Ethoscopy and ethoscope-lab: a framework for behavioural analysis to lower entrance barrier and aid reproducibility. Bioinform Adv. 3 (1), vbad132(2023).
  14. gilestrolab/ethoscopy. , https://github.com/gilestrolab/ethoscopy (2025).
  15. Bilder, D., Irvine, K. D. Taking stock of the Drosophila research ecosystem. Genetics. 206 (3), 1227-1236 (2017).
  16. Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (4), 504-523 (2010).
  17. Affleck, J. G., Walker, V. K. Drosophila as a model for developmental toxicology: using and extending the Drosophotoxicology model. Methods Mol Biol. 1965, 139-153 (2019).
  18. Frias, J., Simoes, N. Fruit Fly Potato Culture Media. protocols.io. , (2020).
  19. Diegelmann, S., et al. The Capillary Feeder (CAFE) Assay measures food intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), e55024(2017).
  20. Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., VandenBrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Sci Rep. 5, 15298(2015).
  21. Gilestro, G. F. Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster. Nat Protoc. 7 (5), 995-1007 (2012).
  22. Ardekani, R., et al. Using GFP Video to Track 3D Movement and Conditional Gene Expression in Free-Moving Flies. PLoS One. 7 (7), e40506(2012).
  23. Mackay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482, 173-178 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Drosophila

מאמרים קשורים