מאמר שיטה

במבחנה בנייה מחדש של רשתות שלד ציטו בתוך שלפוחיות ענק חד-שלדיות מופרדות (GUVs)

2.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68530

⸱

20 ביוני 2025

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג בנייה מחדש פשוטה של סיר אחד של רשתות שלד ציטו בתוך שלפוחיות ענק מופרדות פאזה. ניתן להכליל את השיטה וליישם אותה על אנקפסולציה או כליאה של מגוון רחב של ביומולקולות.

תקציר

ממברנות ליפידים ביומימטיות בצורת שלפוחיות חד-פעמיות ענקיות (GUVs) משמשות בדרך כלל לחיקוי התנהגות ממברנה תאית בגלל הקלות של בנייה מחדש של חלבון בתוך GUVs, הדמיה, כמו גם הבנת דינמיקת קרום-חלבון תאית. עם זאת, קרומי התאים מורכבים מרפסודות שומנים (או תחומים) הנובעים מנוכחותם של שומנים שונים בקרום התא. ניתן לשלב מורכבות מוגברת כזו במערכות מודל כדי לגרום ל-GUVs מופרדים פאזה, שבהם ניתן לכוונן את הרכב השומנים בעדינות. בעוד ששיטות אנקפסולציה ליצירת GUVs הומוגניים ידועות ברבים, שיטות לעטוף חלבונים בתוך GUVs מופרדים פאזה מוגבלות. כאן, פרוטוקול זה מציג ייצור פשוט בסיר אחד של GUVs מופרדים פאזה, המורכבים מתחומים עם הפרעה נוזלית (Ld) ונוזל (Lo), העוטפים ביעילות חלבוני שלד תאים שונים, כלומר, FtsZ ואקטין, מה שהופך את השיטה לכלי רב-תכליתי לייצור תאים מינימלי. באופן ספציפי, גישה זו משתמשת בפרוטוקול העברת תחליב כדי לייצר GUVs עם יעילות אנקפסולציה גבוהה. בשיטה זו, ליפיד-חד-שכבתי נוצר תחילה על ידי תחליב תמיסת חלבון בתערובת שומנים/שמן, כאשר ליפידים בטמפרטורות מעבר פאזה משתנות נבחרים כדי להניב הפרדת פאזה ב-GUVs המתקבלים. תחליב זה מועבר בעדינות על גבי תמיסת שומן בשמן בשפופרת אחרת, וכתוצאה מכך נוצר ממשק מים-שמן. לאחר מכן התמיסה עוברת צנטריפוגה בטמפרטורות גבוהות (באופן אידיאלי ב-37 מעלות צלזיוס כדי לשמור על פעילות החלבון), ולאחר מכן נאספים GUVs להדמיה. שיטה זו מפשטת את הבנייה מחדש במבחנה של חלבוני שלד ציטו בתוך GUVs מופרדים פאזה ללא שימוש במערך מעבדה מסורבל, ובכך משמשת כשיטה נוחה לחקר המכניקה של אינטראקציות ציטוס-שלד בקרום בכליאה.

מבוא

שלפוחיות ענק משמשות כמערכות מודל להבנת תפקודים תאיים 1,2. קלות הייצור, ההדמיה, הכוונון והבנייה מחדש של ביומולקולות במבחנה הופכים את המודלים הביומימטיים הללו למערכת הבחירה עבור מחקרים רבים 3,4,5. ישנן מספר שיטות ידועות לייצור GUVs, כגון אלקטרופורמציה6, cDICE 7,8, העברת תחליב ושיטות אחרות המבוססות על מיקרופלואידיקה 9,10. ייצור GUV בשיטות כאלה מדווח בספרות 3,11. יתר על כן, במבחנה, בנייה מחדש של רשתות שלד ציטו בתוך GUVs תוארה בעבר בשיטת העברת תחליב בשל הקלות של שיטת היווצרות סיר אחד זו, שאינה דורשת התקנה מורכבת12. עם זאת, בנייה מחדש כזו מדווחת לעתים קרובות מאוד ב-GUVs הומוגניים, מערכת שאינה מחקה באופן מלא את המורכבות של ממברנות התאים.

פרוטוקול זה מתאר את הבנייה מחדש במבחנה של רשתות שלד ציטו בתוך GUVs מופרדים פאזה, המציגה את המורכבות של קרום השומנים. בעוד שרשתות כאלה דווחו בעבר כנקשרות על פני הממברנה (מבחוץ) אך אינן מוגבלות בתוך שלפוחיות הענק13,14, טכניקת העברת האמולסיה הנוכחית מתמקדת בפרוטוקול כדי להניב הפרדת פאזה, כמו גם לשמור על פעילות היווצרות הרשת של השלד הציטולוגי. אחד האתגרים העיקריים בטכניקה זו הוא הטמפרטורה. שיטות ייצור סטנדרטיות ליצירת GUVs מופרדים פאזה דורשות שימוש בטמפרטורות גבוהות, המשתנות בהתאם לטמפרטורת מעבר הפאזה של השומנים המרכיבים. עם זאת, חלבוני שלד ציטו אינם מסוגלים להתפלמר למבנים מסדר גבוה יותר בטמפרטורות כה גבוהות 15,16,17. לפיכך, פרוטוקול זה לא רק משתמש בהרכב ליפידים כדי להניב הפרדת פאזה ב-GUVs בטמפרטורת החדר, אלא גם מייעל את התנאים להפקת תשואה טובה של GUVs בטמפרטורות פיזיולוגיות.

היבט נוסף שיש לקחת בחשבון בעת ייצור מערכות GUV משוחזרות הוא נפח הביו-מולקולות המכוסות הנדרשות. עבור רוב החלבונים, ייצור נפחים גדולים יותר יכול להיות יקר וגוזל זמן, וכולל מספר סבבי טיהור. יתר על כן, ניסויי בנייה מחדש במבחנה מחייבים בדרך כלל שלב גישוש ראשוני שבו ריכוזי הביו-מולקולות, הרכבי החיץ וכו', נבדקים תחילה כדי להשיג תכולת תמיסה פנימית אופטימלית. לפיכך, פרוטוקול זה מייעל את פרוטוקול הייצור של GUV עבור שתי בדיקות שונות, המותאמות להנחות היסוד הנ"ל. מצד אחד, פרוטוקול זה מתאר בדיקה אחת המייעלת את פרוטוקול האמולסיה ההפוכה הסטנדרטי, הכולל נפחים גבוהים יחסית של חלבונים ומייצר ייצור GUV בעל תפוקה גבוהה בצינורות, המועברות מאוחר יותר ללוחות הדמיה של 96 בארות. מצד שני, הגישה המתוארת כאן גם מייעלת את הפרוטוקול לייצור GUV מופרד-פאזה ישירות בלוחות בארות הדמיה, המעסיק נפחים נמוכים יותר של ביו-מולקולות (~1/4 מהכמויות הנדרשות לייצור בצינורות) ומאפשר יצירת GUV בסדרה, תוך השגת תנאים עטופים רבים בשלב צנטריפוגה אחד. לפיכך, הפרוטוקול המוצג כאן מציג שיטת אנקפסולציה אחת אך מאפשר למשתמש לבחור כל אחת מההגדרות על סמך דרישותיו.

יתר על כן, פרוטוקול זה מתאר שיטה אופטימלית לאנקפסולציה עבור שתי רשתות שלד תא שונות: FtsZ ואקטין. מכיוון ששני החלבונים הללו דורשים תנאי חיץ וצפיפות שונים, הפרוטוקול מתייחס לשינויים הדרושים הבאים כדי להשיג בנייה מחדש אופטימלית של הרשת. לכן, ניתן להשתמש בגישה המוצגת כאן ולהכליל אותה לעטיפת כל ביומולקולות נדרשות בתוך GUVs מופרדים פאזה.

פרוטוקול

הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת תערובת שומנים

  1. קח 0.5 מ"ל כלורופורם בבקבוקון זכוכית של 5 מ"ל. הוסף 17.5 מיקרוליטר DOPC, 7.4 מיקרוליטר DOPG, 29.6 מיקרוליטר DPPC (הכל ממלאי שומנים של 25 גרם/ליטר שהוכנו בכלורופורם), 32.2 מיקרוליטר של 10 גרם/ליטר DPPG ו-20.6 מיקרוליטר של 18 גרם/ליטר כולסטרול. הוסף 1.2 מיקרוליטר של 1 גרם/ליטר צבע Atto655-DOPE. מערבלים בעדינות את תערובת השומנים ומאדים את הכלורופורם תחת זרימת חנקן ומשעים מחדש את הסרט הדק בסך הכל 400 מיקרוליטר כלורופורם.
  2. עבור אנקפסולציה של FtsZ, תערובת השומנים הסופית שהוכנה היא ביחס DOPC: DOPG: DPPC: DPPG: Chol (17.499: 7.5: 31.5: 13.5: 30 mol ratio) מסומן ב-0.001 mol% Atto655-DOPE. לייצור GUVs עם אקטין צרור מכוסה, תערובת השומנים מכילה ליפידים ביוטיניליים, והיא מוכנה ביחס DOPC: DOPG: DPPC: DPPG: Chol: Biotinyl CAP PE (17.499: 7.5: 30.5: 13.5: 30: 1) מסומן ב-0.001 mol% Atto655-DOPE.
  3. ממיסים את תערובת השומנים (32 מ"מ, 50 מיקרוליטר) בכלורופורם ומייבשים בבקבוקון זכוכית מתחת לזרימת גז N2 למשך ~15 דקות.
  4. לאחר מכן, בקבוקון הזכוכית מאוחסן בוואקום בחומר ייבוש למשך ~30 דקות כדי להיפטר מכל שאריות של כלורופורם שנותר.
  5. פזרו את הסרט המיובש בתערובת של דקאן (20 מיקרוליטר) ושמן מינרלי (500 מיקרוליטר) בבקבוקון הזכוכית כדי להניב את הריכוז הסופי של 3.2 מ"מ וסוניקט בטמפרטורות גבוהות (~50 מעלות צלזיוס) למשך ~30 דקות באמצעות סוניקטור אמבטיה.
  6. העבירו את תערובת השומנים בשמן לצינור ודגרו את השפופרת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ~10 דקות לפני שתמשיכו לשלבים הבאים.
  7. הכן את תערובת האנקפסולציה הפנימית לחלבונים.

2. הכנת תמיסות פנימיות לאנקפסולציה

  1. תערובת נימה FtsZ
    1. מכינים את תערובת החלבון FtsZ בנפח כולל של 10 מיקרוליטר במיקרו-צינור. עבור רשת חוטי FtsZ, הוסף 0.87 μL של 23 μM FtsZ-YFP-mts, 1.31 μL של 381 g/L Ficoll70, 1.11 μL של 271 g/L BSA ו-1 μL של 25 mM GTP לחוצץ תגובה FtsZ (RB) של 5.71 μL. הנפח הכולל של התמיסה הוא 10 μL המכיל 2 μM FtsZ-YFP-mts, 50 g/L Ficoll70, 30 g/L BSA ו-2.5 mM GTP בתמיסה הסופית. שמור אותו על קרח לפני השימוש בו למעטפת בתוך GUVs.
      הערה: מאגר תגובה FtsZ (RB) מכיל 50 מ"מ Tris-HCl, pH 7.5, 150 מ"מ GluK, 5 מ"מ GluMg.
  2. תערובת אקטין-צרור
    1. למעטפת צרורות אקטין, הכינו תחילה תערובת מאסטר של 10 מיקרוליטר אקטין (A-Mix) המכילה 86% G-אקטין, 10% Atto488-actin ו-4% אקטין ביוטיניל במים. לשלב זה, הכינו פתרונות מלאי חלבון לפי הוראות היצרן. לאחר מכן, לריכוז סופי של 35.42 מיקרומטר A-Mix, הוסף 6.39 μ ליטר של 2 גרם/ליטר G-אקטין, 1.48 מיקרוליטר של 1 גרם/ליטר Atto488-אקטין, 1.19 מיקרוליטר של 0.5 גרם/ליטר אקטין ביוטיניל ו-0.9 מיקרוליטר H2O. שמור על קרח וכסה מאור.
    2. כדי למנוע פילמור מקדים וחבילה של אקטין מחוץ ל-GUVs, הכינו את תמיסת האקטין הסופית דקות לפני האנקפסולציה. התמיסה הסופית מורכבת מ-7% יודיקסאנול, 0.01 גרם/ליטר נויטראווידין, 2.4 מיקרומטר A-Mix, 0.6 מיקרומטר פאשין, 10 גרם/ליטר BSA, 20 גרם/ליטר Ficoll70 ו-5 מ"מ ATP במאגר פילמור אקטין.
      1. כדי להכין את התמיסה הסופית הזו, אותה יש לשמור על קרח כל הזמן, הוסף בסדר הבא: 2.92 מיקרוליטר של 60% יודיקסאנול, 10.25 מיקרוליטר H2O, 2.5 מיקרוליטר של 0.1 גרם/ליטר נויטרווידין, 0.92 מיקרוליטר של 271 גרם/ליטר BSA, 1.31 מיקרוליטר של 381 גרם/ליטר Ficoll70, 2.5 מיקרוליטר של 10x מאגר פילמור אקטין, 1.69 מיקרוליטר של 35.42 מיקרומטר A-Mix, 1.65 מיקרוליטר של 9 מיקרומטר פאשין ו-1.25 מיקרוליטר של 100 מ"מ ATP. מערבבים היטב ולוקחים במהירות את 5 המיקרוליטר הדרושים למעטפת.
        הערה: מדוד את האוסמולריות של תמיסה פנימית זו באמצעות אוסמומטר (~430 mOsm/Kg). יש להכין תערובת תמיסה חיצונית תואמת עם אותה אוסמולריות על ידי דילול גלוקוז במים עד להגעה לאותו ערך אוסמולריות (ראה שלב 3.2). מאגר פילמור אקטין 10x מכיל 100 מ"מ Tris-HCl, pH 7.5, 500 מ"מ KCl ו-50 מ"מ MgCl2.

3. ייצור GUV ואנקפסולציה במבחנה

  1. ייצור GUV בצינורות: אנקפסולציה של FtsZ
    1. עבור אנקפסולציה של FtsZ, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר תגובה FtsZ (RB) בצינור פלסטיק של 1.5 מ"ל והוסף בעדינות תערובת שומנים בשמן של 200 מיקרוליטר (שהוכנה בשלב 1.6 לעיל) כדי לאפשר היווצרות ממשק שמן-מים ושקיעה של חד-שכבת שומן בממשק זה.
    2. כדי ליצור את האמולסיה, קחו תחילה שפופרת נוספת של 1.5 מ"ל והוסיפו 200 מיקרוליטר ליפידים בשמן. דגרו את הצינור הזה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ~10 דקות לפני יצירת האמולסיה.
    3. לאחר הדגירה, הוסף 5 מיקרוליטר מתערובת החלבון FtsZ (שהוכנה ב-2.1.1) לצינור זה. החלבון 5 מיקרוליטר במדיה מימית שוקע לתחתית הצינור כטיפה.
    4. הכינו תחליב על ידי הקשה עדינה על תחתית הצינור 5-6 פעמים עד שהתמיסה הופכת עכורה בעליל.
    5. פיפטה בעדינות את האמולסיה הזו והנח אותה על גבי ממשק השמן-מים (הוכן בשלב 3.1.1 לעיל).
    6. צנטריפוגה זו ב-6000 x גרם למשך 30 דקות בטמפרטורה שחוממה מראש של 37 מעלות צלזיוס ושומרת על טמפרטורה זו עד לסיום ייצור השלפוחית.
    7. הניחו לדגימה להתקרר לטמפרטורת החדר כמעט 30 דקות לפני ההדמיה.
    8. הסר את שכבת השמן העליונה על ידי פיפטינג בעדינות מהחלק העליון של הצינור, והשאיר תמיסה של כמעט 100-200 מיקרוליטר להדמיה.
    9. חותכים קצה פיפטה בזווית נוטה בעזרת מספריים ומרימים בעדינות 50-100 מיקרוליטר מתמיסת ה- GUV מתחתית הצינור. פתרון זה ישמש להדמיה.
  2. ייצור GUV ישירות בצלחות של 96 בארות: אנקפסולציה של אקטין
    1. לאנקפסולציה של אקטין, הכינו תחילה תערובת תמיסה חיצונית (גלוקוז במים) עם אותה אוסמולריות כמו תערובת האקטין הפנימית. כדי להתאים את ~430 mOsm/Kg של התערובת הפנימית, הכינו תערובת תמיסה חיצונית על ידי הוספת 198 מיקרוליטר של גלוקוז 2 M ב-802 מיקרוליטר H2O.
    2. כדי להכין את השלפוחיות ישירות על צלחת באר, תחילה פסיביים באר אחת של צלחת 96 בארות. מוסיפים 100 מיקרוליטר של 10 גרם/ליטר BSA בבאר ודוגרים למשך 10-15 דקות. לאחר מכן, שטפו את הבאר בתמיסה חיצונית של 100 מיקרוליטר חמש פעמים תוך הקפדה לא לגעת בתחתית הזכוכית הפסיבית עם קצה הפיפטה. השאירו 100 מיקרוליטר מתערובת התמיסה החיצונית בבאר לאחר השלמת הכביסה.
    3. מוסיפים בעדינות לבאר תערובת שומנים של 50 מיקרוליטר בשמן כדי להכין את שכבת השומנים החד-שכבתית על גבי התמיסה החיצונית. כדי להבטיח שקיעה נכונה של השמן על גבי השלב הימי, הנח את קצה הפיפטה בצד אחד של הבאר ותן לשמן להחליק מדופן הבאר.
    4. כדי ליצור את האמולסיה, קחו תחילה שפופרת של 1.5 מ"ל והוסיפו 100 מיקרוליטר ליפידים בשמן. דגרו את הצינור הזה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ~10 דקות לפני יצירת האמולסיה.
    5. הוסף 2.5 מיקרוליטר מתמיסת האקטין הסופית (משלב 2.2.2) לשפופרת המכילה תערובת שומנים בשמן של 100 מיקרוליטר (שלב 1.6 לעיל). החלבון של 2.5 מיקרוליטר במדיה מימית שוקע לתחתית הצינור כטיפה.
    6. הכינו תחליב על ידי הקשה עדינה על תחתית הצינור 10-20 פעמים עד שהתמיסה הופכת לעכורה בעליל.
    7. פיפטה בעדינות את האמולסיה הזו והנח אותה על גבי ממשק השמן-מים (הוכן בשלב 3.2.3 לעיל). טבלו את קצה הפיפטה בזהירות באמצע שכבת השמן החד-שכבתית והפקידו את האמולסיה. האמולסיה יוצרת ענן עכור המוגבל בשלב חד-שכבת השמן.
    8. צנטריפוגה את צלחת 96 הבארות ב-200 x גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה שחוממה מראש של 37 מעלות צלזיוס ושמרו על טמפרטורה זו עד לסיום ייצור השלפוחית.
      הערה: צנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 10 דקות כדי לקצר את זמן ייצור השלפוחית. עם זאת, היצמד לפרמטרים אלה של צנטריפוגה לקבלת התוצאות הטובות ביותר. צנטריפוגה מעל 400 x g גורמת לשלפוחיות דחוסות עם אגרגטים ליפידים המצטברים בתחתית לוחית ההדמיה.
    9. הניחו לדגימה להתקרר לטמפרטורת החדר כמעט 30 דקות לפני ההדמיה.
      הערה: ניתן לבצע הדמיה ישירה על באר ללא צורך להסיר את שכבת השמן העליונה או להעביר את השלפוחיות לתא/באר אחר.

4. הדמיה ושחזור תמונות תלת מימד

  1. קח לוחית באר הדמיה 96 ופסיב אותה עם BSA למשך ~10 דקות לפני העברת הדגימה ללוחית באר ההדמיה (ראה שלב 3.2.2).
  2. העבירו את תמיסת ה-GUV לצלחת הבאר הפסיבית.
  3. הגדר את לוחית הבאר על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך על מטרת מים פי 40.
  4. התמקד בכל אזור עניין (ROI) וקח רצף תמונות z-stack מההחזר על ההשקעה שנבחר עם מרווחי z-step קבועים. הפרוטוקול מביא ל-GUVs בגודל 5-30 מיקרומטר, כך שניתן לקבע את המרווח ל-0.5-1 מיקרומטר, לפי הצורך.
  5. שמרו כל רצף תמונות ב-z-stack בתבנית .tiff.
  6. פתח רצף תמונות מעניין בתוכנת עיבוד תמונה (ImageJ/Fiji). זהה את התמונה בעוצמה הגבוהה ביותר. החזק את ctrl+shift+c כדי לפתוח את חלון הבהירות והניגודיות ולחץ על אוטומטי.
  7. בתפריט ImageJ/Fiji, עבור אל Analyze > Set Scale והזן את המרחק הפיזי הידוע ואת היחידה שלו עבור כל פיקסל בתמונה.
  8. בתפריט ImageJ/Fiji, עבור אל פרויקט Image > Stacks > Z כדי לשחזר תמונה תלת-ממדית מערימת z. הגדר את סוג ההקרנה כסטיית תקן. ניתן להשתמש באפשרויות ברירת המחדל עבור שאר ההגדרות (פרוסת התחלה ופרוסת עצירה).
    הערה: היזהר מחפצי הקרנה של סטיית תקן הנובעים מערימות z חופפות בשחזור תלת מימד. כדי להבטיח שאין חפצים, הסר ערימות z בחצי הכדור התחתון של הכדור כדי לצפות רק בהקרנה של החצי העליון.

5. ניתוח סטטיסטי של תדירות GUV על בסיס גודל

  1. רכוש תמונות Z-stack של ה-GUVs המעניינים, כפי שמוסבר בשלבים 4.4 ו-4.5. כדי לצלם כמה שיותר GUVs בשדה ראייה רחב, רכוש ערימות קונפוקליות בזום 1x או 2x.
  2. פתח את רצפי ה-Z-stack בתוכנת עיבוד תמונה (במקרה זה, ImageJ/Fiji), כפי שהוסבר ב-4.6.
  3. בחר את ערוץ התצוגה שבו נרכש אות הקרינה של הממברנה על ידי לחיצה על הסרגל המסומן כ-c מתחת לתמונה. כוונן את הבהירות והניגודיות של התמונה כפי שמוסבר ב-4.6.
  4. נווטו בין המישורים השונים שנרכשו על ידי לחיצה על סרגל z מתחת לתמונה הפתוחה. בחר את המישור שבו קוטר השלפוחית שיש לנתח הוא הגדול ביותר.
  5. פתח את מנהל ההחזר על ההשקעה ב-ImageJ/Fiji על ידי לחיצה על ניתוח כלי > > מנהל החזר ההשקעה.
  6. מהכלים הזמינים בחלונית הראשית של ImageJ/Fiji, לחץ על הבחירה הסגלגלה.
  7. צייר עיגול שמתאים ל-GUV על ידי מעקב אחר עוצמת הקרינה של קרום ה-GUV. כדי לצייר בחירת עיגול, הקש על מקש Shift וגרור את העכבר כדי להרחיב את העיגול עד לגודל השלפוחית. ניתן להזיז את בחירת העיגול על ידי לחיצה בו זמנית על כפתור העכבר השמאלי במרכז השלפוחית וגרירת העכבר למיקום הרצוי.
  8. אחסן את בחירת העיגול שצוירה במנהל ה-ROI על ידי לחיצה על הוסף [t], הממוקם בחלונית האפשרויות של מנהל ה-ROI.
  9. כדי לקבל את גודל השלפוחית במיקרונים, לחץ על מדידה הממוקמת בלוח של מנהל החזר ההשקעה. יופיע חלון חדש. קח את הערך המוצג בעמודה ראשי או משני (שתי העמודות חייבות להיות בעלות ערך זהה מכיוון שהן מתייחסות לצירי אליפסה) כמדידה לקוטר השלפוחית.
  10. השתמש בתוכנת התוויה (Excel, Origin, Prism) כדי ליצור גרף עמודות שבו מצוין חלק ה-GUVs עבור טווחי גדלים שונים.

תוצאות

כצעד ראשון, GUVs עם הפרדת פאזה ממברנה יוצרו בעקבות גישת אמולסיה הפוכה שונה (איור 1A). התוצאה היא תפוקה גבוהה של GUVs, המציגים ממברנה מעורבבת לתחומי Ld ו-L, כפי שמיוצג על ידי תווית Atto 655-DOPE על תחום Ld ואזורים כהים המתאימים לתחומי Lo לא מסומנים (איור 1B). שיטה זו מניבה GUVs מופרדים-פאזה בגדלים הנעים בין 5-30 מיקרומטר (איור 1C) בטמפרטורות גבוהות (כל השלבים מבוצעים ב-37 מעלות צלזיוס ומצולמים ב-RT). יתר על כן, מהירויות הצנטריפוגה הותאמו כדי להבטיח את שילוב השומנים המרכיבים המקוריים בתוך GUVs וכן כדי למנוע אוכלוסיית יתר מוגזמת.

יתר על כן, כדי להדגים את האנקפסולציה המוצלחת של ביומולקולות בשיטת האמולסיה המתוארת בפרוטוקול הנוכחי, הן רשתות FtsZ והן רשתות אקטין נבנו מחדש בניסויים בודדים. רשתות FtsZ מסוכמות בתוך GUVs, אשר מופיעים כחוטים הנקשרים באופן מועדף לתחומי Ld באמצעות רצף מיקוד הממברנה שלהם (MTS) בנוכחות 2.5 mM GTP ו-50 g/L Ficoll70 (כפי שמתואר באיור 2). הרשתות נצפו כשעה לאחר שלב האנקפסולציה. עם זאת, רשתות אקטומיוזין מופיעות כצרורות דקים (בניגוד לרשתות עבות של FtsZ) לאחר בנייה מחדש בתוך GUVs (איור 3). יש לציין כי ליפידים ביוטיניליים ממלאים תפקיד מכריע בקשירת רשתות האקטומיוזין לקרום ה-GUVs. ללא ליפידים ביוטיניליים, צרורות אקטומיוזין אינם יכולים לאמץ תצורה מעוקלת ולהישאר כצרורות ישרים, קצרים ונוקשים בלומן במקום להיצמד לממברנה כרשת סבוכה של צרורות ארוכים (איור 4).

בפרוטוקול האמולסיה המותאם, מהירות הצנטריפוגה מותאמת להשגת GUVs מופרדים פאזה, כפי שהוזכר קודם לכן. ואכן, מהירויות צנטריפוגה גבוהות יותר עם דגימות המכילות רשתות אקטומיוזין (600 x g למשך 15 דקות) גורמות לצבירת שלפוחיות לתצורה דמוית רקמה בתוך באר הייצור. לפיכך, בכל ניסויי הבנייה מחדש הסטנדרטיים של רשתות אקטומיוזין, מהירות הצנטריפוגה האופטימלית הוגדרה ל-200 x g כדי להשיג GUVs לא מצטברים (איור 5).

figure-results-1
איור 1: יצירת סיר אחד של GUVs מופרדים פאזה תוך שימוש בשיטת העברת תחליב כפול. (A) סכמה ניסויית של שלבי המפתח בייצור סיר אחד של שלפוחיות מופרדות פאזה באמצעות העברת תחליב כפולה. (B) תמונת הקרנת Z קונפוקלית של ה-GUVs המתקבלים שנוצרו בעקבות השיטה המתוארת ב-A. סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר. (C) גרף עמודות עם חלק ה-GUVs המופרדים פאזה שנוצר בהתאם לקוטר שלהם. ניסויים שבוצעו n = 3, המספר הכולל של GUVs שנותחו לכל ניסוי = 100. נתונים המוצגים כערכים ממוצעים, נקודות נתונים בודדות הן שלושת הניסויים הבלתי תלויים. קווי שגיאה מייצגים את סטיית התקן של שלושת הניסויים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: שלפוחיות מופרדות פאזה עם רשתות FtsZ עטופות. (A) תמונות הקרנה תלת-ממדיות קונפוקליות המבוצעות על מחסנית z נרכשת במלואה של GUV מופרד פאזה המכיל רשת FtsZ. (B) תמונות הקרנת Z קונפוקליות שמבוצעות רק בחצי העליון של השלפוחית. בשל היווצרות הטרוגנית של תחומים על פני השטח של ה-GUV, השחזור התלת-ממדי של הפרוסות הקונפוקליות הנרכשות מראה חפיפה של תחומי שומנים מהאזורים העליונים והתחתונים של השלפוחית. כדי למנוע חפיפה ולהקל על הבדיקה החזותית של הדומיינים, המחצית התחתונה של ערימות ה-z שנרכשו מוסרות מהקובץ. החצי העליון שנוצר משמש לאחר מכן להקרנה תלת-ממדית באמצעות סטיית תקן. פסי קנה המידה הם שניהם 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: שלפוחיות מופרדות פאזה עם רשתות אקטומיוזין עטופות. (A) תמונות הקרנה Z קונפוקליות של ערימה נרכשת שלמה עם זום-אאוט של הבאר לאחר ייצור השלפוחית. התשואה הגבוהה של השלפוחיות המתקבלות מאפשרת לחקור מבני אקטומיוזין שונים בתוך השלפוחית. סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר. (B) תמונות הקרנת Z קונפוקליות המבוצעות בחצי העליון של שלפוחית. כדי להקל על הניתוח החזותי של תחומי השומנים, רק המחצית העליונה של פרוסות התמונה משמשת לביצוע הקרנה תלת מימדית. סרגל קנה המידה הוא 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: חשיבותם של ליפידים ביוטיניליים ליצירת רשתות אקטומיוזין הקשורות לממברנה בתוך שלפוחיות מופרדות פאזה. הקרנות תלת מימד קונפוקליות המתארות שלפוחיות מופרדות פאזה עם רשתות אקטומיוסין שאינן מחוברות. אם ליפידים ביוטיניליים אינם משולבים בתערובת, נוצרים מבני אקטומיוזין בלומן ואינם רוכשים תצורה מעוקלת על העלון הפנימי של השלפוחיות (פאנל ימני, אקטין מסומן ב-Atto488). סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: השפעת מהירות הצנטריפוגה על ייצור שלפוחיות מופרדות פאזה באמצעות העברת אמולסיה. תמונות דו-ממדיות קונפוקליות המציגות דגימת GUV שנוצרה על ידי הפעלת כוח צנטריפוגה של 600 x g למשך 15 דקות. מהירות הצנטריפוגה המופעלת, גבוהה מ-200 x g האופטימלית, מביאה לצבירת שלפוחיות לתצורה דמוית רקמה בתוך הבאר. סרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

אחד האתגרים העיקריים לבנייה מחדש במבחנה של מערכות מודל מבוססות ממברנה הוא אנקפסולציה של חלבונים בתוך GUVs מופרדים פאזה בשל הכנתם בטמפרטורות גבוהות. ואכן, יצירת שלפוחיות מופרדות פאזה מסוג זה באמצעות סינתזה של סיר אחד עלולה להוביל לקשיים הנובעים מפירוק חלבונים בטמפרטורות גבוהות. לפיכך, פרוטוקול זה מתאר את התנאים האופטימליים לצפייה בהפרדת פאזות הממברנה בעקבות שיטת האמולסיה הכפולה לייצור GUV בטמפרטורות פיזיולוגיות, תוך שמירה על פעילות החלבונים העטופים. גישה זו מציגה מטען שלילי לשני התחומים כדי להקל על קשירת כל החלבונים הרצויים כאשר אינטראקציות אלקטרוסטטיות הן תנאי מוקדם. במקרה של אנקפסולציה של FtsZ, למרות נוכחותו של מטען שלילי בשני התחומים, רשתות השלד הציטו-שלד מתפתחות ונקשרות באופן מועדף לתחומי Ld , מה שמצביע על כך שיחד עם מטען שלילי, נזילות הממברנה היא דרישה חיונית לקשירת חלבון18. יתר על כן, במקרה של אנקפסולציה של אקטין, הרשתות מתפתחות על אזורי ממברנה שבהם משולבים ליפידים ביוטיניליים19.

למרות שבדיקת העברת האמולסיה נמצאת בשימוש נרחב בספרות, היא יושמה רק על ייצור GUVs הומוגניים. פרוטוקול זה, אם כן, מורכב ממספר היבטים מותאמים של הבדיקה, המאפשרים תצפית על היווצרות תחום בממברנה. אחד ההיבטים העיקריים בהקשר זה הוא הטמפרטורה. כדי לצפות בתחומים, כמו גם לשמור על הפונקציונליות של החלבונים (במיוחד היווצרות רשת שלד תאים), פרוטוקול זה משתמש ב-37 מעלות צלזיוס כדי לייצר GUVs. מצד אחד, כאשר GUVs מיוצרים בטמפרטורה גבוהה יותר, החלבונים העטופים מאבדים את הפונקציונליות שלהם, שוכנים בלומן ולא מתפלמרים למבנים מסדר גבוה יותר. מצד שני, אם GUVs מיוצרים בטמפרטורה נמוכה יותר, לא נצפית הפרדת פאזה בקרום. לפיכך, 37 מעלות צלזיוס הופכת לטמפרטורה האופטימלית לייצור GUV בניסויים.

חשוב לציין כי פרוטוקול זה מספק שתי מערכות בדיקה אפשריות לייצור GUVs בהתאם לאותו עיקרון העברת תחליב: בתוך צינורות וצלחות באר. שניהם מציגים יתרונות וחסרונות, שייתכן שהמשתמש יצטרך לקחת בחשבון בשלב תכנון הניסוי כדי לקבוע איזו מערכת מתאימה ביותר לצרכיו. ואכן, צינורות פלסטיק אינם דורשים צנטריפוגה המצוידת ברוטור לצלחות באר, קל יותר לטפל בהם ומאפשרים שליטה על גורם הדילול של השלפוחיות לאחר הייצור ולפני ההדמיה. עם זאת, הם דורשים נפחים גבוהים יותר (הן עבור שמן והן עבור פאזות מימיות) והסרת שכבת השמן לאחר הייצור לצורך מיצוי GUV, מה שעלול להשאיר שאריות שמן בבאר ההדמיה אם שלב זה לא יבוצע בקפידה. לחלופין, לוחות באר דורשים שימוש בפחות נפח דגימה, מאפשרים עטיפה של תנאים פנימיים שונים בסדרה ובבת אחת, ואינם דורשים מיצוי GUV, שכן ניתן לדמות שלפוחיות מיד לאחר הייצור באותה באר ייצור. החיסרון העיקרי של לוחות באר הוא צבירת שלפוחיות והצורך להתאים פרמטרי צנטריפוגה כדי להגיע לתפוקת ייצור שלפוחית דומה לזו שנצפתה בצינורות.

ללא תלות במערכת האנקפסולציה המופעלת (צינורות או לוחות באר), גישה זו מראה כי נדרשים תנאי צפיפות אופטימליים לייצור ה-GUVs, כמו גם כדי להקל על פילמור של חלבונים עטופים. בפרט, בעקבות פרוטוקול זה, המצב הטוב ביותר עבור GUVs עם FtsZ עטוף נצפה עם 30 גרם/ליטר BSA ו-50 גרם/ליטר Ficoll7018; ואילו עבור אקטין, נדרשה תערובת של 10 גרם/ליטר BSA, 7% יודיקסאנול ו-20 גרם/ליטר Ficoll7019.

היבט חשוב נוסף בייצור GUV הוא מהירות הצנטריפוגה וזמן. ליצירת רשתות FtsZ תחת ריכוזי הצפיפות שהוזכרו לעיל, צנטריפוגה ב-6000 x g למשך 30 דקות הופכת אוכלוסייה של GUVs המפוזרים היטב ומופרדים על פני לוחית באר ההדמיה. לעומת זאת, עבור אקטין, 200 x g למשך 20 דקות מאפשר יצירת תפוקת ייצור GUV גבוהה. אם מהירות הצנטריפוגה או הזמן מופחתים, התשואה של GUVs מושפעת, ואילו הגדלתה מעל הערכים האמורים מובילה לצבירה של GUVs. בתנאים האמורים, פרוטוקול זה מייצר GUVs עם יעילות אנקפסולציה מקסימלית כמו גם GUVs בודדים שאינם נדבקים זה לזה.

בעוד שניתן להכליל פרוטוקול זה לכל שומנים וביו-מולקולות עטופות, הרכב הממברנה הרצוי ותכולת השלפוחיות מכתיבים את פרמטרי הצנטריפוגה, המאפשרים יצירת שלפוחיות מופרדות פאזה. לכן, פרוטוקול זה משמש כקו מנחה המאפשר ייצור שלפוחיות מגוונות עם תחומי ממברנה.

מתודולוגיות כאלה של בנייה מחדש במבחנה בתוך GUVs מופרדים פאזה הן חיוניות להבנת דינמיקה מורכבת של חלבון-ממברנה המתווכת דרך תחומי שומנים, תוך התחשבות במורכבות של ממברנות התא14. הגודל הקטן והאופי הדינמי מאוד של תחומי השומנים הללו מקשים על אפיון אינטראקציות הפנים in vivo. לפיכך, GUVs משמשים ככלי חיוני בשל קלות ההכנה היחסית שלהם ואפנון פיזיקלי-כימי, כמו גם התאמתם לניתוח במיקרוסקופ אור20.

בנוסף, האנקפסולציה של מולקולות פונקציונליות בתוך ממשקים ביולוגיים הטרוגניים מציגה יישומים מבטיחים בתחום הננו-רפואה. בפרט, פיתוח מערכות אספקת תרופות פונקציונליות בעלות תכונות שונות הנובעות מהתפלגות אסימטרית וחלוקה של ביומולקולות לאזורים סגורים על פני השטח שלהן21. אינטראקציות בין תרופות לשומנים ממלאות תפקיד משמעותי בתכונות הפרמקוקינטיות של תרופות, כגון הובלתן, הפצתן והצטברותן, אשר בסופו של דבר משפיעות על יעילות התרופות המשמשות22. לכן, הבנת התפקיד של אינטראקציות אלה על התכונות הפרמקוקינטיות של תרופות היא קריטית בפיתוח תרופות יעילות. ניתן לחקור ממברנות ליפידים מודל כדי להבין את מנגנוני האינטראקציות שלהם עם פפטידים, פולימרים וננו-נשאים23. לפיכך, שינויים בהרכב השומנים של תאים ורקמות במצבי מחלה מסוימים עשויים לשנות אינטראקציות ביופיזיקליות, שניתן לחקור כדי לפתח תרופות ספציפיות למטרה ומערכות העברת תרופות24.

לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן מספק אסטרטגיה קלה ליצירת GUVs מופרדים פאזה עם חלבונים עטופים המעוגנים לעלון השומנים הפנימי שלהם. ליצירת מערכות שלפוחית אלה יש שימוש מבטיח בתחומים כמו ביוטכנולוגיה וביולוגיה סינתטית, שבהם מכלולים מרובי רכיבים עם פונקציות מורכבות לחיקוי פונקציות דמויות תא עשויים להביא פתרונות חדשניים ויישומים חדשים.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

המחברים רוצים להודות למתקן הליבה של MPIB על הסיוע בטיהור חלבונים, למיכאלה שפר על שיבוט פלסמיד, לקרסטין רורל לטיהור חלבונים ולסנדרה אורטמאייר על תכשירי שומנים. המחברים רוצים גם להודות לאדריאן מרינו-סלומון ולשונשי קוהימה על דיונים מועילים על תנאי צפיפות ואנקפסולציה של חלבונים. מ.ר.-ל. הוא חלק מ-IMPRS-ML ופרויקט ONE MUNICH הנתמך על ידי משרד החינוך והמחקר הפדרלי (BMBF) וכן מדינת בוואריה החופשית תחת אסטרטגיית המצוינות של הממשלה הפדרלית וה-Länder. המחברים רוצים גם להודות לתמיכת המרכז לננו-מדע (CeNS) במינכן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (מלח נתרן) (DOPG)שומנים קוטביים של Avanti840475בכלורופורם
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)שומנים קוטביים של Avanti850375בכלורופורם
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (מלח נתרן) (18:1 מכסה ביוטיניל PE)ליפידים קוטביים של Avanti870273ב כלורופורם
1,2-דיפלמיטויל-sn-גליצרו-3-פוספו-(1'-rac-גליצרול) (מלח נתרן) (DPPG)שומנים קוטבייםשלאוונטי 840455 בכלורופורם
1,2-דיפלמיטויל-sn-גליצרו-3-פוספוכולין (DPPC)שומנים קוטביים של אוונטי850355בכלורופורם
עם 96 בארות מיקרו-פלטה שטוחה (SensoPlate)
אקטין (אלפא-אקטין שריר שלד, ארנב)HYPERMOL8101-01
Atto488-Actin (אלפא-אקטין שריר השלד, ארנב)HYPERMOL8153-01
Atto655-DOPEATTO-TECAD 655-16אבקת
סוניקטורלאמבט ברנסון 1510R-MTHBransonic מנקה אולטראסוני
ביוטין-אקטין (שריר השלד אלפא-אקטין, ארנב)HYPERMOL8109-01
BSASigma AldrichA6003
צנטריפוגהEppendorf5424R
צנטריפוגהEppendorf5804 R
כלורופורםסיגמא אולדריץ'67-66-3
כולסטרול (ovine)Avanti Polar lipids700000בכלורופורם
DecaneTCI Deutschland GmbHD0011
Fascin (אנושי, רקומביננטי)Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)CS-FSC01-A
Ficoll70Sigma AldrichF2878
Iodixanol (OptiPrep)Sigma AldrichD1556
LSM800 לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ סורקCarl ZeissC-Apochromat 40  וזמנים;  /1.2 מטרת טבילה במים. לייזרים במצב מוצק עם דיודה: 488  ננומטר ו-640  ננומטר.
שמן מינרליסיגמא אולדריץ'8042-47-5
מיוזין II (שריר השלד של ארנב)Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)MY02-A
NeutravidinThermo Fisher Scientific Inc.31000
אוסמומטרFiske Associatesפיסקה מיקרו-אוסמומטר דגם 120
גריינר ביו-וואן  גמב"ה07-000-109

מקורות

  1. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  2. Imai, M., Walde, P. Giant unilamellar vesicles: From protocell models to the construction of minimal cells. The Giant Vesicle Book. , (2019).
  3. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Res Lett. 8 (1), 102(2013).
  4. Litschel, T., Schwille, P. Protein Reconstitution Inside Giant Unilamellar Vesicles. Annu Rev Biophys. 50 (1), 100620-114132 (2021).
  5. Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. J Phys Condens Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
  6. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discuss Chem Soc. 81 (0), 303-311 (1986).
  7. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  8. Dürre, K., Bausch, A. R. Formation of phase separated vesicles by double layer cDICE. Soft Matter. 15 (47), 9676-9681 (2019).
  9. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  10. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nat Commun. 7 (1), 10447(2016).
  11. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  12. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the Inverted Emulsion Method for High-Yield Production of Biomimetic Giant Unilamellar Vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  13. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys J. 91 (11), 4064-4070 (2006).
  14. Lopes dos Santos, R., Malo, M., Campillo, C. Spatial Control of Arp2/3-Induced Actin Polymerization on Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. ACS Synth Biol. 12 (11), 3267-3274 (2023).
  15. Sun, Q., Fu, Y., Wang, W. Temperature effects on hydrophobic interactions: Implications for protein unfolding. Chem. Phys. 559, 111550(2022).
  16. Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of temperature on the mechanism of actin polymerization. Biochemistry. 25 (21), 6432-6438 (1986).
  17. Concha-Marambio, L., Maldonado, P., Lagos, R., Monasterio, O., Montecinos-Franjola, F. Thermal adaptation of mesophilic and thermophilic FtsZ assembly by modulation of the critical concentration. PLoS One. 12 (10), e0185707(2017).
  18. Kanwa, N., Kohyama, S., Fröhlich, L., Desai, A., Schwille, P. Mutual dependence between membrane phase separation and bacterial division protein dynamics in synthetic cell models. Angew Chem Int Ed Engl. 64 (6), e202417800(2025).
  19. Reverte-López, M., et al. Self-organized spatial targeting of contractile actomyosin rings for synthetic cell division. Nat Commun. 15 (1), 10415(2024).
  20. dos Santos, R. L., Campillo, C. Studying actin-induced cell shape changes using Giant Unilamellar Vesicles and reconstituted actin networks. Biochem Soc Trans. 50 (5), 1527(2022).
  21. Staufer, O., et al. Microfluidic production and characterization of biofunctionalized giant unilamellar vesicles for targeted intracellular cargo delivery. Biomaterials. 264, 120203(2021).
  22. Lopes, D., Jakobtorweihen, S., Nunes, C., Sarmento, B., Reis, S. Shedding light on the puzzle of drug-membrane interactions: Experimental techniques and molecular dynamics simulations. Prog Lipid Res. 65, 24-44 (2017).
  23. Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical interactions with model lipid membranes: applications in drug discovery and drug delivery. Mol Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
  24. Schulz, M., Werner, S., Bacia, K., Binder, W. H. Controlling Molecular Recognition with Lipid/Polymer Domains in Vesicle Membranes. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (6), 1829-1833 (2013).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

GUVsFtsZ

מאמרים קשורים