הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שאיבת יתר וטיהור נוקלאז רעיל מ-Escherichia coli

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68577

⸱

29 באוגוסט 2025

 , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, College of Charleston

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר מתודולוגיה לביטוי יתר של Nsp15 רקומביננטי, נוקלאז רעיל, במערכת ביטוי C41(DE3), ואחריה טיהור החלבון המתויג באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה והדרת גודל. ניתן להתאים את הפרוטוקולים האלה לחלבונים רעילים מאתגרים אחרים.

תקציר

Escherichia coli נמצא בשימוש נרחב כמערכת ביטוי לייצור חלבונים רקומביננטיים. עם זאת, סוגים מסוימים של חלבונים רקומביננטיים, כגון נוקלאזות, יכולים להיות קשים לביטוי יתר רקומביננטי ב-E. coli בשל פעילותם האנזימטית על ה-DNA התאי או ה-RNA. השפעות רעילות כאלה עלולות להוביל לצמיחה איטית ולתפוקת חלבון ירודה. דוגמה אחת כזו היא האנדוריבונוקלאז Nsp15 מנגיפי קורונה: התשואות של גמא-קורונה מסוג פרא (WT) Nsp15 נמוכות בהרבה מ-Nsp15 לא פעיל מבחינה קטליטית. כדי לטפל בבעיה זו, השתמשנו בתאי C41 (DE3) ובתרביות התחלה של מושבה בודדת באותו יום כדי לסייע בהפחתת הרעילות. Nsp15 רקומביננטי המכיל תג N-terminal 6xHis-tag התבטא יתר על המידה וטוהר באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה מבוססת קובלט ואחריה כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC). התשואות המתקבלות של חלבון מטוהר מספיקות לבדיקות ביוכימיות ולמחקרים מבניים של מיקרוסקופ אלקטרונים. גישה זו הוכחה כיעילה בהפחתת ההשפעות הרעילות ובהשגת תפוקות חלבון משביעות רצון להמשך ניתוח מחקרי.

מבוא

Escherichia coli (E. coli) הוא חיידק הנמצא בשימוש נרחב לייצור חלבונים רקומביננטיים. זנים מוטנטיים רבים, כולל BL21(DE3) ונגזרותיו, פותחו כדי לבטא חלבוני מטרה1. התהליך מונע בדרך כלל על ידי בקטריופאג' T7 RNA פולימראז מקודד ומושרה עם איזופרופיל ß-D1-thiopalactopyranoside (IPTG), אנלוגי של לקטוז שיפעיל את אופרון הלאק על ידי שחרור מדכא הלק 1,2,3. מכיוון שהוא אינו ניתן להידרוליזה, יש ביטוי mRNA רציף וייצור חלבון גבוה יותר3.

בעוד שסוג זה של מערכת נוח ועקבי עבור חלבונים רבים, סוגים מסוימים של חלבונים רקומביננטיים גורמים לרעילות ב-E. coli, מה שמוביל לתפוקת חלבון ירודה. רעילות מנוכחות חלבון רקומביננטי המשפיע לרעה על החיידקים עשויה לנבוע מביטוי דולף לפני אינדוקציה או לחץ על החיידקים בעת השראת 3,4. התוצאה היא ירידה בקצב הצמיחה והכדאיות של חיידקים5. דיכוי ביטוי דולף יכול למלא תפקיד חשוב בביטוי מוצלח של חלבונים רעילים. זני ביטוי של E. coli עם פלסמידים pLysS (כלומר, BL21(DE3)pLysS, C41(DE3)pLysS וכו') מדכאים ביטוי דולף על ידי ביטוי ליזוזים T7 המעכב T7 פולימראז לפני השראת 6,7. זנים אחרים, כגון זנים C41(DE3) ו-C43(DE3), מכילים מוטציות המפחיתות את פעילות הפולימראז T7 על ידי הפחתת רמות ה-mRNA שלו, ומסלקות את פרוטאזות ה-lon וה-ompT 1,4,8,9,10. דיכוי ביטוי דולף או הפחתת קצב ייצור החלבון הרקומביננטי (באמצעות ויסות T7 פולימראז או ירידה בטמפרטורות) מסייע להגדיל את התפוקה של חלבונים רעילים 1,9.

נוקלאזות הן לרוב חלבונים רעילים וקשים לביטוי בעת שימוש במערכת ביטוי E. coli בשל פעילותם האנזימטית כלפי DNA תאי או RNA1. לדוגמה, האנדוריבונוקלאז Nsp15 שנמצא בנגיפי קורונה ונידו-וירוסים אחרים רעיל לחיידקים, וכתוצאה מכך קצב גדילה איטי יותר ויבול נמוך 11,12,13,14,15,16,17. בגלל תפקידו הקטליטי, פיצול 3' של אורידינים ב-RNA נגיפי, Nsp15 נחשב כפועל הן על עצמו והן על ה-mRNA התאי כאשר הוא מתבטא רקומביננטית, מה שגורם לחוסר ויסות של חילוף החומרים וביטוי חלבון רקומביננטי11,14. עבור Nsp15, אוליגומריזציה נחוצה לפעילות אנזימטית. מחקרים קודמים על בטא-קורונה (כגון SARS ו-SARS-CoV-2) Nsp15 הראו כי האנזים בעיקר אוליגומר להומוהקסמר בתמיסה, כאשר הצורה המונומרית אינה פעילה 16,18,19,20. כאשר עבר מוטציה ליצירת מונומרים בלבד, נצפו עליות משמעותיות ביבול14. בנוסף, בעת מוטציה של אחת המשקעים הקטליטיים בתוך השילוש הקטליטי לאלנין, נצפה ביטוי משופר באותם תנאים כמו ה-WT, מה שתומך עוד יותר בכך שהרעילות של Nsp15 ל-E. coli מונעת על ידי פעילות הנוקלאז שלו 13,16,17. בפרוטוקול זה, אנו מראים את ההבדל בתפוקה בין WT gamma-coronavirus (נגיף ברונכיטיס זיהומי) Nsp15 לבין גרסה קטליטית-מתה שהושגה על ידי מוטציה של אחד משאריות ההיסטידין הקטליטיות (H223A).

כאן אנו מתארים מתודולוגיה שלב אחר שלב לביטוי יתר של Nsp15 רקומביננטי במערכת ביטוי C41 (DE3), ואחריה טיהור חלבון באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה ואי הכללת גודל. N-terminal 6x His-tag עם כרומטוגרפיה של זיקה מתכתית משותקת מבוססת קובלט (IMAC) משמשת לבידוד החלבון. טיהור נוסף מבוצע באמצעות SEC כדי להפריד את Nsp15 לפי מצב אוליגומרי ולבודד את המינים ההקסמריים הפעילים. גישה זו מציעה שיטה לביטוי יתר וטיהור נוקלאזות רעילים למחקרים ביוכימיים ומבניים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנה למאגר וריאגנטים

  1. ריאגנטים לביטוי יתר
    1. הכן 1 ליטר של מדיה 2xTY על ידי שילוב של 16 גרם טריפטון, 10 גרם תמצית שמרים, 5 גרם נתרן כלורי (NaCl) ו-900 מ"ל מים נטולי יונים בבקבוק מבולבל של 2 ליטר. חיטוי הבקבוק למשך 30 דקות לפחות במחזור נוזלי.
      הערה: יש צורך בלפחות 2 ליטר של מדיה 2xTY לכל טיהור.
    2. הכן מלאי/ים אנטיביוטיים מתאימים לפלסמיד. עבור Nsp15-pET-14b, הכינו 15 מ"ל של 100 מ"ג/מ"ל אמפיצילין על ידי המסת 1.5 גרם אמפיצילין עם מים נטולי יונים בצינור חרוטי של 15 מ"ל. יש לאחסן את מלאי האנטיביוטיקה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד הצורך.
    3. הכן 250 מ"ל של חומר אגר מרק ליזוגני (LB) על ידי שילוב של 2.5 גרם טריפטון, 1.25 גרם תמצית שמרים, 2.5 גרם NaCl, 3.75 גרם אגרוז ו-250 מ"ל מים נטולי יונים בבקבוק זכוכית של 500 מ"ל. עקרו את התמיסה על ידי חיטוי למשך 30 דקות לפחות במחזור נוזלי והתקררו עד שהיא חמה למגע.
    4. הכן צלחות אגר LB בתוספת אמפיצילין על ידי העברת 25 מ"ל ממדיית האגר החמה של LB לבקבוק ארלנמאייר מעוקר של 250 מ"ל (25 מ"ל לצלחת להכנה). הוסף 25 מיקרוליטר של 100 מ"ג/מ"ל אמפיצילין לכל 25 מ"ל מדיה וסובב כדי לאחד את התוכן. בעזרת פיפטה סרולוגית, הוסיפו 25 מ"ל של תערובת מדיה לצלחת פטרי סטרילית מפלסטיק; הימנע מהכנסת בועות כלשהן.
      1. מנע זיהום על ידי ניגוב ספסל המעבדה באתנול 20% והדלקת מבער בונסן לשמירה על סטריליות בזמן מזיגת הצלחות.
      2. הניחו לצלחות להתקרר לפני שמאחסנים אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
    5. הכן 15 מ"ל של 1 M IPTG על ידי המסת 3.574 גרם IPTG עם מים נטולי יונים בצינור חרוטי של 15 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד הצורך. הימנע ממחזורי הקפאה/הפשרה חוזרים ונשנים על ידי הצעת מחיר לשלוש מנות של 5 מ"ל.
  2. ריאגנטים לטיהור
    הערה: יש להכין את כל הריאגנטים לפחות יום אחד לפני הטיהור
    1. הכן 250 מ"ל של מאגר ליזה (50 מ"מ Tris pH 8.0, 150 מ"מ NaCl, 5% גליצרול, 5 מ"מ אימידזול) ואחסן ב-4 מעלות צלזיוס.
    2. הכן 15 מ"ל של מאגר פליטה (50 מ"מ Tris pH 8.0, 150 מ"מ NaCl, 5% גליצרול, 250 מ"מ אימידזול) ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד הצורך.
    3. הכן 250 מ"ל של מאגר מחשוף (50 מ"מ HEPES pH 7.5, 150 מ"מ NaCl, 5% גליצרול) ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד הצורך.
    4. הכן 1 ליטר של מאגר SEC (20 מ"מ HEPES pH 7.5, 150 מ"מ NaCl, 5 מ"מ MnCl2) וסנן דרך מסנן PES של 0.22 מיקרומטר באמצעות סינון ואקום. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם FPLC.
    5. הכן 15 מ"ל של 1 M 4-(2-Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF) על ידי המסת 3.595 גרם של AEBSF עם מים נטולי יונים בצינור חרוטי של 15 מ"ל. הכינו 1 מ"ל בצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד הצורך.
    6. אופציונלי: הכן את תערובת המאגר לטעינת ג'ל של נתרן דודציל סולפט (SDS) על ידי דילול 200 מיקרוליטר של תמיסת מלאי (250 מ"מ Tris pH 6.8, 8% SDS, 0.1% ברומופנול כחול, 40% גליצרול, 100 מ"מ DTT) ב-400 מיקרוליטר של מים נטולי יונים.
    7. הכן צינורות דגימת ג'ל כדי לעקוב אחר הטיהור. העבירו 30 מיקרוליטר של מאגר טעינה 1x לכל צינור.
    8. הכן 1 ליטר של מאגר ריצה 10x Tris-Glycine על ידי המסת 30 גרם בסיס Tris, 144 גרם גליצין ו-20 גרם SDS, ב-1000 מ"ל מים נטולי יונים. לקבלת תמיסה 1x, יש לדלל 100 מ"ל מתמיסת 10x ב-900 מ"ל מים נטולי יונים בבקבוק של 1 ליטר. אחסן את שני הריאגנטים בטמפרטורת החדר עד לשימוש נוסף.

2. ביטוי יתר של Nsp15

הערה: יש לשמור על כל הריאגנטים והחומרים סטריליים ככל האפשר כדי למנוע את הסיכון לזיהום.

  1. שינוי
    1. הסר תאי C41(DE3) E. coli מ-80 מעלות צלזיוס כדי להפשיר למשך 10 דקות על קרח. פיפטה 1 מיקרוליטר של DNA פלסמיד לתוך צינור המכיל את תאי C41. תן לו לדגור על ידי ישיבה על קרח במשך 30 דקות.
      הערה: בעוד שריכוזי הפלסמידים עשויים להשתנות, עבור הנתונים המתוארים כאן, נוספו 10-20 ננוגרם של DNA לכל טרנספורמציה. הפרוטוקול המסחרי לתאי C41 (DE3) ממליץ על 10-50 ננוגרם DNA לכל טרנספורמציה. פרוטוקול זה חל על כל פלסמיד המשתמש במערכת המקדם T7; עם זאת, כאן פורסם בעבר pET14b המקודד פלסמיד Nsp15 מותאם לקודון, עם אתר TEV העוקב אחר אתר N-terminal 6xHis-tag ואתר מחשוף תרומבין, שונה על ידי החלפת SARS-CoV-2 Nsp15 ברצף IBV Nsp15 (GENBANK: WIL95322.1, 5989-6324)19.
    2. הנח את הצינור בגוש חום בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות כדי לחשמל את התאים כדי לקלוט את הפלסמידים. דגרו את הצינור על קרח למשך 2 דקות.
    3. פיפטה 200 מיקרוליטר של אמצעי התאוששות (SOC או מדיה עשירה אחרת) לתוך הצינור המכיל את תאי C41 (DE3) והפלסמידים. יש לנער ב-210 סל"ד למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.
    4. הסר את צלחות האגר LB בתוספת אמפיצילין מ-4 מעלות צלזיוס והניח באינקובטור שאינו רועד המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס.
    5. חיידקי פיפטה על צלחת האגר. בעזרת מפזר סטרילי מורחים את התאים על צלחת האגר. מניחים את הצלחת באינקובטור שאינו רועד המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס כדי לגדול במשך 14-16 שעות.

3. צמיחה

  1. קטיף מושבה בודדת
    הערה: נעשה שימוש בהתחלות של מושבה בודדת באותו יום במקום בתרבית התחלה של לילה על מנת לחסן תאים בשלב הצמיחה הלוגריתמי. עבור תרביות לילה, תאים נמצאים בדרך כלל בשלב נייח או מוות, במיוחד עם חלבונים רעילים. בנוסף, בהינתן זמני תרבית ארוכים יותר, מזהמים או מוטציות יכולים להתחרות בנוקלאז הרעיל.
    1. השתמש בבקבוק ארלנמאייר מעוקר אחד של 50 מ"ל עבור כל ליטר תרבית בתוספת 2-3 מנות ראשונות נוספות. סמן את אחת הצלוחיות בכוכב לבדיקת צפיפות אופטית (OD). ה-OD שנאסף מבקבוק זה ייצג את כל הגידול אלא אם כן יש הבדל חזותי בין הצלוחיות.
      הערה: צלוחיות ארלנמאייר נמצאו כמספקות אוורור טוב יותר מצינורות מתנע של 15 מ"ל.
    2. צור תערובת מאסטר של 2xTY בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה באמצעות נפח של 10 מ"ל x N מספר התחלות. לגידול של 4 ליטר, הכינו 6 תרביות התחלה. תערובת המאסטר תהיה 60 מיקרוליטר של מלאי אמפיצילין (מופשר מ-20 מעלות צלזיוס) ו-60 מ"ל של 2xTY (דילול של 1:1000). מערבבים כדי לערבב ומכניסים 10 מ"ל לכל ארלנמאייר.
    3. הסר את הצלחת שהפכה מהחממה. קוטפים מושבה בודדת ומבודדת מהצלחת בעזרת קיסם סטרילי או קצה פיפטה. מעבירים את הקיסם עם המושבה לבקבוק עם מדיה. חזור על הפעולה עד שכל בקבוק מכיל קיסם.
    4. מניחים את צלוחיות ההתחלה המחוסנות באינקובטור הרועד ב-210 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס. אפשר לצלוחיות המתנע לצמוח במשך ~5-7 שעות.
  2. חיסון תרבית
    1. לאחר 5 שעות, בדוק את ה-OD ב-600 ננומטר (OD600) של הבקבוק המסומן בכוכב באמצעות מיקרוקובט וספקטרומטר. מוציאים ומעבירים 1 מ"ל מהתרבית מהבקבוק למיקרו-קובטה. חזור על המדידות מעת לעת עד שה-OD600 יגיע ל-0.8-1.0.
    2. 30 דקות עד שעה לפני החיסון (כאשר OD600 מגיע ל-0.4), יש לחמם את 2 צלוחיות 2 ליטר 2xTY ב-37 מעלות צלזיוס. מדיה חמה מפחיתה את זמן ההשהיה לאחר החיסון בתרבית התחלתית.
    3. הפשירו מלאי אמפיצילין של 100 מ"ג/מ"ל מ-20 מעלות צלזיוס. לאחר השגת היעד OD600 , הכינו ארבע צלוחיות של 2 ליטר עם 1 ליטר של מדיה 2xTY על ידי הוספת 1 מ"ל של 100 מ"ג/מ"ל אמפיצילין (דילול של 1:1000).
    4. כדי לחסן יש למזוג את תכולת בקבוק ההתחלה לבקבוק אחד בנפח 2 ליטר. יש לחזור על הפעולה עד שכל בקבוק של 2 ליטר מחוסן. הימנע מלשפוך את הקיסם לבקבוק כדי להקל על קצירת התאים.
    5. הנח את צלוחיות 2 ליטר המחוסנות לתוך החממה הרועדת ב-210 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות לפני בדיקת ה-OD600 הראשון.
  3. אינדוקציה עם IPTG
    1. בדוק את ה-OD600 על ידי הוצאת 1 מ"ל מדיה מבקבוק עם פיפטה סרולוגית. חזור על הפעולה עד שה-OD600 יגיע ל-0.8-1.0.
    2. לאחר השגת היעד OD600 , הוסף 1 מ"ל של 1 M IPTG לריכוז סופי של 1 מ"מ (מופשר מ-20 מעלות צלזיוס) כדי לגרום לביטוי יתר.
    3. העבירו את צלוחיות 2 ליטר לחממה רועדת ב-210 סל"ד, 16 מעלות צלזיוס לאינדוקציה למשך הלילה (14-16 שעות).
      הערה: הטמפרטורה הקרה יותר תאט את הצמיחה של תאי E. coli , ותפחית את הרעילות על ידי האטת ייצור החלבון ופעילות הנוקלאז.
  4. קציר
    1. הסר את הצלוחיות המושרות מהחממה הרועדת ושפך את התכולה לבקבוקי צנטריפוגה נפרדים של 1 ליטר. אזנו את הבקבוקים באמצעות מים נטולי יונים. סובב את התאים ב-4500 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    2. הסר את הסופרנטנט והעביר את הכדור לצינור חרוטי של 50 מ"ל באמצעות מרית. שלב כדורים לצינור חרוטי יחיד. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

4. טיהור Nsp15

הערה: יש לשמור את כל המאגרים והצינורות על קרח. כל שלבי הצנטריפוגה צריכים להתבצע בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הפרוטוקול הבא מניח חלבון מתויג His.

אופציונלי: לאחר כל שלב, ניתן לקחת דגימות ג'ל כדי לעקוב אחר התקדמות הטיהור.

  1. ליזיס תאים והבהרת ליזאט
    1. השעו מחדש את גלולת החיידקים על ידי הוספת 2 מ"ל של מאגר ליזה לכל 1.2 גרם גלולה. הוסף 100 מיקרוליטר של 1 M AEBSF עבור כל 10 מ"ל של מאגר ליזה כמעכב פרוטאז. אם משתמשים בכדור משולב מ -4 ליטר, הוסף 100 מיקרוליטר של DNase I לריכוז סופי של 200 U.
      הערה: ניתן להחליף טבלית קוקטייל אחת של מעכב פרוטאז ללא EDTA לליטר כמעכב פרוטאז.
    2. מערבול בקצרה את תכולת הצינור למשך 30 שניות כדי לאפשר לגלולה ולמאגר להתערבב. העבירו את הגלולה המערבולת למטחנת רקמות של Dounce. בעזרת עלי רופף, הומוגניזציה של התוכן (~10 פעימות).
    3. העבירו את הדגימה ההומוגנית לכוס מתכת לסוניקציה.
      1. כדי להבטיח את קבלת הדגימה המקסימלית, שטפו את הצינור המכיל את הגלולה המקורית עם 5 מ"ל של מאגר ליזה ומערבלו את הצינור לזמן קצר. יוצקים את התוכן לתוך ההומוגנייזר של Dounce, מורחים ~5 משיכות ולאחר מכן מעבירים לכוס הסוניקציה.
    4. לכוס המתכת, הוסף 75 מיקרוליטר של Triton X-100 כדי לסייע בליזיס הממברנה והמסתה. הנח את המתכת באמבט קרח כדי להבטיח שהדגימה תישאר קרה במהלך הסוניקציה.
    5. הנח את בדיקת הסוניקציה בכוס המתכת ועשה סוניקציה של הדגימה למשך 6 דקות ו-30 שניות עם פולסים כל 2 שניות והגברה ב-70%.
      זהירות: השתמש בהגנה על שמיעה אם בדיקת הסוניקטור אינה סגורה.
    6. בעזרת פיפטה סרולוגית, העבירו את הליזאט לצינור צנטריפוגה. לאותו צינור, הוסף 1 M AEBSF בדילול של 1:100 כמעכב פרוטאז טרי. הבהירו את הליזאט באמצעות צנטריפוגה ב-26,915 x גרם למשך 50 דקות.
  2. כרומטוגרפיה של זיקה על ידי סינון כוח הכבידה
    הערה: שרף קובלט מפחית משמעותית קלסרי מתכת לא ספציפיים בהשוואה לשרף ניקל21.
    1. בזמן סוניקציה, השג 2 מ"ל של תמיסת שרף קובלט והשהה מחדש עם 25 מ"ל של מאגר ליזה בצינור חרוטי חדש. צנטריפוגה את השרף המושעה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 500 x גרם. לאחר הצנטריפוגה, שפכו את הסופרנטנט, והקפידו לא לאבד שרף.
    2. חזור על הפעולה עם שתי שטיפות חיץ נפרדות של 25 מ"ל ואחריה צנטריפוגה. אין לשפוך את חומר העל של הכביסה האחרונה עד שהוא מוכן לקשירת אצווה. כשהוא מוכן, שפכו את מאגר הליזיס משטיפת השרף האחרונה והשעו מחדש את השרף עם 10 מ"ל של מאגר ליזה טרי (10 מ"ל מאגר לכל 1 מ"ל שרף).
    3. הוסף את החלק המסיס לצינור ואפשר לחלבון המתויג פי 6 להיקשר לשרף על נדנדה למשך 45 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: אם נפח כריכת האצווה עולה על 50 מ"ל, בצע שלב זה בכוס של 250 מ"ל עם מוט ערבוב במהירות איטית מאוד ב-4 מעלות צלזיוס. העבירו את כל השרף לכוס בעת ביצוע שלב זה באמצעות מאגר ליזה.
    4. לאחר קשירת האצווה, שפכו את התכולה במורד עמוד סינון כוח הכבידה ואספו את הזרימה בבקבוק ארלנמאייר בנפח 125 מ"ל. התוכן בתוך הבקבוק צריך להיות כל חלבון שלא נקשר לשרף; Nsp15 המתויג שלו יהיה קשור לשרף. בעזרת בקבוק נפרד לאיסוף, שטפו את השרף עם 8 x 25 מ"ל של מאגר בסך הכל לפחות 200 מ"ל (~פי 5 מהנפח המקורי) באמצעות פיפטה סרולוגית.
      הערה: הוסף לאט את המאגר במורד צד העמוד ולא ישירות באמצע כדי למנוע הפרעה למיטת השרף, מה שעלול להוביל לכביסה לא יעילה או לא אחידה.
  3. פליטת חלבון
    1. יש לשטוף את ה-Nsp15 המתויג ב-His בשלושה מאגרים עם מאגר פליטה. אלוטיונים 1 ו-2 הם פליטות של 2 מ"ל, ופליטה 3 היא פליטה של 1 מ"ל.
    2. בצע בדיקת ברדפורד "מהירה ומלוכלכת" על ידי ביצוע דילול של 1:1 של ריאגנט ברדפורד במים. מעבירים 10 מיקרוליטר מכל פליטה לצינורות והופכים לערבוב. התמיסה צריכה להפוך לכחולה בנוכחות חלבון. העריכו את שינוי הצבע כדי לקבוע כיצד לשלב את האלוטים.
      הערה: אם הפליטות 1 ו-2 חזקות והפליטה 3 חלשה, שלב את הפליטות 1 ו-2 והמשיך. אם כולם חלשים, שלב את כל שלושת הצינורות.
  4. ריכוז חלבון ומחשוף תגים
    1. העבר את דגימת הפליטה המשולבת לרכז MWCO של 30 kD (או גודל מתאים לחלבון מעניין). יש לרכז את החלבון ל-≤2 מ"ל על ידי צנטריפוגה בחום של 3,000 x גרם למשך 10 דקות. העבירו את הדגימה המרוכזת לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל. העלה את נפח הדגימה הסופי ל-2 מ"ל עם מאגר מחשוף במידת הצורך.
    2. הכן עמוד התפלה חד פעמי (למשל, עמוד PD-10) לפי הוראות היצרן. הוסף את המדגם של 2 מ"ל לעמודה. הנח את העמוד לתוך צינור חרוטי נקי של 50 מ"ל והוציא על ידי צנטריפוגה ב-1,000 x גרם למשך 2 דקות.
      הערה: שלב זה מסיר במהירות את האימידזול, המפריע למחשוף התרומבין תוך הימנעות מצבירה הנגרמת על ידי ריכוז בעת שימוש ברכזי MWCO כדי לחצץ החלפה.
    3. לפליטה, הוסף β-Me ו-CaCl2, לריכוז סופי של 2 מ"מ כל אחד. הוסף 50 מיקרוליטר של מלאי תרומבין של 1 U/μL. לאחר הוספת כל הרכיבים, הניחו את הצינור על שייקר זקוף ואפשרו לתגובה לדגור בטמפרטורת החדר למשך 4 שעות בניעור עדין.
      הערה: מחשוף לילה ב-4 מעלות צלזיוס עשוי לעבוד עבור חלבונים מסוימים; תפוקות משופרות של Nsp15 נצפו עם מחשוף של 4 שעות ב-RT בהשוואה למחשוף של 4 מעלות צלזיוס בלילה.
    4. אזנו מחדש את עמודת סינון הכבידה במאגר המחשוף (שטפו 3x עם מאגר מחשוף של 25 מ"ל). ודא שזין העצירה סגור והוסף 5 מ"ל של מאגר מחשוף כדי למנוע את התייבשות השרף. אחסן את העמודה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך תקופת המחשוף.
  5. הפרדת חלבון מפוצל מחלבון His-tag וחלבון ללא גלישה
    1. בעזרת פיפטה סרולוגית, פיפטה בזהירות את תגובת המחשוף ישירות על השרף ואספו את הפליטה לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל.
    2. שוטפים את השרף עם 2 מ"ל של מאגר מחשוף ואוספים באותו צינור של 15 מ"ל. חזור על הפעולה בסך הכל שתי כביסות. בסיום, הוסף AEBSF לצינור כדי להרוות את התרומבין לקבלת ריכוז סופי של 10 מ"מ.
    3. העבר את דגימת המעבר מחדש לרכז MWCO חדש של 30 kD. רכז את החלבון עד ≤500 מיקרוליטר על ידי צנטריפוגה ב-3,000 x גרם למשך 10 דקות. העבירו את הדגימה המרוכזת לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 0.5 מ"ל.
  6. כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל
    1. הפעל עמודה אנליטית להגדלת S200 (או עמודת גודל מתאימה אחרת לחלבון המעניין) בהתאם למפרט היצרן. אזנו במאגר SEC והגדירו את גודל שבר ה-FPLC ל-500 מיקרוליטר.
    2. העבירו צינורות שבר נבחרים מהפסגות לצינורות מיקרו-צנטריפוגה חדשים של 1.5 מ"ל והוסיפו 2.5 מיקרוליטר של 1 M DTT (ריכוז סופי של 5 מ"מ) לכל שבר כדי לשמור על ה-Nsp15 המטוהר מופחת.
    3. מדוד את ערכי A280 של כל שבר באמצעות ננו-ספקטרופוטומטר. רוקן את המכשיר עם מאגר SEC לפני איסוף המדידות. אחסן את דגימות ה-Nsp15 המטוהרות ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
  7. אופציונלי: בדיקת טיהור
    1. מחממים את צינורות דגימת הג'ל על גוש חום של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צנטריפוגה קצרה של הצינורות לאחר החימום כדי לסובב כל עיבוי. טען את הדגימות על 4-20% ג'ל/s Mini-Protean TGX נטול כתמים והפעל ב-300 וולט למשך 17 דקות. דמיין את הג'ל/ים כדי לבדוק את הטוהר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בשל הרעילות של Nsp15 כנוקלאז, נדרשו בדרך כלל ~7 שעות כדי שתרביות ההתחלה יגיעו ל-OD600 של 0.8-1.0. לאחר החיסון, נדרשו בדרך כלל ~3-5 שעות לאותו OD600 אופטימלי של 0.8-1.0 לזירוז. במקרה זה, זמן ההכפלה נראה כ~1 שעה. כאשר התבטאה מוטציה קטליטית-מתה של Nsp15, ההכפלה של תאי E. coli נראתה נורמלית (~20 דקות), עדות נוספת לכך שפעילות הנוקלאז אחראית לרעילות (איור 1A).

לאחר השראת לילה, נקטפו בדרך כלל 6-9 גרם של כדור תאים במשקל רטוב לכל גידול של 2 ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הצגנו פרוטוקול מפורט המביא לביטוי יתר מוצלח ב- E. coli של נוקלאז רעיל וטיהור באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה ואי הכללת גודל. יישום של תרביות התחלה של מושבה בודדת של 10 מ"ל באותו יום במקום תרביות התחלה בן לילה הגדיל את העקביות בזמני הגידול ובתפוקות החלבון על פני הגידולים. בחרנו להשתמש בתאי C41(DE3), המכילים מוטציות המפחיתות את פעילות T7 פולימראז, כדי לסייע בניהול רעילות חלבון רקומביננטי 1,4,8,9,10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים לא מדווחים על ניגודי אינטרסים.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי מימון הסטארט-אפ של בית הספר למדעי הטבע והסביבה של מכללת צ'רלסטון, מחקר לתואר ראשון ופעילויות יצירתיות של מכללת צ'רלסטון מחקר קיץ לתואר ראשון עם מענק פקולטה, ופרס משנה SC INBRE DRP מ-P20GM103499.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.22 ומיקרו; m PES, סטריליזציה, כריכת חלבון נמוכה, מערכת סינון, 1 ליטרקורנינג431098
מעכב סרין פרוטאז AEBSFגולדביו30827-99-7
אגר, בקטריולוגיאמרסקוJ637
Ä מערכת טיהור KTA goציטיבה29383015
רכז Amicon Ultra 15 מ"ל, 30 kDa MWCOמיליפורUFC903024
אמפיצילין נתרןגולדביוא-301-25
צלוחיות טלטול מבולבלותנלג'ין F0527
צנטריפוגה ספסלאפנדורף 5920R
ביופוטומטר פלוסאפנדורףE-BP6132
טרומבין בקרביופארם91-030
מגיב צבע ברדפורדבוסטון ביופרודקטסBPA-200
כחול ברומופנולסיגמא-אולדריץ'114931
סידן כלוריסיגמא-אולדריץ'C4901
אמבטיה יבשה דיגיטליתביו ראד1660562
מפזרים חד פעמיים, בצורת Lשותפי MedSupply62-1014-1
דיתיותרייטולגולדביו27565-41-9
DNaseI מלבלב בקרסיגמא-אולדריץ'D4527
מטחנת רקמות דוס, 40 מ"לויטון357546
עמודות כרומגטוגרפיה של עמודות חסכוניותביו-ראד737-1532
מערבל אגוזים אנדורו מינימיקסלבנטS0600
אתנולסיגמא-אולדריץ'459844
אקסלה E25R Inc/Ref שייקראפנדורףNB-E25R
FastPette V2לבנטעמ' 2000
רוטור זווית קבועה Fiberlite F10-4x1000 LEXתרמו פישר סיינטיפיק096-041075
רוטור זווית קבועה Fiberlite F21-8x50yתרמו פישר סיינטיפיק096-084275
ג'ל דוק EZ Imagerביו-ראד1708270
גליצרולסיגמא-אלריךG5516
גליציןביו-ראד161-0718
הפססיגמא-אולדריץ'H3375
בוחש פלטה חמהVWR12365-346
חומצה הידרוכלוריתVWRBDH3028
אימידזולגולדביוI-902-25
איזופרופיל-ß-D-תיוגלקטיוזיד (IPTG)גולדביוקוד 12481ג25
Lemo21(DE3) תאי E. coli מוכשריםמעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנדC2528J
מנגן (II) כלוריד טטרהידרטסיגמא-אולדריץ'M3634
צינורות מיקרוצנטריפוגה, 0.5 מ"לVWR87003-290
צינורות מיקרוצנטריפוגה, 1.7 מ"לשותפי MedSupply15-1151
צינורות מיקרוצנטריפוגה, 2 מ"לאקסיג'ןMCT-200-C
תא אלקטרופורזה אנכי Mini-PROTEAN טטרהביו-ראד10025025
ג'ל מיני-פרוטאן טריס-גליצין, 4-20%ביו-ראד4568094
צנטרפוגה מיני MyFugeשותפי MedSupplyC1008-B
בקבוק צנטריפוגה סופר מהיר של Nalgene 1 ליטרתרמו פישר סיינטיפיק3141-1006
צינור צנטריפוגה רכס אלון נלג'יןתרמו פישר סיינטיפיק31139-0050
ננופוטומטראימפלן3769
אינקובטור שאינו רועדלבנטא 5110 
תאים בעלי יכולת כימית C41 (DE3) יתר על המידהטכנולוגיות Biosearch60442-1
תאים בעלי יכולת כימית C41 (DE3) יתר על המידהסיגמא-אולדריץ'CMC0017הופסק; תאי Biosearch C41(DE3) או תאי NEB Lemo21 הם אלטרנטיבה
צלחות פטרישותפי MedSupply62-1077-3
פלסמידים (עמוד שדרה pET-14b)ג'נסקריפטהזמנה מותאמת אישית
מיקרו-קובטות פלסטיקפישר סיינטיפיק14955127
ספק כוח PowerPacuniversalביו-ראד1645070
מחט החלקה מדויקתבקטון דיקסון305198
תקני דיוק פלוס חלבון ללא כתמיםביו-ראד1610363
אמצעי התאוששות לביטוי סיגמא-אולדריץ'CMR0001K
רוטור דלי מתנדנד S-4x1000אפנדורףEP-S4X1
פיפטה סרולוגית, 10 מ"לפאקלון357551
פיפטה סרולוגית, 25 מ"לפאקלון35725
פיפטה סרולוגית, 5 מ"לפאקלון35743
פיפטה סרולוגית, 50 מ"לPr1maPR-סרו-50
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ'S9888
נתרן דודציל סולפטסיגמא-אולדריץ'L3771
נתרן הידרוקסידסיגמא-אולדריץ'567530
מפרק סוניקפישר סיינטיפיקFB505
צנטריפוגה Sorvall Lynx 4000תרמו פישר סיינטיפיק75006580
עמודת Spephadex G-25 M PD-10ציטיבה17085101
ß-מרקפטואתנולמיליפור444203
גריפין מפלדת אל-חלדכלי קוטבברקוד 13977-010-EA
צינורות בז סטריליים, 15 מ"לבז352097
צינורות בז סטריליים, 50 מ"לבז352098
טור Superdex 200 10/300 GLציטיבה28990944
מזרקים, 1 מ"לאייר-טיט א1
מזרקים, 3 מ"לבקטון דיקסון309657
שרף זיקה מתכת TALONטאקארה635503
קיסמיםרחוב היצירתיותPAC3690-01
בסיס טריסגולדביוטי-400-1
טריטון X-100MP ביומדיקל807423
טריפטוןמוצרי מחקר בינלאומייםT60065
וורנדואמת מידהBV101-G
תמצית שמריםמוצרי מחקר בינלאומייםY20025

מקורות

  1. Francis, D. M., Page, R. Strategies to optimize protein expression in E. coli. Curr Protoc Protein Sci. 61 (1), 5.24.1-5.24.29 (2010).
  2. Dumon-Seignovert, L., Cariot, G., Vuillard, L. The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3). Protein Expr Purif. 37 (1), 203-206 (2004).
  3. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol. 5, 1-17 (2014).
  4. Wagner, S., et al. Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).
  5. Kato, Y. Extremely low leakage expression systems using dual transcriptional-translational control for toxic protein production. Int J Mol Sci. 21 (3), 705(2020).
  6. Dubendorf, J. W., Studier, F. W. Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. J Mol Biol. 219 (1), 45-59 (1991).
  7. Studier, F. W. Use of bacteriophage T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression system. J Mol Biol. 219 (1), 37-44 (1991).
  8. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
  9. Schlegel, S., Genevaux, P., de Gier, J. W. De-convoluting the genetic adaptations of E. coli C41(DE3) in real time reveals how alleviating protein production stress improves yields. Cell Rep. 10 (10), 1758-1766 (2015).
  10. James, J., et al. Protein over-expression in Escherichia coli triggers adaptation analogous to antimicrobial resistance. Microb Cell Fact. 20 (1), 13(2021).
  11. Shi, Y., et al. A dimerization-dependent mechanism drives the endoribonuclease function of porcine reproductive and respiratory syndrome virus nsp11. J Virol. 90 (9), 4579-4592 (2016).
  12. Nedialkova, D. D., et al. Biochemical characterization of arterivirus nonstructural protein 11 reveals the nidovirus-wide conservation of a replicative endoribonuclease. J Virol. 83 (11), 5671-5682 (2009).
  13. Zhao, J., et al. Coronavirus endoribonuclease ensures efficient viral replication and prevents protein kinase R activation. J Virol. 95 (7), e02103-e02120 (2021).
  14. Joseph, J. S., et al. Crystal structure of a monomeric form of severe acute respiratory syndrome coronavirus endonuclease nsp15 suggests a role for hexamerization as an allosteric switch. J Virol. 81 (12), 6700-6708 (2007).
  15. Xie, Y., et al. Diversity for endoribonuclease nsp15-mediated regulation of alpha-coronavirus propagation and virulence. Microbiol Spectr. 11 (6), e02209-e02223 (2023).
  16. Guarino, L. A., Bhardwaj, K., Dong, W., Sun, J., Holzenburg, A., Kao, C. Mutational analysis of the SARS virus nsp15 endoribonuclease: identification of residues affecting hexamer formation. J Mol Biol. 353 (5), 1106-1117 (2005).
  17. Xu, X., et al. New antiviral target revealed by the hexameric structure of mouse hepatitis virus nonstructural protein nsp15. J Virol. 80 (16), 7909-7917 (2006).
  18. Bhardwaj, K., et al. Structural and functional analyses of the severe acute respiratory syndrome coronavirus endoribonuclease nsp15. J Biol Chem. 283 (6), 3655-3664 (2008).
  19. Pillon, M. C., et al. Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics. Nat Commun. 12 (1), 636(2021).
  20. Kim, Y., et al. Crystal structure of nsp15 endoribonuclease NendoU from SARS-CoV-2. Protein Sci. 29 (7), 1596-1605 (2020).
  21. Chaga, G., Hopp, J., Nelson, P. Immobilized metal ion affinity chromatography on Co2+ carboxymethylaspartate-agarose Superflow, as demonstrated by one-step purification of lactate dehydrogenase from chicken breast muscle. Biotechnol Appl Biochem. 29 (1), 19-24 (1999).
  22. Cao, J., Wu, C. C., Lin, T. L. Turkey coronavirus non-structure protein NSP15 - an endoribonuclease. Intervirology. 51 (5), 342-351 (2008).
  23. Andersen, K. R., Leksa, N. C., Schwartz, T. U. Optimized E. coli expression strain LOBSTR eliminates common contaminants from His-tag purification. Proteins. 81 (11), 1857-1861 (2013).
  24. Saida, F., Uzan, M., Odaert, B., Bontems, F. Expression of highly toxic genes in E. coli: special strategies and genetic tools. Curr Protein Pept Sci. 7 (1), 47-56 (2006).
  25. Godoy, A. S., et al. Allosteric regulation and crystallographic fragment screening of SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 51 (10), 5255-5270 (2023).
  26. Otter, C. J., et al. SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease antagonizes dsRNA-induced antiviral signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (15), e2320194121(2024).
  27. Wang, X., Zhu, B. SARS-CoV-2 nsp15 preferentially degrades AU-rich dsRNA via its dsRNA nickase activity. Nucleic Acids Res. 52 (9), 5257-5272 (2024).
  28. Zheng, A., et al. Insight into the evolution of nidovirus endoribonuclease based on the finding that nsp15 from porcine deltacoronavirus functions as a dimer. J Biol Chem. 293 (31), 12054-12067 (2018).
  29. Huang, T., et al. Kinetic analysis of RNA cleavage by coronavirus nsp15 endonuclease: evidence for acid-base catalysis and substrate-dependent metal ion activation. J Biol Chem. 299 (6), 104787(2023).
  30. Zhang, L., et al. Structural and biochemical characterization of endoribonuclease nsp15 encoded by Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Virol. 92 (22), e00893-e00918 (2018).
  31. Jernigan, R. J., et al. Room-temperature structural studies of SARS-CoV-2 protein NendoU with an X-ray free-electron laser. Structure. 31 (2), 138-151.e5 (2023).
  32. Ricagno, S., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of nsp15 from SARS coronavirus. Acta Crystallogr F Struct Biol Cryst Commun. 62 (4), 409-411 (2006).
  33. Canal, B., et al. Identifying SARS-CoV-2 antiviral compounds by screening for small molecule inhibitors of nsp15 endoribonuclease. Biochem J. 478 (13), 2465-2479 (2021).
  34. Bhardwaj, K., Guarino, L., Kao, C. C. The severe acute respiratory syndrome coronavirus nsp15 protein is an endoribonuclease that prefers manganese as a cofactor. J Virol. 78 (22), 12218-12224 (2004).
  35. De Marco, A. Strategies for successful recombinant expression of disulfide bond-dependent proteins in Escherichia coli. Microb Cell Fact. 8 (1), 26(2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

ביטוי יתר של חלבוןכרומטוגרפיית זיקהכרומטוגרפיית ה exclusion של גודלניקוי Nsp15ביטוי חלבון רקומביננטימיקרוסקופיה אלקטרונית קריוגנית (Cryo-EM)בדיקת שסוע RNAהסרת תג His
שאיבת יתר וטיהור נוקלאז רעיל מ-Escherichia coli
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.