זיהוי מטבולי בזמן אמת בתאים חיים באמצעות תמ"ג היפרפולרי 13C

Tomoto Ura; Keita Saito; Ryoma Kobayashi; Natsuko Miura; Yoichi Takakusagi

doi:10.3791/68539

מאמר שיטה

זיהוי מטבולי בזמן אמת בתאים חיים באמצעות תמ"ג היפרפולרי ¹³C

DOI:

10.3791/68539

⸱

8 ביולי 2025

Tomoto Ura¹^,² , Keita Saito¹ , Ryoma Kobayashi¹ , Natsuko Miura³ , Yoichi Takakusagi¹^,⁴

¹Institute for Quantum Life Science, National Institutes for Quantum Science and Technology, ²Institute of Pure and Applied Sciences, University of Tsukuba, ³Department of Applied Biological Chemistry, Graduate School of Agriculture, Osaka Metropolitan University, ⁴Center of Quantum Life Science for Structural Therapeutics (cQUEST), Chiba University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה משלב מערכת ביו-ריאקטור שנבנתה בהתאמה אישית עם ספקטרוסקופיה של ¹³C NMR היפרפולרית כדי למדוד מטבוליזם פירובט בזמן אמת בתאים חיים, ולשפר את יכולת השחזור והדיוק הקינטי עבור מחקרים מטבוליים ויישומי סינון תרופות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מציג שיטה לשילוב מערכת ביו-ריאקטור שנבנתה בבית עם ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR) היפרפולרית ¹³C כדי למדוד את חילוף החומרים של פירובט בתאים חיים בזמן אמת. הפרוטוקול מתאר בניית מערכת ביו-ריאקטור המאפשרת תזמון מדויק של הזרקת מצע היפר-פולרי ורכישת אותות NMR תוך שמירה על סביבת תרבית תאים יציבה. השיטה מזהה באופן אמין את ההמרה המטבולית של פירובט ללקטט בתוך חלון מדידה של 60 שניות תוך שמירה על יחס אות לרעש מספיק לאורך כל התהליך. יכולת הערבוב באתרה של המערכת מאיצה את זיהוי אותות ה-NMR ומפחיתה את הפסדי ההרפיה של T₁. הפרוטוקול כולל גם הוראות מפורטות להכנת ג'ל אלגינט כדי לעטוף תאים ולמקם אותם בתוך הביוריאקטור. השיטה המוצעת מציגה יכולת שחזור משופרת ודיוק קינטי בהשוואה לשיטות קונבנציונליות, מה שמצביע על יישומים פוטנציאליים במחקרי מטבוליזם של סרטן ובדיקת תרופות. שיפורים נוספים של המערכת, כגון אימוץ מטריצות ג'ל חלופיות, עשויים לשפר את הרבגוניות שלה במחקרים ביולוגיים שונים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תמ"ג היפר-פולריזציה, במיוחד באמצעות קיטוב גרעיני דינמי (DNP), משפר משמעותית את עוצמת אות ה-NMR¹ ומאפשר מעקב בזמן אמת אחר שינויים מטבוליים עם רגישות משופרת מאוד ^2,3. טכניקה זו יושמה בהצלחה על פני מערכות ביולוגיות שונות, כולל שמרים ^4,5, מודלים של תאים סרטניים ^6,7,8 ומיקרואורגניזמים ^9,10. הוא שימש גם לניטור מסלולים מטבוליים מרכזיים כגון גליקוליזה^11,12, הומאוסטזיס חמצון חיזור^13,14 וויסות pH^15,16. מעבר למחקר בסיסי, תמ"ג היפר-פולרי משמש כיום בהדמיה קלינית באמצעות MRI, ומאפשר הערכה מטבולית מקנה המידה התאי לכל הגוף¹⁷. התפתחויות אלו מדגישות את הביקוש הגובר לפרוטוקולים נגישים המאפשרים שימוש נרחב יותר בתמ"ג היפר-מקוטב בהקשרים ביולוגיים מגוונים.

למרות הרבגוניות שלו, יישום מדידות מטבוליות בזמן אמת בתאים חיים באמצעות NMR היפרפולרי נותר מאתגר מבחינה טכנית. מערכות קונבנציונליות מסתמכות לרוב על הגדרות מורכבות וספציפיות למעבדה חסרות יכולת שחזור וקשות לתפעול ללא מומחיות נרחבת 8,18,19,20. זה מהווה מחסום מרכזי בפני חוקרים השואפים לאמץ טכנולוגיה זו למחקר ביולוגי או תרגומי. בהשוואה לשיטות חלופיות כגון הדמיה אופטית או ספקטרומטריית מסה, תמ"ג היפרפולרי ^{של 13}צלזיוס מאפשר ניטור לא פולשני ונפתר בזמן של תגובות מטבוליות ספציפיות ללא דגימה הרסנית. הוא מספק מידע ביוכימי ישיר בדיוק זמני, מה שהופך אותו למתאים היטב למחקרים דינמיים של חילוף חומרים תאי.

כדי להתמודד עם מגבלות אלה, מחקר זה מציג פרוטוקול מעשי וניתן לשחזור שתוכנן במיוחד כדי לאפשר לחוקרים לבצע מדידות NMR היפר-פולריות של חילוף חומרים של תאים חיים עם מינימום מכשולים טכניים. מתוארת שיטה מקיפה למדידה בסיסית של חילוף החומרים של פירובט בתאים חיים. בעוד שניתן ליישם פרוטוקול זה על ¹³בדיקות אחרות המסומנות ב-C, פירובט מתאים במיוחד בשל הספיגה התאית המהירה שלו, המסלולים המטבוליים המאופיינים היטב ותפקידו המרכזי בחילוף החומרים התאי. ההליך מורכב מ: (i) הכנת דגימות תאים, (ii) אנקפסולציה בג'ל אלגינט, (iii) היפר-פולריזציה באמצעות מקטב DNP, ו- (iv) מדידת תמ"ג ¹³C בזמן-אמת בספקטרומטר MHz 400 (איור 1). בנוסף, ניתנים פרמטרים מרכזיים לבניית מערכת הביוריאקטור כדי להבטיח שחזור ותאימות לחומרת NMR סטנדרטית. הפרוטוקול מותאם ליישום קל באמצעות רכיבים זמינים מסחרית ונועד לעזור לחוקרים, במיוחד אלה החדשים בטכניקה, לקבוע את התאמתו לצרכי הניסוי שלהם.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מערך ביו-ריאקטור (איור 2A-B)

הרכבת צינור ה-NMR
1. השתמש בצינור NMR עם מכסה בורג (קוטר 10 מ"מ, אורך 178 מ"מ) עם מכסה פתוח להכנסת צינורות.
2. הכן מחיצת בקבוקון סיליקון/PTFE (קוטר 9 מ"מ) והכנס דרכו צינור PEEK לאיטום הדוק (איור משלים 1).
3. הכנס את המחיצה עם צינורות PEEK עמידים כימית (קוטר פנימי 1.0 מ"מ, קוטר חיצוני 1.6 מ"מ, עובי דופן 0.3 מ"מ, אורך 1 מ') לתוך פתח המכסה שהשתנה.
4. הנח את המחיצה בין צינור ה-NMR למכסה הפתוח שלו, ואבטח אותו על ידי סגירה חזקה של המכסה. מערך זה מחזיק את המחיצה במקומה ומספק אטימה מספקת למניעת דליפה במהלך זלוף או הזרקה.
הקמת צינורות אספקה בינוניים (איור 2C)
1. חבר את צינור ה-PEEK ליציאות הכניסה והיציאה של צינור ה-NMR כדי לאפשר זלוף רציף. אבטח את החיבורים באמצעות סט אביזרים ללא אוגן כדי למנוע דליפה.
התקנת רכיבי ההתחממות הבינונית
1. חבר את צינור ה-PEEK למשאבה פריסטלטית המתכווננת לקצב זרימה יציב של כ-0.2 מ"ל/דקה, מה שמבטיח זרימה בינונית רציפה באמצעות ערכת זרימה חיצונית. הנח את המאגר הבינוני באמבט מים המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס כדי לשמור על הטמפרטורה.
הוספת רכיב למניעת דליפת ג'ל
1. חותכים ספוג צפוף כך שיתאים לקוטר צינור ה- NMR. הכניסו את הספוג לתחתית הצינור כדי למנוע דליפת ג'ל אלגינט תוך מתן זרימה בינונית.
ייצור והכנסה של רכיב קיבוע הספוג המודפס בתלת מימד (איור 2D-F)
1. הדפס בתלת מימד מחזיק גלילי (קוטר חיצוני 9.1 מ"מ, אורך 20 מ"מ, עם חור מרכזי בקוטר 1.5 מ"מ) באמצעות שרף פוטופולימר התואם להדפסת תלת מימד סטריאוליטוגרפית. מפרטי העיצוב מסופקים בקובץ המשלים המצורף 1.
2. הכנס נימי זכוכית בורוסיליקט (קוטר חיצוני 1.5 מ"מ, קוטר פנימי כ-0.9 מ"מ, אורך 90 מ"מ) דרך החור שנוצר מראש של המחזיק המודפס בתלת מימד.
3. חבר את הספוג לפלטפורמה על המחזיק באמצעות שרף הניתן לריפוי UV עם תכונת עמידות במים. ריפוי במשך 30 שניות תחת אור UV כדי להבטיח התמצקות.
4. הכנס את המחזיק המורכב עם ספוג לתוך צינור ה-NMR.

2. הכנת תאים (התחל שבועיים לפני המדידה)

הפשירו מלאי תאים קפואים (SCCVII או HeLa) במהירות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. העבירו כ-1 ×-10⁶ תאים למדיום RPMI-1640 של 10 מ"ל בתוספת 10% (v/v) סרום בקר עוברי ו-1% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין.
תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ ומעבירה אותם כל 2-3 ימים לאחר שמגיעים למפגש של 70%-80%. המשיכו בתרבית במשך כשבועיים כדי להשיג ~4 x 10⁷ תאים, המוערכים מחמש מנות של 10 ס"מ שגדלו לכ-90% מפגש (כל אחת מניבה ~8 x 10⁶ תאים).

3. הכנת ג'ל אלגינט

הכנת תמיסת אלגינט
1. ממיסים אבקת נתרן אלגינט בדרגת מחקר ביולוגית במים נטולי יונים להכנת תמיסה של 2% (w/v). דגרו את התמיסה למשך הלילה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ומעלה עם תסיסה עדינה מקצה לקצה. השתמש במסובב צינור המוגדר בכ-10-20 סל"ד כדי למנוע בועות ולהבטיח התמוססות אחידה.
אנקפסולציה של תאים בג'ל אלגינט
1. מוסיפים 2 מ"ל של 0.25% (v/v) trypsin-EDTA לכלי 10 ס"מ. הטה את הכלי כך שיכסה את כל המשטח ושאף את עודפי הטריפסין-EDTA.
2. דוגרים את המנה בחום של 37 מעלות למשך 2 דקות.
3. הוסף 10 מ"ל מדיום תרבות לתבשיל. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים. אוספים את כל תרחיף התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
4. קח כ -10 מיקרוליטר מהתרחיף וספור את מספר התאים באמצעות מונה תאים. בדרך כלל, נדרשים בסביבות 1 × 10⁷ תאים להליכים הבאים, אך יש לאשר את המספר בפועל על ידי מדידה.
5. צנטריפוגה את תרחיף התאים הנותר ב -120 × גרם למשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא ב-4 מ"ל של תמיסת אלגינט 2% (w/v). פיפטה לאט כדי למזער את יצירת הבועות.
היווצרות ג'ל על ידי קישור צולב של סידן (איור 3)
1. הוסף 10 מ"ל של תמיסת CaCl₂ של 50 מ"מ לשפופרת צנטריפוגה של 50 מ"ל (איור 3A).
2. קחו 300 מיקרוליטר מתערובת התא-אלגינט למזרק של 0.5 מ"ל המצויד במחט של 30 גרם ו-10 מ"מ, והדק אותה למכסה של צינור הצנטריפוגה (איור 3B).
3. סגור היטב את מכסה צינור הצנטריפוגה כשהמזרק מקובע אליו וצנטריפוגה את כל המכלול בעדינות בטמפרטורה של 200 × גרם למשך 5 דקות. הסירו את תמיסת הסופרנטנט לאחר הצנטריפוגה והשעו מחדש את הג'ל הטעון בתא במדיום (איור 3C-D).
העמסת הג'ל לתוך צינור ה-NMR
1. העבירו את הג'ל העטוף בתא לתוך צינור ה-NMR באמצעות פיפטה של פסטר. הכנס את מתקן הספוג והקפד על אטימה הדוקה.
2. יש לחמם מראש את המאגר הבינוני (המכיל 5% (v/v) D₂O) שהוכן בשלב 1.3.2 באמבט מים ל-37 מעלות צלזיוס ולהפיץ אותו בקצב של כ-500 מיקרוליטר לשעה כדי לייצב את התנאים.
3. ודא שאין נזילות לפני הכנסת צינור ה-NMR למגנט. תוך שמירה על צינור ההצצה ישר, הכנס את צינור ה-NMR למגנט. התאם את גודל הג'ל, מספר החרוז ומהירות הפיפטינג בהתאם לסוג התא ולדרישות הניסוי.

4. הכנת בדיקה היפרפולרית באמצעות מקטב DNP (איור 4)

הכנת בקבוקון הדגימה
1. הוסף 18 מיקרוליטר של [^1-13C] חומצה פירובית (14.2 M) מסוממת עם 25 מ"מ OX063 לבקבוקון דגימה. חבר את הבקבוקון לנתיב הנוזל של מערכת המקטב DNP.
קיטוב המדגם
1. הכנס את הבקבוקון ליחידת הקידוח של מקטב DNP (6.7 T, 1.25 K, 1.2 mbar). הפעל קרינת מיקרוגל בכ-188 GHz (22 mW) למשך 60-80 דקות.
ניטור אות במהלך קיטוב
1. השתמש בספקטרומטר NMR במצב מוצק המובנה במערכת DNP כדי לנטר את עוצמת האות ^{של 13}C. רשום נתוני אות כל 5 דקות באמצעות תוכנת NMR (SPINit).
ממיסים ומכינים את התמיסה ההיפרפולרית
1. ממיסים במהירות את הדגימה המקוטבת ב-3.2 מ"ל של מאגר פירוק שחומם מראש (40 מ"מ Tris, 50 מ"מ NaCl, 80 מ"מ NaOH, 100 מ"ג/ליטר EDTA). ודא שהתמיסה מגיעה לטמפרטורה ביולוגית (308-313 K, pH ~ 7) לפני ההעברה למדידת NMR.
  הערה: היזהר בעת טיפול ברכיבים בלחץ גבוה. מחממים מראש את מאגר הפירוק ל-~461 K כדי להבטיח העברה יעילה ושלמות הדגימה.

5. הגדרת תמ"ג

הכנת ספקטרומטר NMR
1. טען את הדגימה לתוך צינור ה-NMR והכנס אותה לספקטרומטר.
2. בצע נעילה, כוונון, התאמה והחלקה בקונסולת ה-NMR באמצעות ההליך האוטומטי עם הכנסת דגימה, כדי למטב את הרזולוציה הספקטרלית ויציבות האות.
הגדרת פרמטרי הרכישה
1. טען רצף רכישת דופק ^{של 13}C (למשל, zg2d) עם ניתוק פרוטונים מופעל (למשל, 13-CPD).
2. הגדר את זווית ההיפוך ל-90° באמצעות פולס של 1 מיקרו-שניות (P1). הגדר את זמן הרכישה ל-1.376 שניות, את הרוחב הספקטרלי ל-23,663 הרץ ואת מספר נקודות הרכישה (TD) ל-65,536. הגדר את עיכוב ההרפיה (D1) ל-0 שניות.
3. הגדר את מספר מרווחי הזמן (TD1) ל-150 כדי להשיג 150 ספקטרום רציף במצב פסאודו-דו-ממדי. כוונן את רווח המקלט לערך נמוך (למשל, ~1) כדי למנוע רוויית אות מדגימות היפר-פולריות.
  הערה: בשל עוצמת האות הגבוהה של NMR היפרפולריזציה, הגדר את רווח המקלט לערך נמוך (למשל, ~1), המתאים בדרך כלל לפחות מ-1% מהרווח המרבי הזמין. הגבר המקלט הוא פרמטר פנימי ללא-יחידה השולט בהגברת האות. ערכים גבוהים מדי עלולים לגרום לרוויית האות.

6. מדידת תמ"ג

הכנה למדידה
1. מלאו את כל נתיב צינור הכניסה מצינור הכניסה לצינור ה-NMR עם חוצץ פירוק כדי למנוע לכידת אוויר (איור 2B). צינור הכניסה משמש הן לזלוף בינוני והן להזרקת בדיקה היפרפולריזציה.
2. בדוק היטב שאין בועות אוויר בצינור הכניסה או בתוך צינור ה-NMR, שכן בועות באזור זה עלולות להפריע לרכישת האותות במהלך מדידות NMR.
הכנה להזרקת תמיסה היפרפולרית
1. עצור את המשאבה הפריסטלטית כדי לעצור זמנית את זרימת הדם הבינונית לפני הזרקת התמיסה ההיפרפולרית דרך צינור הכניסה.
2. התחל את הרכישה הספקטרלית כ-10 שניות לפני המסת המצע ההיפר-פולרי כדי להבטיח שהאות ייקלט מיד עם הגעתו לאתר זיהוי ה-NMR לאחר ההזרקה.
3. צייר 1 מ"ל מהתמיסה בעזרת מזרק כשהוא יוצא מהמקטב DNP.
הזרקת התמיסה ההיפרפולרית ואישור האות
1. העבר את השסתום התלת-כיווני בכניסת הביוריאקטור למצב B כדי להזריק את התמיסה ההיפר-פולרית לתוך צינור ה-NMR.
2. החזר את השסתום למצב A לאחר ההזרקה כדי לחדש את זרימת הדם הבינונית ולמנוע זרימה חוזרת.
3. אשר הגעה מוצלחת של הזרקה ומצע על ידי התבוננות בעלייה באות דעיכת האינדוקציה החופשית (FID) בתוכנת הרכישה.

7. עיבוד וניתוח נתונים

עיבוד נתונים ספקטרליים
1. טען את ספקטרום ה-NMR שנפתר בזמן לתוכנת עיבוד הנתונים. אם הנתונים מאוחסנים בפורמט קובץ ser, אתר וטען את הקובץ המתאים.
ניתוח הספקטרום
1. בצע את התמרת פורייה (FT) כדי להמיר את ה-FID הגולמי לתחום התדרים. החל תיקון פאזה באופן ידני או אוטומטי. בצע תיקון בסיסי כדי להסיר עיוותים.
הדמיה של המרת מטבוליט
1. שרטט את אותות מהלך הזמן עבור פירובט C1 (~171 ppm) ולקטט C1 (~183 ppm).
כימות המרה מטבולית
1. חשב את השטח מתחת לעקומה (AUC) עבור פסגות הפירובט והלקטט.
2. קבע את היחס [לקטט]/[פירובט] על ידי חלוקת ה-AUC של לקטט בזה של פירובט.
  הערה: נעשה שימוש ב-AUC במקום בגובה שיא כדי למזער את ההשפעה של חפצי צלצול הנגרמים על ידי אות הפירובט הגדול ההיפר-פולרי [1-¹³C]. ערכי AUC מתקבלים על ידי סיכום פשוט של עוצמות האות בטווח האינטגרציה המוגדר עבור כל שיא.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, מערכת מפוברקת חוברה לספקטרוסקופיה היפרפולרית ^{של 13}C NMR כדי למדוד את חילוף החומרים של פירובט בתאים חיים בזמן אמת. האותות העיקריים שזוהו בספקטרום 1D ¹³C NMR תאמו לפירובט (כ-171 ppm) ולקטט (כ-183 ppm)²¹, מה שמאפשר לנו להעריך את ההמרה המטבולית של פירובט ללקטט בתנאים פיזיולוגיים (איור 4).

איכות ספקטרלית ודינמיקת אותות
תוצאות מייצגות ממדידות חוזרות ונשנות על אותה דגימה באמצעות תאי SCCVII - קו קרצינומה של תאי קשקש של עכבר המשמש לעתים קרובות במחקרי MRI היפרפולריזציה - מוצגות באיור 5. המדידה הראשונה הראתה עלייה ברורה באות הלקטט, מה שמעיד על המרה מטבולית פעילה. עם זאת, מדידות עוקבות שנלקחו במרווחים של 1.5 שעות הראו ירידה הדרגתית בפעילות המטבולית. הפחתה תלוית זמן זו משקפת ככל הנראה מתח ביולוגי או הסתגלות הנגרמת על ידי הזרקת הפירובט הראשונית. יש לציין כי אפנון מטבולי חולף דומה דווח in vivo באמצעות MRI ו-EPRI היפרפולריזציה, כאשר חמצון הגידול ירד באופן זמני לאחר מתן פירובט²². תוצאות אלה מדגימות כי יכולת החזרה של מדידות אלה מאפשרת מעקב לא הרסני אחר שינויים מטבוליים דינמיים - יתרון שקשה להשיג בשיטות הרסניות²³.

כדי להעריך את הישימות של פרוטוקול זה על סוגי תאים אחרים, נערכו מדידות נוספות באמצעות תאי HeLa, קו תאי סרטן אנושי בשימוש נרחב. כפי שמוצג באיור 6, תאי HeLa הציגו גם המרה ברורה של פירובט ללקטט. למרות שעוצמת האות ירדה בהדרגה עקב הרפיית T₁, יחס האות לרעש נשאר מספיק לאורך כל תקופת הרכישה של 60 שניות. ממצאים אלה מצביעים על כך שהפרוטוקול הנוכחי ישים באופן נרחב ויכול לשמש ככלי רב-תכליתי לפרופיל מטבולי בזמן אמת בסוגי תאים שונים.

בעוד שדעיכת אות מהירה היא מגבלה אינהרנטית של NMR מבוסס DNP, מערכת הערבוב באתרה שלנו ממזערת את העיכוב בין פירוק למדידה, ובכך משפרת את רגישות הזיהוי. שיפורים נוספים, כגון אופטימיזציה של הרכב מטריצת הג'ל, עשויים להרחיב את הישימות של שיטה זו למגוון רחב יותר של מערכות ביולוגיות.

figure-results-1
איור 1: דיאגרמה סכמטית של זרימת העבודה הכוללת מתרבית תאים ועד למדידת תמ"ג היפר-פולריזציה. התהליך מתחיל בתרבית תאים (~2 שבועות), ואחריה הכנת ג'ל אלגינט (~60 דקות) כדי לעטוף תאים למדידה יציבה. לאחר מכן, היפרפולריזציה מתבצעת באמצעות מערכת מקטב DNP (~60 דקות), ומדידת NMR מתבצעת באמצעות ספקטרומטר NMR של 400 מגה-הרץ (~5 דקות). התצלומים מימין מציגים את המכשירים המתאימים המשמשים בתהליך עבודה זה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: מערך ביו-ריאקטור למדידת תמ"ג היפר-פולריזציה. (A) תרשים סכמטי של מערך הביוריאקטור. מדיום התרבות מוחדר לצינור ה-NMR דרך כניסה A ולאחר מכן מופנה לפסולת. חרוזי אלגינט המכילים תאים חיים ממוקמים בתוך צינור ה-NMR. במהלך מדידות NMR היפרפולריזציה, הגשושית ההיפרפולרית מוזרקת דרך כניסה B, המסומנת ככניסת בדיקה היפרפולריזציה. (ב) תצלום של כל מערך הביוריאקטור, עם צינורות הכניסה והיציאה מסומנים בבירור. (C) מבט מקרוב על מתג צינור הכניסה, שמראה כניסה A (זלוף בינוני) וכניסה B (הזרקת בדיקה היפרפולריזציה). (D) עיצוב CAD ו-(E) תצלום מייצג של רכיב קיבוע הספוג המודפס בתלת מימד הממוקם בתוך צינור ה-NMR. הרכיב כולל חור להנחיית נימי זכוכית המספקים את תמיסת המצע ההיפר-פולריזציה ופלטפורמה להחזקת ספוג. הרכיב עצמו אינו מתאים היטב לקיר הפנימי של צינור ה- NMR; (F) במקום זאת, מוכנס ספוג סביבו כדי למלא את החסר. מבנה זה מייצב את הרכיב ומאפשר למדיום הפסולת לזרום כלפי מעלה דרך הספוג, ומבטל את הצורך בחור יציאה נוסף. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: הכנת ג'ל אלגינט. (A) איור סכמטי ו-(B) תצלום של מנגנון היווצרות כדור ג'ל אלגינט. התמונה השמאלית מציגה את כל המערך, כולל צינור הצנטריפוגה עם מזרק קבוע למכסה השונה שלו. התמונה הימנית העליונה מציגה מכסה עם חור קטן לקצה המזרק, בעוד שהתמונה הימנית התחתונה מציגה מכסה עם פתח מרובע למיקום יציב של המזרק. צינור הצנטריפוגה ממולא מראש ב-10 מ"ל של תמיסת סידן כלוריד, מה שמאפשר לתמיסת האלגינט היוצאת מקצה המזרק לעבור ג'לציה, ויוצרת כדורי ג'ל אלגינט. (C) תמונה מיקרוסקופית מייצגת שמראה את המורפולוגיה של כדורי ג'ל אלגינט. (D) תמונה מיקרוסקופית מייצגת שמראה את המורפולוגיה של כדורי ג'ל אלגינט שמכילים תאי HeLa. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ייצוג סכמטי של שלבי ההכנה למדידת תמ"ג והיפרפולריזציה. במהלך תהליך הצטברות ה-DNP של ~60 דקות, הגדרת ה-NMR מתבצעת במקביל כדי למזער עיכובים. ההכנה כוללת העמסת חרוזי אלגינט לתוך צינור ה-NMR, ואחריה כוונון נעילה ^{של 1}H, שימינג וכוונון בדיקה כדי להבטיח שהמערכת מוכנה למדידה מיידית. לאחר פירוק וערבוב באתר , ספקטרוסקופיה של ¹³C NMR שנפתרה בזמן חושפת פסגות פירובט ולקטט ברורות. הפסגות שנצפו בכ-171 ppm, 179 ppm ו-183 ppm תואמות לפירובט, פירובט הידרט ולקטט, בהתאמה. כ-4 × 10⁷ תאי HeLa עטופים בג'ל אלגינט שימשו למדידת ה-NMR. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: גילוי בפתרון זמן של אותות פירובט ולקטט במדידות חוזרות. ספקטרום תמ"ג ¹³C היפרפולרי של אותה דגימה עטופה בתאי SCCVII נרכשו במרווחים של 1.5 שעות כדי להעריך את ההיתכנות של מדידות חוזרות ולא הרסניות. פירובט (עיגולים פתוחים) ולקטט (עיגולים מלאים, בקנה מידה של 1000×) עוצמות שיא משורטטות לאורך זמן עבור כל רכישה. (א) מדידה ראשונה. (B) המדידה השנייה, אחרי שעה וחצי, מגלה ירידה ניכרת בייצור הלקטט. (C) המדידה השלישית, אחרי שעה וחצי נוספות, אישרה פעילות מטבולית נמוכה מתמשכת. ניתוח כמותי המבוסס על השטח שמתחת לעקומה (AUC) הראה כי היחס [לקטט]/[פירובט] ירד מ-0.00134 (מדידה ראשונה) ל-0.00019 (מדידה שנייה) ו-0.00027 (שלישית). ריכוז התאים הסופי בג'ל האלגינט היה כ-1.0 ×-10⁷ תאים/מ"ל (4 ×-10-7 תאים ב-4 מ"ל). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: המרה של פירובט ללקטט בתאי HeLa. אותות תמ"ג היפרפולריים שנפתרו בזמן של פירובט ולקטט נמדדו בתאי HeLa חיים. עוצמת אות הפירובט מנורמלת לערכו המקסימלי בזמן אפס. עוצמת אות הלקטט מוגדלת בפקטור של 10³ לצורך נראות. ניתוח כמותי המבוסס על השטח שמתחת לעקומה (AUC) הראה יחס [לקטט]/[פירובט] של 0.00121. ריכוז התאים הסופי בג'ל האלגינט היה כ-7.5 ×-10⁶ תאים/מ"ל (3 ×-10-7 תאים ב-4 מ"ל). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1. תמונות מייצגות של מחיצת הבקבוקון המשמשת במערכת הביוריאקטור. (A) מחיצת סיליקון/PTFE (קוטר 9 מ"מ) לפני השימוש. (B) אותה מחיצה בשימוש בפועל, עם צינורות הצצה המוחדרים דרך חורים מנוקבים. האלסטיות של חומר המחיצה מאפשרת לו לאטום מחדש סביב הצינור, תוך שמירה על תנאים אטומים במהלך הזרקת מצע היפרפולריזציה. לחץ כאן להורדת איור זה

איור משלים 2: ספקטרום תמ"ג ¹³C היפרפולרי שנפתר בזמן נרכש לאחר ערבוב חיצוני. ספקטרום מייצג שנפתר בזמן של מטבוליזם פירובט [^1-13C] נמדד באמצעות מערכת NMR שולחנית לאחר ערבוב חיצוני של פירובט היפרפולרי ותאים מחוץ לצינור ה-NMR. לחץ כאן להורדת איור זה

קובץ משלים 1: עיצוב CAD של המחזיק הגלילי. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלבים קריטיים של הפרוטוקול
הצלחת פרוטוקול זה תלויה במספר שלבים קריטיים. ראשית, חשוב להבטיח פירוק והעברה נאותים של פירובט ¹³C היפרפולרי כדי לשמור על יחס אות לרעש גבוה. כדי ללכוד את ההמרה המטבולית המוקדמת של פירובט ללקטט, יש לסנכרן את תזמון הזרקת הגשושית ההיפרפולרית ורכישת ה-NMR. יתר על כן, חשוב לשמור על כדאיות התא לאורך כל הניסוי. סטיות מפרמטרים אלה עלולות לגרום לפעילות מטבולית מופחתת ולאובדן אות.

שינויים ופתרון בעיות בשיטה
בעוד שפרוטוקול זה מספק גישה חזקה לניטור מטבולי בזמן אמת, שינויים מסוימים עשויים לשפר את תחולתו. לדוגמה, התאמת זווית ההיפוך של רכישת התמ"ג יכולה לאזן את עוצמת האות ודעיכת הקיטוב כדי למטב את איסוף הנתונים. בנוסף, למרות שהוצגה שיטה להכנה יציבה של ג'ל אלגינט בגודל מסוים, ניתן להתאים בקלות את גודל הג'לים שייווצרו על ידי בחירת מזרק או מחט. זה יכול לתרום להתרבות סביבה היפוקסית²⁴ בנוסף למניעת בריחת תאים מצינור ה-NMR. בנוסף, ג'ל האלגינט הופך צפוף וצמיג בתוך צינור התמ"ג, במיוחד באזור מדידת התמ"ג. אם אוויר נכנס בעת הזרקת מדיום התרבית או הגשושית ההיפרפולרית מצינור ה-PEEK, סביר להניח שהוא יישאר באתר מדידת ה-NMR, מה שיוביל לירידה באיכות הספקטרום.

מגבלות השיטה
למרות שלמדידות היפרפולריות יש את היתרון של רגישות גבוהה של אותות NMR, יש להן מגבלות מובנות. בשל הרפיית T₁ של פירובט ¹³C היפרפולריזציה, משך המדידות המטבוליות מוגבל לכדקה אחת, מה שמגביל את התצפית על שינויים מטבוליים ארוכי טווח. בנוסף, קשה למדוד דגימת תא מספר שעות לאחר שנמדדה פעם אחת, מה שעשוי להיות קשור לטפטוף של כמות גדולה של פירובט במדידה אחת. זה זהה לעובדה שקבוצות קשורות מדדו ספקטרום יום אחד מאוחר יותר¹⁸, ומרווח המדידה צריך להיות כל כך ארוך.

חשיבות השיטה בהשוואה לטכניקות הקיימות
בהשוואה למבחנים מטבוליים קונבנציונליים, לשיטה שלנו יש יתרון על פני מדידות קצה כגון ספקטרומטריית מסה ומבחנים ביוכימיים בכך שהיא מספקת תובנה בזמן אמת לגבי חילוף החומרים התאי. למרות שניתן להשיג ספקטרום NMR היפר-פולרי דומה ללא שימוש בביו-ריאקטור, היכולת להתחיל מדידות מיד עם ערבוב באתרו מועילה, בהתחשב במהירות ההרפיה. בנוסף, ניתן להגדיר מראש תאים בסביבה יציבה לפני ההזרקה, ולשפר את יכולת השחזור והדיוק הקינטי של הניתוח המטבולי. יתרון זה נתמך על ידי ניסוי משלים (איור משלים 2), שבו ספקטרום שנפתר בזמן נרכש באמצעות מערכת תמ"ג שולחנית לאחר ערבוב חיצוני. במערך זה, עיכוב של כ-30 שניות בין ערבוב לקליטת אות הוביל לאובדן קיטוב משמעותי, שהשפיע במיוחד על זיהוי לקטט. זה מאשר שערבוב באתרו משפר את הנאמנות של מדידות קינטיות בתנאים עם דעיכה מהירה של T₁ . עם זאת, ראוי לציין שעוצמת האות במערך זה באתרה הייתה נמוכה יותר, ככל הנראה עקב דילול שנגרם על ידי זלוף בינוני - נושא שנותר לאופטימיזציה.

חשיבות ויישומים פוטנציאליים
שיטה זו עשויה לסלול את הדרך ליישומים בהבנת התכונות המטבוליות של צורות חיים מגוונות. מדידה בזמן אמת של שטפים מטבוליים מאפשרת לחוקרים להעריך באופן דינמי את ההשפעות של מעכבים מטבוליים. שילוב גישה זו עם טכניקות מדידה אחרות עשוי לשפר עוד יותר את הדיוק של ניתוח חילוף החומרים התוך תאי.

אנו חוזים זרימת עבודה ניסויית מעשית שבה נעשה שימוש במטבולומיקה הרסנית ובעלת תפוקה גבוהה לזיהוי מסלולים מועמדים, ואחריה אימות בזמן אמת באמצעות תמ"ג היפרפולרי ^{של 13}C כדי להעריך את תפקוד האנזים ודינמיקת השטף בתאים חיים. גישה זו מאפשרת זיהוי ישיר של תגובות מטבוליות חולפות בתנאים פיזיולוגיים - דבר שקשה להשיג באמצעות בדיקות אימונולוגיות או חיישני פלואורסצנטיות, המודדים בדרך כלל רמות מטבוליט סטטי או דורשים בדיקות אקסוגניות. בעוד שהדמיה פלואורסצנטית ובדיקות אימונולוגיות הן הכרחיות ללוקליזציה מרחבית ולהקרנה בתפוקה גבוהה, בהתאמה, NMR היפר-פולריזציה מספק קריאה פונקציונלית משלימה הלוכדת את קינטיקה של התגובה בצורה לא הרסנית. אסטרטגיה זו לא רק מאפשרת תובנות מכניסטיות ברמה התאית, אלא גם משמשת כגשר לקראת יישומי אבחון בקנה מידה של רקמה או אורגניזם. בפרט, היכולת ללכוד שינויים מטבוליים תפקודיים בזמן אמת עשויה לתמוך בזיהוי מוקדם של הפרעות מטבוליות ותגובות טיפוליות במערכות ביולוגיות מורכבות.

כמו כן, חלה התקדמות בפיתוח בדיקות מטבוליות המכוונות למסלולים מטבוליים מגוונים וסובסטרטים סינתטיים המיועדים לאנזימים ספציפיים, ומרחיבים את האפשרויות למחקר מטבולי^25,26. יתר על כן, התקדמות בטכניקות היפרפולריזציה, כגון העברת מצעים היפרפולריזציה ישירות מהמקטב ל-NMR דרך מנהרה מגנטית²⁷ - עשויה לשפר את שימור האות ולהרחיב את היישומים הפוטנציאליים של שיטה זו במחקר ביו-רפואי.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק JSPS KAKENHI מספר 23KJ2179 ו-24K17833 (ל-T.U.), 23K27561 (ל-Y.T.); מקסט קי-ליפ [JPMXS0120330644 (לי.ט.)]; ו-MEXT קידום פיתוח של פרויקט מערכת שימוש/מחקר משותף: מענק מספר JPMXP1323015488 של קואליציית האוניברסיטאות לתוכנית מצוינות במחקר (CURE) (תוכנית Spin-L מס' spin24XQ007).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
[1-¹³C] חומצה פירובית	מעבדות קיימברידג' איזוט בע"מ	CLM-8077
מדפסת תלת מימד	אלגואו	שבתאי 2
סידן כלורי	נקלאי טסקה, בע"מ	06729-55
D₂O	סיגמא-אולדריץ'	151882
ערכת זרימה חיצונית למשאבה	כאחד	1-4141-02
סרום בקר עוברי	ג'יבקו	10270106
סט אביזרים ללא אוגן	GL Sciences בע"מ	6010-46390
נימי זכוכית עם ליבה	נארישיגה	GDC-1.5	קוטר פנימי ~0.9 מ"מ, אורך 90 מ"מ
משאבת מחזור מגנטית	כאחד	1-4141-01
מסטרנובה	מחקר Mestrelab		תוכנה לעיבוד וניתוח ספקטרלי של NMR
מזרק הזריקה שלי	תאגיד ניפרו	8277	0.5 מ"ל/100U, 30G x 10 מ"מ, 140 יח'
OX063	אוקספורד אינסטרומנטס בע"מ ו-Polarize IVS Co. Ltd.	-
שפופרת הצצה	כאחד	3-780-05
פניצילין-סטרפטומיצין	נקלאי טסקה, בע"מ	26252-94
משאבת ביו מיני פריסטלטית	אטו	1221200	דיוק גבוה, סוג קצב זרימה רחב לזרימה בינונית יציבה
שרף	סיראיה טק	שחור מעושן
RPMI-1640 בינוני	נקלאי טסקה, בע"מ	30264-85
מחיצת בקבוקון סיליקון / PTFE	GL Sciences בע"מ	1030-50009
נתרן אלגינט 80-120	FUJIFILM Wako תאגיד כימיקלים טהור	194-13321
תוכנת SPINit	RS²D		תוכנת NMR במקטב DNP
ספוג	-	-	ספוג זמין מסחרית חתוך לגודל לייצוב ג'ל
סטוקוק תלת כיווני	כאחד	3-6247-04
טופספין	ברוקר		תוכנה לאיסוף ועיבוד נתוני NMR
טריפסין-EDTA (0.25%)	תרמו פישר סיינטיפיק	07086-74
שרף הניתן לריפוי UV	בונדיק	BD-SKCJ
אמבט מים	כאחד	1-5832-41	רובוט תרמי מסדרת TR-1 ואלפא; לשמירה על 37 מעלות; טמפרטורת C
וילמד צינור NMR עם מכסה בורג	סיגמא	Z271977	תדר 400 מגה-הרץ, קוטר 10 מ"מ, L 178 מ"מ.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of >10,000 times in liquid-state NMR. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (18), 10158-10163 (2003).
Comment, A., Merritt, M. E. Hyperpolarized magnetic resonance as a sensitive detector of metabolic function. Biochemistry. 53 (47), 7333-7357 (2014).
Balzan, R., et al. Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR. J Vis Exp. (108), e53548(2016).
Liu, M., Hilty, C. Metabolic measurements of nonpermeating compounds in live cells using hyperpolarized NMR. Anal Chem. 90 (2), 1217-1222 (2018).
Sannelli, F., Jensen, P. R., Meier, S. In-cell NMR approach for real-time exploration of pathway versatility: substrate mixtures in nonengineered yeast. Anal Chem. 95 (18), 7262-7270 (2023).
Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (43), 18131-18136 (2009).
Rao, Y., et al. Hyperpolarized [1-13C]pyruvate-to-[1-13C]lactate conversion is rate-limited by monocarboxylate transporter-1 in the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (36), 22378-22389 (2020).
Mathiassen, T. B. W., et al. Hyperpolarized 13C NMR for longitudinal in-cell metabolism using a mobile 3D cell culture system. J Magn Reson Open. 16 - 17 (100131), 100131(2023).
Meier, S., et al. Hyperpolarized 13C NMR reveals pathway regulation in Lactococcus lactis and metabolic similarities and differences across the tree of life. Molecules. 29 (17), 4133(2024).
Sriram, R., et al. Detection of bacteria-specific metabolism using hyperpolarized [2-13C]pyruvate. ACS Infect Dis. 4 (5), 797-805 (2018).
Park, J. M., et al. Hyperpolarized sodium [1-13C]-glycerate as a probe for assessing glycolysis in vivo. J Am Chem Soc. 139 (19), 6629-6634 (2017).
Singh, J., et al. Probing carbohydrate metabolism using hyperpolarized 13C-labeled molecules. NMR Biomed. 32 (10), e4018(2019).
Bohndiek, S. E., et al. Hyperpolarized [1-13C]-ascorbic and dehydroascorbic acid: vitamin C as a probe for imaging redox status in vivo. J Am Chem Soc. 133 (30), 11795-11801 (2011).
Yamamoto, K., et al. Real-time insight into in vivo redox status utilizing hyperpolarized [1-13C] N-acetyl cysteine. Sci Rep. 11 (1), 12155(2021).
Düwel, S., et al. Imaging of pH in vivo using hyperpolarized 13C-labelled zymonic acid. Nat Commun. 8 (1), 15126(2017).
Chen, J., Hackett, E. P., Singh, J., Kovács, Z., Park, J. M. Simultaneous assessment of intracellular and extracellular pH using hyperpolarized [1-13C]alanine ethyl ester. Anal Chem. 92 (17), 11681-11686 (2020).
Eills, J., et al. Spin hyperpolarization in modern magnetic resonance. Chem Rev. 123 (4), 1417-1551 (2023).
Keshari, K. R., et al. Hyperpolarized 13C spectroscopy and an NMR-compatible bioreactor system for the investigation of real-time cellular metabolism. Magn Reson Med. 63 (2), 322-329 (2010).
Sriram, R., et al. Real-time measurement of hyperpolarized lactate production and efflux as a biomarker of tumor aggressiveness in an MR compatible 3D cell culture bioreactor. NMR Biomed. 28 (9), 1141-1149 (2015).
Mangas-Florencio, L., et al. A DIY bioreactor for in situ metabolic tracking in 3D cell models via hyperpolarized 13C NMR spectroscopy. Anal Chem. 97 (3), 1594-1602 (2025).
Hill, D. K., et al. Model free approach to kinetic analysis of real-time hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy data. PLoS One. 8 (9), e71996(2013).
Saito, K., et al. 13C-MR spectroscopic imaging with hyperpolarized [1-13C]pyruvate detects early response to radiotherapy in SCC tumors and HT-29 tumors. Clin Cancer Res. 21 (22), 5073-5081 (2015).
Sengupta, D., Pratx, G. Imaging metabolic heterogeneity in cancer: from PET to hyperpolarized MRI. Mol Cancer. 15, 43(2016).
Read, G. H., et al. Three-dimensional alginate hydrogels for radiobiological and metabolic studies of cancer cells. Colloids Surf B Biointerfaces. 171, 197-204 (2018).
Meier, S., Jensen, P. R., Karlsson, M., Lerche, M. H. Hyperpolarized NMR probes for biological assays. Sensors. 14 (1), 1576-1597 (2014).
Kondo, Y., Nonaka, H., Takakusagi, Y., Sando, S. Design of nuclear magnetic resonance molecular probes for hyperpolarized bioimaging. Angew Chem Int. Ed. 60 (27), 14779-14799 (2021).
Milani, J., et al. A magnetic tunnel to shelter hyperpolarized fluids. Rev Sci Instrum. 86 (2), 024101(2015).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

זיהוי מטבולי בזמן אמת בתאים חיים באמצעות תמ"ג היפרפולרי ¹³C

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים