מאמר שיטה

חילוץ היסטונים מדגימות קליניות לפרופיל אפיגנטי באמצעות ספקטרומטריית מסה

DOI:

10.3791/68584

⸱

21 בנובמבר 2025

 ,  , 
1Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS, 2Department of Oncology and Hematology-Oncology (DIPO), University of Milan

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מאפשר חילוץ היסטונים יעיל מדגימות קליניות שונות לניתוח לאחר שינוי תרגומי על ידי LC-MS/MS. על ידי הקלה על זיהוי חזק של שינויים מרכזיים בהיסטונים, היא משמשת ככלי חשוב לפרופילינג אפיגנטי מקיף בקבוצות קליניות גדולות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ראיות ניסיוניות נרחבות תומכות בתפקיד המנגנונים האפיגנטיים בהופעת, התקדמות וחזרת סרטן. מבין אלה, וריאנטים של היסטונים והשינויים שלאחר התרגום (PTMs) שלהם מווסתים את ארגון ודינמיקת הכרומטין, ואת נגישות הגנום, ובכך משפיעים על תהליכים מרכזיים מבוססי DNA, כגון שעתוק, שכפול ותיקון נזקי DNA באמצעות מה שמכונה קוד ההיסטון. דפוסי PTM היסטונים לא מוסדרים נצפים לעיתים קרובות בסרטן, כאשר חלק מהסמנים הוכחו כמשמשים כסמנים אבחנתיים ופרוגנוסטיים. לכן, שיטות חדשניות המאפשרות פרופיל PTM היסטוני בלתי מוטה ומקיף בדגימות קליניות הן בעלות ערך רב לאפיון הנופים האפיגנטיים של הגידולים. כאן אנו מציגים פרוטוקול להפקה יעילה של היסטונים מדגימות קליניות, כולל ביופסיות קפואות במהירות, קפוא בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT), וביופסיות מוטמעות-פרפין (FFPE) עם פורמלין קבוע. גישה זו מניבה חלבוני היסטון בכמות ואיכות מספקת לניתוח מלמטה למעלה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשילוב עם ספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS/MS). תהליך עבודה זה מאפשר גילוי וכימות חזק של שינויים מרכזיים בהיסטונים, במיוחד אצטילציות ליזין ומתילציות, בדגימות גידול ראשוניות, ומספק שכבה מולקולרית נוספת לאפיון סרטן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בגרעין התאים האאוקריוטיים, היסטונים מתאספים עם ה-DNA ליצירת הנוקלאוזומים, היחידות המבניות הבסיסיות של הכרומטין. כל נוקלאוזום מורכב מכ-146 bp של DNA העטוף סביב אוקטמר המורכב משני עותקים של היסטונים הליבתיים H2A ו-H2B, יחד עם שני דימרים של היסטונים H3 ו-H4. בנוסף, קיים גם מקשר היסטון H1 שמסייע לארגון כרומטין בסדר גבוה על ידי קישור המתיחה של הנוקלאוזום וה-DNA המקשר בין נוקלאוזומים1. היסטונים מעוטרים במגוון רחב של שינויים פוסט-תרגומיים (PTMs) שנמצאים בעיקר בזנב הקצה ה-N שלהם. שינויים אלו כוללים מתילציה, סוגים שונים של אצילציה (אצטילציה, פרופיונילציה, בוטירילציה וכו'), פוספורילציה, SUMOylation, יוביקוויטילציה, ADP-ריבוזילציה וקרוטונילציה, ביניהם מתילציה של ליזין וארגינין ואצטילציה של ליזין הם הבולטים2. הסוגים, המיקומים והשילובים הספציפיים של שינויים בהיסטון יוצרים את מה שמכונה קוד ההיסטון. קוד זה מורכב משינויים פוסט-תרגומיים (PTMs) שונים בזנבות ה-N-טרמינליים של ההיסטונים, אשר מתווספים ומוסרים על ידי אנזימים ספציפיים שמשנים היסטונים. שינויים אלו מזוהים על ידי חלבוני אפקטור, מה שמוביל לשינויים במבנה הכרומטין, כגון דחיסה או דה-קונקונזציה, המשפיעים בסופו של דבר על מספר תהליכים ביולוגיים, כולל תיקון נזק DNA, שכפול, ובמיוחד שעתוק גנים 3,4.

מתילציה של DNA ו-PTMs של היסטונים הם בין התכונות האפיגנטיות שנחקרו ביותר בסרטן3. עדויות ניסיוניות עדכניות הראו שינויים ברמות של PTMs היסטונים שונים במספר סוגי סרטן. ראוי לציין כי אובדן H4K20me3 ו-H4K16ac דווח כסימני היכר של סרטן, שכן נמצא כי רמתם ירדה כמעט בכל הגידולים בהשוואה לרקמות תקינות4. הקבוצה שלנו זיהתה את אובדן H3K14ac כסימן פוטנציאלי לסרטן על ידי כימות הפחתתו במספר סוגי סרטן בהשוואה לעמיתים רגילים באמצעות גישות מבוססות ספקטרומטריית מסה(MS) 5. יתרה מזאת, מחקרים רבים הדגישו את הערך הפרוגנוסטי של PTMs היסטונים, והראו כי שינויים ברמות הגלובליות שלהם, שנבדקו בעיקר על ידי אימונוהיסטוכימיה בביופסיות של מטופלים, קשורים להתקדמות סרטן, דירוג היסטולוגי ותגובה טיפולית 6,7,8. לכן, ניתוח PTM היסטוני בדגימות סרטן חשוב לזיהוי סמנים ביולוגיים אבחנתיים ותחזיתיים חדשים, וכן מטרות פוטנציאליות של מה שמכונה אפי-תרופות8.

שיטות נפוצות מאוד לניתוח PTMs היסטונים בקווי תאים ובדגימות קליניות מסתמכות על טכניקות מבוססות נוגדנים, כגון אימונובלוטינג, אימונוהיסטוכימיה ובדיקת אימונוסורבנט מקושרת באנזימים (ELISA)9. עם זאת, שיטות מבוססות נוגדנים סובלות ממגבלות שונות, כולל תגובתיות צולבת או, להפך, מסכת אפיטופים10. תגובתיות צולבת מתרחשת כאשר נוגדנים נקשרים למטרות לא מכוונות עם אפיטופים דומים, מה שמוביל לתוצאות חיוביות שגויות פוטנציאליות, בעוד שהסתרת אפיטופים מתייחסת לאיתור של אפיטופ מסוים (PTM היסטוני או וריאנט, במקרה זה) עקב נוכחות של שינויים נוספים בשאריות השכנים. יתרה מזאת, כמות הרקמה הנדרשת לניתוח שינוי היסטונים באמצעות נוגדנים היא לעיתים גבוהה, שכן ניתן לזהות רק מספר מוגבל של PTMs בו-זמנית, ולכן יש לעבד מספר פרוסות רקמה לניתוחים מרובבים11. ספקטרומטריית מסה (MS) הפכה לשיטה המועדפת לפרופיל של PTMs היסטונים ווריאנטים, תוך התגברות על המגבלות של גישות מבוססות נוגדנים 5,8. טרשת נפוצה מתבססת על זיהוי הבדל במסה (Δm, מסה דלתא) בין המסות התיאורטיות והנמדדות בניסוי של פפטידים וחלבונים. הוא בלתי מוטה, מקיף וכמותי, שכן הוא מאפשר זיהוי וכימות של PTMs וגרסאות מבלי לדרוש ידע מראש על האתר שלהם. דבר זה הופך את טרשת נפוצה לבעלת ערך מיוחד לניתוח רגיש ומדויק של שינויים ב-PTM של היסטונים בסרטןובמצבים פתולוגיים נוספים.

כאן אנו מתארים פרוטוקול אופטימלי להפקת היסטונים מדגימות קליניות, בשילוב עם פרופיל מבוסס טרשת נפוצה של PTMs היסטונים, שנקרא לאחר מכן תהליך עבודה אפי-פרוטאומיקס. ביופסיות מטופלים מאוחסנות בעיקר כדגימות קפואות טריות (FF), דגימות קפואות בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT), ודגימות פרפין מוטמעות-פורמלין (FFPE)12. בעוד שביופסיות טריות מוקפאות במהירות בחנקן נוזלי או איזופנטן מקורר מראש ללא תוספת של מדיום שימור13, ביופסיות קפואות ב-OCT מכילות מדיום הטמעה מקריאו מסיס במים, המורכב בעיקר מפוליוויניל אלכוהול ופוליאתילן גליקול, שמקל על חיתוך רקמות14. דגימות FFPE, לעומת זאת, מקובעות בפורמלין ומוטמעות בפארפין, מייצגות את שיטת האחסון הנפוצה ביותר לדגימות קליניות, שכן ניתן לאחסן אותן בטמפרטורת החדר במשך מספר שנים, וכך לחסוך תחזוקה יקרה בטמפרטורות נמוכות או נמוכות במיוחד15. בהיותם נקיים מתוספי שימור, ביופסיות מוקפאות במהירות יכולות להיות מעובדות ישירות לצורך הפקת היסטונים, בעוד שביופסיות OCT ו-FFPE דורשות שלבים ראשוניים של הסרת תווך/קיבוע משובץ. דגימות FFPE זקוקות גם לפירוק חלבונים נרחב ולשחזור אנטיגן.

פרוטוקול זה מפרט שיטות מפורטות להפקת היסטונים מדגימות קליניות מוקפאות טריות, משובצות OCT ודגימות FFPE, ומבטיח כמות ואיכות מספקות לניתוח טרשת נפוצה במורד הזרם תוך התחשבות באתגרים הספציפיים הקשורים לכל סוג של שימור דגימות (שלב 1). היסטונים שטוהרו מדגימות קליניות מופרדים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל חלבון בתנאי שינוי (SDS-PAGE), לאחר מכן שלב נגזרות, ומתעכלים אנזימטית ליצירת פפטידים באורך מתאים (4-15 חומצות אמינו) לניתוח ספקטרומטריית מסהמלמטה למעלה 16 (שלב 2). באופן מדויק יותר, היסטונים מתעכלים באסטרטגיה דמוית ArgC, שבה טריפסין, שלבדרך כלל חותך בקצה C של ליזינים (K) וארגינינים (R) לא מעודדים, מושרה לחתוך רק בקצה C של ארגינינים, בעקבות אקילציה כימית קודמת של ליזינים לא מתואמים ומונומתילטים עם אנידריק פרופיוני (PRO). לאחר מכן, פפטידים היסטונים מעוכלים דמויי Arg-C עוברים אצילציה בזנב הקצה ה-N שלהם על ידי הוספת פניל איזוציאנאט (PIC). גזירה נוספת זו מגבירה את ההידרופוביות של פפטידים ומאפשרת הפרדה טובה יותר של פפטידי היסטון קצרים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בפאזה הפוכה (RP-HPLC), מה שמשפר את זיהוי וכימות הפפטידידופורמים איזובאריים17,18 (שלב 3). בסך הכול, השיטות המתוארות כאן מדגישות את כוחו של פרופיל היסטונים מבוסס טרשת נפוצה במחקרי אפיגנטיקה של סרטן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביופסיות רקמה מוקפאות טריות ומוקפאות ב-OCT התקבלו בהסכמה מדעת ממטופלים שעברו ניתוח במכון האירופי לאונקולוגיה (מילאנו), בעוד שביופסיות FFPE התקבלו ממטופלים שעברו ניתוח במכון הנוירולוגי קרלו בסטה (מילאנו). מחקר זה אושר על ידי הוועדה האתית של המכון האירופי לאונקולוגיה (מחקר UID 2550) ועל ידי המכון הנוירולוגי קרלו בסטה (מחקר CET 39/24).

1. חילוץ היסטונים מרקמות שמקורן במטופל (איור 1A)

הערה: כדי לנתח היסטונים מאוכלוסיות תאי גידול מייצגות ולהפחתת שונות בין דגימות, מומלץ להשתמש בביופסיות קליניות עם תאי גידול של לפחות 50% וללא אזורים נמקיים ו/או חדירה חיסונית נרחבת.

  1. העשרת היסטונים מרקמות קפואות טריות (משך משוער: 60 דקות)
    הערה: כל השלבים חייבים להתבצע על הקרח.
    1. הפשיר את הרקמה על קרח וחתוך חתיכה של כ-20-30 מ"ג, בדרך כלל בגודל של כ-2 מ"מ 3 של רקמה.
    2. העבר את הדגימה לצינור בנפח 1.5 מ"ל וטחן את הרקמה לחתיכות קטנות באמצעות מספריים (טבלת חומרים).
    3. הוסיפו 1 מ"ל של בופר בידוד גרעינים (טבלה 1) עם תוספת טרייה של מעכבי פרוטאז המפורטים בטבלת החומרים. ערבב טוב אחר כך.
    4. העבר את הדגימה להומוגניזר Dounce (טבלת חומרים).
      הערה: בנוכחות חתיכות רקמה גדולות, השתמש בקצה p1000 (לאחר חיתוך הקצה במספריים) כדי לאסוף את הדגימה בצורה טובה יותר.
    5. הומוגניזציה של הרקמה על ידי שימוש קודם ב-LOOSE ואז ב-TIGHT (טבלת החומרים) עד שחתיכות הרקמה הופכות לבלתי נראות לעין בלתי.
    6. סינן את הדגימה ההומוגנית דרך מסננת תאים בגודל 100 מיקרון (טבלת חומרים) להסרת שאריות רקמה.
    7. פיפטה מעלה ומטה בעוצמה עם p200 כדי להמיס את ממברנת הפלזמה ולהעביר את הדגימה לצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל.
    8. פלט את גרעיני התאים בצנטריפוגה ב-2,300 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס באמצעות צנטריפוגה על שולחן (טבלת חומרים).
    9. השליכו את הסופרנטנט והחזירו את הכדורים הגרעיניים ל-50-100 מיקרוליטר של בופר בידוד גרעינים, עם תוספת של 0.1% SDS להמסה של הממברנה הגרעינית (טבלת החומרים).
    10. הוסיפו 250 U של נוקלאז בנזונאז לעיכול חומצות גרעין, ערבבו היטב ודגרו במשך 2 דקות בטמפרטורה של 37°C (טבלת החומרים).
      הערה: אם הדגימה עדיין צמיגית, ניתן לבצע סוניקציה גם באמבט מים (הגדרה: 10 דקות 30 שניות הפעלה/30 שניות כבוי; עוצמה: גבוהה; טמפרטורה: 4 מעלות צלזיוס). לאחר שלב זה, ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -20°C.
  2. העשרת היסטונים מדגימות OCT (משך משוער: 90 דקות)
    הערה: פרוטוקול זה מותאם ל-4/5 חתכי OCT בעובי 10 מיקרון, המתאימים ל-20-60 מ"ג רקמה. עם זאת, מספר חתכי הרקמה תלוי בסוג הביופסיה הקלינית ובשטח הכולל של הרקמה. בהתחשב במחסור בדגימות קליניות, ניתן לבצע חילוץ מכמות נמוכה יותר של רקמת התחלה, אף על פי שזה עלול להוביל לירידה בזיהוי שינויים בהיסטונים.
    1. הניחו ארבע/חמישה חתכי רקמה בעובי 10 מיקרון, המתאימים לכ-20-60 מ"ג רקמה, בצינור בנפח 1.5 מ"ל.
    2. שטפו את החלקים ב-1 מ"ל של EtOH קר כקרח עם 70% (טבלה 1) למשך 2 דקות על גלגל מסתובב (טבלת החומרים) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    3. צנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה על שולחן.
    4. חזור על שלבים 1.2.2 ו-1.2.3 בסך הכל פי 3.
    5. יש להחזיר את הדגימות ב-1 מ"ל מים מזוקקים כפול (ddH2O) עם סיבוב (טבלת החומרים) למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    6. צנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה על שולחן (טבלת חומרים).
    7. חזור על שלבים 1.2.5 ו-1.2.6 פעמיים עם 1x PBS (טבלת חומרים).
    8. המשך לשלב 1.1.2 של פרוטוקול ההעשרה מדגימות קפואות טריות.
  3. הפקת היסטונים מדגימות FFPE (משך משוער: 8 שעות)
    הערה: הפרוטוקול המתואר פותח עבור ארבעה חתכי FFPE בעובי 10 מיקרון, המתאימים לכ-20-60 מ"ג רקמה. ברוב ניתוחי ה-MS של שינויים בהיסטונים, כמות זו היא מופרזת ומייצגת נקודת התחלה בטוחה כאשר החומר אינו מוגבל. עם זאת, ניתן גם להשתמש בפחות חומר התחלתי, דבר רלוונטי במיוחד לאור כמות הרקמה הקטנה לעיתים הזמינה בעת ניתוח דגימות קליניות. השימוש בפחות חומר התחלתי, אף שהוא אפשרי, בדרך כלל מפחית את עמידות הכימות עבור שינויים בהיסטונים בעלי שפע נמוך (למשל, H3K27ac, או פפטידי H3K27/K36 מרובי מתילטים), והשפעה זו יכולה להשתנות בהתאם לסוג הרקמה וגם מדגימה לדגימה. עם זאת, המעבדה שלנו הראתה בעבר כי ניתן לבצע פרופיל PTM היסטוני מבוסס טרשת נפוצה בהצלחה מאזורים של רקמה מיקרודיספקטית בלייזר בדגימות FFPE של סרטן השד, המתאימים לפחות ל-1,000 תאים18.
    1. הניחו ארבעה חתכי FFPE בעובי 10 מיקרון, המתאימים לכ-20-60 מ"ג רקמה, בצינור בנפח 1.5 מ"ל.
    2. הוסף 1 מ"ל של חומר המיס פרפין לדגימה ולמערבולת (טבלת החומרים) במהירות מקסימלית למשך 30 שניות, עד שהפרפין מתמוסס לחלוטין.
      אזהרה: תגובות הממיסות פרפין הן מוטגניות, מסרטנות ודליקות, ולכן יש להשתמש בהם מתחת למכסה הכימי.
      הערה: התמוססות הפרפין מושגת כאשר חלקי הפרפין אינם נראים עוד בעין בלתי, וסוכן המיס הפרפין בעל צבע לבן והומוגני.
    3. צנטריפוגה 16,000 x g ל-3 דקות ב-RT בצנטריפוגה על הספסל וזרוק את הסופרנטנט. כדי למנוע שאיבת דגימה לא רצויה במהלך הסרת הסופרנטנט, ניתן לכסות משאבת ואקום/פיפטות עם קצה קטן יותר (למשל, p200, p10).
    4. חזור על שלב 1.3.2 ו-1.3.3 שלוש פעמים נוספות (4 פעמים בסך הכל) כדי להבטיח הסרה מלאה של הפרפינים. חלופה נוספת היא לשקול את הדגימה ללא פרפין לחלוטין כדי לקבל קריאה אינדיקטיבית של כמות הרקמה שעובדה.
    5. הוסף 1 מ"ל של תמיסת EtOH של 95% (טבלה 1) ומערבולת במהירות מקסימלית למשך 30 שניות, כדי להבטיח תלייה מלאה של הרקמה.
    6. צנטריפוגה 16,000 x g ל-3 דקות ב-RT בצנטריפוגה על הספסל וזרוק את הסופרנטנט. חלופה נוספת היא לשקול את הדגימה המיובשת כדי לקבל מדד אינדיקטיבי לכמות הרקמה היבשה שעובדה.
    7. חזור על שלב 1.3.5 ו-1.3.6 עם 70%, 50%, ו-20% EtOH (טבלה 1) ו-ddH2O כדי להחזיר את הדגימה.
    8. הוסף 200 מיקרוליטר של בופר חילוץ (טבלה 1).
      הערה: אם יש חתיכות רקמה גדולות יותר, חתכו אותן לחתיכות קטנות יותר עם מספריים. בהתאם לכמות הרקמה, ניתן להוסיף נפחים קטנים/גדולים של בופר חילוץ כדי להבטיח פירוק דגימה תקין. עבור כדורים קטנים במיוחד התלויים בנפח של בופר חילוץ נמוך מ-100 מיקרוליטר, ניתן לבצע סוניקציה באמצעות מכשיר סוניקציה (טבלת חומרים) (30 שניות ON/30 שניות כיבוי: גבוה, 10 מחזורים).
    9. הומוגניזציה של רקמות בבופר חילוץ באמצעות סוניקציה באמצעות סוניפייר דיגיטלי (טבלת חומרים) עם מיקרוטיפ בקוטר 3 מ"מ (>15 מחזורים, 5 שניות הפעלה/2 דקות כיבוי, הספק: 15-30%).
      הערה: דגימות יכולות להיחשב כהומוגניזציה תקינה כאשר אין חלקיקי רקמה גלויים בתמיסה ובופר החילוץ מציג צבע אחיד ולא עכור. שמור דגימות ב-RT במהלך מחזורי סוניקציה. קרח עלול לגרום למשקעים של SDS בבופר החילוץ, ובכך לפגוע בהומוגניזציה של הרקמות. סוניקציה נכונה היא קריטית להשגת ניתוק רקמות מלא והפקת חלבון. הנח את המיקרו-קצה בגובה נכון בצינור הדגימה (אסור לו לגעת בתחתית הצינור, לשחרר חלקיקי פלסטיק, ואסור לו להיות בממשק בופר שאיבת האוויר, מה שיוצר קצף ובועות).
    10. לאחר ההומוגניזציה, דגמו דגימות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות בתרמומיקסר (תרמומיקס). כל 15 דקות, פתח את מכסה הצינורות כדי לאפשר לפורמלדהיד להתאדוי.
    11. דגמו דגימות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות בתרמומיקסר (תרמומיקסר). פתחו את המכסה כל 20-60 דקות כדי לאפשר לפורמלדהיד להתאדה.
    12. צנטריפוגה 16,000 x g למשך דקה אחת ב-RT בצנטריפוגה על שולחן והעברת הסופרנטנט לצינור חדש.
      הערה: ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של מינוס 20°C בשלב זה.

טבלה 1: הרכב בופר. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

2. רזולוציה של היסטונים באמצעות SDS-PAGE ועיכול בתוך הג'ל

  1. SDS-PAGE (איור 1B; משך משוער: 2 שעות)
    1. כדי להעריך את טוהר ההיסטונים ולהעריך את כמותם, טעינו עשירית מתמציות ההיסטונים על ג'ל פוליאקרילאמיד 17% (SDS-PAGE; טבלה 1) לצד כמויות ידועות של היסטונים רקומביננטיים, כפי שמודגם באיור 1B.
      הערה: במקום להעמיס עשירית תמציות היסטונים, ניתן להעמיס 15-50 מיקרוגרם חלבונים, כפי שנמדד באמצעות בדיקות הסובלות ריכוזי דטרגנט גבוהים, כמו בדיקת חלבון חומצה ביצינכונינית (BCA). עם זאת, יש לשים לב שהעשרת היסטונים על חלבונים כוללים יכולה להשתנות משמעותית בין דגימות מוקפאות טריות, OCT מוקפאות ודגימות FFPE, וכימות כמות ההיסטונים יכול להתבסס רק על SDS-PAGE. 1, 0.5 ו-0.25 מיקרוגרם של היסטון רקומביננטי H3.1 (טבלת חומרים) יכולים להיות נטענים כהפניה כדי לכמת את כמות ההיסטונים בדיוק רב יותר.
    2. מערבבים את הדגימות עם בופר טעינה ליתיום דודציל סולפט (LDS), או עם בופרי טעינה מקבילים ל-SDS-PAGE (למשל, בופר Laemmli) עם הוספת דיתיותרייטול (DTT; טבלת החומרים) בריכוז סופי של 10 מ"מ.
    3. דנטור דגימות בטמפרטורה של 95°C למשך 5 דקות בתרמומיקסר (תרמומיקסיר).
    4. לאחר הפרדת חלבונים ב-SDS-PAGE, צבעו את הג'ל בצביעת קומאסי (טבלת חומרים).
    5. הערכת תפוקת היסטונים באמצעות כימות20 של פס היסטונים בדגימות קליניות בסיוע תוכנה או חזותי לעומת היסטון H3 רקומביננטי בכמויות ידועות.
  2. עיכול היסטון בג'ל (איור 2; משך משוער: 2 ימים)
    הערה: עיכול דמוי ArgC משמש לניתוח טרשת נפוצה של PTMs היסטונים, משום שהעיכול הסטנדרטי של טריפסין מייצר פפטידים קצרים מדי, בשל השכיחות הגבוהה של חומצות האמינו ליזין וארגינין ברצף שלהן, מה שמקשה על זיהוי פפטידים ב-LC-MS ובזיהוי PTM. על ידי שינוי כימי של ליזינים, הפיצול הטריפטי באתרים אלו נמנע, מה שמוביל לפיצול בקצה C של הארגינינים בלבד, ויוצר פפטידים ארוכים יותר (4-15 חומצות אמינו) המכילים ליזינים מותאמים בתוך הרצף; בסך הכול, פרוטוקול זה מסייע בזיהוי ומדידת טרשת נפוצה של פפטידי היסטונים מותאמים ותואר בפירוט רב בפרסומים רבים8,17,21.
    אופציונלי: תקן פנימי (למשל, ספייק-אין עם תוויות כבדות, פפטידים מסומנים סינתטית22) ניתן לערבב עם דגימות היסטון ביחס של 1:1 כדי להשיג כימות פפטידי מדויק יותר ב-MS (איור 2B).
    1. העמס 3-5 מיקרוגרם של דגימת היסטון על ג'ל פוליאקרילאמיד 17%, בהתבסס על כימות ההיסטונים המוערך שבוצע בשלב 2.1.5 (איור 2B).
    2. לאחר SDS-PAGE, הצג חלבונים על ידי צביעת הג'ל בצביעת Coomassie.
      הערה: כדי למנוע זיהום שעלול להפריע לניתוח LC-MS/MS, מומלץ לבצע את השלבים הבאים בסביבה נטולת קרטין, כמו מכסה ייעודי, שכן קרטין הוא מזהם חזק ל-MS.
    3. רצועות ג'ל אקסייז התואמים למשקל המולקולרי של חלבוני היסטון ליבה (רצועת ג'ל בין 10 ל-18 קילו-דלטון, בהתחשב במשקל המולקולרי הבא לכל היסטון ליבה: H3 כ-17 קילודאלטון, H2A-H2B כ-14 קילו-דלטון, H4 כ-11 קילו-דלטון) באמצעות סכין (טבלת חומרים) ורצועות חתוכות בחלקים של כ-1 מ"מ 3 כל אחד.
    4. בעזרת הסקלפל, העבירו את חלקי הג'ל לצינור בגודל 1.5 מ"ל.
      הערה: כדי לכסות לחלוטין את חלקי הג'ל, ניתן להגדיל את הנפחים המוזכרים להלן, וכך לשמור על הסטוכיומטריה של התגובה.
    5. הסרת צבע חתיכות הג'ל על ידי הוספת תמיסה של 50% אצטוניטריל (ACN) ב-DDH2O (טבלה 1). הניחו בתרמומיקסר שמכוון ל-1,400 סל"ד למשך 10 דקות RT וזרקו את הסופרנטנט לאחר מכן.
    6. חזור על שלב 2.2.5 עד שחתיכות הג'ל מוסרות לחלוטין.
    7. ייבשו את חלקי הג'ל על ידי הוספת 100% ACN (טבלת חומרים). דגרו במיקס ב-1,400 סל"ד למשך 10 דקות RT וזרוק את הסופרנטנט לאחר מכן.
    8. חזור על שלב 2.2.7 עד שחתיכות הג'ל נראות לבנות וקשות, ולכן מיובשות לחלוטין.
    9. ייבשו את חלקי הג'ל במשך 5 דקות ב-RT בצנטריפוגה בוואקום (טבלת חומרים).
      הערה: היסטונים דלים בציסטאין (רק שני ציסטאין נמצאים בהיסטון H3 במיקומים 96 ו-110 (UniprotKB ID P68431), ורק ציסטאין אחד נמצא בהיסטון H2B במיקום 154 (מזהה UniprotKB B4DR52)). בנוסף, ציסטאינים אלו קיימים בתוך פפטידים שאינם ניתנים לזיהוי בעיכול דמוי ArgC בטרשת נפוצה מלמטה למעלה, כך שאדוקטים כימיים של קבוצות תיול23 אינם תוצר בניתוח טרשת נפוצה של היסטונים, ולא מבוצעים שלבים של הפחתת ציסטאין ואלקילציה בפרוטוקול המתואר.
    10. הוסף 15 מיקרוליטר של 7.7 מטר של תמיסת אנידיד פרופיונית (PRO) (טבלת חומרים) ו-26 מיקרוליטר של 1 מטר אמוניום ביקרבונט (AmBic) (טבלת חומרים) לכל צינור ודוגר דגימות בתרמומיקסר במהירות 350 סל"ד למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
      הערה: מכיוון שאנידרידים המומסים בבופר תגובתי נוטים להתאדים, אין להכין תערובת ראשית של PRO ו-AmBic, אלא להוסיף אותם בנפרד לכל דגימה, כדי לשמור על ריכוז קבוע של PRO בכל צינור.
    11. כסו לחלוטין את חתיכות הג'ל על ידי הוספת 1 M AmBic (נפח מומלץ: 80 מיקרוליטר) ודגרו דגימות עם ערבוב ב-1,400 סל"ד למשך 4 שעות בטמפרטורה של 37°C בתרמומיקסר (תרמומיקסרים). הסר את כל הנוזלים לאחר מכן.
      הערה: 1 M AmBic נוסף לשמירה על pH בסיסי, אידיאלי לזרז פרופיונילציה של ליזינים לא מתואמים ומונומתילציה באמצעות PRO.
    12. שטוף שלוש פעמים עם ddH2O, תוך דגמת דגימות בין לבין ב-RT למשך 10 דקות תוך ערבוב תרמומיקסר ב-1,400 סל"ד. להשליך נוזל אחרי כל שטיפה.
    13. הוסיפו 50% ACN ודגרו בתרמומיקסר במהירות 1,400 סל"ד למשך 15 דקות ב-RT. השליכו את הנוזל לאחר מכן.
    14. ייבשו לחלוטין את חלקי הג'ל על ידי הוספת 100% ACN ודגרו ב-1,400 סל"ד ל-15 דקות ב-RT בתרמומיקסר (תרמומיקסרים). השליכו את הנוזל לאחר מכן.
    15. חזור על שלב 2.2.14 עד שחתיכות הג'ל נראות לבנות ויבשות.
    16. חתיכות ג'ל יבשות 5 דקות ב-RT בצנטריפוגה ואקום.
    17. הוסיפו לכל דגימה 4 מיקרוליטר של תמיסת טריפסין (טבלה 1) ו-20 מיקרוליטר של בופר עיכול (טבלה 1) ודגרו 10 דקות על קרח כדי לאפשר ספיגת טריפסין לחתיכות ג'ל.
      הערה: דגירה זו - המתבצעת עם תמיסת טריפסין מרוכזת ובופ עיכול (50 mM AmBic ב-ddH2O, היוצר אידיאל pH בסיסי לפיצול טריפסין) - מאפשרת לאנזים להיספג על ידי חלקי הג'ל לפני הפעלתו ב-37 מעלות צלזיוס.
    18. כאשר הטריפסין המרוכז נספג לחלוטין, כסה היטב את חלקי הג'ל בבופר עיכול נוסף (נפח מצביע: 80 מיקרוליטר) ודוגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה בתרמומיקסר (תרמומיקסרים).
    19. כדי להפיק פפטידים מעוכלים מחתיכות הג'ל, מוסיפים 100 מיקרוליטר של 100% ACN ודגרו ב-1,400 סל"ד למשך 20 דקות ב-RT בתרמומיקסר (תרמומיקסרים).
    20. אסוף את הסופרנטנט והעבר אותו לצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל.
    21. הוסיפו 80 מיקרוליטר של 100% ACN לחתיכות הג'ל ודגרו ב-1,400 סל"ד למשך 10 דקות RT בתרמומיקסרים.
    22. אוספים סופרנטנטים ואוגדים אותו עם זה שנאסף בשלב 2.2.20, ואז מרוכזים את הפפטידים בצנטריפוגה בוואקום לנפח שבין 1 ל-5 מיקרוליטר.
      הערה: השימוש בצנטריפוגה בוואקום מאפשר אידוי של הממס האורגני (ACN). עם זאת, מומלץ לא לייבש את הדגימה לחלוטין בשלב זה, שכן הדבר עלול להשפיע לרעה על שלב הגזירה הבא. אם הדגימה מתייבשת, החזירו אותה למים ב-DDH2O וסוניקו אותה באמבט מים למשך 5 דקות.
    23. הוסיפו ddH2O לכל דגימה, לנפח סופי של 15 מיקרוליטר, ואז מוסיפים 2 מיקרוליטר של 1 מטר טריאתילמוניום ביקרבונט (טבלת חומרים) ו-3 מיקרוליטר של תמיסת פניל איזוציאנאט (PIC) (טבלה 1) ודגרו ב-350 סל"ד למשך 90 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתרמומיקסרים.
      אזהרה: PIC הוא מוטגני ומסרטן, ולכן מומלץ לטפל בו תחת מכסה כימי. מכיוון ש-PIC הוא תגובתי ונדיף מאוד, מומלץ להימנע מהכנת תערובת מאסטר של טריאתילמוניום ביקרבונט ו-PIC, אך מומלץ להוסיף כל תגובה בנפרד כדי להבטיח את נוכחות הריכוז המדויק של PIC.
    24. הוסף לכל צינור 8 מיקרוליטר של חומצה טריפלואורואצטית 1% (TFA; טבלת החומרים) לעצור את הנגזרת באמצעות PIC.
    25. מדללים כל דגימה ב-100 מיקרוליטר של בופר A (טבלה 1) והעמיסו אותה על קצות שלב C18 (שהוכנו כפי שמתוארב-24 או נרכשו מספקים שונים).
    26. סובבו את הדגימות בעוצמה של 2,100 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C בצנטריפוגה רוטור מתנדנדת כדי לאפשר לפפטידי היסטון להיקשר לשרף C18.
      הערה: ניתן לאחסן דגימות על קצות במה בטמפרטורה של 4°C למשך מספר חודשים.
    27. הוסף 30 מיקרוליטר של בופר שחרור (טבלה 1) לקצוות שלב C18 והנח את הקצוות בצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל. סובבו דגימות בעוצמה של 1,000 x גרם למשך 10 דקות בצנטריפוגה על שולחן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להוציא פפטידים היסטונים.
    28. מרוכזים דגימות לנפח שבין 1 ל-3 מיקרוליטר באמצעות צנטריפוגה בריק, ואז מוסיפים 1% TFA כדי להגיע לנפח סופי של 6 מיקרוליטר.
    29. טעין 5 מיקרו ליטר של תמיסת פפטיד לתוך מיקרופלטת 96 בארות לניתוח MS (טבלת חומרים) ואטום אותה עם משטח איטום (טבלת חומרים).

3. HPLC-MS/MS וניתוח נתונים (איור 3)

הערה: הפרמטרים המתוארים כאן מתאימים למערכת כרומטוגרפיה נוזלית ESAY-nLC 1200 המחוברת דרך עמודת ריסוס EASY לספקטרומטר מסה Q Exactive Plus Orbitrap (טבלת חומרים), אך ניתן להשתמש גם במכשירים דומים/שקולים, עם פרמטרים אד-הוק.

  1. HPLC-MS/MS (משך משוער: 90 דקות לדגימה)
    1. הזרקו 3 מיקרוליטר מתוך 5 מיקרוליטר פפטידי היסטון של שלב 2.2.29 (התואם לכ-0.25-0.8 מיקרוגרם, בהתבסס על כימות היסטון על ידי SDS-PAGE) אל ננועמודת C18 (טבלת חומרים) בזרימה קבועה של 500 ננוליטר לדקה בבופר A.
    2. יש להחיל גרדיאנט ליניארי של 55 דקות של 10%-45% בופר B בקצב זרימה של 250 ננו-ליטר לדקה על פפטידים נפרדים.
    3. רכישת נתוני MS/MS במצב תלוי נתונים (DDA) כדי לעבור אוטומטית בין MS1 ל-MS2 באמצעות חבילות תוכנה ייעודיות (טבלת חומרים).
      הערה: לרכישה והגדרות כלליות, עיינו בטבלה 2.
  2. ניתוח נתוני MS ב-RAW
    הערה: בפרוטוקול זה, הכימות של PTMs היסטונים מתבצע באמצעות EpiProfile, סקריפט פתוח (https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family), ידידותי למשתמש ומתאים לניתוחים סטנדרטיים כפי שמתוארים עבור מתילציות ואצטילציות ליזין H3 ו-H4. עם זאת, ניתן להתאים את EpiProfile לביצוע ניתוחים של שינויים פחות סטנדרטיים ועל פרוטוקולי הכנת דגימות שונים על ידי משתמשים מנוסים יותר. שימו לב ש-EpiProfile דורש רישיון MATLAB כדי לפעול25.
    1. נתח את נתוני ה-RAW שנרכשו באמצעות תוכנת EpiProfile 2.0 (גרסת PRO-PIC)25 (טבלת חומרים) וכימות פפטידי היסטון על ידי בחירת האפשרויות histone_normal, כאשר הניתוח מתבצע ללא תווית, ו-histone_SILAC, בעת שימוש ב-SUPER-SILAC spike-in. הגדר ndebug = 0.
    2. עבור כל פפטיד היסטון (למשל, H3_3-8), יש לחשב את השפע היחסי (%RA) של כל פפטידופורם שעבר שינוי (למשל, H3_3-8 unmod, me1, me2, me3) על ידי חלוקת הכרומטוגרמה היונית שהופקה (XIC) המחושב על ידי EpiProfile בסכום כל ה-XICs שחושבו עבור אותו פפטיד.
      הערה: באופן אופציונלי, ניתן לאמת XICs המחושבים על ידי EpiProfile על ידי בדיקת ספקטרום MS וכימות ידני של פפטידי היסטון באמצעות פריסת ספקטרות ייעודית כפי שמתוארב-18,26.
    3. עבור כל פפטידופורם, יש לחשב את יחס המשקל הקל לכבד (L/H) על ידי חלוקת אחוז ה-RA של כל פפטיד קליל ילידי ב-%RA של הפפטיד הכבד המתאים שמקורו בתערובת SUPER-SILAC, שהוספיק לכל דגימה.
    4. הפכו את יחסי L/H לסולם לוגריתמי. כדי להדגיש הבדלים משמעותיים בשפע הפפטידופורמים בין המדגמים, ניתן לבצע ניתוח סטטיסטי, ויחסי L/H בכל המדגמים יכולים להיות מיוצגים ויזואלית כמפות חום וגרפי פיזור, כפי שמופיע באיור 4.

טבלה 2: רשימת הגדרות הרכישה וההגדרה הכללית בשימוש ב-LC-MS/MS עם המערכת המשמשת בפרוטוקול זה. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביצענו חילוץ היסטונים מדגימות סרטן שד מוקפאות טריות ומוקפאות OCT ומדגימות מנינגיומה של FFPE בהתאם לפרוטוקול שהוזכר לעיל. כפי שמודגם באיור 1A, עבור דגימות קפואות, הסרנו את OCT כאשר הוא קיים, והומוגנו דגימות בבופר בידוד גרעינים המכיל חומר ניקוי עדין (0.1% טריטון שלב 1.1), מה שאפשר בידוד גרעינים. לאחר מכן חילצנו היסטונים עם תוספת של 0.1% SDS; במקום זאת, עבור דגימות FFPE, פיתחנו את הדגימות, היבשנו מחדש וניתקנו את הקישורים החוצה, והפקנו חלבונים בתנאים עם דנטור גב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה המתוארת כאן מספקת זרימת עבודה פשוטה וחזקה לבידוד יעיל של היסטונים מדגימות קליניות המאוחסנות כביופסיות מוקפאות טריות, OCT מוקפאות וביופסיות FFPE, לצורך פרופיל נופי השינוי שלהן באמצעות ניתוח טרשת נפוצה. פרוטוקול הכנת הדגימה הבא באמצעות הפרדת SDS-PAGE ועיכול בג'ל PRO-PIC עם טריפסין מבטיח הסרה יעילה של חומרי ניקוי, מלחים ומזהמי טרשת נפוצה אחרים33 ומשיג כימות מדויק וחזק של אצטילציות והמתילציות של היסטון ליזין והמתילציות. חשוב לציין כי הגזירה בקצה N עם פניל איזוצי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למנתחים ורופאים מהמכון האירופי לאונקולוגיה ומהמכון לנוירולוגיה קרלו בסטה על מתן ביופסיות רקמות קפואה ב-FF, OCT ו-FFPE. אנו מודים לרוברטה נובריני על הדיון המדעי והמתודולוגי במהלך הכנת כתב היד ועל המימון שלנו: PRIN2022 (CUPG53D23001530006), AIRC (מספר מענק IG-2023-28767), וקרן IEO-Monzino (FIEORDT-2023-BONALDI).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>כימיקלים
Histolemon RS להיסטולוגיהקרלו ארבה4549122.5 ליטר
אצטוניטריל (ACN)קרלו ארבה4123411L
אמוניום ביקרבונט (AmBic)סיגמא אולדריץ'A6141500 גרם
אמוניום פרסולפט (APS)WDR1.012.010.500500 גרם
מעכב פרוטאז אפרוטיניןסיגמא אלדריץ'  A11535 מ"ג
בנזונאז נוקלאזמרקE101425 KU
ביסקרילמיד 30% 37.5 מ'AppliChemAPA362610001 ליטר
בופר A 0.1% חומצה פורמית ב-ddH2Oתרמו פישר סיינטיפיק10229884500 מ"ל 
בופר B 0.1% חומצה פורמית /80% אצטוניטריל ב-ddH2Oתרמו פישר סיינטיפיק15431423500 מ"ל
שרף C18מרק66883-Uקוטר 47 מ"מ
קומאסי אינסטנט בלואבקאםAB1192111 ליטר
דיתיוטרייטול (DTT) WDR441496P25 גרם
אתנולקרלו ארבה4146082.5 ליטר
Leupeptin  מעכב פרוטאזסיגמא-אלדריץ'  L85115 מ"ג
N,N,N&פריים;,N&פריים;-טטרמתיל אתילנדיאמין (TEMED)סיגמא אולדריץ'1.107.320100100 מ"ל
בופר דגימה של NuPAGE LDSInvitrogenNP00074x
PBS - מלח מפוזר בפוספאט  MicroGemTL1006500 מ"ל
פניל איזוציאנאט (PIC)סיגמא אולדריץ'185353100 גרם
מעכב פרוטאז של פנילמתילסולפוניל פלואוריד (PMSF)סיגמא אלדריץ'  P76261 גרם
אנידריק פרופיוני (PRO)סיגמא אולדריץ'24031150 גרם
היסטון H3.1 הרקומביננטי האנושיניו אינגלנד ביולאבסM25031 ומיקרו; g/µ L
טריפסין בדרגת ריצוףפרומגהV5113100 מיקרוגרם
מעכב נתרן בוטיראט (NaBut) היסטון דה-אצטליאאזמרקB58875 גרם
נתרן דודצילסולפט (SDS)סיגמא אולדריץ'L3771100 גרם
טריאתילמוניום ביקרבונטסיגמא אולדריץ'T7408100 מ"ל
חומצה טריפלואורואצטית (TFA)תרמו פישר סיינטיפיק289041x10 מ"ל
טריס-HClסיגמא אולדריץ'T3253100 גרם
דטרגנט טריטון X-100סיגמא-אלדריץ'  X100RS5 גרם
<חזק>ערכות/ציוד/תוכנה
מיקרופלטה עם 96 בארותקורנינגPCR-96-FS-Cלא פירוגני, ללא רנז/דנאז
מאזנייםקרן19024
צנטריפוגה על ספסלמעבדת הביופוגה של האראוספיקו, 23396
מכשיר סוניקציה ביורופטורדיאגנוד
ברנסון דיגיטל סוניפייר 250אמרסון
מסננת תאים 100 ומיקרו; mבז352360
Concentrator Plusאפנדורף5305000509
הומוגנייזר דאונס (למשל  דאנס, וויטון...)דאנס, וויטוןמטחנת רקמות בנפח 1 מ"ל
כרומטוגרפיה נוזלית EASY-nLC 1200תרמו פישר סיינטיפיק
עמודת EASY-Spray HPLC C18תרמו פישר סיינטיפיקES9022 ומיקרו; m, 100  Å, 75 ומיקרו; מטר x 25 ס"מ
סקריפט EpiProfile2.0https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family
תוכנת פיג'יhttps://imagej.net/software/fiji/downloads
MATLABhttps://www.mathworks.com
מנוע החיפוש MaxQuanthttps://maxquant.net/maxquant/
פסטל A (רופף)דאנס, וויטון
פסטל B (צמוד)דאנס, וויטון
Q Exactive Plus מערכת LC-MS/MS של Orbitrapתרמו פישר סיינטיפיק
גלגל מסתובבתרמו פישר סיינטיפיק11496548
אזמלקיאטו13010
מספרייםתרמו פישר סיינטיפיק15207266
שטיח איטוםקורנינגAM-96-PCR-RDתואם אוטומציה
צנטריפוגה רוטור מתנדנדתבקמן קולטראלגרה X-15R
קומפקט תרמומיקסראפנדורף5350
מערבולתPBIויברומיקס
תוכנת Xcaliburתרמו פישר סיינטיפיקOPTON-30965

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cutter, A. R., Hayes, J. J. A brief review of nucleosome structure. FEBS Lett. 589 (20 Pt A), 2914-2922 (2015).
  2. Millan-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
  3. Yu, X., et al. Cancer epigenetics: From laboratory studies and clinical trials to precision medicine. Cell Death Discov. 10 (1), 28(2024).
  4. Fraga, M. F., et al. Loss of acetylation at lys16 and trimethylation at lys20 of histone h4 is a common hallmark of human cancer. Nat Genet. 37 (4), 391-400 (2005).
  5. Noberini, R., et al. Profiling of epigenetic features in clinical samples reveals novel widespread changes in cancer. Cancers (Basel). 11 (5), 723(2019).
  6. Khan, S. A., Reddy, D., Gupta, S. Global histone post-translational modifications and cancer: Biomarkers for diagnosis, prognosis and treatment. World J Biol Chem. 6 (4), 333-345 (2015).
  7. Liu, R., et al. Post-translational modifications of histones: Mechanisms, biological functions, and therapeutic targets. MedComm (2020). 4 (3), e292(2023).
  8. Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: Applications, progress, and challenges. FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).
  9. Fuchs, S. M., Strahl, B. D. Antibody recognition of histone post-translational modifications: Emerging issues and future prospects. Epigenomics. 3 (3), 247-249 (2011).
  10. Voskuil, J. L. The challenges with the validation of research antibodies. F1000Res. 6, 161(2017).
  11. Rothbart, S. B., et al. An interactive database for the assessment of histone antibody specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
  12. Gastman, B., et al. Defining best practices for tissue procurement in immuno-oncology clinical trials: Consensus statement from the society for immunotherapy of cancer surgery committee. J Immunother Cancer. 8 (2), e001583(2020).
  13. Steu, S., et al. A procedure for tissue freezing and processing applicable to both intra-operative frozen section diagnosis and tissue banking in surgical pathology. Virchows Arch. 452 (3), 305-312 (2008).
  14. Snijders, M. L. H., et al. Cryo-gel embedding compound for renal biopsy biobanking. Scientific Reports. 9, 15250(2019).
  15. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods Mol Biol. 1897, 253-268 (2019).
  16. Dupree, E. J., et al. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14(2020).
  17. Restellini, C., et al. Alternative digestion approaches improve histone modification mapping by mass spectrometry in clinical samples. Proteomics Clin Appl. 13 (1), e1700166(2019).
  18. Noberini, R., et al. Spatial epi-proteomics enabled by histone post-translational modification analysis from low-abundance clinical samples. Clin Epigenetics. 13 (1), 145(2021).
  19. Olson, B. Assays for determination of protein concentration. Curr Protoc Pharmacol. 73, A 3A 1-A 3A 32 (2016).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Daled, S., et al. Histone sample preparation for bottom-up mass spectrometry: A roadmap to informed decisions. Proteomes. 9 (2), 17(2021).
  22. Kim, H. J., Ha, S., Lee, H. Y., Lee, K. J. Rosics: Chemistry and proteomics of cysteine modifications in redox biology. Mass Spectrom Rev. 34 (2), 184-208 (2015).
  23. Lindemann, C., et al. Strategies in relative and absolute quantitative mass spectrometry based proteomics. Biol Chem. 398 (5-6), 687-699 (2017).
  24. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using stagetips. Nat Protoc. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  25. Yuan, Z. F., et al. Epiprofile 2.0: A computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. J Proteome Res. 17 (7), 2533-2541 (2018).
  26. Noberini, R., Bonaldi, T. A super-silac strategy for the accurate and multiplexed profiling of histone posttranslational modifications. Meth Enzymol. 586, 311-332 (2017).
  27. Valikangas, T., Suomi, T., Elo, L. L. A systematic evaluation of normalization methods in quantitative label-free proteomics. Brief Bioinform. 19 (1), 1-11 (2018).
  28. Noberini, R., Longhi, E., Bonaldi, T. A super-silac approach for profiling histone posttranslational modifications. Methods Mol Biol. 2603, 87-102 (2023).
  29. Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nat Protoc. 2 (4), 933-938 (2007).
  30. Manea, M., Mezo, G., Hudecz, F., Przybylski, M. Mass spectrometric identification of the trypsin cleavage pathway in lysyl-proline containing oligotuftsin peptides. J Pept Sci. 13 (4), 227-236 (2007).
  31. Davies, V., et al. Rapid development of improved data-dependent acquisition strategies. Anal Chem. 93 (14), 5676-5683 (2021).
  32. Herwig-Carl, M. C., et al. Mass spectrometry-based profiling of histone post-translational modifications in uveal melanoma tissues, human melanocytes, and uveal melanoma cell lines - a pilot study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (2), 27(2024).
  33. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  34. Vai, A., et al. Improved mass spectrometry-based methods reveal abundant propionylation and tissue-specific histone propionylation profiles. Mol Cell Proteomics. 23 (7), 100799(2024).
  35. Chen, J., et al. In-gel nhs-propionate derivatization for histone post-translational modifications analysis in arabidopsis thaliana. Anal Chim Acta. 886, 107-113 (2015).
  36. Nshanian, M., et al. Short-chain fatty acid metabolites propionate and butyrate are unique epigenetic regulatory elements linking diet, metabolism and gene expression. Nat Metab. 7 (1), 196-211 (2025).
  37. Joseph, F. M., Young, N. L. Histone variant-specific post-translational modifications. Semin Cell Dev Biol. 135, 73-84 (2023).
  38. Amatori, S., Tavolaro, S., Gambardella, S., Fanelli, M. The dark side of histones: Genomic organization and role of oncohistones in cancer. Clin Epigenetics. 13 (1), 71(2021).
  39. Mohammad, F., Helin, K. Oncohistones: Drivers of pediatric cancers. Genes Dev. 31 (23-24), 2313-2324 (2017).
  40. Louis, D. N., et al. The 2021 who classification of tumors of the central nervous system: A summary. Neuro Oncol. 23 (8), 1231-1251 (2021).
  41. Deshmukh, S., Ptack, A., Krug, B., Jabado, N. Oncohistones: A roadmap to stalled development. FEBS J. 289 (5), 1315-1328 (2022).
  42. Lopes, M., Lund, P. J., Garcia, B. A. Optimized and robust workflow for quantifying the canonical histone ubiquitination marks h2ak119ub and h2bk120ub by lc-ms/ms. J Proteome Res. 23 (12), 5405-5420 (2024).
  43. Turriziani, B., et al. On-beads digestion in conjunction with data-dependent mass spectrometry: A shortcut to quantitative and dynamic interaction proteomics. Biology (Basel). 3 (2), 320-332 (2014).
  44. Hamza, G. M., et al. Affi-bams: A robust targeted proteomics microarray platform to measure histone post-translational modifications. Int J Mol Sci. 24 (12), 10060(2023).
  45. Nel, A. J., Garnett, S., Blackburn, J. M., Soares, N. C. Comparative reevaluation of fasp and enhanced fasp methods by lc-ms/ms. J Proteome Res. 14 (3), 1637-1642 (2015).
  46. Ledvinova, D., et al. Filter-aided sample preparation procedure for mass spectrometric analysis of plant histones. Front Plant Sci. 9, 1373(2018).
  47. Picard, G., et al. Psaq standards for accurate ms-based quantification of proteins: From the concept to biomedical applications. J Mass Spectrom. 47 (10), 1353-1363 (2012).
  48. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The maxquant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  49. Zhang, C., Liu, Y. Retrieving quantitative information of histone ptms by mass spectrometry. Methods Enzymol. 586, 165-191 (2017).
  50. Thomas, S. P., Haws, S. A., Borth, L. E., Denu, J. M. A practical guide for analysis of histone post-translational modifications by mass spectrometry: Best practices and pitfalls. Methods. 184, 53-60 (2020).
  51. Bauden, M., Kristl, T., Andersson, R., Marko-Varga, G., Ansari, D. Characterization of histone-related chemical modifications in formalin-fixed paraffin-embedded and fresh-frozen human pancreatic cancer xenografts using lc-ms/ms. Lab Invest. 97 (3), 279-288 (2017).
  52. Noberini, R., Uggetti, A., Pruneri, G., Minucci, S., Bonaldi, T. Pathology tissue-quantitative mass spectrometry analysis to profile histone post-translational modification patterns in patient samples. Mol Cell Proteomics. 15 (3), 866-877 (2016).
  53. Sugii, N., Matsuda, M., Tsurubuchi, T., Ishikawa, E. Hemorrhagic complications after brain tumor biopsy: Risk-reduction strategies based on safer biopsy targets and techniques. World Neurosurg. 176, e254-e264 (2023).
  54. Govaert, E., et al. Extracting histones for the specific purpose of label-free ms. Proteomics. 16 (23), 2937-2944 (2016).
  55. An, Y. A., Scherer, P. E. Mouse adipose tissue protein extraction. Bio Protoc. 10 (11), e3631(2020).
  56. Vantaggiato, L., et al. Protein extraction methods suitable for muscle tissue proteomic analysis. Proteomes. 12 (4), 27(2024).
  57. Noberini, R., et al. Extensive and systematic rewiring of histone post-translational modifications in cancer model systems. Nucl Acids Res. 46 (8), 3817-3832 (2018).
  58. Chatzikyriakou, P., et al. A comprehensive characterisation of phaeochromocytoma and paraganglioma tumours through histone protein profiling, DNA methylation and transcriptomic analysis genome wide. Clin Epigenetics. 15 (1), 196(2023).
  59. Noberini, R., et al. Pat-h-ms coupled with laser microdissection to study histone post-translational modifications in selected cell populations from pathology samples. Clin Epigenetics. 9, 69(2017).
  60. Henikoff, S., et al. RNA polymerase II at histone genes predicts outcome in human cancer. Science. 387 (6735), 737-743 (2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FFPE

מאמרים קשורים