הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

באתרו זיהוי תאים פעילים מטבולית ברקמת קרצינומה של הכבד באמצעות הדמיית קריוסקציה מבוססת MTT

324 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68575

⸱

31 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  , 
1Gastroenterology Department, First Hospital of Quanzhou Affiliated to Fujian Medical University, 2Medical School, Huaqiao University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט לאיתור התאים הפעילים מטבולית ברקמת קרצינומה של הכבד באמצעות הדמיית קריוסקציה מבוססת MTT. שיטה זו עשויה לשמש גם לאיתור תאים פעילים באתרם ברקמות או באיברים אחרים.

תקציר

עדויות מתפתחות, כולל מחקרים קודמים, מדגישות תת-אוכלוסייה של תאים בתוך רקמות קרצינומה של הכבד (HCC) המציגים פעילות מטבולית מעולה ועמידות בפני לחץ. תאים אלה הם מניעי מפתח להתקדמות הגידול ועמידות לטיפול. עם זאת, השיטות הקיימות לזיהוי תאים ברי קיימא במקום פוגעות לעתים קרובות בשלמות הרקמות, משנות את כדאיות התאים או תובעניות מבחינה טכנית. מחקר זה מציג גישה חדשנית, פשוטה ולא הרסנית לזיהוי באתרם של תאים פעילים מטבולית ברקמות HCC באמצעות הפחתה תלויה במיטוכונדריה של 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) לגבישי פורמזן בלתי מסיסים. על ידי אופטימיזציה של גודל שבר הרקמה (1 × 1 × 0.2 ס"מ3), תנאי תרבית (20% FBS, 1 מ"ג/מ"ל MTT ודגירה של 3 שעות עם מערבולת לסירוגין), ופרמטרים של הקפאה (עובי 20 מיקרומטר, קיבוע 4% PFA וצביעה נגדית DAPI), הושג מיפוי מרחבי של תאי HCC ברי קיימא תוך 5 שעות. פרוטוקול חסכוני זה אינו דורש ציוד מיוחד ושומר על ארכיטקטורת רקמות, ומאפשר זיהוי מרחבי של אשכולות תאים בעלי כדאיות גבוהה ועמידים בפני לחץ באזורי פני השטח. המגבלות כוללות אובדן כדאיות מתקדם מעבר ל-6 שעות ותזוזה של גביש במהלך החיתוך, שניתן להפחית באמצעות תוסף FBS והקפאה מבוקרת. שיטה זו מספקת פלטפורמה מעשית לבידוד תאים בודדים של תת-אוכלוסיות עמידות לטיפול, ומקדמת את מחקר המיקרו-סביבה של HCC.

מבוא

קרצינומה של הכבד (HCC), הגורם השלישי המוביל למקרי מוות הקשורים לסרטן בעולם, מאופיינת בהטרוגניות גבוהה ובשיעורי הישנות1. הטרוגניות מרחבית וזמנית זו הופכת אוכלוסיות תאים מסוימות ברקמות הגידול לפעילות יותר מאחרות בחילוף חומרים, התפשטות, התקדמות, עמידות ללחץ ועמידות לתרופות. לזיהוי באתרם של תאים ברי קיימא בתוך רקמות HCC יש משמעות קלינית וביולוגית עמוקה, שכן תאים אלה כוללים תת-שיבוטים מתרבים, אוכלוסיות עמידות לטיפול ותאים יוזמי גרורות. תאים ברי קיימא כאלה יכולים לשמש כמניעים קריטיים להישנות הגידול, התחמקות חיסונית וכישלון טיפולי2.

עם זאת, טכנולוגיות פרופיל מרחבי עכשוויות (למשל, טרנסקריפטומיקה מרחבית) דורשות מכשור מיוחד וקשורות לעלויות גבוהות, בעוד שניתוחים בתפזורת מסורתיים מתעלמים לעתים קרובות מההטרוגניות המרחבית של תאים ברי קיימא ומהאינטראקציות הדינמיות שלהם עם רכיבים סטרומליים3. לדוגמה, תאי HCC ברי קיימא שנותרו לאחר הכריתה מציגים פרופילים מטבוליים מובהקים שלא ניתן לסכם בנאמנות במערכות תאים מנותקות4. לפיכך, קידום טכנולוגיות זיהוי שנפתרו מרחבית הוא הכרחי כדי לפענח את הדיבור התפקודי בין תאי גידול ברי קיימא למיקרו-סביבה שלהם, ובסופו של דבר ליידע אסטרטגיות טיפוליות מדויקות. למרות ששיטות קונבנציונליות כגון ציטומטריית זרימה או אימונוהיסטוכימיה (IHC) שימשו את קבוצתנו לאיתור התאים הקיימים ב-HCC, הן דורשות דיסוציאציה או קיבוע של רקמות, ובכך מאבדות את ההקשר המרחבי ומעכבות את ניתוח האינטראקציות בין תאים 5,6. לפיכך, פיתוח טכנולוגיות לא הרסניות ברזולוציה גבוהה לזיהוי במקום של תאים ברי קיימא הוא קריטי להבהרת מנגנוני עמידות ל-HCC ולהנחיית טיפולים מדויקים.

כדי לזהות ולהציג במהירות את התאים הקיימים ברקמות HCC באתרם ללא טיפול הרסני, פותחה שיטת תרבית רקמות פשוטה מבוססת 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). בקצרה, רקמות ה-HCC הדקות הטריות (כ-1 ×-1 ×-0.2 ס"ממעוקב) תורבו לראשונה במדיום DMEM למשך 3 שעות שהכיל 20% סרום בקר עוברי (FBS) ו-MTT (1 מ"ג/מ"ל). לאחר מכן, לאחר קיבוע של 4% פרפורמלדהיד (PFA) והרכבה המכילה DAPI, שקופיות רקמה קפואות משובצות OCT (עובי 20 מיקרומטר) היו נתונות לתצפית מיקרוסקופית באור בהיר או UV. התאים הקיימים יציגו צבע סגול, סגול-אדום או סגול-שחור. באמצעות פרוטוקול זה, זיהינו בהצלחה את התאים הקיימים ברקמות HCC תוך 5 שעות. בינתיים, שיטה זו משמרת מיקרו-ארכיטקטורה תלת מימדית, תואמת לניתוח מולטי-אומיקס במורד הזרם, והיא פשוטה, כמו גם ידידותית לזמן ולעלות. עם זאת, שיטה זו מציגה מגבלות מסוימות. התהליכים הרב-שלביים של שטיפה, חתך ותרבות עשויים לגרום לעיוות מבני ואפופטוזיס ברקמות, במיוחד בדגימות מטבוליות גבוהות, כגון רקמת HCC במחקר זה. בנוסף, עובי מוגבר של פרוסות קריוסקציה פוגע בבהירות ובשטיחות של תצפיות מיקרוסקופיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים נערכו בהתאם להצהרת הלסינקי ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים המסונף הראשון של צ'ואנג'ואו (No. FJMU IACUC2021257). רקמות HCC הוסרו בניתוח ונאספו בבית החולים הראשון של צ'ואן-ג'ואו, המסונף לאוניברסיטה הרפואית פוג'יאן, בהסכמה מדעת של המטופלים. ניסוי זה דורש אמצעי הגנה סטנדרטיים, כולל לבישת חלוק מעבדה, מסכה חד פעמית וכפפות.

1. הכנת רקמות

  1. מניחים צלחת פטרי סטרילית בגודל 9 ס"מ על קרח. הוסף 30 מ"ל של מי מלח פוספט קרים כקרח (PBS).
  2. העבר מיד את רקמת ה-HCC האנושית שנכרתה בניתוח ל-PBS.
  3. סובבו בעדינות את המנה למשך 5 שניות כדי להסיר מזהמי דם. שאפו PBS באמצעות פיפטה סטרילית.
    הערה: חזור על הפעולה שלוש פעמים.
  4. מעבירים את הרקמה למכסה צלחת הפטרי.
    הערה: הרקמות נדבקות בקלות למכסה צלחת הפטרי הלא רטוב לטיפול טוב יותר לאחר מכן.
  5. חותכים את הרקמה לכ-1 ×-1 ×-0.2 ס"מ3 שברים בעזרת להב כירורגי סטרילי (מס' 11).
    הערה: ניתן לשנות את אורך ורוחב השברים, אך העומק צריך להיות פחות מ-0.2 ס"מ.
  6. מחזירים שברים לכלי טרי בגודל 9 ס"מ מלא ב -30 מ"ל PBS קר כקרח.
  7. סובבו בעדינות את המנה למשך 5 שניות כדי להסיר מזהמי דם. שאפו PBS באמצעות פיפטה סטרילית.
    הערה: חזור על שלב 1.7 שלוש פעמים. שבר רקמה אחד שהורתח ב-PBS (95 מעלות צלזיוס, 10 דקות) הוגדר כביקורת שלילית. בצע את כל השלבים בתנאים סטריליים.

2. תרבית רקמות

  1. הוסף 1.8 מ"ל של מדיום תרבית שלם DMEM (שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס) המכיל גלוקוז (ריכוז סופי = 4.5 גרם/ליטר) ו-L-גלוטמין (ריכוז סופי = 2 מ"מ) לכל באר של צלחת של 6 בארות. לאחר מכן, הוסף 0.6 מ"ל FBS (ריכוז סופי = 20% v/v), ו-0.6 מ"ל מלאי MTT (ריכוז סופי = 1 מ"ג/מ"ל) לכל באר של צלחת של 6 בארות.
  2. העבירו את שברי הרקמה לבארות באמצעות מלקחיים סטריליים.
  3. מניחים את צלחת 6 הבארות בחממה. יש לדגור למשך 3 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2.
    הערה: סובבו בעדינות את הצלחת למשך 3 שניות כל 30 דקות. הדגירה יכולה להסתיים ברגע שפני השטח של שברי הרקמה הופכים לסגולים או סגולים-שחורים.

3. סיום וקיבוע

  1. שאפו את מדיום ה-MTT. שוטפים שברי רקמות במי מלח קרים כקרח.
    הערה: חזור על הפעולה חמש פעמים.
  2. הוסף 2 מ"ל של פורמלין ניטרלי (NBF) של 4% לכל באר של צלחת של 6 בארות.
  3. מכניסים את הצלחת למקרר בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך שעה.

4. הקפאה

  1. כתם את השברים בעדינות על נייר סופג נקי.
  2. יש להניח טישו בקריומולד מלא בתרכובת OCT.
    הערה: ודא שהרקמה מכוסה במלואה בתרכובת OCT.
  3. מקפיאים את הטישו במקרר בטמפרטורה נמוכה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  4. הרכיבו את הבלוק הקפוא על צ'אק קריוסטט בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  5. חותכים קטעים של 100 מיקרומטר ב-20 מעלות צלזיוס עד שמשטח הרקמה נחשף.
    הערה: משטח הרקמה מציג צבע דמוי סגול.
  6. אוספים פרוסות של 20 מיקרומטר באמצעות שקופיות מצופות דבק.
    הערה: פרוסות הרקמה צריכות להופיע בגוון של סגול, סגול-אדום או סגול-שחור.
  7. מקבעים את הפרוסות ב -4% פרפורמלדהיד (PFA) בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
  8. שוטפים בעדינות את השקופיות עם PBS למשך דקה.
    הערה: חזור על הפעולה שלוש פעמים.

5. הרכבה

  1. החל טיפה אחת של מדיום הרכבה המכיל DAPI (ריכוז סופי: 1 מיקרוגרם/מ"ל).
  2. מכסים בכיסוי.
  3. אוטמים את הקצוות עם לק.
    הערה: ניתן לאחסן שקופיות עם קצוות אטומים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך אם לא מבוצעת מיקרוסקופיה באופן מיידי.

6. מיקרוסקופיה

  1. דמיין מרבצי פורמאזאן סגולים, סגולים-אדומים או סגולים-כהים (תאים ברי קיימא) בהגדלה של 20× תחת שדה בהיר באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר.
  2. זיהוי DAPI כחול (גרעינים) תחת תאורת UV באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  3. מיזוג ערוצי שדה בהיר ופלואורסצנטי למתאם מרחבי.
    הערה: התוכנה המשמשת כאן היא NIS Element F (גרסה 4.00.06).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מחקר זה זיהה בהצלחה תאים פעילים מטבולית ברקמת HCC מבלי לשבש את ארכיטקטורת הרקמה. ראשית, תמונות השדה הבהיר (איור 1A) הראו כי פני הרקמה הציגו כיסוי תאי צפוף וערימה רב-שכבתית של תאים על פני השקופית, מה שמאשר את השלמות הארכיטקטונית השמורה של רקמת ה-HCC לאורך התרבית והעיבוד. יש לציין כי אשכולות של תאים באזורים שטחיים הציגו מרבצי פורמאזן סגולים-אדומים מובהקים, המעידים על פעילות מיטוכונדריאלית באוכלוסיות תאים בנות-קיימא. שנית, צביעה נגדית גרעינית DAPI יכולה לזהות בקלות את המיקום וקווי המתאר של תאים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המתודולוגיות הנוכחיות לזיהוי תאים ברי קיימא באתרן עדיין מתמודדות עם מגבלות מרובות פנים. IHC ואימונופלואורסצנציה (IF), הנמצאים בשימוש נרחב לזיהוי סמני התפשטות או חלבונים הקשורים לאפופטוזיס, סובלים מהפרעה בשלמות הממברנה הנגרמת על ידי קיבוע פורמלדהיד7. יתר על כן, חדירת נוגדנים בקטעי רקמה עבים היא תת-אופטימלית8. בדיקות כדאיות פלואורסצנטיות כגון Calcein-AM, למרות שהן יעילות בתיוג תאים חיים פעילים באסטראז ex vivo, מציגות ספציפיו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

מחקר זה מומן על ידי לשכת המדע והטכנולוגיה של העיר שיאמן (מס' 3502Z20227197), קרן הסטארט-אפ למחקר מדעי של האוניברסיטה הרפואית פוג'יאן (2021QH1240). אנו מודים לשיאן-יינג ג'אנג, ג'ינג-ג'ינג ג'ואו ושאו-קונג וונג (אוניברסיטת הוא-צ'יאו) על הסיוע הטכני שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
-80 ו-deg; מקפיא C (זקוף)תרמו פישר סיינטיפיקTSX60086V
ספסל נקי (זרימה למינרית אנכית)AIRTECHSW-CJ-1FD
חממת CO2 (165 ליטר)תרמו פישר סיינטיפיקHeracell VIOS 160i (למשל, 51030400 / 51033559)
Coverslip (24&; 50 מ"מ, #1.5)סיטוגלאס (סיטוטסט)0341-3610
צלחת פטרי תרבותית (90 מ"מ)קן752001 (דוגמה)
מדיום התקנה המכיל DAPIביוטייםP0131 (5 מ"ל/25 מ"ל)
DMEM (סוכר גבוה, עם פירובאט)Invitrogen (Gibco)11995-065
FBS (מוסמך, מקור אמריקאי)Invitrogen (Gibco)A3160501
מיקרוסקופ פלואורסצנטיניקוןסדרת ECLIPSE Ti2
מיקרוטום הקפאה (קריוסטט)לייקהCM1950
שקופיות מיקרוסקופ (פשוטות, 25& 75 מ"מ)סיטוגלאס (סיטוטסט)0317-0001
תגובת MTT (אבקה)ביוטייםST316
לק לציפורניים (שקוף)ביוטיים—
NBF (פורמלין ניטרלי עם בופר)ביוטיים—
תרכובת OCTסאקורה (סאקורה פינטק)4583
מיקרוסקופ אופטי (זקוף)ניקוןסדרת ECLIPSE Ci (למשל, Ci-L)
PBS (500 מ"ל)ביוטייםC0221A
PFA, 4% ב-PBS (קיבוע)ביוטייםP0099
קצה פיפטה (1 מ"ל, קשירה נמוכה)קירגןKG1313-L
קצה פיפטה (200 ומיקרו; L)אקסיגן (קורנינג)T-200-Y (נפח) / T-200-Y-R-S (עם מדפים, סטרילי)
פיפטור (ערוץ יחיד)תרמו פישר סיינטיפיקפינפיפט F2 (חתול ספציפי לטווח#)
אזמלהיסטיקהדגם משתנה (למשל, הפניה לספק 100022208326)
פינצטההיסטיקהדגם משתנה

מקורות

  1. Forner, A., Reig, M., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 391 (10127), 1301-1314 (2018).
  2. Sun, Y. F., et al. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of CTCs by single-cell RNA-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 12 (1), 4091(2021).
  3. Calderaro, J., Couchy, G., Imbeaud, S. Histological subtypes of hepatocellular carcinoma are related to gene mutations and molecular tumour classification. J Hepatol. 67 (4), 727-738 (2017).
  4. Finn, R. S., Qin, S., Ikeda, M. Atezolizumab plus Bevacizumab in unresectable hepatocellular carcinoma. N Engl J Med. 384 (20), 1894-1905 (2020).
  5. Lin, C. C., Zhou, J. P., Liu, Y. P. The silencing of Pokemon attenuates the proliferation of hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo by inhibiting the PI3K/Akt pathway. PLoS One. 7 (12), e51916(2012).
  6. He, J. The lactate receptor HCAR1 drives the recruitment of immunosuppressive PMN-MDSCs in colorectal cancer. Nat Immunol. 26 (3), 391-403 (2025).
  7. Zhou, H. G., Guo, M. Y., Li, J. Y. Hypoxia-triggered self-assembly of ultrasmall iron oxide nanoparticles to amplify the imaging signal of a tumor. J Am Chem Soc. 143 (4), 1846-1853 (2021).
  8. Baker, A. M., Huang, W. N., Wang, X. M. Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution. Nat Commun. 8 (1), 1998(2017).
  9. Morrison, J. K. Single-cell transcriptomics reveals conserved cell identities and fibrogenic phenotypes in zebrafish and human liver. Hepatol Commun. 6 (7), 1711-1724 (2022).
  10. Qi, L., Liang, J. Y., Li, Z. W. Deep learning-derived spatial organization features on histology images predicts prognosis in colorectal liver metastasis patients after hepatectomy. iScience. 26 (10), 107702(2023).
  11. Aizarani, N., Saviano, A. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors. Nature. 572 (7768), 199-204 (2019).
  12. Tasdogan, A., Faubert, B., Ramesh, V. Metabolic heterogeneity confers differences in melanoma metastatic potential. Nature. 577 (7788), 115-120 (2020).
  13. Guo, D. Z. Single-cell tumor heterogeneity landscape of hepatocellular carcinoma: Unraveling the pro-metastatic subtype and its interaction loop with fibroblasts. Mol Cancer. 23 (1), 157(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

MTT
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.