הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אורגנואידים ספציפיים למטופל שמקורם ב-iPSC לחקירת הפרעות קרנית הקשורות לאנירדיה

155 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68556

⸱

28 ביולי 2026

 ,  ,  ,  , 
1Izmir Biomedicine and Genome Center, 2Izmir International Biomedicine and Genome Institute, Dokuz Eylül University, 3Department of Medical Biology and Genetics, Faculty of Medicine, Dokuz Eylül University

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים של קרנית מ-iPSCs שמקורם בחולי אנרידיה, ויוצרים מודל ייעודי למטופל לחקר הפרעות בקרנית. אורגנואידים אלו מחקים תכונות מבניות ותפקודיות מרכזיות, ומספקים פלטפורמה אמינה לחקר מנגנוני מחלה, בדיקת טיפולים פוטנציאליים וקידום גישות רגנרטיביות מותאמות אישית למחלות עיניים קדמיות.

תקציר

אנירידיה היא הפרעה מולדת נדירה בעיניים המתאפיינת בהיעדר חלקי או מוחלט של הקשתית, ולעיתים קרובות היא קשורה לאטימות קרנית ולחוסר בתאי גזע לימבליים. המוטציות הגנטיות הבסיסיות, המשפיעות בעיקר על גן PAX6, משבשות הן את התפתחות והן את תפקוד הקרנית. המאפיינים העיניים השכיחים ביותר מלבד פגמים באיריס הם ניסטגמוס, היפופלזיה פובית, קטרקט, גלאוקומה וקרטופתיה הקשורה לאנרידיה (AAK). למרות שמודלים in vivo מציעים תובנות חשובות לגבי הפתולוגיה של אנירידיה, מודלים במבחנה שמקורם במטופל הם חיוניים לחקר מנגנוני מחלה ולהערכת טיפולים פוטנציאליים. במחקר זה אנו מציגים מודל AAK במבחנה המשתמש בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) שמקורם במטופל. הפרוטוקול שלנו כולל התמיינות הדרגתית של iPSCs לתאים אפיתל דמויי קרנית בתוך אורגנידים תלת-ממדיים מורכבים בעצמם, המדמים את המיקרו-סביבה הטבעית של הקרנית. באמצעות אופטימיזציה של תנאי תרביות התמיינות, הצלחנו לייצר אורגנואידים בקרניתיים המכילים אוכלוסיות תאי קרנית מובחנות, ומחזירים את התכונות המבניות והפונקציונליות המרכזיות של הקרנית האנושית.

מבוא

הקרנית היא רקמה שקופה ואוסקולרית היוצרת את השכבה החיצונית ביותר של העין, ומורכבת בעיקר משלוש שכבות: שכבה חיצונית אפיתלית, שכבה סטרומלית המכילה מטריצה חוץ-תאית עשירה בקולגן המאוכלסת בקרטוציטים, ושכבת תא אנדותל1. הקרנית ממלאת תפקיד חיוני בראייה על ידי הגנה על מבני עיניים פנימיים ושוברת אור.

אנירידיה היא הפרעה פנוקולרית מולדת נדירה הנגרמת בעיקר ממוטציות הטרוזיגוטיות בגן הקופסה הזוגית 6 (PAX6), רגולטור ראשי להתפתחות העין, ומאופיינת בהיעדר חלקי או מוחלט של הקשתית2. בנוסף להיפופלזיה של הקשתית או להיעדרות, רוב המטופלים מפתחים חריגות קרנית מתקדמת, המכונות יחד קרטופתיה קשורה לאנרידיה (AAK), הכוללת פגמים אפיתליים, תפקוד לקוי של תאי גזע לימבליים, שינויים סטרומליים ואטימות מתקדמת בקרנית, מה שמוביל בסופו של דבר לפגיעה בראייה. AAK משפיע על כ-78%–90% מחולי אנרידיה, עם חומרה הולכת וגוברת לאורך זמן3. מטרתנו להקים פרוטוקול מפורט וניתן לשחזור ליצירת אורגנואידים של קרנית מתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) שמקורם בחולי אנרידיה, כדי למודל שינויים קרניתיים רלוונטיים למחלה במבחנה. למרות שמודלים של בעלי חיים ומחקרים מחוץ לחיים סיפקו תובנות חשובות לגבי פתוגנזה של אנרידיה, הבדלים ספציפיים למין וגישה מוגבלת לרקמת המטופל מגבילים את הרלוונטיות התרגומית שלהם.

אורגנואידים שמקורם ב-iPSC אנושיים הפכו למערכות חוץ גופיות עוצמתיות למידול התפתחות ומחלות אנושיות 4,5. אורגנואידים של הקרנית, במיוחד, מאפשרים יצירת מבנים תלת-ממדיים דמויי רקמה הדומים יותר לארכיטקטורה טבעית של הקרנית, כולל ארגון אפיתל שכבתי, אינטראקציות סטרומליות-אפיתליות, והצטברות מטריצה חוץ-תאית, בהשוואה לתרביות חד-שכבתיות דו-ממדיות קונבנציונליות, שחסרות ארגון מרחבי, אינטראקציות פיזיולוגיות בין תא לתא ומורכבות מיקרוסביבתית 4,5. מספר אסטרטגיות התמיינות, כולל גישות מבוססות SEAM ושיטות מונעות על ידי אבות עיניים, דווחו כמייצרות רקמות דמויות קרנית מ-iPSCs6. גישות אלו כוללות בדרך כלל שלב ראשוני של השראת שושלת עינית, ואחריו הגדרת רקמה מתקדמת ובחירה מאוכלוסיות אבות עיניים הטרוגניות. יצירת אורגנואידים של קרנית מספקת הזדמנות לחקור סוגי תאים שונים הנמצאים ברקמת הקרנית 7,8. יתרה מזאת, אורגנואידים של קורנית שמקורם ב-iPSC של מטופלי אנרידיה מאפשרים חקר הרקע הגנטי של המחלה ומציעים הזדמנות ייחודית לחקור אנרידיה.

בפרוטוקול הנוכחי, גם קווי iPSC מסוג פראי וגם קווי iPSC שמקורם באנרידיה עוברים אסטרטגיית התמיינות זהה ורב-שלבית, הכוללת חשיפה רציפה להבחנה (DM), התמיינות רשתית (RDM) ומדיית התמיינות קרנית (CDM) לאורך תקופת תרבית ממושכת של שבועות. שלב ניסויי קריטי הוא המעבר מתרבות דבק לתנאי תלוי, שבמהלכם נשמרים אזורים נבחרים דמויי קרנית כדי לקדם ארגון עצמי אפיתלי.

בעוד שגישה זו תומכת ביצירת מבנים אפיתל דמויי קרנית המתאימים למידול מחלות השוואתי, היא אינה משחזרת במלואה תכונות מורכבות ב-vivo כגון עצבוב עצבי או ארגון נישה לימבית מלא, שיש לקחת בחשבון בעת הערכת יישום השיטה.

בהקשר זה, אנו מתארים פרוטוקול סטנדרטי ליצירת אורגנואידים של קרנית מ-iPSCs שמקורם במטופלים הנושאים מוטציות PAX6 הקשורות לאנרידיה. חשוב לציין שאסטרטגיית ההבחנה עצמה אינה משתנה בין קווים מסוג פרא לקווים שמקורם באנרידיה; במקום זאת, פנוטיפים ספציפיים למחלה נובעים מרקע גנטי ספציפי למטופל במסגרת ניסויים אחידה אחרת.

בסך הכל, שיטה זו מספקת פלטפורמה איתנה וניתנת לשחזור לחקר התפתחות הקרנית ומנגנוני מחלות הקשורות לאנרידיה, ועשויה לשמש בסיס למחקרים מכניים ותרגומיים עתידיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות ועדת האתיקה. המחקר נרשם במאגר רישום תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCreg), והאישורים האתיים תועדו תחת משרד המחקר והחדשנות (MESRI; IE-2018-967)9. ה-iPSC מסומנים בקודים AAKIPSi001-A (AAK1), AAKIPSi002-A (AAK2), AAKIPSi003-A (AAK3) ו-WT (מתורמי בריאות). בנוסף, ועדת האתיקה באוניברסיטת חצטפה אישרה את השימוש במחקר זה, כפי שמצוין במספר ההפניה 16969557-1213. קווי התאים האנושיים ששימשו במחקר זה דרשו אישור רגולטורי לאומי בזמן הרכישה. האישור ניתן במסגרת קונסורציום שבה אחד המחברים היה מעורב. למרות שכתב היד הנוכחי אינו קשור ישירות לפרויקט הקונסורציום הזה, החומרים הביולוגיים בהם השתמשו הושגו ואושרו במסגרת אתית זו. לכן, האישור מהאוניברסיטה צוין כראוי כדי להבטיח שקיפות רגולטורית מלאה. כל הפרטים הקשורים לחומרים, תגובות וציוד המשמשים בפרוטוקול זה מופיעים בטבלת החומרים. כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בתוך ארון זרימה למינרי (BSL-2) לשמירה על סביבה סטרילית. מערכת זו מבטיחה שכל החומרים והציוד המשמשים במחקר יעברו עיקור מספק, ובכך מפחית את הסיכון לזיהום ומבטיח את שלמות תוצאות הניסוי.

1. יצירת אורגנואידים של קרנית שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים (hiPSC) על ידי אדם

  1. תחזוקה ותרבות ראשונית של תאי גזע פלוריפוטנטיים שמקורם בחולה אנירידיה (AAK1, AAK2, AAK3)10 תחת מדיה מותנית ללא האכלה (איור 1)
    1. הכינו את הדברים הבאים מראש: ציפוי באר אחת בלוח עם 6 בארות ב-1 מ"ל של תמיסת מטריצה חוץ-תאית (ECM) קרה בריכוז 0.1 mg/mL. הליך הציפוי הזה חייב להתבצע על קרח, לא כדי להצקות את ה-ECM, ויש לאפשר לו לדגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך מינימום של 30 דקות, בהתאם להוראות היצרן כדי להבטיח הכנה נכונה למצע.
    2. הפשיר אליקוט שמורת קריופ של 1 x 106 hiPSC (WT, AAK1, AAK2, AAK3). אל תפשיר את התאים הקפואים במלואם; במקום זאת, אפשר לתליית התא המוקפא בקריוביאל להפשיר עד שכמחצית הנפח נשארת קפואה.
    3. העבר מיד את ההוספנסיה החלקית המופשרת ל-1 מ"ל של מדיום תחזוקה מלא בטמפרטורת החדר (RT) המכיל מעכב ROCK (קינאז חלבון קשור Rho) ל-10 מיקרומול, מוקצה מראש בצינור של 15 מ"ל. אל תשתמש בפיפטה במהלך ההעברה.
    4. צנטריפוגה בעוצמה של 300 x g למשך 5 דקות וזרוק את הסופרנטנט.
    5. לאחר מכן תלו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מדיום תחזוקה מלא המכיל מעכב ROCK של 10 מיקרומון.
    6. קבעו את צפיפות התאים עם הדרת כחול טריפן. ספירת תאים באמצעות המוציטומטר לאחר צביעת היתכנות בכחול טרייפן. בקצרה, מערבבים 20 מיקרוליטר של מתלה תא 1:1 עם 20 מיקרוליטר של 0.4% כחול טרייפן, ואחר כך מוסיפים 60 מיקרוליטר PBS, מה שמוביל לדילול סופי של 1:5 של מתלה התא המקורי. מתערובת זו, טעינו 10 מיקרו-ליטר לתא ההמוציטומטר. לספור תאים ברי קיימא (כחול-שלילי טרייפן) בארבעה ריבועים גדולים. מחשב את מספר התאים הממוצע בריבוע והכפל ב-5 (מקדם דילול תלול תאי התא) ו-10,000 כדי לקבוע את ריכוז התאים הסופי (תאים/מ"ל).
      תאים/מ"ל = (ממוצע מספר תאים לריבוע) x 5 x 104
    7. זרעו את התאים על באר ECM מצופה מראש בלוח של 6 בארות, כדי להבטיח צפיפות תאים של 2 × 104 תאים/סנטימטר 2 לכל באר.
    8. התבוננו במורפולוגיה ובחיבור התא באמצעות מיקרוסקופיית פאזה-ניגודיות בהגדלה של פי 10. לאחר מכן, דגרו את לוחות 6 הבארות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ כדי להבטיח תנאי גדילה מיטביים.
      הערה: יש להשתמש במעכב סלעים רק במהלך הלילה בעת מעבר או הפשרת התאים. במהלך החלפות מדיום יומיות, הוסיפו את המדיום בעדינות לאורך קיר הבאר. הימנעו מחימום מדיום תחזוקה מלאה באמבט מים; במקום זאת, איזון את המדיום בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפני השימוש.
  2. שלב ההבחנה הספונטנית (יום 0 – 2)
    1. הכינו את מדיום ההבדלה (DM) על ידי ערבוב הבאים: 8% KnockOut Serum Replacement (KSR), 1x חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 1x גלוטמקס, 1x פניצילין-סטרפטומיצין, ותערובת Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham F-12 (DMEM/F-12) של Dulbecco.
    2. כאשר תרביות hiPSC מגיעות לכ-70%–80% מפגש ליצירת התמיינות ספונטנית8, יש לשאוב בעדינות ולזרוק לחלוטין את המדיום, ואז להחליף אותו מדי יום ב-1 מ"ל DM טרי בכל באר עד ליום השלישי, אז מתחיל שלב ההתמיינות הרשתית לפי לוח זמנים ניסיוני.
  3. שלב התמיינות רשתית (יום 3 – 47)
    הערה: מדיום התמיינות רשתית משמש לתקופות ממושכות כדי לאפשר היווצרות אוכלוסיות אבות עיניים הטרוגניות.
    1. הכינו את מדיום ההתמיינות הרשתית (RDM) על ידי ערבוב הבאים: 8% KSR, 1 x NEAA, 1 גרוטמקס, 2% B27, 1 פניצילין-סטרפטומיצין ו-DMEM/F-12.
    2. לאחר יומיים של הבחנה ספונטנית, רעננו את מדיום התרביות מדי יום על ידי שאיפה זהירה של מדיום ה-DM והחלפתו ב-1 מ"ל מדיום RDM טרי לכל באר. המשך את זה בסך הכל 30 יום.
      הערה: צפויה עלייה משמעותית בצפיפות התאים במהלך תקופה של 30 יום זו. חשוב לבצע תצפיות מיקרוסקופיות על צפיפות התאים באזורים שונים בכל באר. כדי למנוע הרמת תאים, יש להימנע משטיפה ולהיזהר במהלך החלפת המדיום. הוסיפו את המדיה דרך קיר הבאר. איזון את המדיום ב-RT למשך 15 דקות לפני השימוש.
    3. ביום ה-32, התאים מגיעים למצב מפגש נראה ויוצרים מצברים רב-שכבתיים של 2.5D. בשלב זה, יש להתחיל את המעבר לתרבות תלייה על ידי גירוד עדין של כל הבאר באמצעות קצה פיפטה בנפח 1000 מיקרוליטר. במהלך תהליך זה, יש לפצל את שכבת התא לקבוצות קטנות.
      הערה: למרות שכל התאים משתחררים מפני השטח של התרבית, אגרגטים רב-שכבתיים של 2.5D נאספים באופן מועדף ומועברים לתרבות תלויה (איור משלים 1), שכן ההעשרתם מקדמת הרכבה עצמית מהירה יותר ויצירת אורגנידים גדולים יותר בהשוואה לתאים בודדים או קטעי חד-שכבתיות.
    4. מיד לאחר הגירוד, אספו את אשכולות התאים המתקבלים והעבירו אותם ללוחות תרבית 6 בארות עם חיבור נמוך המכילות RDM כדי לקבוע תנאי תרבית תלוי.
    5. שמרו על תאים בתרבות תלייה למשך 15 ימים נוספים, עם החלפת מדיום יומית באמצעות 2 מ"ל RDM טרי לכל באר. במהלך היומיים הראשונים של תרבית ההשעיה, הימנעו משינוי בינוניים כדי למנוע אובדן אשכולות תאים קטנים. במהלך תרבית התלייה, התאים מתארגנים בהדרגה ויוצרים מבנים תלת-ממדיים, שקופים, דמויי קרנית, המנוטרים באופן קבוע באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה בהגדלה של פי 4 ו-10.
  4. שלב התמיינות הקרנית (יום 48 – 90)
    1. הכינו את מדיום ההתמיינות הקרנית (CDM) על ידי ערבוב החומרים הבאים: 8% KOSR, 1x NEAA, 1x גלוטמקס, 1x N2-MAX, 1x אינסולין-טרנספרין-סלניום, 5 ng/mL FGF2, 10 ng/mL EGF, ו-DMEM/F-12.
    2. לאחר 15 הימים הראשונים (מיום 32 עד יום 47) של תרבית מתלים בלוחות חיבור נמוכים (37 °C, 5% CO₂), החליפו את RDM ב-CDM תוך שמירה על האגרגטים בתנאי מתלים ביום 47. רענן CDM כל יומיים עם 2 מ"ל לכל באר, כדי להבטיח שאורגנידים תמיד שקועים לחלוטין במדיום התרבות. במהלך תקופה זו, מבנים פרימורדיאליים שקופים ודמויי בועה של קרנית (CP) מתפתחים בהדרגה.
    3. המשך תרבית השעיה ב-CDM עד היום ה-90, מה שמאפשר הבשלה נוספת והפרדה מרחבית של אזורי CP שקופים ממחלקות רקמה אטומות יותר.
    4. ביום ה-90, יש להפריד באופן מכני אזורים שקופים של CP לתאי רקמה אטומים יותר באמצעות מלקחיים ופינצטה מעוקרים כאשר מתוכננים ניתוחים ספציפיים ל-CP במורד הזרם.
      הערה: בידוד מכני של אזורי CP מתבצע כאשר ניתוחים דורשים במיוחד מבנים מועשרים ב-CP. אם מעניינים תאים רקמתיים אחרים או ארכיטקטורה אורגנואידית כללית, ניתן לשמר אורגנואידים שלמים כדי לשמור על הטרוגניות מבנית.
    5. המשך את תרבית ההשעיה ב-CDM עבור מבני CP מבודדים או אורגנואידים שלמים, בהתאם למטרה הניסויית.

2. אפיון אורגנואידים של קרנית

  1. הערכה מורפולוגית ומבנית של אורגנואידים
    1. יש לעקוב באופן קבוע אחרי אורגנואידים של קרנית באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד בהגדלה של פי 4 ו-10. העריכו גודל, שקיפות ומורפולוגיה כוללת בנקודות זמן מוגדרות ותיעדו שינויים מבניים באמצעות רכישת תמונה.
  2. אפיון מבוסס אימונופלואורסצנציה
    1. קיבוע אורגנואיד בקרנית
      1. הכינו תמיסות של 4% PFA ו-30% סוכרוז לפני הקיבע. קח את אורגנואיד הקרנית מהתרבות עם כף אוטוקלב. העבר את האורגנואיד ל-4% PFA בצינור של 1.5 מ"ל ודגר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
      2. לאחר הדגירה, יש להשליך בזהירות את ה-PFA מהצינור מבלי לפגוע באורגנואיד הקרנית. הוסיפו 1 מ״ל של תמיסת סוכרוז 30% לצינור ומניחים אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, יש להכין ולסמן צינורות של 5 מ"ל וחנקן נוזלי לקיבוע OCT.
      3. זרקו בזהירות את תמיסת הסוקרוז מהשפופרת. העבר את האורגנואיד למכף הסטרילית. עם פיפטה של 20 מיקרוליטר, הסר בזהירות את תמיסת הסוכרוז העודפת מהאורגנואיד.
      4. שפוך OCT לתוך פקק הצינור של 5 מ"ל, והכנס את האורגנואיד לתוך ה-OCT. השתמש בכף סטרילי נוסף כדי להעביר את האורגנואיד למכסה המכיל OCT.
      5. הוסיפו OCT כדי לכסות את פני השטח של אורגנואיד הקרנית. לפוצץ את הבלונים ב-OCT עם מחט כדי לקבל חלקים נקיים של האורגנואיד.
      6. סגור את המכסה של צינורות ה-5 מ"ל והשתמש בפינצטה כדי לטבול בחנקן הנוזלי. אחסן את הדגימות ב-20- מעלות צלזיוס עד לחתיכה.
      7. חתך אותם בעובי 5 מיקרון באמצעות קריוסטט וגם אחסן אותם בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד לצביעה. שמור על עובי חתך אחיד וכיוון רקמה כדי להבטיח צביעה שניתנת לשחזור.
    2. צביעת IF
      1. להכנת חלקי אורגנואיד בקרנית לצביעת IF, שטפו את הסליידים 3 פעמים עם PBS-T (0.3% Triton X-100) ב-RT למשך 10 דקות.
      2. נקה את השקופית עם נייר טישו וצור מסגרת עם עט PAP. הוסיפו כמות מתאימה של תמיסת חסימה שתכסה לחלוטין את חתך הרקמה (בדרך כלל 100–200 מיקרוליטר לכל שקופה, תלוי בגבול עט ה-PAP) ודגרו אותה ב-RT למשך שעה.
      3. שאפו את פתרון החסימה וצרו מסגרת עם עט ה-PAP. הוסף את 150 מיקרוליטר של תמיסות ראשוניות של Ab (PAX6, p63, OCT3/4, NANOG, Na+/K+-ATPase, AQP1, CK3, CK5, CK14, CK19, N-cad, KERA, COLIV, שיעורי הדילול מפורטים בטבלת החומרים) על הסקופית ודגרו אותם ב-RT למשך שעה.
      4. שטוף פעמיים עם PBS-T (0.3% Triton X-100) ב-RT למשך 10 דקות. תכין את הגבול שוב עם עט PAP.
      5. הוסף את 150 מיקרול תמיסת Ab משנית (Anti Rabbit-488, Anti Mouse-594, שיעורי הדילול מופיעים בטבלת החומרים) אל הסלייד ודגר אותו ב-RT בתנאי חשוך למשך 2 שעות. שטוף פעמיים עם PBS-T (0.3% טריטון-X) ב-RT למשך 10 דקות. נקה את השקופיות והתקן עם פתרון DAPI.
      6. עבור iPSCs לא מובחנים, יש לבצע חסימה וחדירות לאחר הקיבוע ולהמשיך בצביעה באמצעות אותו פרוטוקול. הצג דגימות מוצבעות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או קונפוקלי בהגדלה של פי 4 ו-10x.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

גבעול תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים על ידי אדם (hiPSCs)

כדי להעריך את העומק של iPSCs אנושיים ששימשו בניסויים, ביצענו הדמיה בשדה בהיר, צביעת חיסון וניתוח qRT-PCR. הערכנו את הביטוי של סמנים מרכזיים של פלוריפוטנטיות, כולל OCT3/4, SOX2 ו-NANOG, שהם גורמי שעתוק מרכזיים הנדרשים לשימור פלוריפוטנטיות והתחדשות עצמית בתאי גזע פלוריפוטנטייםאנושיים 11.

הדמיית ברייטפילד חשפה מורפולוגיה טיפוסית של ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ניתוח השוואתי בין אורגנואידים בביקורת לאלו שמקורם בחולי אנירידיה מגלה פגמים בשכבות אפיתליות, בהשקעה לא תקינה במטריצות חוץ-תאיות ובביטוי לא מפוזר של גן PAX6 9.

קצב הגדילה של iPSCs שמקורו בדגימות שונות של מטופלי אנרידיה, במיוחד קווי AAK1, AAK2 ו-AAK3, מציג שונות, המשקפת את המגוון הגנטי הבסיסי, הנגרם בעיקר ממוטציות בגן PAX6 , שיכולות להוביל להבדלים ביעילות התכנות מחדש התאית ובהתנהגות תאי הגזע, עבור תכונות תאיות ייחודיות ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים לא חשפו.

תודות

מחקר זה ממומן על ידי TÜBİTAK 121N276 והתכנית המשותפת האירופית למחלות נדירות, ונתמך חלקית על ידי האיחוד האירופי (תוכנית כיסא ERA של Horizon 2020, מענק פרויקט RareBoost מס' 952346). A.C.K. נתמכת על ידי מלגת YÖK 100/2000 PhD ומלגות TÜBİTAK-BİDEB 2211A.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10 mL serological pipettesזא ביאוטקנוLabselect SP-003-10
15 mL Conical Tubes Labselect CT-002-15A
2 mL serological pipettesLabselect Labselect SP-003-2
5 mL serological pipettesCleanteksBiofil GSP010005
50 mL Conical TubesGolden Gate CT-002-50
50 mL serological pipettesBIOFILLGSP020050
Anti Mouse 594Jackson Immuno715-585-150טווח דילול: 1:100 - 1:800
Anti Rabbit 488 Jackson Immuno711-545-152טווח דילול: 1:100 - 1:800
Autoclave VAPOUR-Line liteVWR chemicalsVAPOUR-Lineeco 25
B27 SupplementGIBCO12587010עם ויטמין A
Benchtop CentrifugeEppendorf5702
Benchtop microscope DMI1OlympusCKX41
Biological Safety Cabinets Class IIThermoSafe 2020
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA8806
CellBanker 1Worthington IndustriesLABS-20K
Coverslips 24 mm x 50 mmISOLAB280
Cryomatrix, OCTFisher Healthcare30226281
CryovialBioSigmaN403522
DAPINEOFROXX 1322
DAPINEOFROXX 15390.5 ug/mL
DMEM/F12 MediaGIBCO 31330-038
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS)Gibco141901441X
EGFGIBCOPHG0311
Ethanol 100%Sigma64-17-5
Ethanol 70%Sigma64-17-5תמציות אתנול
Extracellular Matrix (ECM)Corning354277LDEV-free
FGF2GIBCOPHG0024
GlutaMaxGIBCO35050061
GoTaq Master MixPromegaM7123
IncubatorMemmert INCO 153 med44043
Insulin-Selenium-TransferrinGIBCO41400045
KnockOut Serum (KOSR)GIBCO10828028
Microtome RM2235LeicaRM2235
Mounting mediumabcamab104135
mTSER MediaSTEMCELL85850
Mutiwell Culture Plates (6-well)CORNING   3516
N2 SupplementR&DAR003
Non-essential amino acids (NEAA)LONZABE13-114E
P20, P200 and P1000 pipettesGilsonF167350
ParaffinVWR chemicals10048502
Paraformaldehyde Sigma-AldrichF8775
Primer Antibody Aquaporin mAbabcamab9566טווח דילול: 1:50-1:200
Primer Antibody CK14Santa Cruz Biotechnology sc-53253טווח דילול: 1:50-1:500
Primer Antibody CK19ProteinTech14965-1-APטווח דילול: 1:150-1:600
Primer Antibody CK3NOVUSNBP2-91997 0.1 MLטווח דילול: 1:50-1:200
Primer Antibody CK5Thermo MA517057טווח דילול: 1:200-1:1000
Primer Antibody Collagen Type IVabcamab6586טווח דילול: 1:100-1:500
Primer Antibody KeratocanBiossbs-11054Rטווח דילול: 1:50-1:200
Primer Antibody Na/K - ATPaseSanta Cruz Biotechnologysc-21712טווח דילול: 1:50-1:500
Primer Antibody N-Cadherinabcamab76011טווח דילול: 1:50-1:500
Primer Antibody p63SANTACRUZ   sc-25268טווח דילול: 1:50-1:500
Primer Antibody Pax6NovusNBP2-44576טווח דילול: 1:50-1:200
RNA isolation kitMacherey–Nagel 740984.50
Rock Inihibitor (Y-27632)TOCRIS1254
SlidesStarFrostMBB-0302-55Aדבק, קרקע
Stainless steel forceps no:5Sigma F6521-1EA
Stainless Stell Scalpel Sterile N 21Swann-Morton1033060
The OneScript Plus cDNA Synthesis Kit Applied Biological MaterialsG236
Triton-X100NEOFROXX 8500
TRIzol reagentThermo15596026
Trypan blueGIBCO15250061
Ultra low attachment (ULA) 6-well  plate Corning3471
Water bathNüveNb9

מקורות

  1. Hassell, J. R., Birk, D. E. The molecular basis of corneal transparency. Exp Eye Res. 91 (3), 326-335 (2010).
  2. Daruich, A., et al. Congenital aniridia beyond black eyes: From phenotype and novel genetic mechanisms to innovative therapeutic approaches. Prog Retin Eye Res. 95, 101133(2023).
  3. Eden, U., Riise, R., Tornqvist, K. Corneal involvement in congenital aniridia. Cornea. 29 (10), 1096-1102 (2010).
  4. Huch, M., Koo, B. K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).
  5. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  6. Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  7. Foster, J. W., et al. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 7, 41286(2017).
  8. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
  9. Koc, A. C., et al. Patient-derived cornea organoid model to study metabolomic characterization of rare disease: aniridia-associated keratopathy. BMC Ophthalmol. 25 (1), 14(2025).
  10. Ilmarinen, T., et al. Production and Limbal Lineage Commitment of Aniridia Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells. 41 (12), 1133-1141 (2023).
  11. Chambers, I., et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).
  12. Okur, F. V., Cevher, I., Ozdemir, C., Kocaefe, C., Cetinkaya, D. U. Osteopetrotic induced pluripotent stem cells derived from patients with different disease-associated mutations by non-integrating reprogramming methods. Stem Cell Res Ther. 10 (1), 211(2019).
  13. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  14. Lima Cunha, D., Arno, G., Corton, M., Moosajee, M. The Spectrum of PAX6 Mutations and Genotype-Phenotype Correlations in the Eye. Genes (Basel). 10 (12), 1050(2019).
  15. Hayashi, R., et al. Co-ordinated ocular development from human iPS cells and recovery of corneal function. Nature. 531 (7594), 376-380 (2016).
  16. Gonzalez, G., Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. Limbal stem cells: identity, developmental origin, and therapeutic potential. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 7 (2), (2018).
  17. Ji, H. P., et al. MicroRNA-28 potentially regulates the photoreceptor lineage commitment of Muller glia-derived progenitors. Sci Rep. 7 (1), 11374(2017).
  18. Hatou, S., et al. Role of insulin in regulation of Na+-/K+-dependent ATPase activity and pump function in corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (8), 3935-3942 (2010).
  19. Higa, K., et al. Aquaporin 1-positive stromal niche-like cells directly interact with N-cadherin-positive clusters in the basal limbal epithelium. Stem Cell Res. 10 (2), 147-155 (2013).
  20. Chen, Q., et al. Stromal fibroblasts derived from mammary gland of bovine with mastitis display inflammation-specific changes. Sci Rep. 6, 27462(2016).
  21. Soiberman, U., Foster, J. W., Jun, A. S., Chakravarti, S. Pathophysiology of Keratoconus: What Do We Know Today. Open Ophthalmol J. 11, 252-261 (2017).
  22. Lima Cunha, D., et al. Restoration of functional PAX6 in aniridia patient iPSC-derived ocular tissue models using repurposed nonsense suppression drugs. Mol Ther Nucleic Acids. 33, 240-253 (2023).
  23. Harding, P., et al. Variant-specific disruption to notch signalling in PAX6 microphthalmia and aniridia patient-derived hiPSC optic cup-like organoids. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871 (6), 167869(2025).
  24. Cunha, D. L., Smits, J., Zhou, H. Q., Moosajee, M. Transcriptomic analysis of aniridia iPSC-derived limbal epithelial stem cells reveals early changes linked to the limbal niche. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2821(2023).
  25. Harding, P., et al. Generation of human iPSC line (UCLi013-A) from a patient with microphthalmia and aniridia, carrying a heterozygous missense mutation c.372C>A p.(Asn124Lys) in. Stem Cell Res. 51, (2021).
  26. Theerakittayakorn, K., et al. Differentiation Induction of Human Stem Cells for Corneal Epithelial Regeneration. Int J Mol Sci. 21 (21), (2020).
  27. Bar-Nur, O., et al. Small molecules facilitate rapid and synchronous iPSC generation. Nat Methods. 11 (11), 1170-1176 (2014).
  28. Maiti, G., et al. Single cell RNA-seq of human cornea organoids identifies cell fates of a developing immature cornea. PNAS Nexus. 1 (5), pgac246(2022).
  29. Dorot, O., et al. The antipsychotropic drug Duloxetine rescues PAX6 haploinsufficiency of mutant limbal stem cells through inhibition of the MEK/ERK signaling pathway. Ocul Surf. 23, 140-142 (2022).
  30. van Velthoven, A. J. H., et al. Future directions in managing aniridia-associated keratopathy. Surv Ophthalmol. 68 (5), 940-956 (2023).
  31. Kocak, G., et al. Generation of Anterior Segment of the Eye Cells from hiPSCs in Microfluidic Platforms. Adv Biol (Weinh). 8 (5), e2400018(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

233233JoVE

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.