מאמר שיטה

ניתוח העשרה של ויטמין A ב-13מעלות צלזיוס בדגימות ביולוגיות על ידי ספקטרומטריית מסה של יחס כרומטוגרפיה-בעירה-איזוטופ

491 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68571

⸱

14 בנובמבר 2025

 ,  ,  , 
1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר ניתוח של דגימות סרום, חלב אם וכבד להעשרת C של 13אסטרי רטינול ורטיניל ליישומי מעקב. כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים משמשת לטיהור וכימות ריכוזי רטינול, וספקטרומטריית מסה של יחס כרומטוגרפיה-בעירה-איזוטופ של גז (GC-C-IRMS) משמשת לניתוח התמציות המטוהרות.

תקציר

ויטמין A חיוני לבריאות, אבל הערכת מצב ויטמין A היא מאתגרת. זרימת ויטמין A בדם מבוקרת באופן הומאוסטטי ולעתים קרובות אינה משקפת מחסור או עודף של ויטמין A. השימוש ב-13ויטמין C A מאפשר לעקוב ולכמת את סך מאגרי ויטמין A בגוף ומידע נוסף על פרמקוקינטיקה וחילוף חומרים. פרוטוקול זה מתאר מיצוי, טיהור וקביעה של 13העשרה איזוטופית C של ויטמין A בדגימות סרום, חלב אם ורקמות באמצעות ספקטרומטריית מסה של יחס כרומטוגרפיה-בעירה-איזוטופ של גז (GC-C-IRMS). ניתוח באמצעות GC-C-IRMS מספק ערכי העשרה רגישים ומדויקים, במיוחד עבור דגימות עם העשרה של 13מעלות צלזיוס קרוב לרמות השפע הטבעיות. זה מאפשר גמישות בעיצובי המחקר לשימוש במינונים קטנים יותר של מעקב ודגימה פרמקוקינטית ארוכת טווח. בקצרה, לסרום של 0.4 עד 1 מ"ל, מוסיפים אתנול כדי לזרז חלבונים, C-23 β-אפו-קרוטנול מתווסף כסטנדרט פנימי, והקסאן משמש למיצוי רטינואידים. לאחר מכן התמצית מושעה מחדש במתנול ומטוהרת באמצעות HPLC. לאחר מכן מושעה מקטע הרטינול בהקסאן ומוזרק למערכת GC-C-IRMS. % האטום (At%) מחושב ישירות בהתייחס לפחמן דו חמצני, אשר מכויל כנגד תקן סוכרוז באמצעות מנתח יסודות. סוגי רקמות אחרים שנותחו על ידי GC-C-IRMS כוללים חלב אם וכבד לאחר סבוניפיקציה. ניתן להשתמש בטכניקות מיצוי פאזה מוצקה כדי לסייע בטיהור מטריצות מורכבות אלה או אחרות. יתר על כן, ניתן לחבר מנתח יסודות ל-IRMS כדי לנתח דגימות מזון לתכולת 13C בסך הכל.

מבוא

ויטמין A (VA) הוא מיקרו-נוטריינט חיוני הנדרש לראייה, לתפקוד מערכת החיסון, להתמיינות התאים ולוויסות חילוף החומרים. אופטימיזציה של סטטוס VA נותרה אתגר בריאותי עולמי, שכן מחסור או עודף עלולים לפגוע בתוצאות הבריאותיות. הערכה מדויקת של מצב VA היא קריטית למחקרים קליניים או אוכלוסייה המנחים התערבויות מתאימות. עם זאת, ריכוז הרטינול בסרום לבדו הוא סמן ביולוגי וכלי אבחון גרוע מכיוון שהוא מווסת באופן הומאוסטטי על פני מגוון רחב של מאגרי גוף כוללים (TBS) ומושפע מדלקת ומחסורים תזונתיים אחרים 1,2.

עוקבים מסומנים איזוטופית שינו באופן דרמטי את מחקר ה-VA על ידי מתן אפשרות להערכה כמותית של TBS באמצעות מבחן דילול איזוטופ רטינול (RID) 3,4,5. עבור RID, ניתן עוקב VA מועשר ב-13C או 2H, מתאזן עם מאגרי הגוף, ויחס הרטינול (TTR) בסרום (או פלזמה) נמדד באמצעות MS. משוואת דילול איזוטופים מיושמת עם הנחות ספציפיות הקשורות למטבוליזם של VA לחישוב TBS 5,6.

ניתן להשתמש בשילובים רבים של כרומטוגרפיה וטרשת נפוצה כדי לקבוע את הרטינול TTR בסרום (למשל, GC-MS, LC-MS, LC-MS/MS). דיוק אנליטי הוא קריטי להערכות RID מדויקות מכיוון ש-TBS הם ביחס הפוך ל-TTR. LC-MS/MS מתאים היטב עבור יישומים בעלי תפוקה גבוהה בעת שימוש בעוקבים עם תוויות כבדות ובמינוני עוקבים גבוהים יחסית. שיטות LC-MS/MS טיפוסיות מדווחות על סטיות תקן יחסיות של רטינול (RSDs) של 3-6% עבור בדיקה פנימית ו-<8% עבור בדיקה בין-מבחנית7, אך ישנם נתונים מוגבלים על הדיוק והדיוק של TTRs. לעומת זאת, ספקטרומטריית מסה של יחס כרומטוגרפיה-בעירה-איזוטופ של גז (GCCIRMS) מציעה דיוק יוצא דופן להעשרת 13C-retinol, עם RSDs טיפוסיים של 13C/12C שפע איזוטופים של ~0.02-0.05 8,9. זה מאפשר קביעה מדויקת של ריכוזי העוקבים בדגימות שבהן ההעשרה נמוכה. השימוש ב- IRMS עבור יישומי RID מאפשר אות אנליטי הולם תוך שימוש בפחות מסת עוקב ופחות אטומים מסומנים בעוקב, שניהם חוסכים עלויות הקשורות למינוני העוקב.

כתב יד זה מתאר ניתוח של 13C-רטינול מדם, חלב אם ורקמות באמצעות GC-C-IRMS. בהתאם לדגימה הביולוגית הנבדקת, ניתוח של 13רטינול עם תווית C באמצעות GC-C-IRMS מתחיל באחת מכמה שיטות מיצוי פוטנציאליות לבידוד התרכובות הלא קוטביות הכוללות את הרטינול המסומן. עבור דגימות סרום, זה כרוך במיצוי נוזלי-נוזלי על ידי הוספת אתנול והקסאן ואיסוף שבר ההקסאן. אם בודקים חלב אם, הדגימות עוברות תחילה סבון עם אשלגן הידרוקסיד, ולאחר מכן מיצוי נוזלי-נוזלי דומה לסרום. דגימות חלב אם אלו מטוהרות גם באמצעות מחסניות מיצוי פאזה מוצקה כדי להפחית את כמות השומנים האחרים שנותרו. אם מפיקים מרקמה (למשל, כבד), הדגימה נטחנת בנתרן גופרתי נטול מים כדי להסיר מים, מופקת עם מתילן כלוריד ומסוננת לבקבוק נפחי או תחתון עגול לאידוי סיבובי. אליקוט מיובש, מושעה מחדש באתנול, מסובן, ומופק באותה שיטה כמו חלב אם. תמיסות לא קוטביות אלה מכל דגימה מיובשות תחת חנקן ומשוחזרות במתנול לטיהור וכימות בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC).

הרגישות של IRMS מאפשרת קביעת העשרה בדגימות עם העשרת דגימה נמוכה, כגון דגימות פרמקוקינטיות ליישומי מודלים מתמטיים ארוכי טווח או דגימות רקמה חוץ-כבדיות למעקב מדויק אחר חילוף החומרים של VA. בדיקת RID זוגית במינון יחיד הוצעה כדי להעריך את מצב ה-VA לפני ואחרי התערבות כדי לקבוע יעילות בנבדקים תיאורטיים10, שיכולה להיות גישה מבטיחה אם תאושר בבני אדם. IRMS מסוגל לזהות עוקבי VA ליד ערכי העשרה טבעיים, מה שיאפשר חלונות מעקב ארוכים וגמישות בפרוטוקולי הדגימה.

חלב אם הוכח כגישת דגימה חלופית פחות פולשנית להערכת מצב VA1. רטינול חלב אם יכול לשמש כמקור דגימה לבדיקת RID, והראה מתאם חזק עם ערכי RID שמקורם בסרום בנשים בזמביה עם מאגרי VA נמוכים11. עבור רקמות ודגימות חלב אם, טכניקות מיצוי שלב מוצק יכולות לסייע בטיהור דגימות אלו במטריצות מורכבות. IRMS שימש גם להבחנה בין מקורות מזון של VA ולקביעת תרומות תזונתיות יחסיות באמצעות שינויים בשפע הטבעי של 13מעלות צלזיוס של רטינול בסרום 9,12,13. ניתן להשתמש במנתח יסודות גם עם IRMS כדי לנתח דגימות מזון עבור תכולת C כוללת של 13C ולהשוות אותה להעשרת VA.

כאשר משתמשים בתוויות של 13C, חשוב להבין את העשרת הרטינול הבסיסית של 13C, בשל המתרחש באופן טבעי 13C (~1.1% מסך הפחמן), שיכול להשתנות בהתאם למקורות ה-VA הנצרכים על ידי אנשים ואוכלוסיות כאחד. לכן, לקבלת הדיוק הטוב ביותר ברמה האישית, מומלצת דגימת דם בסיסית. עבור הערכות אוכלוסייה, ניתן ליצור אומדן מבוסס אוכלוסייה באמצעות תת-קבוצה שנבחרה באופן אקראי או פרטים נפרדים מאותה קבוצת אוכלוסייה14.

פרוטוקול

1. מיצוי רטינול מדגימות ביולוגיות

הערה: כל הליכי הטיפול והחילוץ של הדגימה מתבצעים תחת אור צהוב או מסונן UV כדי למזער את ההשפלה.

  1. מיצוי מסרום
    1. פיפטה של 1 מ"ל של סרום (או כמה שזמין) לתוך מבחנה מזכוכית בגודל 13 x 100 מ"מ (או גודל דומה). רשום את נפח הסרום שבו נעשה שימוש.
      הערה: מומלץ להשתמש בפיפטה עם תזוזה חיובית.
    2. הוסף פי 1.5 מהנפח של אתנול 200 הוכחה.
    3. הוסף 25 מיקרוליטר מהתקן הפנימי, כגון C-23 β-apo-carotenol (מסונתז מרשתית all-trans, abs = 0.9)9. מכסים את הדגימה ומערבבים לפי מערבולת למשך 15 שניות.
    4. מוסיפים 1 מ"ל הקסאן, מערבבים במערבולת למשך 15 שניות, וצנטריפוגה למשך 2 דקות (~1,300 × גרם) בטמפרטורת החדר.
    5. בעזרת פיפטה של פסטר, פיפטה בזהירות את שכבת ההקסאן העליונה לתוך מבחנה זכוכית חדשה (12 x 75 מ"מ או 13 x 100 מ"מ).
    6. חזור על שלבים 1.1.4 ו-1.1.5 2x, איגום שלוש תמציות ההקסאן בצינור השני. מניחים את תמצית ההקסאן המאוגדת מתחת לזרם עדין של חנקן עד לייבוש.
    7. הוסף 100 מיקרוליטר מתנול לדגימה המיובשת וכסה אותה מיד. סובב את התמיסה למעלה ולמטה בצידי הצינור ולאחר מכן ערבב את הדגימה במערבולת למשך 15 שניות.
    8. מניחים את הדגימות במקפיא של -80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפחות.
      הערה: דגימות יכולות להישאר מאוחסנות בשלב זה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד למחרת.
  2. שאיבת דגימות חלב אם
    1. הפשירו דגימות חלב לחלוטין והפכו בעדינות מספר פעמים כדי להבטיח שהדגימות אחידות. לתוך צינור צנטריפוגה עליון בורג זכוכית של 10 מ"ל, מדוד 0.5-1.5 מ"ל (1.0 מ"ל סטנדרטי) של חלב, ורשום את הנפח המשמש.
    2. הוסף פי 1.5 מהנפח של 200 אתנול הוכחה (המכיל 0.1% בוטילאט הידרוקסי טולואן (w:v)), ערבב עם מערבולת למשך 15 שניות.
    3. הוסף 25 מיקרוליטר מהתקן הפנימי, כגון C-23 β-apo-carotenol (מסונתז מרשתית all-trans, abs = 0.9)15. מכסים את הדגימה ומערבבים לפי מערבולת.
    4. הוסף פי 0.8 מנפח דגימת החלב של 50:50 אשלגן הידרוקסיד במים (מוכן כ-w:v, למשל, 50 גרם KOH מומס ב-50 מ"ל מים), מערבבים במערבולת למשך 15 שניות.
      הערה: KOH: יש להרכיב מים במיכלי פלסטיק (למשל, HDPE).
    5. יש לסבול את הדגימות למשך שעה אחת באמבט מים של 45 מעלות צלזיוס, ולערבב לזמן קצר עם מערבולת כל 15 דקות.
    6. הוסף מים קרים נטולי יונים או אוסמוזה הפוכה באותו נפח כמו נפח החלב ההתחלתי.
    7. מוסיפים 1 מ"ל הקסאן, מערבבים במערבולת למשך 15 שניות, וצנטריפוגה למשך 2 דקות (~1,300 × גרם) בטמפרטורת החדר.
    8. בעזרת פיפטה של פסטר, פיפטה בזהירות את שכבת ההקסאן העליונה למבחנה זכוכית חדשה (12 x 75 מ"מ או 13 x 100 מ"מ).
    9. חזור על שלבים 1.2.7 ו-1.2.8 פעמיים נוספות, תוך איגום הקסאן בצינור השני.
    10. קח כל דגימה דרך מיצוי פאזה מוצקה (SPE); התחל בחיבור מחסניות SPE הדרושות (PE 500 מ"ג/3 מ"ל של -NH2) לסעפת הוואקום.
    11. התנה כל מחסנית על ידי העברת 3 x 2 מ"ל של הקסאן דרך כל מחסנית, ולעולם אל תאפשר לרמת הממס לרדת מתחת לחלק העליון של חומר האריזה. אסוף הקסאן לתוך צינור זכוכית בגודל 16X75 מ"מ והשליך אותו כראוי.
    12. טען את הדגימות למחסניות ומשוך עם הוואקום עד שהממס נמצא מעט מעל מפלס חומר האריזה. שטפו כל מחסנית עם 3 x 2 מ"ל הקסאן באותו אופן כמו שלב 1.2.11. השלך את ממס הפסולת והחלף את צינורות איסוף הזכוכית בחדשים באותו גודל, המסומנים במזהה המדגם.
    13. שטפו את הרטינול עם 3 x 2 מ"ל מתילן כלוריד, ואספו את השבר הזה.
    14. יבש את הפליטה מתחת לחנקן והרכיב מחדש ב-100 מיקרוליטר של מתנול (דרגת MS). מערבבים את הדגימה במערבולת ומערבבים את הממס על כל צידי הצינור. צנטריפוגה למשך 20-30 שניות.
    15. מניחים את הדגימות במקפיא של -80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפחות.
      הערה: דגימות יכולות להישאר מאוחסנות בשלב זה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד למחרת.
  3. שאיבת דגימות כבד
    1. במשפך זכוכית בקוטר 8 ס"מ מקפלים ומניחים נייר פילטר Whatman #1 15 ס"מ בצורת חרוט. הניחו בקבוק נפחי של 50 מ"ל מתחת למשפך.
    2. מפשירים רקמות ושוקלים 0.5 גרם, או כמה דגימה זמינה. רשום משקל רקמה בשימוש.
    3. מעבירים דגימות למכתש ועלי וטוחנים עם כ -5 גרם נתרן גופרתי.
    4. הוסף 250 מיקרוליטר של תקן פנימי כגון C-2315.
      הערה: אין להשתמש בצורות אסטריות של ויטמין A (כלומר, רטיניל אצטט, רטיניל בוטיראט) מכיוון שהדגימה בסופו של דבר תעבור סבוניזציה, מה שהופך את התקן לבלתי ניתן להבחנה בין רטינול אנדוגני.
    5. במכסה אדים, יוצקים 10-15 מ"ל מתילן כלוריד לתוך המרגמה עם דגימת הכבד הטחון ומערבבים בעדינות בעזרת העלי.
    6. יוצקים מתילן כלוריד דרך נייר הסינון לבקבוק הנפחי.
    7. חזור על שלבים 1.3.5 ו-1.3.6 פעמיים נוספות, וודא שהממס הכולל בבקבוק הנפחי יישאר מתחת לקו.
    8. השתמש בפיפטה של פסטר כדי לשטוף את שארית תכולת המרגמה לתוך המשפך עם מתילן כלוריד. המשיכו להוסיף מתילן כלוריד למשפך עם פיפטת פסטר עד שהממס בבקבוק הנפחי יגיע לקו. מכסה את הבקבוק הנפחי, ותוך כדי אבטחת המכסה במקומו, הפוך את הבקבוק מספר פעמים.
    9. יוצקים כ-10 מ"ל מתמצית מתילן כלוריד לבקבוק ארלנמאייר בנפח 25 מ"ל. העבירו 5 מ"ל מהתמיסה לצינור צנטריפוגה מזכוכית של 10 מ"ל עם מכסה עליון של בורג. יבש את הדגימה תחת זרם עדין של גז חנקן.
    10. הרכיבו מחדש את הדגימה ב-2 מ"ל אתנול + 0.1% בוטילאט הידרוקסי טולואן ומערבולת כדי לערבב את הדגימה.
    11. מוסיפים 0.8 מ"ל של 50:50 (w:v) אשלגן הידרוקסיד במים, ומערבבים במערבולת למשך 15 שניות.
    12. יש לסבול את הדגימות למשך שעה אחת באמבט מים של 45 מעלות צלזיוס, ולערבב לזמן קצר עם מערבולת כל 15 דקות.
    13. הוסף 0.1 מ"ל מים קרים נטולי יונים או אוסמוזה הפוכה.
    14. מוסיפים 1 מ"ל הקסאן, מערבבים במערבולת למשך 15 שניות, וצנטריפוגה למשך 2 דקות (~1,300 × גרם).
    15. בעזרת פיפטה של פסטר, פיפטה בזהירות את שכבת ההקסאן העליונה למבחנה זכוכית חדשה (12 x 75 מ"מ או 13 x 100 מ"מ).
    16. חזור על שלבים 1.3.14 ו-1.3.15 פעמיים נוספות, תוך איגום הקסאן בצינור השני.
    17. יבש את ההקסאן המאוגד מתחת לחנקן והרכיב מחדש ב-100 מיקרוליטר של מתנול (דרגת MS). מערבבים את הדגימה במערבולת, ומערבבים את הממס על כל צידי הצינור. צנטריפוגה למשך 20-30 שניות ומניחים את הדגימות במקפיא של -80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפחות.
      הערה: דגימות יכולות להישאר מאוחסנות בשלב זה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד למחרת.

2. טיהור וכימות דגימות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים

  1. הכן מערכת HPLC 1 עם עמודת C18 (5 מיקרומטר, 4.6 x 250 מ"מ) וגלאי UV-Vis מוגדר ל-325 ננומטר.
  2. הכן שלב נייד של אצטוניטריל: מים 92:8 על ידי מדידת נפחי האצטוניטריל והמים בנפרד ולאחר מכן שפיכת המים לאצטוניטריל. סנן ואקום את התמיסה המעורבת כדי להסיר גז מומס.
  3. הפעל את מערכת HPLC 1, בצע טיהור ממס ב-HPLC במידת הצורך, ולאחר מכן הגדר את קצב הזרימה ל-1 מ"ל/דקה למשך 15 דקות לפחות כדי לאזן את המערכת באופן מלא.
  4. הזרקת תקנים למערכת HPLC.
    1. לכימות ריכוזי הרטינול, יש להזריק 25 מיקרוליטר של תמיסה סטנדרטית פנימית C-23 ולרשום את התוצאה פי 3 כדי להשוות עם דגימות.
    2. הזרקו תקן רטינול כדי לקבוע את זמן השמירה המדויק של המערכת המשמשת להנחיית איסוף שברים וכימות רטינול.
  5. הכן מערכת HPLC 2 (הרכיבים זהים למערכת 1). אם אתה משתמש במערכת HPLC אחת עבור שני השלבים, החלף את העמודה המשמשת לטיהור הראשוני בעמודה זהה שנייה כדי למזער את ההעברה הפוטנציאלית של תרכובות מהדגימות.
  6. עבור מערכת 2, מסנן מתנול בוואקום, נקה את השלב הנייד של HPLC ולאחר מכן הפעל 0.7 מ"ל/דקה למשך 20 דקות כדי לאזן.
  7. הסר דגימות אחת אחת מהמקפיא -80 מעלות צלזיוס, וצנטריפוגה ב-1,300 × גרם למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.
  8. הזריק את הדגימה המלאה ל-HPLC, הימנע מכל חומר גלולה. התחל להקליט אם מכמתים רטינול.
  9. אסוף את שיא הרטינול לתוך צינור זכוכית קטן (12 x 75 מ"מ או 13 x 100 מ"מ) כאשר הממס עובר דרך הגלאי. אסוף את החלק האמצעי של השיא כדי למקסם את הטוהר, בדרך כלל ערכי ספיגה גדולים מ-0.1 יחידות ספיגה (איור 1), הניתנים להתאמה בהתאם לריכוז הרטינול בדגימה. המתן עד ששיא ה-C-23 יתפוגג ויפסיק את ההקלטה.
  10. דגימה יבשה תחת זרם עדין של חנקן.
  11. הוסף 100 מיקרוליטר מתנול (דרגת MS) לדגימה המיובשת ומכסה מיד. סובב את התמיסה למעלה ולמטה בצידי הצינור, ולאחר מכן ערבב את הדגימה במערבולת למשך 15 שניות. מניחים את הדגימות במקפיא של -80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפחות.
    הערה: דגימות יכולות להישאר מאוחסנות בשלב זה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד למחרת.
  12. הסר דגימות אחת אחת מהמקפיא -80 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה במשקל 1,300 × גרם למשך 30 שניות.
  13. הזרקו את הדגימה המלאה למערכת HPLC 2, הימנעו מכל חומר גלולה.
  14. כאשר שיא הרטינול נפלט, אסוף את הממס כשהוא עובר דרך הגלאי לתוך בקבוקון זכוכית קטן (<1 מ"ל) עם תחתית חרוטית, והחלק בעדינות את בקבוקון הדגימה למבחנה בגודל 12X75 מ"מ.
  15. הפעל את רכז הוואקום ותן למעבה להתקרר למשך 20 דקות.
  16. הנח את הדגימות בתצורה מאוזנת בקרוסלה, הגדר את הגדרת החום לאף אחד ואת הוואקום ל-05.1, סגור את המכסה ולחץ על הפעלה.
    הערה: לדגימות לוקח בדרך כלל 10-20 דקות להתייבש. חשוב לכרומטוגרף הגז שכל המתנול הוסר מהדגימות.
  17. לאחר הייבוש, העבירו את בקבוקון ה-HPLC לבקבוקון ענבר של 4 מ"ל עם מכסה בורג, והרכיבו מחדש את הדגימה עם 4-7 מיקרוליטר הקסאן.
    הערה: זה בדרך כלל 7 מיקרוליטר, אך הוא מצטמצם כאשר הדגימה נקבעת כריכוז נמוך במהלך הטיהור. דגימות כבד עשויות להיות מרוכזות הרבה יותר, לכן יש להרכיב מחדש בנפח גדול יותר. שאפו בין 75 ננוגרם/מיקרוליטר ל-400 ננוגרם/מיקרוליטר.
  18. הזרקו 1-5 מיקרוליטר ל-GC-C-IRMS כדי להשיג אות מתאים, בהתבסס על ריכוז הדגימה הנדרש להזרקת כ-75 ננוגרם רטינול.

3. ניתוח מדגם עם GC-C-IRMS

  1. הכן את ה-GC עם עמודה (100% דימתיל-פוליסילוקסן, לא קוטבי, 15 מ', 0.25 מ"מ ID, סרט 0.25 מיקרומטר), וקצב זרימת ההליום של 1.2 מ"ל/דקה.
  2. בצע בדיקות מערכת כדי לוודא שאין דליפות, ומקור ה-IRMS ממוקד כראוי במסות 44, 45 ו-46.
    הזרקת 2 μL של תקן רטינול מועשר C 75 n/μL 13בכל יום כהזרקה הראשונה כדי לקבוע את זמן השמירה ולאמת את ביצועי המערכת.
  3. בתוכנת הרכישה, טען את שיטת המכשיר, הקלד את השם עבור המדגם ולחץ על מדגם הפעלה. מערכת GC-C-IRMS תבצע שגרת הגדרת מערכת לפני הזרקה. לאחר שהאור הירוק מוכן להזרקה בחזית ה-GC נדלק, הזריק את נפח הדגימה שנקבע מראש למזרק ה-PTV לאידוי טמפרטורה הניתן לתכנות, הסר את המזרק ולחץ על כפתור התחל .
  4. הפעל את מזרק ה-PTV במצב PTV Splitless, כאשר עמוד ההגנה יושב בחלק העליון של תותב המזרק להזרקה מדומה על העמוד. הגדר את תוכנית המזרק כך שתתחיל בטמפרטורה התחלתית של 50 מעלות צלזיוס, החזק למשך 1.05 דקות, הגדל ל-200 מעלות צלזיוס בקצב של 14.5 מעלות צלזיוס לשנייה, החזק ב-200 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, עבור ל-300 מעלות צלזיוס ב-14.5 מעלות צלזיוס לשנייה, ולאחר מכן החזק כדי לטהר את המזרק למשך 4 דקות עם זרימת פיצול הליום של 50 מ"ל/דקה לפני חזרה ל-50 מעלות צלזיוס להזרקה הבאה.
  5. תכנת את טמפרטורת תנור ה-GC לטמפרטורה ראשונית של 50 מעלות צלזיוס, החזק למשך דקה אחת, רמפה 30 מעלות צלזיוס לדקה עד 150 מעלות צלזיוס, לאחר מכן 15 מעלות צלזיוס לדקה עד 265 מעלות צלזיוס, לאחר מכן עד 295 מעלות צלזיוס ב-40 מעלות צלזיוס לדקה, ולאחר מכן החזק למשך 2.50 דקות לפני הקירור ל-50 מעלות צלזיוס להזרקה הבאה.
  6. ודא שכל כרומטוגרמה מתחילה בשלושה פולסים של CO2 (טוהר 99.999%), מכוילים כנגד סוכרוז (IAEA-CH-6). התוצאה של Access היא תוכנת הרכישה.
  7. לאחר כל הזרקה, בדוק כל כרומטוגרמה כדי לוודא ששיא הרטינול קיים, ושהאינטגרציה מתאימה. השתמש בתוכנה כדי לשלב אוטומטית את פסגות הרטינול ככל האפשר כדי למזער הטיה פוטנציאלית מאינטגרציות ידניות. השתמש בהגדרות זיהוי שיפוע התחלה וסיום סטנדרטיות של 20 mV/s.
    הערה: משרעת שיא של 200 mV ומטה קטנה מכדי לספק מדידה מדויקת ביחס של 13C.
  8. ייצא נתוני כרומטוגרמה לתוכנית גיליון אלקטרוני. כלול את קטגוריות הנתונים החיוניות הבאות: שם מדגם, זמן שימור שיא, משרעת שיא במסה 45 ו-AT%.
    הערה: ניתן לציין את הנתונים המיוצאים באמצעות שיטת ייצוא מוגדרת. הערך δ מועיל לנוחות הפרשנות אך אינו נדרש לחישובים.

4. חישוב סך מאגרי הגוף וריכוזי הכבד של ויטמין A

  1. משוואות דילול איזוטופ רטינול.
    הערה: משוואת איזון האיזוטופים המועדפת והסימון המתאים המשמש חלק מהחוקרים מבוססים על המלצות האיגוד הבינלאומי לכימיה טהורה ויישומית16. נציין כי קבוצות מחקר מסוימות משתמשות בסימון המנסה לשמר שימוש היסטורי בגורמים המשמשים במשוואות RID. אנו מציינים גם כי גורמים וספרות תומכת יכולים להיות שונים בשאלה אם הם חלים באופן ישיר יותר על חישובים עבור TBS או ריכוזי VA בכבד, בהתאם לתכנון המחקר, מודל הניסוי והתוצאות האנליטיות.
    1. קבע רטינול TTR בסרום באמצעות השפע האיזוטופי של 13C של CO2 לאחר הבעירה על פי המשוואה הבאה:
       figure-protocol-1    
      כאשר F הוא השפע האיזוטופי (הידוע גם בשם שבר כמות איזוטופים, בקיצור 'x') של מינון העוקב (Fa), רטינול בסרום בנקודת ההתחלה (Fb) ורטינול בסרום לאחר מינון וערבוב עם מאגר הגוף (Fc). תקופות הערבוב המשמשות הן בדרך כלל בסביבות 14-21 ימים עבור בני אדם, אך יכולות להיות קצרות או ארוכות יותר בהתאם לתכנון המחקר הספציפי.
    2. השתמש במשוואות RID כדי לחשב VA TBS לפי משוואת הבסיס הבאה.
      figure-protocol-2
      איפה
      figure-protocol-3
      הערה: גורמים המשמשים לספיגה ואחסון כוללים 1) אחסון מינון בזמן שיווי המשקל (ספיגת מינון) המוערך בדרך כלל בין 75% ל-90% עבור אנשים בריאים. ניתן להפחית את ההערכה אם קיימת דלקת. 2) שמירת מינון; קבוע: e-kt; k = ln(2)/זמן מחצית החיים של רטינול; 32 עד 136 ימים לילדים; 140 יום למבוגרים); t = ימים מאז המינון (בדרך כלל 14-21 ימים); חלוקת סרום/כבד עוקב: TTRserum / TTRliver; 0.65-0.9 עם צריכת VA במהלך תקופת הערבוב; 0.9-.1 אם משתמשים במינון מעקב נמוך, צריכת VA מבוקרת ודגימת צום.
      figure-protocol-4
    3. חשב את ריכוזי ה-VA בכבד עם הנחות נוספות למשקל הכבד ולחלק ה-VA TBS בכבד.
      figure-protocol-5
      איפה
      figure-protocol-6
      היחס בין הכבד למשקל הגוף מוערך בדרך כלל כקבוע ספציפי לגיל: תינוקות: 4-4.2%; ילדים: 3%; מבוגרים: 2.4%; חלק TBS בכבד משתנה בהתאם למצב ויטמין A. אומדנים ששימשו בעבר הם סטטוס VA שולי או נמוך: 0.5; סטטוס VA הולם: 0.8-0.9.

תוצאות

דוגמה לכרומטוגרמה של דגימת סרום המנוטרת ב-325 ננומטר מסופקת עבור סעיף פרוטוקול 2 (איור 1). בהתאם למערכת ולעמודה הספציפית המשמשת, זמן השמירה האופייני לרטינול הוא 4-6 דקות ו-6-8 דקות לתקן הפנימי. האזור המוצלל בירוק מראה את טווח איסוף היעד עבור מקטע הרטינול כדי למזער זיהומים. יעילות המיצוי של רטינול מסרום היא בדרך כלל ≥-85%, בעוד שדגימות חלב אם ורקמות שעברו סבון נוטות להיות בעלות יעילות נמוכה יותר, בממוצע ~70-80%. ניתן להבחין בכמויות קטנות של רטינול cis-isomers נפלטות זמן קצר לפני או אחרי שיא ה-all-trans העיקרי במהלך טיהור HPLC. לא נצפה איזומר ציס ניכר בדגימה המוצגת באיור 1 אך ניתן לראותו באיור משלים 1 בהתייחסות17. לעתים קרובות, איזומר נוסף יופרד במהלך טיהור ה-HPLC השני (לא מוצג) או במהלך הפרדת ה-GC (איור 2).

דוגמה כרומטוגרמות GC-C-IRMS עבור דגימת סרום סטנדרטית וריקה מוצגות עבור סעיף פרוטוקול 3 (איור 2)9. כל דגימה כוללת שיאי ייחוס CO2 עם העשרה של 13C מכוילת לתקן סוכרוז של סבא"א (IAEA-CH-6).

דיוק ה-IRMS הניסיוני (CV%) לשפע איזוטופי של 13C/סה"כ C עבור: 1) ייחוס CO2 היה 0.012 ליציבות ו-0.031 ליניאריות (n = 10 כל אחד); 2) תקן הרטינול היה 0.036 ליציבות בין-יומית ו-0.022 ליניאריות תוך יומית (n = 4 כל אחד); ו-3) הניסוי היה 0.073 ±-0.061 על פני קו הבסיס ושמונה קבוצות טיפול תזונתי בגרבילים (n = 46 ב-9 קבוצות)9.

להלן דוגמה לאופן שבו נעשה שימוש בנתוני GC-C-IRMS המתקבלים בסרום לחישוב TBS וריכוזי VA בכבד שנקבעו 14 יום לאחר מתן המנה באמצעות משוואת RID לשיטה 4:

מאפייני המשתתפים במחקר:

גיל:4 שנים
משקל גוף:16.0 ק"ג
פא (2 פחמנים מסומנים בתוספת שפע טבעי):0.11
פ.ב:0.010757
FC:0.011057
מינון מעקב מיושם:1.0 מיקרומול
זמן מאז המינון:14 ימים
מחצית חיים של VA:32 ימים
הקליטה:0.8
יחס TTR בסרום/כבד (דיאטה לא מבוקרת):0.9
שבר TBS בכבד:0.8

חישוב:

TTR = (Fc-F b)/(Fa-F c)
TTR = (0.0110568 - 0.010757) / (0.11 - 0.0110568) = 0.0030300213
1/TTR = 1 / 0.0030300213 = 330.03

שמירת מינון = e-kt עם זמן מחצית חיים של 32 יום וזמן דגימה של 14 יום
k= ln(2)/36 = 0.693147181 / 36 = 0.021660849
t = 14
e-kt = e-0.02166 x 14= 0.738413073

figure-results-1

TBS = 1 × 330.03 x 0.8 x 0.738413073 × 0.9 = 175 מיקרומול

לחישוב ריכוזי VA בכבד:
משקל כבד (גרם) = 1,000 × משקל גוף (ק"ג) × 3% (הערכה לילדים)
משקל כבד = 1,000 x 16.0 x 0.03 = 480 גרם
figure-results-2
ריכוז VA בכבד = (175 / 480) x 0.8 = 0.29 מיקרומול/גרם

figure-results-3
איור 1: כרומטוגרמה HPLC של דגימת סרום אנושית. מערכת HPLC 1 עם פאזה ניידת איזוקרטית 90:10 MeOH:H2O וזיהוי ב-325 ננומטר. שיא הרטינול נאסף לערכי ספיגה מעל ~0.1 (אזור מוצל ירוק). התקן הפנימי C-23 β-apo קרוטנול משמש לכימות ריכוז הרטינול בסרום (אם רוצים) בשלב זה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 2: כרומטוגרמות GC-C-IRMS המדגימות קביעת רטינול 13 C/12 C. כרומטוגרמה GC-C-IRMS של (A) רטינול סטנדרטי, (B) רטינול מטוהר מסרום, ו-(C) הזרקה ריקה המותאמת מ-Gannon et al.9. שלושה עקבות הם למסה 44 (המקבילה ל-12C16O2), 45 (המקבילה ל-13C16O2 או 12C16O17O), ו-46 (המקבילה בעיקר ל-12 C16O18O, המשמשת לתיקון מסה 45 עבור תרומה של 17O). שלוש פסגות רחבות לפני 200 שניות הן פסגות ייחוס CO2 מכוילות לחומר ייחוס סוכרוז 13C. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

השיטות המתוארות למדידת העשרה של 13C של רטינול באמצעות GC-C-IRMS יכולות לספק נתונים חשובים להערכת התערבויות תזונתיות,18 מודלים של קינטיקה של ויטמין A,19,20,21 מחקר קליני, או מחקרי אוכלוסייה המשלבים RID להערכות משופרות של מצב VA 22.

בבדיקה זו, רטינול מטוהר מדגימה ביולוגית מועבר דרך עמודת ה-GC על ידי הליום בדרגת מחקר (טוהר >99.999999%) עם שיפוע טמפרטורה, המפריד אותו מהזיהומים שנותרו בדגימה. הרטינול נשרף ליצירת CO2 ומים, והמים מוסרים. ה-CO2 נישא ל-IRMS, שם נמדדות המסות 44, 45 ו-46, ו-δ ו-AT% נקבעים ביחס לייחוס גז CO2 , אשר מכויל בנוסף כנגד תקן סוכרוז (IAEA-CH-6).

בהכנת הרטינול להזרקה, הרטינול המופק חייב להיות בעל טוהר מירבי כדי להשיג יחסים איזוטופיים הניתנים לשחזור ולמקסם את אורך החיים של הפלטפורמה האנליטית בין ניקוי יסודי. ממיסים המשמשים למיצוי צריכים להיות בדרגת הטוהר הגבוהה ביותר שיש, שהיא בדרך כלל בדרגת MS. כל כלי הזכוכית, כגון צינורות מיצוי, פיפטות פסטר ובקבוקוני הזרקת HPLC צריכים להיות חדשים מכיוון שקשה לנקות אותם כראוי לניתוח טרשת נפוצה. חשוב להשתמש בצינורות זכוכית ופיפטות ולא בפלסטיק כדי למזער את הפלסטיק בתמציות המצטברות על עמודי ה-GC והבעירה.

ניתן לבצע שינויים בזרימת עבודה זו של ניתוח מדגם בהתאם לעיצוב המחקר הספציפי ולמקור הדגימה. לדוגמה, סביר להניח שמערכת HPLC אחת יכולה להיות אופטימלית לטיהור רטינול. מניסיוננו, זה ידרוש מים בשלב הנייד, וידרוש שיפוע פאזה נייד, או זמן ייבוש דגימה מוגבר לפני ההזרקה ב-GC-C-IRMS. מצאנו ששימוש בשתי מערכות HPLC עם שיטות איזוקרטיות קצרות מאזן את הדרישות האנליטיות תוך קבלת אותות ברורים על ה-GC-C-IRMS (איור 2). השימוש ב-LC-MS/MS יכול לספק זרימת עבודה אנליטית יעילה יותר עבור דגימות RID7. עם זאת, לרגישות של GC-C-IRMS יש יתרונות מובהקים של היכולת להשתמש בכמויות תיוג איזוטופים במינון נמוך יותר, כימות עוקבים בנקודות זמן ארוכות יותר וניתוח דגימות עם העשרת דגימה נמוכה.

המגבלות של שיטה זו כוללות דרישה למספר מכשירים, טיפול טכני מיומן ואילוצי תפוקת דגימה עקב זמני הכנת דגימה ארוכים יותר. ניתן לשפר את זמן האדם הנדרש להכנת כל דגימה על ידי הטמעת HPLC עם יכולות איסוף שברים אוטומטיות מכיוון ששלבי הטיהור של HPLC משתמשים בשיטות איזוקרטיות, וכתוצאה מכך זמני שימור אנליטים עקביים. ניתן לייעל את השיטה לשימוש בטיהור HPLC אחד בלבד. אנו משתמשים בשתי מערכות במקביל כדי להגדיל את התפוקה ולהקל על ייבוש הדגימה לפני בנייה מחדש בהקסאן והזרקה על ה-GC-C-IRMS.

בעוד GC-C-IRMS רגיש ביותר לקביעת יחסי איזוטופים, הוא דורש יותר מסת רטינול כוללת לדגימה כדי לקבל אות רטינול מתאים. דרישות המדגם תלויות הן בכמות המדגם והן בריכוז ה-VA של הדגימה. בדרך כלל, 75 ננוגרם של רטינול מכוון לשיא חזק, מה שמאפשר שינויים בהעברת GC וביעילות הבעירה. בפועל, בתנאי פעולה אופטימליים, השגנו אות הולם עם דגימות וכתוצאה מכך הזרקות GC-C-IRMS נמוכות עד 25 ננוגרם. זה מתאים לדגימת סרום עם נפח נמוך יותר (~0.4 מ"ל), ריכוז רטינול נמוך (~0.5 מיקרומול/ליטר), והפסדים קלים בהליכי המיצוי והטיהור. בפיתוח האנליטי של שיטת RID, שיפור משמעותי היה לעבור למזרק PTV. טמפרטורת ההתחלה הנמוכה מונעת מההקסאן הנושא את הדגימה להתרחב מהר מדי, ומאפשרת הדמיה של הזרקות על העמודה של דגימות. הזרקה ישירות לעמודה ממקסמת את האות של הרטינול עם החיסרון של צורת שיא קצת יותר גרועה ותחזוקה מתמדת יותר.

חלב אם הוצע כתחליף לדגימות סרום בבדיקת RID. זה אומת בנשים מניקות בזמביה שהיו להן בעיקר מאגרים נמוכים של VA11. זה עדיין לא אושר אצל נשים שיש להן צריכה גבוהה יותר של VA מוכן מראש, כמו שניתן למצוא במדינות בעלות הכנסה גבוהה או באוכלוסיות הצורכות מקורות מרובים של VA, כולל צריכה תזונתית, העשרת מזון ותוספי תזונה.

להערכת VA של חלב אם יש מספר יתרונות על פני אינדיקטורים ביוכימיים אחרים של סטטוס VA. איסוף חלב אם הוא לרוב קל יותר מדם מכיוון שאין צורך בפלבוטומיסטים, ואיסוף חלב אם נחשב בדרך כלל פחות פולשני עבור נבדקים23. השימוש בדגימות חלב אם מזדמנות נוח ודורש רק 5 מ"ל חלב. יתר על כן, אין צורך לעבד דגימות באופן מיידי, מה שמקצר את זמן הטיפול בדגימה, במיוחד בהגדרות שדה. עם זאת, סטנדרטיזציה של איסוף דגימות עבור דגימות חלב אם מלאות היא קריטית מכיוון שריכוזי השומן והרטינול גבוהים יותר בחלב אחורי מאשר בחלב קדמי, וריכוזי שומן החלב והרטינול נוטים להשתנות עם השעה ביום והמרווח מאז ההאכלה האחרונה 1,24. עבור דגימות מזדמנות, ריכוז הרטינול מתבטא בצורה הטובה ביותר לכל גרם שומן חלב. יש לקבוע שומן חלב באופן אידיאלי מיד לאחר האיסוף בשיטת creamatocrit25. דגימות צריכות להיות מוגנות מפני אור. יש להכין Aliquots (בדרך כלל 1 עד 5 מ"ל) לניתוח HPLC בזמן האיסוף מכיוון שהחלב אינו הומוגני לאחר הקפאה והפשרה.

ישנן שתי נסיבות עיקריות שבהן מדידת העשרת 13C של VA בכבד עשויה להיות אפשרית ומעניינת. המצב השכיח ביותר הוא שימוש ב-13רטינול עם תווית C במחקרים בבעלי חיים, כאשר הכבד נאסף. ה-TBS המחושבים של VA יושוו לריכוז ה-VA בכבד כפי שנקבע על ידי HPLC/UPLC, אך העשרת 13C של מאגרי הכבד שימושית גם לקביעת אופן חלוקת העוקב במחזור ביחס למאגרים לטווח ארוך. בנוסף, בנסיבות ייחודיות מסוימות, ניתן לקבל דגימות ביופסיית כבד מבני אדם שנתנו את הסכמתם וגם נטלו מינון מסומן של ויטמין A26,27. דגימות אלו שימושיות גם לאימות ובדיקה של ערבוב 13C-רטינול. עיבוד דגימות כבד מתחיל בטחינת דגימה מדודה עם נתרן גופרתי נטול מים כדי ללכוד מים ולפרק את הרקמה. לאחר מכן זה מופק עם 50 מ"ל מתילן כלוריד דרך נייר סינון. חלק מיובש תחת חנקן ומיוצר מחדש באתנול עם 0.1% בוטילאט הידרוקסי טולואן שנוסף כחומר משמר. הדגימה עוברת סבון ומופקת באותו הליך המשמש לחלב אם.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי NIH-R01 DC019357 ופרויקט המחקר המתואם E43035 של הסוכנות הבינלאומית לאנרגיה אטומית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומר ייחוס 13C שניתן לעקוב אחר סולם VPDB-LSVEC (סוקרוז)הסוכנות הבינלאומית לאנרגיה אטומיתסבא"א-CH-6 שם המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה: RM 8542
אצטוניטריל (דרגת HPLC)פישר סיינטיפיקUN1648
אתנול (טהור 200 proof, חסר מים, &GE; 99.5%)סיגמא459836
פיפטות פסטור מזכוכיתכלשהו
מבחנות זכוכיתכלשהו
הליום (מחקר, (>99.9995% טוהר)כלשהו
הקסאניםסיגמא178918
מתנול (דרגת MS)VWRMSPP-A-456
טיט ועלי, קרמיקהכלשהו
פיפטה עם תזוזה חיובית 3-25 ומיקרו; LגילסוןFD10002
פיפטת הדחקה חיובית 10-100 ומיקרו; LגילסוןFD10004
פיפטת הדחקה חיובית 50-250 ומיקרו; LגילסוןFD10005
פיפטה עם תזוזה חיובית 100-1000 ומיקרו; LגילסוןFD10006
אשלגן הידרוקסידפישר סיינטיפיקUN1813
נייר פילטר איכותי #1 150 מ"מווטמן1001-150
משפכים נפרדיםכלשהו
סולפט נתרן, חסר מיםפישר סיינטיפיקS415-212
בקבוקי נפח (50 מ"ל)כלשהו

מקורות

  1. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of nutrition for development (BOND)-vitamin A review. J Nutr. 146 (9), 1816S-1848S (2016).
  2. Gannon, B. M., et al. Selected laboratory-based biomarkers for assessing vitamin A deficiency in at-risk individuals. Cochrane Database Syst Rev. 5 (5), CD013742(2025).
  3. Furr, H. C., et al. Stable isotope dilution techniques for assessing vitamin A status and bioefficacy of provitamin A carotenoids in humans. Public Health Nutr. 8 (6), 596-607 (2005).
  4. Lietz, G., et al. Current capabilities and limitations of stable isotope techniques and applied mathematical equations in determining whole-body vitamin A status. Food Nutr Bull. 37 (2 Suppl), S87-S103 (2016).
  5. Gannon, B. M., Tanumihardjo, S. A. Comparisons among equations used for retinol isotope dilution in the assessment of total body stores and total liver reserves. J Nutr. 145 (5), 847-854 (2015).
  6. Bausch, J., Rietz, P. Method for the assessment of vitamin A liver stores. Acta Vitaminol Enzymol. 31 (1-5), 99-112 (1977).
  7. Oxley, A., et al. An LC/MS/MS method for stable isotope dilution studies of β-carotene bioavailability, bioconversion, and vitamin A status in humans. J Lipid Res. 55 (2), 319-328 (2014).
  8. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84 (Suppl 1), 30-39 (2014).
  9. Gannon, B. M., et al. 13C natural abundance of serum retinol is a novel biomarker for evaluating provitamin A carotenoid-biofortified maize consumption in male Mongolian gerbils. J Nutr. 146 (7), 1290-1297 (2016).
  10. Green, M. H., Green, J. B. Use of the paired retinol isotope dilution test, but with a single isotope dose, to assess the impact of a vitamin A intervention on vitamin A stores in theoretical children with low stores. J Nutr. 154 (10), 3151-3156 (2024).
  11. Kaliwile, C., et al. Breast milk-derived retinol is a potential surrogate for serum in the 13C-retinol isotope dilution test in Zambian lactating women with vitamin A deficient and adequate status. J Nutr. 151 (1), 255-263 (2021).
  12. Howe, J. A., Valentine, A. R., Hull, A. K., Tanumihardjo, S. A. 13C natural abundance in serum retinol acts as a biomarker for increases in dietary provitamin A. Exp Biol Med (Maywood). 234 (2), 140-147 (2009).
  13. Sheftel, J., Gannon, B. M., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Provitamin A-biofortified maize consumption increases serum xanthophylls and 13C-natural abundance of retinol in Zambian children. Exp Biol Med (Maywood). 242 (15), 1508-1514 (2017).
  14. Gannon, B. M., et al. Comparison of total body vitamin A stores using individual versus population 13C-natural abundance of serum retinol in preschool children and women residing in six diverse African countries. J Nutr. 153 (4), 949-957 (2023).
  15. Tanumihardjo, S. A., Howe, J. A. Twice the amount of α-carotene isolated from carrots is as effective as β-carotene in maintaining the vitamin A status of Mongolian gerbils. J Nutr. 135 (11), 2622-2626 (2005).
  16. Coplen, T. B. Guidelines and recommended terms for expression of stable-isotope-ratio and gas-ratio measurement results. Rapid Commun Mass Spectrom. 25 (17), 2538-2560 (2011).
  17. Tanumihardjo, S. A., et al. Synthesis of 13C2-retinyl acetate and dose preparation for retinol isotope dilution tests. J Vis Exp. (222), e68535(2025).
  18. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  19. Gannon, B. M., Valentine, A. R., Davis, C. R., Howe, J. A., Tanumihardjo, S. A. Duration of retinol isotope dilution studies with compartmental modeling affects model complexity, kinetic parameters, and calculated vitamin A stores in US women. J Nutr. 148 (8), 1387-1396 (2018).
  20. Lopez-Teros, V., et al. The "super-child" approach is applied to estimate retinol kinetics and vitamin A total body stores in Mexican preschoolers. J Nutr. 150 (6), 1644-1651 (2020).
  21. Green, M. H., et al. Use of population-based compartmental modeling and retinol isotope dilution to study vitamin A kinetics and total body stores among Ghanaian women of reproductive age. Curr Dev Nutr. 8 (11), 104484(2024).
  22. Engle-Stone, R., et al. Filipino children with high usual vitamin A intakes and exposure to multiple sources of vitamin A have elevated total body stores of vitamin A but do not show clear evidence of vitamin A toxicity. Curr Dev Nutr. 6 (8), nzac115(2022).
  23. Stoltzfus, R. J., Underwood, B. A. Breast-milk vitamin A as an indicator of the vitamin A status of women and infants. Bull World Health Organ. 73 (5), 703-711 (1995).
  24. Ruel, M. T., Dewey, K. G., Martinez, C., Flores, R., Brown, K. H. Validation of single daytime samples of human milk to estimate the 24-hour concentration of lipids in urban Guatemalan mothers. Am J Clin Nutr. 65 (2), 439-444 (1997).
  25. Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. Creamatocrit: simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk. Br Med J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).
  26. Furr, H. C., Clifford, A. J., Bergen, H. R. 3rd, Jones, A. D., Anderson, D. P., Olson, J. A. Vitamin A concentrations in liver determined by isotope dilution assay with tetradeuterated vitamin A and by biopsy in generally healthy adult humans. Am J Clin Nutr. 49 (4), 713-716 (1989).
  27. Haskell, M. J., et al. Assessment of vitamin A status by the deuterated-retinol-dilution technique and comparison with hepatic vitamin A concentration in Bangladeshi surgical patients. Am J Clin Nutr. 66 (1), 67-74 (1997).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

AA 13CHPLC

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.