פרוטוקול זה מתאר מערכת קיבוע מתמר אולטרסאונד שתוכננה במיוחד לגירוי אולטרסאונד של חוט השדרה בעכברים ערים. השיטה משתמשת במערכת קיבוע כדי להבטיח מיקום מדויק של מתמר האולטרסאונד ובמקביל מאפשרת לנבדקים לנוע בחופשיות מבלי לפגוע בדיוק הגירוי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
קיבוע מתמרי אולטרסאונד לנוירומודולציה של חוט השדרה בעכברים
במאמר זה
סיכום
תקציר
אולטרסאונד ממוקד (FUS) התגלה כטכנולוגיית נוירומודולציה חדשנית ולא פולשנית המדגימה פוטנציאל משמעותי לוויסות עצבי של חוט השדרה. עם זאת, השגת קיבוע מתמר יציב לאורך עמוד השדרה מציגה אתגרים טכניים בולטים. שיטות קיבוע קיימות דורשות לעתים קרובות הרדמה ממושכת של בעלי חיים או מפגינות אמינות הידבקות לא מספקת. אילוצים קריטיים אלה מדגישים את הצורך הדחוף בפיתוח פרדיגמת קיבוע חדשה המבטיחה הן יציבות תפעולית והן תאימות פיזיולוגית. פרוטוקול זה מציג מערכת קיבוע מתמר אולטרסאונד חדשנית לגירוי חוט השדרה בעכברים ערים הנעים בחופשיות. הקמת שיטה אמינה למיקום מדויק של מתמר אולטרסאונד על עמוד השדרה היא המפתח לניסויים בגירוי עצבי. שיטה זו משלבת שלושה שלבים: חשיפה כירורגית של גוף החוליה T13, שחיקה מדויקת של התהליך הקוצני ליצירת ממשק מגע מישורי, והדבקה מאובטחת של בסיס המתכת והקולימטור לעמוד השדרה באמצעות חומר בסיס תותבת ותערובת דבק. הוא מאפשר התנהגויות מוטוריות טבעיות באמצעות תנועה בלתי מוגבלת ומבטיח מיקום יציב עם שונות מרחבית מינימלית בין המפגשים, מה שמקל על חקירה של התערבויות חוט השדרה בתיווך אולטרסאונד במודלים של בעלי חיים מודעים. זה רלוונטי במיוחד למחקרים הדורשים הערכות התנהגותיות בתיקון פגיעות בעמוד השדרה, אפנון מחסום דם-חוט שדרה ומנגנוני כאב כרוני. על ידי התמודדות עם אתגר טכני קריטי במחקר נוירומודולציה של בעלי חיים ערים, פרוטוקול זה מציע ממשק מתמר-עמוד שדרה יציב ללא הגבלת תנועה, וסולל את הדרך לתוצאות ניסוי מדויקות ואמינות יותר.
מבוא
חוט השדרה הוא מרכז חיוני לשילוב מידע בין מערכת העצבים המרכזית וההיקפית, מה שהופך אותו לבעל ערך למחקר קליני בתחומים כמו העברת אותות כאב, שחזור רשת עצבית מוטורית וויסות נוירופלסטיות. אולטרסאונד ממוקד (FUS), טכנולוגיית נוירומודולציה לא פולשנית מתפתחת, הפכה לאמצעי חשוב לוויסות עצבי של חוט השדרה. עם המאפיינים הפיזיים שלו של חדירת רקמות עמוקות, רזולוציה מרחבית ברמה מילימטרית ופרמטרים של תפוקת אנרגיה הניתנים לשליטה, היישום שלו משתרע ממחקר נוירו-מנגנון בסיסי למחקרי תרגום פרה-קליניים של מודלים פתולוגיים שונים של חוט השדרה.
מחקרים מראים ש-FUS יכול לווסת מעגלים עצביים בחוט השדרה בשתי דרכים: או על ידי עיכוב או על ידי הפעלתם באמצעות השפעות תרמיות ומכניות. הוא מאופיין גם בהפיכות הזמנית שלו ובבטיחות לרקמות 1,2,3. במחקר של מודלים של פגיעות בחוט השדרה, FUS שיפר את היכולת המוטורית של חולדות על ידי ויסות תגובות דלקתיות וקידום תיקון עצבי 4,5,6. יתר על כן, הוכח כי FUS פותח את מחסום הדם-חוט השדרה ומשפר את יעילות העברת התרופות המקומית באמצעות אפקט קוויטציה בתיווך מיקרו-בועות 7,8. בתחום הכאב הנוירופתי, ליאו ועמיתיו אישרו כי FUS מקל ביעילות על ביטויי כאב נוירופתיים בחולדות על ידי ויסות ביטוי KCC2 ועיכוב מסלול CaMKIV KCC29. סונג ואחרים הראו כי tsFUS בעוצמה נמוכה המופעל בחוט השדרה המותני הפחית משמעותית את האלודיניה המכנית ודיכא את הפעלת המיקרוגליה במודל פגיעה כרונית של חולדה10. השגת אפנון מדויק של חוט השדרה עם FUS תלויה ביציבות המרחבית של מערכת אספקת האנרגיה של האולטרסאונד. אסטרטגיות הקיבוע הנוכחיות מחולקות בעיקר לשתי קטגוריות: 1) שיטת קיבוע נוקשה: היא משיגה מיקום מדויק באמצעות מסגרת סטריאוטקטית, אך דורשת הרדמה מתמשכת, המדכאת את הפעילות העצבית של הנבדקים ומשפיעה על תוקף ההערכות ההתנהגותיות 1,2,3,4,10 ; 2) שיטת קיבוע גמישה: היא מאפשרת מחקר על נבדקים מודעים באמצעות מכשיר חגורה אלסטית, אך בשל הניידות הגדולה של עמוד השדרה, ישנן שגיאות תזוזה וניתוק מתמר 6,8,9. בנוסף, ההטרוגניות הגיאומטרית של הלמינה של עמוד השדרה מובילה להנחתה משמעותית של אנרגיית האולטרסאונד, ומפחיתה את יעילות האפנון העצבי 7,8.
מחקר זה מציע באופן חדשני תוכנית קיבוע מתמר אולטרסאונד ממוקד הניתנת להשתלה למחקר אפנון עצבי של חוט השדרה בעכברים מודעים הנעים בחופשיות. פרוטוקול זה משתמש בגישה כירורגית זעיר פולשנית כדי לשלב את בסיס המתכת, הקולימטור ועמוד החוליות, תומך בלבישה חוזרת של מתמר האולטרסאונד, מבטיח את עקביות מטרת האולטרסאונד ושומר על הנחתת אנרגיית האולטרסאונד דרך הלמינה בטווח מקובל. המתודולוגיה שפותחה מתייחסת למגבלות הקריטיות של הגישות הקיימות, ובכך מאפשרת ניסויים אמינים וניתנים לשחזור נוירומודולציה של חוט השדרה בבעלי חיים ערים ומתנהגים. הפרמטרים העיקריים כוללים חתך קו אמצע של 2.5 ס"מ ב-T13, קיבוע בסיס מתכת מנירוסטה ויחס נפח של 3:1 של חומר בסיס תותבת לדבק ציאנואקרילט. המגבלות כוללות פולשניות כירורגית מתונה ודיוק תלוי מפעיל בהכנת משטח העצם.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים בבעלי חיים המתוארים במחקר הנוכחי אושרו על ידי הוועדה האתית המוסדית לניסויים בבעלי חיים של מכוני שנזן לטכנולוגיה מתקדמת (מספר תעודה: SIAT-IACUC-200721-YGS-NLL-A1313). כל הניסויים השתמשו בעכברי C57BL/6J זכרים (בני 8 שבועות). עכברים שקלו 18-22 גרם בזמן הניתוח.
1. אינדוקציה ותחזוקה של הרדמה (5 ± 1 דקה)
- טען מראש את מעגל ההרדמה למשך 5 דקות.
- הגדר את תא האינדוקציה לספק 4% איזופלורן באוויר רפואי בקצב זרימה של 2 ליטר לדקה.
- עבור לאוורור מסכת פנים לאחר אובדן רפלקס היישור.
- כוונן את הוופורייזר כדי לשמור על ריכוז של 1.5-2% איזופלורן.
- שמור על טמפרטורת גוף העכבר באמצעות שמיכת חימום ל-37 מעלות צלזיוס, עם טווח יעד של 36-38 מעלות צלזיוס לאורך כל ההרדמה.
- מרחו משחת עיניים טרמיצין.
2. מיקום (1 ± 1 דקה)
- השתמש במתאם סטריאוטקטי מתכוונן לעכבר.
- מצב נוטה את העכבר עם יישור עמוד השדרה כדי לשמור על עקמומיות פיזיולוגית בעמוד השדרה.
- אבטח את ראש העכבר באמצעות מוטות אוזניים.
- מקם גפיים בצורה סימטרית.
3. הכנת שדה כירורגי (1 ± 1 דקה)
- השתמש בקוצץ חשמלי (מרווח להב 0.1 מ"מ) כדי להסיר שיער מאתר הניתוח.
- ודא ששטח האפילציה הוא כ -3 ס"מ × 1 ס"מ.
- בצע שלושה מעברים של גזירה בכיוון ההפוך לצמיחת השיער.
4. חתך וגישה (2 ± 1 דקה)
- נגב את האזור ביודופור 3 פעמים (מרווחים של 30 שניות).
- מיששו את הצלע האחרונה (המחוברת לחוליה T13 בעכברים) והשתמשו בה כ
ציון הדרך העיקרי. צור חתך של 2.5 ס"מ בגובה החוליה T13 לאורך
קו האמצע הגבי באמצעות אזמל. - לנתח ברצף את הפאשיה התת עורית.
- חשוף את שרירי עמוד השדרה דרך המישורים האנטומיים.
5. דיסקציה של שריר עמוד השדרה (5 ± 1 דקה)
- הגדר את הגדלת המיקרוסקופ הניתוחי ל-5x להדמיה אופטימלית של שרירי עמוד השדרה ומבני החוליות.
- בצע דיסקציה חדה של שרירי עמוד השדרה באמצעות מיקרו-מספריים.
- כריתת שרירי עמוד השדרה הגבי והרוחבי לחלוטין תוך שמירה על שכבות שרירי הגחון.
- נהל דימום עם גזה המוסטטית נספגת.
6. התקנת בסיס מתכת (1 ± 1 דקה)
- התקן את מוט הקיבוע (פלסטיק) למתאם הסטריאוטקטי.
- התקן את בסיס המתכת המותאם אישית (נירוסטה, 0.28 גרם) בקצה הדיסטלי של המוט (איור 1A).
- מקם את בסיס המתכת המותאם אישית באופן דו-צדדי בתהליכים רוחביים בעמוד השדרה T13.
- ודא את יציבות הצימוד.
7. הכנת ממשק עצם (2 ± 1 דקה)
- הסר רקמת שריר שיורית מהלמינה ותהליכים קוצניים תחת המיקרוסקופ הכירורגי.
- השג המוסטזיס מלא עם דחיסה של התחייבויות כותנה סטריליות.
- צור משטח מגע מישורי באמצעות מקדחת עצם מדויקת עם השקיה רציפה במי מלח. הפעל את המקדחה במהירות של 5,000-10,000 סל"ד כדי למזער את יצירת החום. ללבוש מגן עיניים ומסכה במהלך הקידוח.
- הסר אבק עצמות בעזרת צמר גפן רטוב במי מלח.
8. איטום מערכת קיבוע (3 ± 1 דקה)
- מערבבים חומרי בסיס תותבות ודבק ציאנואקרילט (דבק 502) ביחס נפח של 3:1. יש ללבוש כפפות ניטריל ומשקפי מגן כדי למנוע מגע עם העור/עיניים.
- חבר את הקולימטור האולטרה-סוני (פלסטיק, 0.6 גרם, איור 1B) ובסיס המתכת לעמוד החוליה באמצעות תערובת הדבק (איור 1C).
- אפשר לתערובת הדבק להתרפא בתנאי סביבה מבוקרים (24 ± 1 מעלות צלזיוס, 40-60% לחות יחסית). שמור על מיקום סטטי למשך 60 שניות עד לאישור חזותי של התמצקות מלאה (אובדן ברק פני השטח והיווצרות ממשק קשיח).
- הפרד את בסיס המתכת ממוט הקיבוע הפלסטי.
- אימות יציבות קיבוע: הפעל כוח סיבובי עדין על בסיס המתכת במישור האופקי. שים לב לממשק קולימטור-חוליה בהגדלה פי 5 עבור כל תזוזה (<סובלנות של 0.1 מ"מ). אם התנועה חורגת מהסובלנות, יש למרוח מחדש את תערובת הדבק (שלב 8.2) ולחזור על הריפוי (שלב 8.3).
9. סגירת פצע (1 ± 1 דקה)
- יישר את קצוות הפצע כדי לעטוף את בסיס המתכת במלואו.
- בצע תפירה מופרעת עם 4-0 תפרי משי.
- נגב את החתך ביודופור.
- נקה שאריות דם/עצמות בתוך אתר החשיפה הלמינרית של הקולימטור וארוז עם כותנה סטרילית לאיטום והמוסטזיס.
10. ניהול לאחר הניתוח
- ויסות חום: שמור את העכבר על שמיכה מחממת (37 מעלות צלזיוס) עד להתאוששות מלאה של האמבולציה (בדרך כלל 2-3 שעות לאחר ההרדמה).
- טיפול מונע אנטיביוטי לאחר הניתוח: מתן צפזולין נתרן (50 מ"ג/ק"ג, מומס במי מלח 0.9% לריכוז של 50 מ"ג/מ"ל) באמצעות הזרקה תת עורית לאזור הצוואר הגבי מיד לאחר הניתוח.
- שמור על היגיינת הפצעים. נקו את הפצע באמצעות צמר גפן רטוב במי מלח פעם ביום במשך 3 הימים הראשונים ובצעו בדיקה יומית של אתר הניתוח לאיתור סימני זיהום, היפרדות או דלקת.
- משככי כאבים לאחר הניתוח: יש לתת קרפרופן (5 מ"ג/ק"ג, תת עורי) כל 12 שעות למשך 3 ימים לאחר הניתוח11.
הערה: איור 1D מציג את מערכת הקיבוע המושתלת בעכבר חי לאחר ההתאוששות.
11. פינוי פסולת מסוכנת
- אסוף אבק עצמות וחומרים מזוהמים בדם בשקיות חסינות דליפות המסומנות בסמלי "Biohazard" להעברה למתקן מורשה לסילוק פסולת רפואית.
- הניחו חומר בסיס תותבות לא מעובדות ושאריות דבק 502 במיכלים אטומים עמידים לכימיקלים עם הכיתוב "פסולת כימית", ואחסנו אותם בארון מאוורר ייעודי לסילוק באמצעות פרוטוקולי ניהול פסולת כימית.
- השליכו מחטים, להבי אזמל ומקדחי עצם במיכלים חדים עמידים לנקב המסומנים בתוויות "Biohazard".
12. אזהרות בטיחות
- בעת טיפול בחומרים על בסיס תותבות, הימנע ממגע ישיר בעור על ידי לבישת כפפות ניטריל ומשקפי מגן, ובצע ערבוב וריפוי במכסה אדים מאוורר היטב כדי למזער שאיפת מונומרים נדיפים.
- השלך חומר שיורי כפסולת כימית לפי הנחיות מוסדיות. עבור דבקי 502 ציאנואקרילט, יש למנוע מגע עם העור או העיניים ולשטוף מיד במים למשך 15 דקות אם מתרחשת חשיפה, תוך פנייה לעזרה רפואית. השתמש בהם באזורים מאווררים, אחסן אותם במקומות קרירים ויבשים הרחק ממקורות הצתה, והימנע ממגע עם בדי כותנה או צמר.
- בעת שימוש במקדחות מדויקות, אבטח את הידית, ללבוש מגן פנים ומסכה כירורגית ולהשקות את אתר הקידוח במי מלח כדי למנוע פגיעה תרמית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בדיקת שדה פתוח
מבחן השדה הפתוח תוכנן להעריך שינויים התנהגותיים פוטנציאליים בעכברים לאחר ניתוח (איור 2A). נעשה שימוש בתא שדה פתוח סטנדרטי של 40 ס"מ ×-40 ס"מ כדי להבטיח מרחב פעילות מספיק לעכברים תוך שמירה על תנאי סביבה עקביים יחסית ומזעור הפרעות חיצוניות. הניסוי כלל שני שלבים: לפני הניתוח ו-7 ימים לאחר הניתוח. בכל שלב בוצעה הקלטת וידאו של 10 דקות כדי לתעד את התנהגות העכברים. תוכנת SMART שימשה לניתוח הסרטונים שנאספו ולמדידה מדויקת של המרחק הכולל שעברו העכברים, ובכך לכמת את ר...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחקר זה מציג פרוטוקול צימוד חוליות חדשני המאפשר נוירומודולציה מדויקת של חוט השדרה בעכברים ערים המתנהגים בחופשיות. בניגוד לגישות קיבוע קונבנציונליות, מתודולוגיה זו מתגברת על המגבלות של גישות קיבוע קונבנציונליות. בניגוד למסגרות סטריאוטקטיות נוקשות הזקוקות להרדמה מתמשכת (המדכאת פעילות עצבית ומסבכת הערכות התנהגותיות10) וחגורות אלסטיות המועדות לטעויות תזוזה מתנועת עמוד השדרה9, מתודולוגיה זו משמרת התנהגויות מוטוריות טבעיות החיוניות למחקרים פונקצי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי פרויקט סטארט-אפ מחקר מדעי ברמה גבוהה של בית החולים של אוניברסיטת הונג קונג-שנזן תחת מענק HKUSZH202207003. אנו מודים מקרב לב לכל חברי המעבדה על עזרתם באופטימיזציה של פרוטוקולים וטיפול בבעלי חיים, ולמכון שנזן לטכנולוגיה מתקדמת, האקדמיה הסינית למדעים (SIAT), על תמיכתם המוסדית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תא אינדוקציה להרדמה | שנזן RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts | |
| דבק ציאנואקרילט (דבק 502) | מפעלי הכימיה של בייג'ינג | https://item.taobao.com/item.htm? detail_redpacket_pop=נכון& id=736 869038961& LTK2=1752156592779 mdbp47qqp4vyv57mq156e& ns=1& מחיר TId=214780251752156543206 3926e1996& query=502%E8%83% B6%E6%B0%B4%20%E5%8C%97 %E4%BA%AC%E5%8C%96%E5% B7%A5%E5%8E%82& skuId=52584 34238219 | |
| חומרי בסיס תותבות | ניו סנצ'ורי דנטל | https://www.sncdental.com/product-item-11.html | |
| מוט קיבוע | מנהג | ||
| איזופלורן | שנזן RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts | |
| בסיס מתכת | מנהג | ||
| מיקרו-מכשיר | שנזן Zongshi מכשירים מדעיים ושות', בע"מ | ||
| מקדחה מדויקת | שנזן RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment | |
| מערכת הרדמה רב ערוצית לבעלי חיים קטנים | שנזן RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia/data_66.html | |
| מתאם סטריאוטקטי לעכברים וחולדות צעירות | צ'אנגשה מאיו | https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop =נכון& id=651346369142& ltk2=1752 157416717wlsrozz5uroehtbq5ycim4 & ns=1& מחירTId=214781ce1752157 3520498589e101a& query=%E8%84 %91%E7%AB%8B%E4%BD%93%E5%AE% 9A%E4%BD%8D%E4%BB%AA%20% E9%95%BF%E6%B2%99%E8%BF% 88%E8%B6%8A& skuId=4891677573 207& spm=a21n57.1.hoverItem.14& utparam=%7B%22aplus_abtest% 22%3A%22a478799868a3178d0dd 433b763909e16%22%7D& xxc= taobaoSearch | |
| מיקרוסקופ כירורגי | שנזן Zongshi מכשירים מדעיים ושות', בע"מ | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment | |
| תפר כירורגי (פרולן) | Ethicon (ג'ונסון & ג'ונסון) | https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop =נכון& id=774292384846& ltk2= 1752157506907c0321finubb5 rpkub6av6n& ns=1& priceTId= 214781ce1752157493734800 4e101a& query=%E5%BC%B A%E7%94%9F%E7%BC%9D %E7%BA%BF& skuId=594224 1331046& spm=a21n57.1.hoverI | |
| משחת עיניים טרמיצין | פייזר | https://theterramycin.com/terramycin-ophthalmic-ointment/ | |
| קולימטור אולטראסוני | מנהג |
מקורות
- Song, W., et al. Transspinal focused ultrasound suppresses spinal reflexes in healthy rats. Neuromodulation. 27 (4), 614-624 (2024).
- Tsehay, Y., et al. Low-intensity pulsed ultrasound neuromodulation of a rodent's spinal cord suppresses motor evoked potentials. IEEE Trans Biomed Eng. 70 (7), 1992-2001 (2023).
- Kim, E., Kum, J., Kim, H. Trans-spinal focused ultrasound stimulation selectively modulates descending motor pathway. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 30, 314-320 (2022).
- Hong, Y. -R., et al. Ultrasound stimulation improves inflammatory resolution, neuroprotection, and functional recovery after spinal cord injury. Sci Rep. 12 (1), 3636(2022).
- Hwang, B. Y., et al. Ultrasound in traumatic spinal cord injury: A wide-open field. Neurosurgery. 89 (3), 372-382 (2021).
- Liao, Y. -H., et al. Low-intensity focused ultrasound alleviates spasticity and increases expression of the neuronal K-Cl cotransporter in the l4-l5 sections of rats following spinal cord injury. Front Cell Neurosci. 16, 882127(2022).
- Payne, A. H., et al. Magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound to increase localized blood-spinal cord barrier permeability. Neural Regen Res. 12 (12), 2045-2049 (2017).
- Fletcher, S. -M. P., Choi, M., Ogrodnik, N., O'Reilly, M. A. A porcine model of transvertebral ultrasound and microbubble-mediated blood-spinal cord barrier opening. Theranostics. 10 (17), 7758-7774 (2020).
- Liao, Y. -H., Wang, B., Chen, M. -X., Liu, Y., Ao, L. -J. Lifu alleviates neuropathic pain by improvingthe kcc2 expression and inhibiting the camkiv-kcc2 pathway in the l4-l5 section of the spinal cord. Neural Plast. 2021, 6659668(2021).
- Song, W., Giannotti, A., Bekiaridou, A., Bloom, O., Zanos, S. Low intensity trans-spinal focused ultrasound reduces mechanical sensitivity and suppresses spinal microglia activation in rats with chronic constriction injury. Bioelectron Med. 11 (1), 8(2025).
- Glasenapp, A., Bankstahl, J. P., Bähre, H., Glage, S., Bankstahl, M. Subcutaneous and orally self-administered high-dose carprofen shows favorable pharmacokinetic and tolerability profiles in male and female C57bl/6j mice. Front Vet Sci. 11, 1430726(2024).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
