מאמר שיטה

סינתזה של 13C 2-רטיניל אצטט והכנת מינון לבדיקות דילול איזוטופ רטינול

595 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68535

⸱

22 באוגוסט 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Wisconsin-Madison

במאמר זה

סיכום

רטיניל אצטט מסומן בדרך כלל בשני 13C כאשר נעשה שימוש בספקטרומטריית מסה של יחס כרומטוגרפיה-בעירה-איזוטופ לניתוח סרום וחלב אם. מאמר זה מתאר את הסינתזה של 13C 2-רטיניל אצטט והכנת מינונים לבדיקות דילול איזוטופ רטינול שיועברו על ידי פיפטה תזוזה חיובית או מזרק טוברקולין.

תקציר

בדיקת דילול איזוטופ רטינול (RID) היא השיטה הרגישה ביותר להערכת מצב ויטמין A על ידי הערכת סך עתודות הכבד, הנחשבת לתקן הייחוס. לזיהוי ספקטרומטריית מסה של יחס כרומטוגרפיה-בעירה-איזוטופ של גז, מתווסף 13C לחלק הרטינול. ההליך הסינתטי של 13C-רטיניל אצטט מתחיל ב-β-ionone המופיע באופן טבעי. בקצרה, קטון C18-טטראן מסונתז מ-β-יונון ומטוהר. אם רוצים 13C 4-רטיניל אצטט, ניתן להשתמש בקרבניון של 13C2 מסומן טריאתילפוספונואצטט כדי להוסיף שני 13C לחלק β-ionone לפני הוספת שלושת הפחמנים של אצטון לסינתזה של C18-tetraene ketone. אם רוצים 13C 3-רטיניל אצטט, ניתן לסמן את שלושת הפחמנים של האצטון ב-13C.

עבור האצטט הנפוץ ביותר של 13C 2-רטיניל לניתוח עתידי על ידי ספקטרומטריית מסה של יחס איזוטופ גז-כרומטוגרפיה-בעירה, נעשה שימוש בהליך Wittig-Horner שונה, וקטון טטראן C18 ללא תווית מגיב עם הקרבניון של 13C2-label-triethylphosphonoacetate כדי להוסיף 2-13C למיקומים 14 ו-15 של מולקולת הרטינול. האתיל-אסטר שנוצר מצטמצם לאלכוהול והופך לאסטרי ל-13C 2-רטיניל אצטט עם אנהידריד אצטי. איזומר ה-all-trans מטוהר על אלומינה מנוטרלת במים של 8% באמצעות ממיסים-הקסנים ואתר דיאתיל תמימים יחסית, נדיפים מאוד, אשר מוסרים על ידי אידוי סיבובי וסוניפיקציה של מנות שמן. המוצר מאופיין בספקטרוסקופיה אולטרה סגולה (UV-Vis), כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC) וכרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) כנגד תקנים אנליטיים. המינון המרוכז מאוחסן מומס בשמן סויה ב-80 מעלות צלזיוס. המינונים הסופיים מדוללים בשמן סויה (~200 מיקרוליטר למנה) ומכומתים על ידי ספקטרוסקופיה UV-Vis כנגד שמן הסויה של הרכב. המינונים נמדדים למסירה לבני אדם עם פיפטה תזוזה חיובית או מזרקי טוברקולין לבדיקת RID. באמצעות הנחות מתאימות, מאגרי הגוף הכוללים מחושבים וסך עתודות הכבד מוערכות.

מבוא

דילול איזוטופים של רטינול (RID) הוא הסמן הביולוגי היחיד למצב ויטמין A המודד את סך מאגרי ויטמין A בגוף (TBS) באופן כמותי ועם הנחות מתאימות, יכול להעריך את סך עתודות הכבד (TLR). זוהי הדרך הרגישה ביותר למדוד את רמת ויטמין A ואת ההשפעה של התערבויות המכילות קרוטנואידים מוכנים של רטינול או פרו-ויטמין A. למרות שהוא מאתגר מבחינה טכנית, RID מדויק וזעיר פולשני מכיוון שהוא דורש רק דגימות דם בניגוד לביופסיות כבד1. בדיקת ה-RID כוללת מתן רטיניל אצטט דוטראט או 13מסומן C, בהתאם לפלטפורמת ספקטרומטר המסה. לפני מתן המינון, נאספת דגימת דם בסיסית, שהיא חיונית בעת שימוש ב-13תוויות C, אך ניתן לעשות זאת על תת-קבוצה שנבחרה באופן אקראי. דגימה שנייה נאספת לאחר ערבוב 13רטיניל אצטט המסומן ב-C עם TBS1.

התערבויות למניעת מחסור בוויטמין A כוללות העשרת מזון, חיזוק ביולוגי, גיוון תזונתי ותוספי תזונה. עם זאת, במדינות מסוימות, היו התערבויות חופפות המכוונות לאותם אנשים, מה שהוביל להיפר-ויטמינוזיס A2, ובכך דרשו מסגרת ניטור להערכת תוצאות התוכנית. לכן יש צורך בשיטות שמודדות כמותית את רמת ויטמין A. בעבודה עם המדינות החברות, הסוכנות הבינלאומית לאנרגיה אטומית (סבא"א) מקדמת שימוש לצרכי שלום באיזוטופים במחקר והערכות, מה שתומך ביישום מבחן RID. בדיקת RID צוברת תאוצה ועשויה לשמש בקרוב בסקרי אוכלוסייה גדולים כדי להעריך את מצב ויטמין A ממחסור לעודף במדינות המיישמות התערבויות ויטמין A3.

בעבר, 10,11,14,15-13 C 4-רטיניל אצטט סונתז באמצעות שינויים מברגן ואחרים עבור רטיניל אצטט 4,5. תרכובת זו שימשה בחולדה6 ובניסויים בבני אדם עם ספקטרומטריית מסה של יחס כרומטוגרפיה-בעירה-איזוטופ של גז (GCCIRMS) שהותאמה לניתוח7. מהניסויים החשובים הללו, קבענו ש-GCCIRMS היה כל כך רגיש שארבעה 13C לא נדרשו לבדיקת RID באמצעות GCCIRMS. לכן, ההוצאה של העוקב מופחתת על ידי שימוש בשני 13C בלבד במיקומים 14 ו-15 של מולקולת הרטינול (איור 1). שינוי זה מקטין את העלויות הכרוכות בסינתזה ומוביל לתשואות מוגברות עקב המסלול הסינטטי. כאן, מתואר פרוטוקול מורחב לסינתזה שלו.

GCCIRMS רגיש יותר מסוגים אחרים של ספקטרומטריית מסה למדידת איזוטופים יציבים8 ויכול להגיב לשינויים בתזונה ולשינויים טבעיים בהעשרת C 13ברטינול בסרום. זה תואר בגרבילים9 ובבני אדם10שצרכו תירס, ובבני אדם שנרשמו להתערבות צמחית11. אכן, השכיחות הטבעית של 13C משתנה בין אוכלוסיות שונות ויש לקבוע אותה בנבדקים שנרשמו להערכות RID12. עם זאת, תת-קבוצות קטנות שימשו למדידת העשרה טבעית עם RID בילדים גאנה ותאילנדים13,14 ונשים תאילנדיות15. יש לקבוע העשרה בסיסית 13C לקביעה המדויקת ביותר של TBS ברמה האישית12.

פרוטוקול

הערה: בעת גיוס נבדקים אנושיים למחקר, התערבויות או מחקרים הערכתיים, יש להמשיך באישור מועצת הביקורת המוסדית (IRB) עם הליכי הסכמה מדעת מתאימים.

1. סינתזה של 13C2 -רטיניל אצטט (איור 2)

הערה: כל ההליכים הסינתטיים והכימות מבוצעים תחת תאורת פלורסנט זהב כדי למנוע פירוק ואיזומריזציה של תרכובות.

  1. לסנתז β-יוניל אצטט באצווה גדולה מ-β-ionone הזמין מסחרית. לדוגמא, כסו נתרן הידריד (NaH) (4 גרם, 0.16 שומה) ב-100 מ"ל אתר. מוסיפים טריאתילפוספונואצטט ללא תווית (36 גרם, 0.16 שומה) ב-100 מ"ל אתר טיפתי ומערבבים במשך שעתיים. H2 משתחרר והמתלה הראשוני הופך צלול וענבר.
    זהירות: נתרן הידריד (NaH) הוא חומר מחזר חזק ושימושי במגוון רחב של תגובות כימיות. עם זאת, שריפות מעבדה יכולות להתרחש בגלל התגובה האקסותרמית הגבוהה שלה עם מים באטמוספירה16,17. מומלץ לגשת לגיליון נתוני בטיחות; הנחיות נוספות לטיפול במוצקים פירופוריים בינוניים כגון NaH פורסמו18. שמור אותו תלוי בשמן או בממס שאינו מגיב בזמן טיפול, שטיפת כלי תגובה ומיכלי אחסון עם גז אינרטי (כגון חנקן או ארגון), קירור כלי התגובה ואחסון במיכלים אטומים המוחזקים בסביבה יבשה. במעבדה שלנו, NaH מועבר בכמויות קטנות (~1 גרם) בסביבת חנקן לבקבוקונים ולאחר מכן מאוחסן בחומר ייבוש אטום עד לשימוש.
  2. הוסף β-יונון (21 גרם, 0.12 שומה) ב-40 מ"ל אתר והגיב בן לילה (~15 שעות ב-20 מעלות צלזיוס). ביום השני, הרוו את התגובה במים וחלצו את האתיל-β-יונילידן אצטט להקסנים ושטפו שוב ושוב במים בסדרה של משפכי הפרדה כדי למקסם את ההתאוששות. יבש את השכבה האורגנית (MgSO4 נטול מים), סנן ורכז
    הערה: כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC) מגלה בדרך כלל רק זיהומים קלים בשלב זה של הסינתזה. ניתן לאחסן זאת לתקופה ממושכת בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך לשלבים הבאים.
  3. להגיב אתיל-β-יונילידן אצטט (28 גרם, 0.11 מול) עם 120 מ"ל של 1 ליתיום אלומיניום הידריד מולארי (LiAlH4) באתר דיאתיל. טבלו את כלי התגובה באמבט אצטון בקרח יבש וערבבו את התמיסה ברציפות כדי להפיק אתנול β-יונילידן.
    זהירות: ליתיום אלומיניום הידריד (LiAlH4) הוא חומר מפחית חזק. גש לגיליון נתוני בטיחות, ועיין בהנחיות נוספות לטיפול במוצקים פירופוריים בינוניים כגון LiAlH418,19. המטרה העיקרית של רוב אמצעי הזהירות היא למזער את הסיכון לחשיפה של LiAlH4 לאטמוספירה ולמנוע תגובות בורחות. זה כרוך בדרך כלל בשמירה על תרכובות אלו תלויות בשמן או בממס שאינו מגיב בזמן הטיפול, שטיפת כלי תגובה ומיכלי אחסון עם גז אינרטי (כגון חנקן או ארגון), קירור כלי התגובה ואחסון LiAlH4 במיכלים אטומים המוחזקים בסביבה יבשה. במעבדה שלנו, ליתיום אלומיניום הידריד נרכש בבקבוקים אטומים של 1 טוחנת במקום בצורת האבקה, כאשר הנפחים הנדרשים מוסרים באמצעות מזרק ואטמוספירת הבקבוק מוחלפת בחנקן.
  4. ממיסים 28 גרם (0.12 שומה) של אתנול β-יונילידן ב-300 מ"ל הקסנים. מוסיפים כ-50 גרם ליום של 90% MnO2 במשך 3 ימים (51 גרם, 52 גרם ו-54 גרם) ומערבבים את תערובת התגובה למשך זמן רב יותר (לרוב יומיים ב-20 מעלות צלזיוס). לבסוף, מוסיפים 35 גרם MnO2 ומשאירים למשך הלילה למשך כ -15 שעות; התגובה שלמה בכ-90%. מסננים ושוטפים את האצטאלדהיד β-יונילידן מה-MnO2 עם דיכלורומתאן.
  5. ממיסים אצטאלדהיד גולמי β-יונילידן (22 גרם, 0.10 שומה) ב-150 מ"ל אצטון תוך ערבוב מתמיד, ומוסיפים 10 מ"ל של 1 N נתרן הידרוקסיד טיפה. השאירו את התגובה למשך 6 שעות.
  6. חלץ את ה-C18 טטראן קטון עם הקסנים ושטוף שוב ושוב במים באמצעות סדרה של משפכי הפרדה כדי למקסם את ההתאוששות. יבש את התמיסה המתקבלת עם מאייד סיבובי כדי להניב קטון טטראן cis-trans C18 גולמי. מכיוון שאיזומר הטרנס רצוי ביותר למחקרים בבני אדם, יש לטהר את התערובת על 4% סיליקה ג'ל מנוטרל במים (300 גרם) באמצעות שיפוע איטי של 0-10% אתיל אצטט בהקסאן.
  7. מערבבים NaH (1.2 גרם, 0.05 שומה) עם 50 מ"ל אתר. מוסיפים 13C 2-triethylphosphonoacetate (11 גרם, 0.049 שומה) מומס ב-50 מ"ל אתר טיפתי ומערבבים במשך שעתיים. ממיסים C18 טטראן קטון (12 גרם, 0.044 שומה) ב-50 מ"ל אתר ומגיבים למשך הלילה במשך כ-15 שעות ב-20 מעלות צלזיוס.
  8. להרוות את התגובה במים ולחלץ את אתיל אסטר 14,15-13 C 2-retinoic acid עם הקסנים ולשטוף במים במשפך הפרדה. יבש את השכבה האורגנית עם MgSO4 נטול מים ורכז; טהר על 8% אלומינה ניטרלית מנוטרלת מים (400 גרם) עם אתר דיאתיל איטי של 0 עד 3% בשיפוע הקסאן כדי להפיק איזומרים של ציס/טרנס.
    הערה: לעתים קרובות, הטיהור הראשון מכיל מזהמים כפי שנשפט על ידי TLC. מזהמים נראים על ידי תגובה של צלחת TLC עם אדי יוד. כאשר קיימים מזהמים, חיוני לטהר מחדש על 400 גרם של אלומינה ניטרלית מנוטרלת 8% מים עם 100% הקסנים כדי לגרום ל-14,15-13 C 2-חומצה רטינואית אתיל אסטר.
  9. הפחיתו 14,15-13 מעלות צלזיוס 2-חומצה רטינואית אתיל אסטר (3.7 גרם) עם 15 מ"ל של 1 ליתיום אלומיניום הידריד מולארי באמבט אצטון בקרח יבש תוך ערבוב כדי להפיק 14,15-13 מעלות צלזיוס 2-רטינול (איור 1).
  10. ממיסים 14,15-13 C 2-רטינול (3.5 גרם) ב-20 מ"ל של טריאתילאמין. תוך כדי ערבוב התמיסה, מערבבים 3.5 מ"ל אנהידריד אצטי עם 7 מ"ל טריאתילאמין ומוסיפים טיפה לבקבוק. השאירו את הבקבוק למשך הלילה במקרר ליצירת אצטט 14,15-13 C 2-רטיניל (כ -15 שעות).
  11. לחלץ 3.9 גרם של 14,15-13 C 2-רטיניל אצטט גולמי להקסנים, לייבש, לרכז ולטהר על 500 גרם של אלומינה ניטרלית 8% מנוטרלת במים עם אתר דיאתיל איטי של 0-3% בשיפוע הקסאן. עקוב אחר שברים עם ספקטרופוטומטר נראה אולטרה סגול (UV-Vis) ב-325 ננומטר. הסר את כל הממיסים שנותרו בעזרת מאייד רוטו. הערך את המוצר הסופי עם זיהוי HPLC ופוטו-דיודה כדי לקבוע את יחס cis/trans. דוגמה למערכת שיפוע מתקדמת להפרדת פרופיל cis/trans באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ אולטרה זמינה באיור משלים S1.
    הערה: היחס cis/trans הוא בדרך כלל >95% all-trans בשלב זה.
  12. לאחסון, ממיסים כל טרנס 14,15-13 C2-רטיניל אצטט בשמן סויה באיכות מזון ללא תוספים אחרים ומאחסנים בזכוכית ענבר שטיפה בחנקן ב-80 מעלות צלזיוס ומסמנים כמלאי מרוכז.

2. הכנת מינון של תמיסות שמנוניות של רטיניל אצטט יציב עם תווית איזוטופ

הערה: רטיניל אצטט בעל תווית איזוטופית ניתן בכמוסות20 או בתמיסות שמן המסופקות עם פיפטה 21 עם תזוזה חיובית של 250 מיקרוליטראו מזרק רפואי22 (איור 3). בדקנו את היציבות של קפסולות (איור 4), המתוארת להלן.

  1. מיד לאחר הסינתזה, ממיסים את הרטיניל אצטט המסומן ל~15 מ"ל של שמן צמחי לא מועשר (למשל, שמן סויה באיכות מזון) לפני שהוא מתחיל להתגבש ולאחסן בבקבוקון ענבר של 24 מ"ל בטמפרטורה של -30 עד -80 מעלות צלזיוס עד שמוכן להכין את המינונים הסופיים.
    1. אם נרכש רטיניל אצטט המסומן, הצמד בזהירות את החלק העליון של האמפולה האטומה בוואקום על ידי ניקוד עם קובץ או שבור את החותם על בקבוק מוברג. בהתאם למסה הדרושה, הכניסו כמות שקולה לבקבוק ענבר חום של 24 מ"ל והוסיפו כמות קטנה של שמן צמחי (סביר להניח ש-10 מ"ל יספיקו). סוניקציה של התערובת עד שהיא הופכת לתמיסה ברורה.
  2. העריכו את כמות הנפט הסופית הדרושה על ידי הכפלת מספר הנבדקים ב-200 מיקרוליטר. לדוגמה, אם יש להירשם ל-60 נבדקים, היוו כ-70 מנות שיספיקו לבזבוז (כ-10-20%). לפיכך, 70 × 200 מיקרוליטר הם 14 מ"ל.
    הערה: אל תסתמך על מסת השמן הסינטטי או הגבישים. עליך להשתמש בספקטרופוטומטר כדי לכמת את המינונים. כל ויטמין A סינתטי מכיל שאריות ממסים. אלה יכולים להתפוגג על ידי סוניפיקציה או תחת זרם עדין של חנקן, אך הם הסיבה העיקרית לכך שלא ניתן להשתמש במסה לבדה לקביעת מינוני איזוטופים.
    אם תמיסות הרטיניל אצטט המסומנות נשמרות זמן רב מאוד במקפיא ללא שימוש, יש לנתח אותן מחדש כדי לקבוע אם התרחשה השפלה משמעותית.
  3. כדי לכמת רטיניל אצטט:
    1. הפעל את הספקטרופוטומטר UV-Vis (עדיפות לסריקת ספקטרופוטומטר עם אלומה כפולה) ואת המחשב המצורף, אם רלוונטי. הפעל את הספקטרופוטומטר UV-Vis בהתאם להוראות היצרן. אפשר לספקטרופוטומטר להתחמם לפחות 30 דקות לפני הקריאה.
    2. הגדר שתי צלוחיות וכובעים נפחיים של 25 מ"ל ומלא כל אחת ב-25 מ"ל הקסאן כמעט עד הקו. סמנו בקבוק אחד "שמן" או "ריק" ואת השני "ויטמין A" או "מינון"; לאחר מכן, הניחו בצד את בקבוק ויטמין A עד לאחר הפעלת החסר.
    3. יוצקים מעט שמן סויה טהור לכוס פלסטיק חד פעמית ומוסיפים 20-40 מיקרוליטר לבקבוק השמן כדי לרוקן את המערכת.
      הערה: לעתים קרובות אנו משתמשים ב-20 מיקרוליטר, אך כל עוד נפח מינון הריק והאיזוטופ זהים, אפשר להשתמש יותר.
    4. הפוך פי 4-5 כדי לערבב את השמן וההקסנים, ולאחר מכן שטוף את שתי קובטות הקוורץ של הספקטרופוטומטר בתמיסה זו, ומלא את שניהם ~75% מלאים.
    5. הכניסו את שתי הקובטות לספקטרופוטומטר, והקפידו לא לגעת בחזית ומאחור השקופים (ידית בצדדים החלביים בלבד). לקבלת הדיוק הטוב ביותר, פנה לחזית הממוספרת של כל קובטה תואמת לכיוון המשתמש.
    6. סגור את הדלת חוסמת האור מעל הדגימות.
    7. לחץ על הפונקציה ריק או בסיסי ואפשר למערכת למדוד את הספיגה הבסיסית של שמן והקסאנים. זה מתקן את הספיגה של תמיסת הקסאנס Oil Blank. סרוק מ-260 עד 400 ננומטר; ודא שהקריאה היא "אפס" ב-400 ננומטר לאחר סיום תהליך זה. אם לא, לחץ על כפתור האפס והפעל מחדש את הסריקה. לאחר השלמתה, המערכת מוכנה למדוד את ספיגת מינון הרטיניל אצטט.
    8. השליכו את תכולת קובטת הדגימה ומלאו בתמיסת הקסאנס המינון. הנח את הדגימה במקום המתאים וסרוק את הספקטרום. בחר את השיא וקרא את הספיגה. לרטיניל אצטט טהור יש רק למבדה אחת מקסימום ב-325 ננומטר.
      הערה: אם יש לך יותר משיא אחד או שיש לך אחד ב-280 ננומטר, הרטיניל אצטט התדרדר ואין להשתמש בו למינון.
  4. חישובים לשלב 2.3
    הערה: ה-E 1%, 1 ס"מ לרטינול הוא 1,810 ב-325 ננומטר בהקסאנים. אתה תכמת את הרטיניל אצטט במקבילות רטינול.
    1. חלקו את הספיגה ב-0.181 כדי לקבל את ה-μg/mL של התמיסה.
    2. הכפל ב-25 מ"ל כדי לקבל את המיקרוגרם ב-20 מיקרוליטר של תמיסת שמן.
      הערה: לשעברample: ספיגה של 20 מיקרוליטר שמן ב-25 מ"ל הקסנים היא 0.295.
      0.295/0.181 = 1.630 מיקרוגרם/מ"ל ×-25 מ"ל = 40.75 מיקרוגרם ב-20 מיקרוליטר שמן
      אם אתה צריך 286 מיקרוגרם למינון, זה 140.4 מיקרוליטר. זה 1 מיקרומול, אבל 288 מיקרוגרם של 13C 2-רטינול ייוצרו במעיים בגלל התווית. ייתכן שתרצה לבצע דילול כדי להתקרב לכמות המינון של 200 מיקרוליטר ולבצע מחדש את הכימות לעיל.
  5. הכנת כמוסות לבדיקת יציבות
    1. יש להפריד את הכמוסות לתחתית הלבנה הגדולה יותר ולכיפות הכחולות הקטנות יותר.
    2. יש להניח את תחתית הכמוסות הלבנות בקופסאות קצה פיפט (96 כמוסות לקופסה) ולסגור כדי למנוע כניסת אבק לכמוסות ולהכניס את הפקקים הכחולים לשקית ניילון עם רוכסן למשך הלילה. השליכו כמוסות סדוקות.
    3. תן לתמיסת שמן רטיניל אצטט להגיע לטמפרטורת החדר. יש למזוג כמות קטנה (~5 מ"ל) לכוס פלסטיק קטנה שאינה בשימוש.
    4. הכן פיפטה משחזרת על ידי טעינת מזרק 5 מ"ל (כאשר 1 = 100 מיקרוליטר) והגדרתו ל-"2" כדי להוציא 200 מיקרוליטר לכל לחיצת הדק.
    5. טען את שמן הרטיניל אצטט לתוך פיפטת המשחזר על ידי משיכת זרוע הטעינה. יש להוציא לפחות 4 x 200 מיקרוליטר בחזרה לכוס כדי לנקות בועות אוויר מהקצה.
    6. הוצא 1 x 200 מיקרוליטר לכל תחתית קפסולה לבנה על ידי נגיעה קלה בקצה הפיפטה בדופן הפנימית של הקפסולה ולחיצה על ההדק.
    7. לאחר שפיפטה המשחזר קרובה להתרוקן, שאב עוד שמן.
    8. לאחר השלמת סט שלם של 96 כמוסות, הוציאו את השמן בחזרה לתוך הכוס ולאחר מכן התחילו להחליק קלות את הפקקים הכחולים על כל תחתית לבנה, והקפידו לא לסדוק את הפקקים.
    9. לאחר שכל הפקקים מונחים על הכמוסות, הרימו כל כמוסה החוצה, וודאו קלות שהמכסה מונח היטב ולאחר מכן החזירו אותו לקופסת הקצה.
    10. אחסן את הכמוסות בטמפרטורות ובתנאים שנבחרו. ניתן להשיג חושך על ידי אחסון הקפסולות במתלים מתחת לרדיד אלומיניום. להלן דוגמאות:
      a.  במקפיא: -20 מעלות צלזיוס בחושך
      b.  במקרר: 4 מעלות צלזיוס בחושך
      ג. על הספסל: 20 מעלות צלזיוס (טמפרטורת החדר) בחושך
      ד. על הספסל אך נשאר בחוץ: 20 מעלות צלזיוס (טמפרטורת החדר) חשוף לתאורת פלורסנט סטנדרטית
      e.  בתנור, משכפל טמפרטורות סביבה גבוהות יותר במקומות אחרים: 37 מעלות צלזיוס בחושך

3. מתן מינון

הערה: פיפטת התזוזה החיובית הושוותה ישירות עם מזרקי טוברקולין כדי לקבוע דיוק ודיוק בקרב טכנאים (איור 5).

המינונים ניתנים באמצעות פיפטות תזוזה חיוביות של 250 מיקרוליטר Rainin או מזרקי טוברקולין של 1 מ"ל.

  1. הפשירו את המנות הקפואות או הניחו אותן בצידנית עם שקיות קרח אם הולכים לאתר השדה. במהלך ההובלה, המינונים בדרך כלל מפשירים.
  2. הסר את בקבוקון הזכוכית הענבר מהצידנית ופתח. שמור את הבקבוקון ב"ספל" או בכוס כדי למנוע ממנו להתהפך.
  3. הכניסו את קצה הפיפטה או מזרק הטוברקולין לשמן ושאבו כמות קטנה. לחץ על הבוכנה במהירות כדי לעקור בועות שעלולות להיווצר. שאב לאט את כמות הנפח הדרושה לתוך הפיפטה או המזרק. וודאו שאין בועות.
  4. נגב את החלק החיצוני של הקצה עם טישו. אל תיגע בקצה קצה הפיפטה או המזרק מכיוון שהדבר ישאב את הנוזל.
  5. הכניסו את הקצה לפיו של המשתתף, שחררו את השמן לתוך פיו והורו לאדם לסגור את פיו ולבלוע.
    הערה: זה מועיל אם המשתתפים יכולים להטות את ראשם מעט לאחור למינון.
  6. לאחר המינון, יש לתת "צ'ייסר" או חטיף שומני המספק לפחות 10 גרם שומן. לילדים צעירים, יש לתת 1 מ"ל של שמן לא מועשר המועבר על כף פלסטיק כצ'ייסר. לילדים גדולים יותר ולמבוגרים, חצי כריך חמאת בוטנים, תפוח אדמה לבן מטוגן או בגט עם ממרח שוקולד הם חטיפי המשך טובים.
    הערה: יש לערוך מחקר אינפורמטיבי כדי לקבוע איזה חטיף מקובל מקומית.

תוצאות

החל מ-β-ionone הזמין מסחרית, סונתז 28 גרם של אתיל-β-יונילידן אצטט. לאחר הפחתה, 22 גרם β-יונילידן אצטאלדהיד הגיבו עם אצטון בתנאים בסיסיים כדי לייצר C18-טטראן קטון; התקבל 12 גרם של קטון C18-טטראן מטוהר, שהיה ~90% all-trans. זה הגיב לאחר מכן עם הקרבניון של 13C 2-triethylphosphonoacetate באמצעות נוהל Wittig-Horner שונה כדי להוסיף שני 13C במיקומים 14, 15 של מולקולת הרטינול. אתיל אסטר שהתקבל (תפוקה של 3.7 גרם) הופחת לאלכוהול והפך לאסטרי ל-13C 2-רטיניל אצטט עם אנהידריד אצטי מומס בטריאתילאמין. הוויטמין הסינתטי טוהר על אלומינה מנוטרלת במים של 8% באמצעות ממיסים אורגניים נדיפים מאוד - הקסנים ואתר דיאתיל. התכשיר שהתקבל אופיין באמצעות ספקטרוסקופיה UV-Vis, TLC ו-HPLC. לאחסון לטווח ארוך, הרטיניל אצטט המסומן מאוחסן מומס בשמן סויה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

התוכנית הסינתטית המוצלחת עבור 14,15-13 C 2-רטיניל אצטט שתוארה לעיל מתוארת באיור 2. המסלול הכולל שמתחיל ב-β-ionone מורכב משבעה שלבים. התשואה הראשונה הייתה 0.9 גרם של אול-טרנס 14,15-13 C 2-רטיניל אצטט. שברי איזומר ציס/טרנס (1.2 גרם) שולבו וטוהרו מחדש על 300 גרם של אלומינה ניטרלית מנוטרלת 8% מנוטרלת במים כדי להביא לתוספת של 0.3 גרם נוסף של 14,15-13 C 2-רטיניל אצטט.

כדי לקבוע את היציבות של רטיניל אצטט בכמוסות, רטיניל אצטט (1 גרם) הומס בהקסנים וטוהר על ידי כרומטוגרפיה של עמודה פתוחה באמצעות 300 גרם של אלומינה מנוטרלת במים 8% עם הקסנים כממס. הרטיניל אצטט נוטר על ידי ספקטרוסקופיה TLC ו-UV-Vis, ונעשה שימוש רק בשברים הטהורים. תהליך זה זהה לזה המשמש בסינתזה וטיהור של 13C 2-רטיניל אצטט במעבדת Tanumihardjo לבדיקת RID כמתואר לעיל. הרטיניל אצטט המטוהר הומס בשמן סויה, הממס האורגני הוסר על ידי מאייד סיבובי, ושמן נוסף נוסף לריכוז סופי של 7.5 מיקרומטר (כדי להניב 1.5 מיקרומול ל-200 מיקרוליטר, נקודת האמצע בין המינון למבוגר לילד לבדיקת RID כאשר GCCIRMS משמש לניתוח). הריכוז נקבע על ידי ספקטרוסקופיה UV-Vis כמתואר לעיל.

כמות של 200 מיקרוליטר מהשמן חולקה לכמוסות תאית בגודל 3 (נפח מקסימלי 300 מיקרוליטר) למחקר היציבות. הכמוסות של כל מנה אוחסנו בחמישה תנאים. החושך הושג על ידי אחסון הקפסולות במדפים מתחת לרדיד אלומיניום. כמוסות (150) הוכנו לכל מצב בסך הכל 750 כמוסות: 1) במקפיא: -20 מעלות צלזיוס בחושך; ii) במקרר: 4 מעלות צלזיוס בחושך; iii) על הספסל: 20 מעלות צלזיוס (טמפרטורת החדר) בחושך; iv) על הספסל אך נשאר בחוץ: 20 מעלות צלזיוס (טמפרטורת החדר) חשוף לתאורת פלורסנט סטנדרטית; v) בתנור, משכפל טמפרטורות סביבה גבוהות יותר במקומות אחרים: 37 מעלות צלזיוס בחושך.

במחקר יציבות הקפסולה נמדדו שלוש כמוסות מכל מצב בכל נקודת זמן (-20 מעלות צלזיוס, 4 מעלות צלזיוס, טמפרטורת החדר כהה, אור בטמפרטורת החדר, 37 מעלות צלזיוס). כל הקפסולות הורשו להגיע לטמפרטורת החדר (קפסולות בטמפרטורת החדר נותחו תחילה); שינוי טמפרטורה גורם לשינוי ספיגה. הכמוסות נמדדו ל-480 יום. הכמוסות נשארו יציבות במשך תשעה חודשים ב-20 מעלות צלזיוס ו-4 מעלות צלזיוס (איור 4).

נערכה השוואת שיטות להשוואת מזרקי טוברקולין חד פעמיים לפיפטות תזוזה חיוביות של Rainin כתקן הייחוס. פיפטת התזוזה החיובית של Rainin כוילה במים, תוך התחשבות בטמפרטורה ובלחץ המקומיים, ולאחר מכן נבדקה עם שלושה קצות במשולש כדי לקבוע את נפח שמן היעד המופץ בהגדרה של 200 מיקרוליטר על סירת משקל מזופתת. פרוטוקול החלוקה נערך על ידי 10 טכנאים ברמת ניסיון. עבור כל טכנאי, שמונה מזרקים נבדקו בשלושה עותקים והושוו להתייחסות לפיפטה. דפנות הפיפטה ניגבו בטישו, והשמן נשפך לתוך סירת השקילה בזווית, מה שהבטיח שחרור שמן מקסימלי. הטכנאים היו עיוורים לתוצאות המסה המחולקת לאורך כל הפרוטוקול; מסת השמן נרשמה על ידי טכנאי נפרד. התהליך חזר על עצמו עם 200 מיקרוליטר שמן סויה באמצעות שמונה מזרקי טוברקולין (למשל, Norm-Ject).

נעשה שימוש בתוכנה סטטיסטית R כדי להתאים למודל רכיבי שונות (FitVCA)22 (איור 5). גורמי השונות שנמדדו כללו טכנאי, מזרק בתוך טכנאי ושגיאת שכפול. ערך אספקת המזרק המנורמל הממוצע (95% CI) בהשוואה לנפח אספקת הפיפטה היה 0.996 (0.912, 1.08). שונות משגיאת שכפול היוותה 64.8% מהשונות הכוללת, מה שמצביע על כך שהמקור הגדול ביותר לשונות היה ממדידות חוזרות באותו מזרק. אחוז השונות מהטכנאי והמזרק בתוך הטכנאי היה נמוך בהרבה, ותרם 22.9% ו-12.3%, בהתאמה.

ניתוח תת-קבוצות בוצע על ידי פיצול הטכנאים לשתי קבוצות (n = 5 לקבוצה) על סמך ניסיון. אספקת המזרק הממוצעת המנורמלת הייתה דומה בין שתי הקבוצות, אך ה-CI של 95% היה צר יותר עבור טכנאים עם ניסיון רב יותר; 1.001 (0.939, 1.063) ו-0.998 (0.900, 1.100), בהתאמה. בקרב טכנאים מנוסים יותר, רוב השונות הגיעה ממזרק בתוך טכנאי (57.0%) ושגיאת שכפול (42.9%), בעוד שעבור טכנאים פחות מנוסים, רוב השונות הגיעה מטכנאי (32.7%) ושגיאת שכפול (67.2%).

figure-results-1
איור 1: מבנה הרטינול עם הפחמנים הממוספרים. ה-13C מתווספים בדרך כלל במצבים 14 ו-15 לשימוש עם ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיית גז-בעירה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: התוכנית הסינתטית של 14,15-13 C 2-רטיניל אצטט המשמשת בבדיקות דילול איזוטופים של רטינול כאשר ספקטרומטריית מסה של יחס כרומטוגרפיה-בעירה-איזוטופ משמשת לניתוח סרום או חלב אם. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: מזרק טוברקולין של 1 מ"ל ללא נפח מת בקצה ופיפטה עם תזוזה חיובית של 250 מיקרוליטר המשמשת למינון במחקרי מעקב. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: עקומות פירוק של רטיניל אצטט המאוחסנות בכמוסות בחמישה תנאים שונים. התנאים הם -20 מעלות צלזיוס, 4 מעלות צלזיוס, 20 מעלות צלזיוס (טמפרטורת החדר) בחושך, 20 מעלות צלזיוס (טמפרטורת החדר) באור פלורסנט סטנדרטי ו-37 מעלות צלזיוס. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: ניתוח מרכיבי שונות של כמות אספקת המינון בהשוואה של מזרקי טוברקולין של 1 מ"ל לפיפטה עם תזוזה חיובית של 250 מיקרוליטר בקרב 10 טכנאים שהיו עיוורים לתוצאות במהלך ההערכה. הערכים מחולקים מסת שמן (200 מיקרוליטר) ממזרקים מנורמלים לפיפטה תזוזה חיובית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים S1: דוגמה לבדיקת הטוהר הסופית של 14,15-13C-רטיניל אצטט על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ אולטרה-לחץ. הספקטרום המתאים אופייני לצורות cis/trans של הוויטמין. תנאי ה-UPLC היו ממס A 70:25:5 (אצטוניטריל: מים: איזופרופנול) עם 10 מ"מ אמוניום אצטט וממס B היה 75% אצטוניטריל, 25% איזופרופנול. העמודה ששימשה הייתה עמודה Acquity UPLC, BEH C18 1.7 מיקרומטר, 2.1 x 100 מ"מ. העמודה נקבעה על 29 מעלות צלזיוס, וקצב הזרימה היה 0.4 מ"ל לדקה. השיפוע התחיל ב-100% ממס A והחזיק מעמד במשך 5.0 דקות, ולאחר מכן עבר ל-98% ממס B ב-7 דקות והוחזק במשך 8 דקות לפני המעבר חזרה ל-100% ממס A במשך דקה אחת והוחזק למשך שיווי משקל של 4 דקות. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

בעוד שישנם מקורות מסחריים של רטיניל אצטט דוטראט ו-13עם תווית C, ישנם מספר מסלולים סינתטיים לרטינול בספרות עבור כימאים אורגניים מיומנים. בחרנו נתיב סינתטי לרטיניל אצטט דוטראט לעקוב אחריו וביצענו התאמות מתאימות כדי להוסיף 13C לעמוד השדרה של חלק הרטינול, המתוארים לעיל. הסינתזה של 14,15-13 C 2-רטיניל אצטט הושגה באמצעות הליך בן שבעה שלבים שהחל ב-β-ionone הזמין מסחרית. β-יונון הוא מרכיב צמחי טבעי התורם לניחוחות, כגון מוורדים. השלב המכריע ביותר במסלול הסינטטי הוא היווצרות ה-C18 טטראן קטון. תרכובת ביניים זו צריכה להיות לפחות 90% טהורה עבור השלבים הבאים כדי לייצר תשואות טובות.

התיוג בוצע באמצעות נוהל Wittig-Homer שונה עם 13C 2-triethylphosphonoacetate זמין מסחרית. התרכובות המסומנות משמשות בבדיקת RID כדי לקבוע TBS ולהעריך TLR. השיטה משתמשת ב-GCCIRMS לניתוח רטינול מטוהר מסרום או מחלב אם של אנשים שקיבלו מינון עם רמות פיזיולוגיות של התרכובות המסומנות המינונים הנפוצים ביותר הם 1 מיקרומול לילדים ו-2 מיקרומול למבוגרים. בעוד שניתוח GCCIRMS רגיש להעשרת איזוטופים, ניתוח הסרום דורש מינימום של 400 מיקרוליטר של סרום כדי להשיג מספיק מסת רטינול להחדרה ל-GC.

מבחן 13C-RID שימש במחקרים קליניים23,24 ובקבוצות של ילדים אפריקאים25 עם תוכניות עתידיות להפוך אותו לנגיש לעבודה מבוססת אוכלוסייה. ביצענו את הניסויים עם קפסולות ומזרקים כדי לחקור אם השינויים האלה מתאימים לעבודת אוכלוסייה. הקפסולות היו צריכות להיות במצב זקוף או שהן דלפו; מיהרנו לזרוק את הרעיון שניתן לאחסן אותם בבקבוקי גלולות ענבר רגילים לשימוש בשטח. הקפסולות היו יציבות רק במשך ~9 חודשים בטמפרטורות המקרר והמקפיא. ייצור כמוסות אטומות עשוי לשפר את היציבות על ידי הפחתת חשיפה קלה לאטמוספירה במהלך האחסון. יש לבדוק ולאמת את השימוש בכמוסות על ידי קבוצות משתמשים לפני היישום.

תמיסות השמן הסופיות יציבות בטמפרטורת החדר למשך ~ חודשיים, אך ברגע שהן מתחילות להתכלות, הפירוק ממשיך במהירות. אין פעילות חלקית המקובלת לבדיקות RID מכיוון שהכמות המינונה משמשת לחישוב TBS. עדיף לשמור את התמיסות על שקיות קרח בשטח במהלך השימוש ולהקפיא אותן בהקדם האפשרי לאחר השלמת המינון. עדיף להביא רק כמה מנות יותר ממה שצריך ליום ולהקפיא את השאר. הקפאה והפשרה אינם משפיעים על תמיסות אלה מכיוון שבשמן עצמו יש נוגדי חמצון. תמיסות השמן חזקות יותר מדגימות דם, אך עדיין יש לשמור אותן בחושך כל הזמן ולהקפיא אותן כאשר אינן בשימוש.

המינונים ניתנים באמצעות פיפטות תזוזה חיוביות של 250 מיקרוליטר Rainin או מזרקי טוברקולין של 1 מ"ל. פיפטות עקירת אוויר אינן מתאימות למינונים המומסים בשמן. המעבדה שלנו השוותה באופן ניסיוני בין שתי השיטות הללו (ראו תוצאות מייצגות). הניהול עם הפיפטה או המזרק דומה עם כמה סטיות. פיפטות תזוזה חיוביות של Rainin מומלצות למחקר או למחקרים קליניים, אך ניתן להשתמש במזרקים לעבודה מבוססת אוכלוסייה. מומלץ להשתמש במזרקים עם נפח מת קטן בקצה כדי למקסם את דיוק המינון (למשל, Norm-Ject).

החישובים לבדיקת RID כוללים את כמות המינון הניתנת, והשגיאה בכמות המינון הניתנת פרופורציונלית לשגיאה בהערכה המתקבלת של TBS. עבור שימוש במזרקי טוברקולין לעומת פיפטות עם תזוזה חיובית, אספקת המזרק המנורמלת הממוצעת הייתה קרובה ל-1, מה שמצביע על כך שמזרקים יכולים לספק אספקת מינון מדויקת למחקרי אוכלוסייה. גבולות הביטחון של 95% היו כ-±-8% ממתן מנת היעד. לטכנאים עם ניסיון קודם יותר עם המזרקים היה רווח בר-סמך צר יותר של 95% (± 6%) ותרומת שונות נמוכה יותר מטכנאי בהשוואה לטכנאים עם פחות ניסיון (± 10%). זה מצביע על כך שיש לבצע פרוטוקול הדרכה ואימות באמצעות שמן רכב לפני היישום בשטח. תוצאות אלה ראויות לאימות נוסף בכל מעבדה שרוצה להשתמש במזרקי טוברקולין חד פעמיים כשיטת אספקה חסכונית וחוסכת זמן למתן המינונים בבדיקות תגובה למינון ו-RID במחקרים מבוססי אוכלוסייה.

בחרנו בפיפטה תזוזה חיובית למחקר ומחקרים קליניים באמצעות מבחן RID כדי למקסם את הדיוק ברמת הפרט, מכיוון שהדיוק והדיוק המדווחים שלהם הם ≤1%. לשם השוואה, מבחן תגובת המינון היחסי המותאם הוא איכותי, ואין חישובים המבוססים על כמות המינון שניתנה1. לכן, המלצנו להשתמש במזרקים לבדיקה בסקרים מבוססי אוכלוסייה ולהמיס את המינון בכ-0.7 מ"ל של רכב.

בדיקת RID היא שיטה רגישה לכימות TBS ולהערכת TLR, שהוא תקן הייחוס להערכת מצב ויטמין A. הוא שימש ביישומי מחקר רבים באמצעות תיוג דאוטריום או 13C. יישומים נוכחיים ועתידיים ישתמשו במבחן RID במסגרות קליניות ותת-קבוצות אוכלוסייה בסקרים. פישוט המינון יהיה חשוב עבור יישומים אלה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים עם התוכן של כתב היד הזה.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי NIH-R01 DC019357 ופרויקט המחקר המתואם E43035 של הסוכנות הבינלאומית לאנרגיה אטומית. אנו מודים לניקולס קולר מקבוצת הייעוץ הסטטיסטי באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון על הסיוע בניתוח השוואת שיטת המזרק החד-פעמי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אנהידריד אצטיסיגמא אולדריץ'242845
אצטוןסיגמא אולדריץ'179124
תחמוצת אלומיניוםסיגמא אולדריץ'199974
כוסותכלשהוכל חברה לאספקת זכוכית 
בטא-יונוןסיגמא אולדריץ'W259500
אתרסיגמא אולדריץ'673811
פיפטות פסטר מזכוכיתכלשהוכל חברה לאספקת זכוכית 
הקסניםסיגמא178918
מסומן טריאתילפוספונואצטטסיגמא אולדריץ'293202
פתרון ליתיום אלומיניום הידרידאקרוס אורגני199511000
תחמוצת מנגןסידמה אולדריץ'310700
פיפטות תזוזה חיוביתריינין17008579
רטיניל אצטטסיגמא אולדריץ'₪1000
משפכי הפרדהכלשהוכל חברה לאספקת זכוכית 
סיליקה ג'לסיגמא אולדריץ'1.07734
נתרן הידרידאולדריץ'223441
נתרן הידרוקסידפישר סיינטיפיקS318-100
ספקטרופוטומטרכל סריקהעדיף קרן כפולה
טריאתילאמיןסיגמא אולדריץ'471283
טריאתילפוספונואצטטאולדריץ'T61301
מזרק טוברקוליןנורמה-ג'קט19G334
שמן צמחיסויהמכולת
צלוחיות נפח (25 מ"ל)כלשהוכל חברה לאספקת זכוכית 

מקורות

  1. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of nutrition for development (BOND) - Vitamin A review. J Nutr. 146 (9), 1816S-1848S (2016).
  2. Tanumihardjo, S. A., Kaliwile, C., Boy, E., Dhansay, M. A., van Stuijvenberg, M. E. Overlapping vitamin A interventions in the United States, Guatemala, Zambia, and South Africa: case studies. Annals NY Acad Sci. 1446 (1), 102-116 (2019).
  3. Sheftel, J., Loechl, C., Mokhtar, N., Tanumihardjo, S. A. Use of stable isotopes to evaluate bioefficacy of provitamin A carotenoids, vitamin A status, and bioavailability of iron and zinc. Adv Nutr. 9 (5), 625-636 (2018).
  4. Bergen, H. R., Furr, H. C., Olson, J. A. Synthesis of tri-, tetra-, and penta-deuterated forms of vitamin A. J Labelled Cpd Radiopharm. 25 (1), 11-21 (1988).
  5. Tanumihardjo, S. A. Synthesis of 10, 11, 14, 15-13C4- and 14, 15-13C2-retinyl acetate. J Labelled Cpd Radiopharm. 44 (5), 365-372 (2001).
  6. Tanumihardjo, S. A. Vitamin A status assessment in rats using 13C4-retinyl acetate and gas chromatography-combustion isotope ratio mass spectrometry (GCCIRMS). J Nutr. 130 (1), 2844-2849 (2000).
  7. Gannon, B. M., Valentine, A. R., Davis, C. R., Howe, J. A., Tanumihardjo, S. A. Duration of retinol isotope dilution studies with compartmental modeling affects model complexity, kinetic parameters, and calculated vitamin A stores in US women. J Nutr. 148 (8), 1387-1396 (2018).
  8. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84 (Suppl 1), 30-39 (2014).
  9. Gannon, B. M., et al. 13C natural abundance of serum retinol is a novel biomarker for evaluating provitamin A carotenoid-biofortified maize consumption in male Mongolian gerbils. J Nutr. 146 (7), 1290-1297 (2016).
  10. Sheftel, J., Gannon, B. M., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Provitamin A-biofortified maize consumption increases serum xanthophylls and 13C-natural abundance of retinol in Zambian children. Exp Biol Med. 242 (15), 1508-1514 (2017).
  11. Howe, J. A., Valentine, A. R., Hull, A. K., Tanumihardjo, S. A. 13C natural abundance in serum retinol acts as a biomarker for increases in dietary provitamin A. Exp Biol Med. 234 (2), 140-147 (2009).
  12. Gannon, B. M., et al. Comparison of total body vitamin A stores using individual versus population 13C-natural abundance of serum retinol in preschool children and women residing in 6 diverse African countries. J Nutr. 153 (4), 949-957 (2023).
  13. Newton, S., et al. Vitamin A status and body pool size of infants before and after consuming fortified home-based complementary foods. Arch Public Health. 74, 10(2016).
  14. Pinkaew, S., et al. Triple-fortified rice containing vitamin A reduced marginal vitamin A deficiency and increased vitamin A liver stores in school-aged Thai children. J Nutr. 144 (4), 519-524 (2014).
  15. Nimmannun, K., et al. Breast milk retinol concentrations reflect total liver vitamin A reserves and dietary exposure in Thai lactating women from urban and rural areas. J Nutr. 152 (12), 2689-2698 (2023).
  16. A campus laboratory fire involving lithium aluminum hydride. , https://ehs.stanford.edu/reference/campus-laboratory-fire-involvinglithium- aluminum-hydride (2025).
  17. Merlic, C. A., Ferber, C. J., Schroder, I. Lessons learned− lithium aluminum hydride fires. ACS Chem. Health Saf. 29 (4), 362-365 (2002).
  18. Chandra, T., Zebrowski, J. P. A safety guidance document for lithium aluminum hydride (LAH) reduction: A resource for developing specific SOPs on LAH manipulations. ACS Chemical Health & Safety. 31 (2), 162-171 (2024).
  19. Procedures for safe use of pyrophoric solids accessed. , https://ehs.ucsc.edu/programs/research-safety/documents/ucla-pyrophoric-solid.pdf (2025).
  20. Tang, G., et al. Green and yellow vegetables can maintain body stores of vitamin A in Chinese children. Am J Clin Nutr. 70 (6), 1069-1076 (1999).
  21. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  22. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2024).
  23. Valentine, A. R., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Vitamin A isotope dilution predicts liver stores in line with long-term vitamin A intake above the current Recommended Dietary Allowance for young adult women. Am J Clin Nutr. 98 (5), 1192-1199 (2013).
  24. Sheftel, J., et al. Findings in 3 clinical trials challenge the accuracy of the Institute of Medicine's estimated average requirements for vitamin A in children and women. Am J Clin Nutr. 113 (5), 1322-1331 (2021).
  25. Suri, D., et al. Association between biomarkers of inflammation and total liver vitamin A reserves estimated by 13C-retinol isotope dilution among preschool children in five African countries. J Nutr. 153 (3), 622-635 (2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

סטטוס ויטמין Aרטיניל אצטט 13Cויטמין A בכבדכרומטוגרפיה גזיתספקטרומטריית מסות של יחסי איזוטופיםסינתזת Wittig-Hornerכרומטוגרפיה בשכבה דקהספקטרוסקופיית UV-Visכרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.