מיקרוסקופ לוקליזציה אולטרסאונד למיפוי ברזולוציה גבוהה של מיקרו-כלי דם במוח המכרסמים

Pia Virginia Pelaez; Sara Romanzi; Adrien Bertolo; Mohamed Nouhoum; Theo Meranger; Nathalie Ialy-Radio; Thomas Deffieux; Sophie Pezet; Jeremy Ferrier

doi:10.3791/68612

מאמר שיטה

מיקרוסקופ לוקליזציה אולטרסאונד למיפוי ברזולוציה גבוהה של מיקרו-כלי דם במוח המכרסמים

DOI:

10.3791/68612

⸱

14 בנובמבר 2025

Pia Virginia Pelaez^*¹ , Sara Romanzi^*¹ , Adrien Bertolo¹ , Mohamed Nouhoum¹ , Theo Meranger¹ , Nathalie Ialy-Radio² , Thomas Deffieux² , Sophie Pezet² , Jeremy Ferrier¹

¹Iconeus, ²Physics for Medicine Paris, Inserm U1273, ESPCI Paris, PSL University, CNRS UMR 8063

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ לוקליזציה אולטרסאונד (ULM) היא טכניקה שפותחה לאחרונה המאפשרת רמה חסרת תקדים של רזולוציה בהדמיית המיקרו-כלי דם in vivo. בעבודה זו, אנו מתארים בפירוט כיצד להשיג תמונות סופר-רזולוציה של כלי הדם במוח במכרסמים באמצעות פלטפורמת הדמיית אולטרסאונד פונקציונלית סטנדרטית המיועדת למחקר פרה-קליני.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיית לוקליזציה אולטרסאונד (ULM) היא טכניקת הדמיה ברזולוציה גבוהה המאפשרת הדמיה in vivo של הארכיטקטורה המיקרו-וסקולרית של המוח העולה על גבול העקיפה של אולטרסאונד קונבנציונלי. על ידי זיהוי ומעקב אחר מיקרו-בועות המוזרקות תוך ורידי בזמן שהן מסתובבות דרך כלי המוח, ULM מייצרת מפות ברזולוציה גבוהה של צפיפות כלי הדם, מהירות הזרימה ומשרעת האות המפוזר לאחור בקנה מידה מרחבי של עד 5-10 מיקרומטר. פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה מלאה לביצוע הדמיית ULM במכרסמים, כולל הכנת בעלי חיים, מיקום בדיקה, רכישת תמונה, הזרקת מיקרו-בועות ועיבוד נתונים, באמצעות פלטפורמת אולטרסאונד פונקציונלית ייעודית. מתוארות שתי שיטות הכנה, המותאמות לעכברים (טרנסגולגולתיים) וחולדות (עם חלונות גולגולת), ואחריהן הוראות מפורטות ליישור בדיקה ומיקוד אנטומי באמצעות אטלס מוח משולב. במהלך הרכישה, רצפי אולטרסאונד מהירים במיוחד מסונכרנים עם הזרקות בולוס של מיקרו-בועות כדי ללכוד נתוני זרימה דינמיים. שלבי השחזור הבאים כוללים סינון עומס, אינטרפולציה של תמונה, זיהוי מיקרו-בועות, לוקליזציה של תת-פיקסלים ומעקב אחר מסלול. התפוקות כוללות מפות צפיפות המשקפות את תפוסת כלי השיט, מפות מהירות החושפות דפוסי זרימה וכיווניות, ומפות משרעת המציעות ניגודיות נוספת לפרשנות מבנית. תוצאות מייצגות ממחישות רכישה מוצלחת על פני מישורי עטרה מלאים ומדגישות מלכודות נפוצות כגון איכות הזרקה ירודה, חפצי תנועה וסטייה הנגרמת על ידי גולגולת. הפרוטוקול תואם הן למחקרי חתך והן למחקרי אורך ומתאים במיוחד לחקירת שינויים בכלי הדם במוח במודלים של הזדקנות, שבץ מוחי, מפרצת ומחלות ניווניות. על ידי שילוב של חדירת עומק, רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה והדמיית כלי דם ללא תוויות, ULM מציעה כלי רב עוצמה לניתוח מיקרו-סירקולציה מוחית לא פולשנית במודלים פרה-קליניים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות שהמוח מהווה רק 2% ממסת הגוף, הוא צורך כ-20% מהחמצן והגלוקוז שלו כדי לשמור על פעילות עצבית¹. דרישה מטבולית גבוהה זו נענית על ידי רשת כלי דם מורכבת, מעורקים וורידים גדולים ועד לכלי דם זעירים כמו עורקים, ורידים ונימים, המווסתים באמצעות צימוד נוירו-וסקולרי². השיבוש של התהליך המכוון היטב הזה היה מעורב בספקטרום רחב של הפרעות נוירולוגיות. ניתוק נוירו-וסקולרי, למשל, הוא מאפיין פתולוגי מוקדם במחלות כמו אלצהיימר, פרקינסון, הנטינגטון וטרשת אמיוטרופית צידית (ALS), לעתים קרובות לפני סימני ההיכר הקלאסיים של ניוון עצבי כגון עמילואיד-בטא ופתולוגיה של טאו 3,4,5,6. הדמיית הטבע המורכב של המוח in vivo הייתה אפוא הדאגה העיקרית כדי לענות על הצורך הגובר בהבנת תהליכים פיזיולוגיים. ההתקדמות הטכנולוגית סיפקה יכולות ייחודיות לחקור את תפקוד המוח ופעילותו, הן באופן ישיר והן בעקיפין, עם דיוק, רזולוציה ונגישות הולכים וגדלים.

אולטרסאונד דופלר התגלה ככלי רב עוצמה למדידה תפקודית של פעילות המוח באמצעות זרימת דם⁷. בפרט, הדמיית דופלר כוח, שנועדה לזהות את תנועת כדוריות הדם האדומות (RBCs), מעבירה פולסים קוליים חוזרים ונשנים לכלי הדם ומתעדת את משרעת ההדים האולטראסונים המפוזרים לאחור על ידי RBCs נעים⁸. הופעת הדמיית אולטרסאונד מהירה במיוחד, במיוחד אולטרסאונד פונקציונלי (fUS), סימנה נקודה מרכזית בהתגברות על מגבלות קודמות. ואכן, אולטרסאונד קונבנציונלי סורק רקמות שורה אחר שורה - גישה רציפה המגבילה את יישומה לעורקי המוח העיקריים, מכיוון שלא ניתן לזהות את זרימת הדם האיטית האופיינית למיקרו-כלי הדם של המוח⁹. טכניקת ה-fUS העדכנית יותר משתמשת בשידורי גל מישור מרובים כדי לרכוש אלפי פריימים לשנייה, ומשפרת באופן דרמטי הן את הרזולוציה הזמנית והן את יחס האות לרעש (SNR). באופן מכריע, fUS מאפשר זיהוי של שינויים המודינמיים בכלי דם קטנים מאוד עם מהירויות נמוכות עד 1 מ"מ לשנייה, ותומך בהדמיה תפקודית בזמן אמת של פעילות המוח עד לרמת העורקים⁸.

בעוד ששיטות דופלר מהירות במיוחד שיפרו משמעותית את ההדמיה המיקרו-וסקולרית, הן עדיין מוגבלות על ידי הרזולוציה המוגבלת בעקיפה של אולטרסאונד¹⁰. במקביל ל-fUS, מיקרוסקופ לוקליזציה של אולטרסאונד (ULM) פורץ את המכשול הזה, ומאפשר הדמיה של מבנים מיקרו-וסקולריים ברמת הנימים על ידי מינוף חומרי ניגוד ואלגוריתמי לוקליזציה ברמת דיוק גבוהה¹¹. זה מספק תובנות חסרות תקדים לגבי מורפולוגיה ותפקוד של כלי הדם. ליתר דיוק, ב-ULM, חומרי ניגוד העשויים ממיקרו-בועות מיוצבות מלאות בגז, בקוטר של כ-1-3 מיקרומטר, מוזרקים לזרם הדם. הם פועלים כמפזרים אקוסטיים חזקים שניתן לזהות כמקורות נקודתיים בודדים. בהתחשב בכך שמיקרו-בועות קטנות משמעותית מאורך הגל של האולטרסאונד, ניתן לבודד אותן מרחבית וזמנית, ולהופיע כפונקציית התפשטות נקודתית (PSF) של המערכת. בהשראת טכניקות סופר-רזולוציה אופטיות כגון STORM ו-PALM, לוקליזציה תת-פיקסלית של מיקרו-בועות אלו מושגת באמצעות שיטות דה-קונבולוציה הממפות את מיקומן בדיוק גבוה 10,12,13,14. זה מאפשר לפתור מבנים וסקולריים ברזולוציה מרחבית של 5-10 מיקרומטר, הרבה מעבר לגבול העקיפה של הדמיית דופלר קונבנציונלית אולטרה-מהירה במיוחד.

ULM הוא כלי רב עוצמה ויעיל למיפוי כלי דם עד לקנה מידה נימי ומתגבר על המגבלות של שיטות אופטיות רבות המוגבלות לשכבות שטחיות. יכולתו לבצע הדמיה מיקרו-וסקולרית בבעלי חיים חיים, המאפשרת מחקרי אורך ופרמקולוגיים, היא יתרון מרכזי נוסף של ULM על פני טכניקות אחרות הדורשות קיבוע וצביעה של המוח. המידע המופק משתרע מעבר למפות כלי דם סטטיות, ומספק הערכות כמותיות של זרימת הדם עד לרמת הנימים, ובכך פותח אפיקים מבטיחים ליישומים פרה-קליניים וקליניים כאחד. כדי להקל על השחזור, אנו מתארים זרימת עבודה מלאה להדמיית מוח מבוססת ULM במכרסמים, המיושמת באמצעות פלטפורמת הדמיית אולטרסאונד פונקציונלית סטנדרטית המיועדת למחקר פרה-קליני.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים המתוארים במחקר זה נערכו בהתאם להנחיית מועצת הקהילה האירופית מיום 22 בספטמבר 2010 (010/63/UE) ואושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית (Comité d'éthique en matière d'expérimentation animale number 59, 'Paris Centre et Sud', project #2020-16). ניסויים נערכו על עכברי C57BL/6 Rj זכרים בוגרים (בני חודשיים, 20-30 גרם) וחולדות Sprague-Dawley Rj:Han (200-300 גרם) שמקורם מסחרי. בעלי החיים שוכנו בקבוצות של ארבעה בכל כלוב במחזור אור/חושך של 12 שעות, עם טמפרטורה קבועה של 22 מעלות צלזיוס, ועם מזון ומים שסופקו אד ליביטום. לפני תחילת הניסויים, כל בעלי החיים עברו תקופת הסתגלות של שבוע לפחות לתנאי הדיור. הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת בעלי חיים

הרדמה והכנת בעלי חיים בעכברים
1. הנח את העכבר בתא האינדוקציה של איזופלורן, תוך מתן 2% איזופלורן עם אוויר (0.075 ליטר לדקה) וחמצן (0.175 ליטר לדקה, או אוויר רפואי).
2. לאחר 5 דקות של השראת הרדמה, העבירו את החיה למסגרת הסטריאוטקסית, המונחת מעל כרית חימום המוגדרת על 37 מעלות צלזיוס כדי לשמור על טמפרטורת הגוף, ולהבטיח אספקה רציפה של איזופלורן באמצעות מסכה באותו ריכוז וקצב זרימה.
3. אשר עומק הרדמה הולם על ידי בדיקת היעדר רפלקסים בתגובה לצביטה בבוהן או בזנב באמצעות לחץ יציב אך לא מזיק. אם קיים רפלקס, הגדל מעט את ריכוז האיזופלורן. העריכו מחדש לפני שתמשיכו.
4. יש למרוח משחת עיניים למניעת היווצרות קטרקט.
5. גלח את ראש העכבר באמצעות גוזם. מרחו קרם אפילציה, הניחו לו לשבת במשך 1-1.5 דקות, ואז שטפו במים חמים וייבשו בגזה. יש לחזור על הפעולה לפי הצורך עד להסרת כל השיער. הימנע מהשארת קרם האפילציה לפרקי זמן ארוכים יותר, מכיוון שהוא עלול לגרום לנזק כימי לעור.
6. מרחו ג'ל אולטרסאונד צנטריפוגה (ללא בועות, נטול גז) על הראש כדי להבטיח צימוד אקוסטי.
הרדמה והכנת בעלי חיים בחולדות
1. לאחר שקילת החולדה, יש לתת זריקה תוך-צפקית של תערובת של קטמין (75 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג) באמצעות מזרק של 1 מ"ל. מגלחים את הפרווה על גבי הראש ומנקים את העור בתמיסת יוד.
  הערה: קטמין הוא חומר מוסדר מאוד במדינות רבות ועשוי לדרוש אישור מיוחד לרכישה ושימוש. ניתן להשתמש במשטרי הרדמה חלופיים להשגת הרדמה ברמה כירורגית.
2. מקם את החיה על מכשיר סטריאוטקסי המונח מעל כרית חימום המוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס כדי לשמור על טמפרטורת הגוף. יש למרוח כמות נדיבה של משחת עיניים על העיניים למניעת יובש והיווצרות קטרקט.
3. הזרקה תת עורית של מלוקסיקם (2 מ"ג/ק"ג) באמצעות מזרק של 1 מ"ל לשיכוך כאבים תוך ניתוחי.
4. ודא עומק הרדמה הולם על ידי בדיקת היעדר רפלקסים בתגובה לצביטה בבוהן או צביטה בזנב באמצעות לחץ יציב אך לא מזיק. אם קיים רפלקס, יש לתת מנה נוספת השווה לרבע ממנת ההרדמה הראשונית. המתן כ-5 דקות לפני הערכה חוזרת של עומק ההרדמה. יש להמשיך רק לאחר אישור מישור הרדמה כירורגי ולהעריך מחדש כל 20-30 דקות.
5. בצע חתך אורכי לאורך התפר הסגיטלי באמצעות אזמל, וודא שהחתך עמוק מספיק כדי לכלול את העור ורקמות החיבור המחוברות לגולגולת.
6. שמור על לחות הרקמות שמסביב לאורך כל הניתוח באמצעות מי מלח פיזיולוגיים.
7. בעזרת מקדחה סיבובית, עקוב קלות אחר קווי המתאר של חלון הגולגולת על ידי סימון שכבת פני השטח של הגולגולת. לגישה אופטימלית למוח, החלון צריך להיות בסביבות 14 מ"מ בממד הצדדי ולפחות 2 מ"מ בממד הקדמי-אחורי, תלוי בגודל הגולגולת.
8. המשיכו לטחון לאורך המתאר עד שלא תישאר עמידות לעצם. במהלך הקידוח יש למרוח מעת לעת כמה טיפות מי מלח פיזיולוגיים כדי לקרר את העצם ולמזער את הנזק התרמי. יש להכניס בקלות מרית עדינה עם קצוות עגולים לפער ללא כוח.
9. בעזרת משיכות קידוח קצרות וחד כיווניות, דק את שכבת העצם האחרונה עד שההתנגדות בקושי מורגשת.
10. הכנס מרית דקה ומעוקלת מעט עם קצוות מעוגלים בקצה הצדדי של חלון הגולגולת.
11. הזיזו לאט את המרית לכיוון המרכז, ונתקו בעדינות את העצם מקרומי המוח. לאחר שלא מורגשת התנגדות, הרם והסר לחלוטין את חתיכת העצם המנותקת.
12. מרחו ג'ל אולטרסאונד צנטריפוגה על גבי הדורה. תיאור של מערך הניסוי מתואר באיור 1.

figure-protocol-1
איור 1: סכמטי של מערך הניסוי להדמיית מוח ULM במכרסמים. מערכת ההדמיה מורכבת מיחידת רכישת אולטרסאונד המחוברת לבדיקה בתדר גבוה המותקנת על שלב מיקום ממונע. גם עכברים וגם חולדות מוצגים במסגרות סטריאוטקסיות: העכבר כולל קרקפת מגולחת להדמיה טרנס-גולגולתית, בעוד החולדה עוברת הדמיה דרך חלון גולגולת שהוכן בניתוח. קטטר וריד זנב מונח להזרקת חומר ניגוד בשני המינים. הגדרה זו מאפשרת רכישה יציבה של נתוני אולטרסאונד פונקציונליים ברזולוציה גבוהה במהלך הזרקת מיקרו-בועות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

צנתור וריד הזנב
1. השתמש בערכת עירוי מכונפת בגודל 27 גרם × 1/2 אינץ' המחוברת למחט 18 גרם × 1/2 אינץ' עם צינורות 8 אינץ'. קצר את הצינור, במידת האפשר, כדי למזער נפח מת.
2. סובבו בעדינות את זנב החיה ב-90 מעלות כדי לחשוף את ורידי הזנב הצדדיים (ראו איור 2). אבטח את הזנב במקומו באמצעות סרט כדי להבטיח יציבות ולמנוע תזוזה מיותרת במהלך הצנתור.
3. זהה את וריד הזנב על ידי התחלה מהקצה הדיסטלי (קצה הזנב) ותנועה לכיוון הבסיס. כדי להקל על שלב זה, ניתן לחמם את הזנב במים פושרים כדי לקדם את הרחבת כלי הדם ולשפר את נראות הוורידים.
4. בעזרת אצבע, הפעילו לחץ עדין בבסיס הזנב והחליקו אותו לכיוון מקום ההזרקה (כלומר, נגד כיוון זרימת הדם). תמרון זה מעכב באופן זמני את החזרת הווריד, וגורם לוורידי הזנב להתרחב ולהיות בולטים יותר, מה שמקל על החדרת הצנתר.
5. הכנס את המחט בגודל 27 גרם × 1/2 אינץ' של ערכת העירוי המכונפת במקביל לווריד, וודא שהשיפוע פונה כלפי מעלה.
6. שימו לב לצינור לנוכחות פלאשבק דם, המאשר מיקום נכון של המחט.
  הערה: התחל צנתור בקצה הזנב הדיסטלי כדי למנוע דליפה מדקירות קודמות במהלך הזריקות הבאות. אם צנתור וריד הזנב מתגלה כמאתגר או לא מוצלח, ניתן לשקול מסלולים מרכזיים חלופיים. אלה כוללים את הסינוס הרטרו-אורביטלי, וריד הצוואר או הווריד הספנוס.

figure-protocol-2
איור 2: אנטומיית חתך של זנב המכרסם הממחישה ציוני דרך בכלי הדם לצנתור. שרטוט סכמטי של חתך רוחבי דרך זנב המכרסם הדיסטלי, המציג את המיקומים היחסיים של כלי הדם העיקריים. שני עורקים קיימים בסמוך לקו האמצע: עורק הזנב הגבי הממוקם באזור העליון (הגבי), ועורק הזנב הגחוני, הממוקם בחלק התחתון (הגחון) של חתך הזנב. עורקים אלה נמנעים בדרך כלל במהלך פרוצדורות תוך ורידיות. משני צדי העורקים לרוחב נמצאים הוורידים הזנביים, העוברים באופן סימטרי משני הצדדים ושוכנים ממש מתחת לעור, מה שהופך אותם לאתרי הגישה המועדפים לצנתור או הזרקת מיקרו-בועות. סקירה אנטומית זו מסייעת בלוקליזציה המדויקת של הוורידים, במיוחד כאשר היא מוגברת על ידי התחממות כדי לקדם הרחבת כלי דם. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מיקום בדיקה באמצעות תוכנת IcoScan
1. בפלטפורמת הרכישה, הפעל את תוכנת הרכישה של fUS (למשל, IcoScan עבור Iconeus One) וצור סשן ניסוי. התאם את מיקום בדיקת האולטרסאונד.
  הערה: מקם את הגשושית כ-1 מ"מ מעל ראש החיה. ודא שהגשושית נמצאת במגע עם ג'ל האולטרסאונד לפני שתתחיל ברצף הדמיה כלשהו.
2. התחל את רכישת Live View והתאם את מיקום הגשושית לפי הצורך באמצעות הדמיית נפח דם מוחי (CBV) בזמן אמת. המוח צריך להיות מרוכז בתמונה. מטב פרמטרי הדמיה, כגון ניגודיות ודחיסה, כדי לשפר את איכות התצוגה החזותית.
3. פתח את תפריט Angio3D בתוכנת הרכישה. התאימו את פרמטרי הסריקה (פרוסה ראשונה, פרוסה אחרונה וגודל צעד), וודאו שהם מכסים את כל המוח. התחל את הרכישה.
  הערה: בעת הגדרת פרמטרי הסריקה, ודא שהסריקה מכסה את החלק האחורי של המוח, כלומר את כל העורקים האחוריים.
4. השאר את תוכנת הרכישה פתוחה והפעל את תוכנת IcoStudio לניתוח נתונים והדמיה. טען את סריקת Angio3D .
5. עבור ללוח רישום המוח ורשום את הסריקה למסגרת הקואורדינטות המשותפת של עכבר אלן באמצעות מצב רישום אוטומטי לחלוטין או ידני.
6. שמור את הרישום כקובץ .bps.
7. לאחר מכן, עבור לתפריט ניווט במוח . בחלונית Atlas Manager , השתמש בנווט עץ האב/צאצא כדי לעיין באטלס המוח של עכבר אלן. בחר את האזורים האנטומיים הממוקדים, שיונחו על גבי הסריקה בחלונית 3 התצוגות.
8. בחר מישור הדמיה החופף לאזורי העניין. הגדר ידנית שני סמנים בתצוגת העטרה כדי להגדיר את פרוסת ההדמיה הממוקדת.
9. לחץ על מערכת מיקום המוח (BPS) כדי לחלץ את הקואורדינטות המוטוריות המתאימות למיקום הגשושית להדמיית המישור הנבחר. בדוק את התצוגה המקדימה של התמונה, המחושבת מסריקת Angio3D, ולחץ על העתק קואורדינטות BPS.
10. עבור לתוכנת IcoScan ופתח את לוח מיקום הבדיקה . לחץ על הזן קואורדינטות BPS והדבק את הערכים שחולצו בשלב 1.4.9. הגשושית תנוע אוטומטית ותיישר עם מישור ההדמיה שנבחר.
11. בצע רכישה של Live View כדי לאשר שמישור ההדמיה הנוכחי תואם למישור החזוי משלב 1.4.8.
  הערה: על ידי שמירה ושימוש חוזר באותם סמנים מרחביים, ניתן להגדיר מחדש את מישור ההדמיה באופן עקבי לאורך מפגשים, מה שמאפשר מיקום מחדש מדויק של בדיקה למחקרי אורך.

2. רכישת ULM

הכנת מיקרו-בועות
הערה: ניתן להשתמש במגוון חומרי ניגוד אולטרסאונד זמינים מסחרית. עם זאת, הרכב הגז, ריכוז הבועה, הקוטר והיציבות עשויים להשתנות בהתאם למוצר בו נעשה שימוש. אנא עקוב אחר המלצות היצרן לגבי הכנה ואחסון.
1. בעזרת מזרק סטרילי, הזריקו 5 מ"ל של תמיסת נתרן כלורי 0.9% לתוך הבקבוקון דרך המחיצה.
  הערה: למתן בולוס חוזר או עירוי רציף, ניתן להשתמש בנפח נמוך יותר של תמיסת נתרן כלורי של 0.9% להכנת תרחיף מיקרו-בועות מרוכז יותר. התאם את גורם הדילול בהתאם ליישום המיועד.
2. ערבבו את הבקבוקון במרץ במשך 20 שניות כדי להשעות מחדש את המיקרו-בועות ולהשיג פיזור אחיד.
הקלטת ULM
1. הגדר מראש את פרמטרי ההקלטה, כולל רצף האולטרסאונד, קצב הפריימים וזמן ההקלטה הכולל.
  הערה: הפרמטרים המומלצים להקלטה הם 5-10 דקות ב-2.5 הרץ.
2. צייר את נפח המיקרו-בועות להזרקה והתחל את הרכישה. לאחר תחילת הרכישה, המשך בהזרקת המיקרו-בועה. מומלץ להזריק 200 מיקרוליטר לחולדות ו-100 מיקרוליטר לעכברים, בדילול המתאים.
3. אשר את שיפור הניגודיות בתמונת Live View. מיד לאחר מכן, שטפו את המיקרו-בועות הנותרות בנפח המת על ידי הזרקת נוזל פיזיולוגי לתוך הצנתר. דוגמה טיפוסית לפרופיל עוצמת מיקרו-בועות מוצגת באיור 3.
4. המתן להשלמת הרכישה ושמור את הנתונים.
5. בתום הרכישה, המשך באופן הבא, בהתאם לפרוטוקול בו נעשה שימוש:
  1. לעכברים (פרוטוקול לא פולשני): הפוך את ההרדמה על ידי הפסקת מתן איזופלורן ועקוב אחר בעל החיים במהלך ההחלמה בסביבה חמה עד להתעוררות מלאה.
  2. לחולדות (פרוטוקול פולשני עם חלון גולגולתי): המתת חסד של בעל החיים על ידי הזרקה תוך-צפקית של אותסול (פנטוברביטל נתרן, 140 מ"ג/ק"ג), בהתאם להנחיות מוסדיות ואתיות.

figure-protocol-3
איור 3: עוצמת אות מיקרו-בועות לאורך זמן. (A) איור של אזור העניין (ROI) שמשמש לחילוץ אותות, שמקיף את כל פרוסת המוח העטרה. (B) מהלך זמן של עוצמת אות מיקרו-בועה במהלך רכישה של 5 דקות. בולוס המיקרו-בועות הוזרק ב-30 שניות, וכתוצאה מכך עלייה אופיינית במשרעת האות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

3. שחזור תמונה באמצעות תוכנת IcoLab

פתח את IcoLab ונווט אל ULM על ידי לחיצה על הכרטיסייה ULM בחלק השמאלי ביותר של המסך.
לחץ על מחשוב מפות ULM כדי להתחיל את זרימת העבודה של העיבוד, כמפורט באיור 4.
בחר את תיקיית המקור המכילה את הנתונים שנרכשו.
בחר את הסריקה הספציפית לעיבוד והתאם את גבולות זמן העיבוד במידת הצורך.
לחץ על הבא כדי להמשיך לשלב הדיווח. בשלב דיווח, קבע את תצורת נתיב תיקיית הפלט שבו יישמרו קבצים מעובדים. הגדר את פרמטרי התצוגה החזותית עבור התמונות שייכללו בדוח PowerPoint.
סקור את סיכום האפשרויות שנבחרו המוצג במסך הסופי.
כשתהיה מוכן, לחץ על RUN כדי להתחיל בעיבוד. לאחר השלמת העיבוד, ייווצר קובץ .trk, המכיל את כל הקואורדינטות של מיקרו-בועות מקומיות, יחד עם קבצי TIFF עם רסטר עבור צפיפות, מהירות ומשרעת מפוזרת לאחור (BSA).
הערה: רכישה של 5 דקות עשויה לדרוש מספר שעות של עיבוד. שלב זה מבוצע בצורה הטובה ביותר במהלך הלילה או בתחנת עבודה ייעודית.
1. יצירת מפות צפיפות מיקרו-בועות: מיקומים מקומיים של כל המיקרו-בועות שזוהו מצטברים לאורך זמן הרכישה שנבחר. מפה מיקומים אלה על רשת מרחבית ברזולוציה קבועה.
  הערה: כל פיקסל במפת הצפיפות המתקבלת משקף את ספירת המיקרו-בועות הממוקמות בתוך אותו סל מרחבי. הפלט הסופי הוא תמונה בגווני אפור (TIFF) שבה עוצמת הפיקסלים תואמת לתפוסת כלי הדם, ומאפשרת שחזור ברזולוציה גבוהה של רשת כלי הדם.
2. יצירת מפות מהירות: התוכנה עוקבת אחר מיקרו-בועות בודדות על פני מסגרות עוקבות כדי ליצור מסלולים. עבור כל מסלול, התוכנה מחשבת וקטור מהירות על ידי חלוקת התזוזה בזמן שחלף (מניב וקטור מהירות במ"מ לשנייה).
  הערה: ניתן ליצור שני סוגים של מפות מהירות: מפות מהירות מוחלטות, שבהן כל פיקסל מאחסן את גודל המהירות הממוצע של מיקרו-בועות שעוברות דרכו, ומפות מהירות כיווניות, שבהן המהירות מתפרקת לאורך ציר אנטומי נבחר (כלומר, x או z), והרכיב החתום המתאים מאוחסן. מפות אלה מוסיפות רסטר באותה רשת מרחבית ונשמרות כתמונות TIFF נפרדות.
3. יצירת מפות BSA: עבור כל מיקרו-בועה מקומית, מוצגת משרעת אות האולטרסאונד הגולמית (עוצמה מפוזרת לאחור). הקרן את המשרעות הללו על הרשת המרחבית, וצברה את עוצמת האות בכל פיקסל. מפת ה-BSA שהתקבלה מדגישה אזורים שבהם מיקרו-בועות עברו דרך אזור המוקד של האלומה, ומספקת ניגודיות המשלימה את מפות הצפיפות והמהירות¹⁵.

figure-protocol-4
איור 4: תרשים זרימה של צינור העיבוד עבור שחזור מפת ULM. האיור ממחיש את שלבי העיבוד הרציפים שבוצעו בתוכנת הניתוח ליצירת מפות ULM מנתוני אולטרסאונד גולמיים. החל ממסגרות מורכבות (n = 200), שלב 1 מחיל סינון עומס של פירוק ערך יחיד (SVD) כדי לבודד אותות מיקרו-בועות (MB) מרקע הרקמה. בשלב 2, אותות ה-MB עוברים אינטרפולציה של לנצ'וס, וכתוצאה מכך ערימת תמונות מעובדת מראש. שלב 3 מבצע זיהוי מקסימום מקומי ומתאם אותם עם פונקציית התפשטות הנקודה (PSF) של המערכת כדי לזהות מיקומי מיקרו-בועות מועמדים. בשלב 4, לוקליזציה של תת-פיקסלים (זיהוי צנטרואידי) ומעקב אחר חלקיקים משמשים לחילוץ מסלולי מיקרו-בועות, שמהם מחושבות מפות של מהירות ומשרעת מפוזרת לאחור. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

4. ויזואליזציה של נתונים באמצעות תוכנת IcoStudio

טען קובץ .trk ב-IcoStudio כדי להתחיל בחקר נתונים.
התאם פרמטרים של תצוגה חזותית כגון ניגודיות, דחיסה ומפת צבעים בחלונית הימנית כדי לחדד את ייצוג הנתונים.
הגדר את זמן האינטגרציה באמצעות המחוון הכפול בתחתית התצוגה הראשית כדי להגדיר את מסגרות ההתחלה והסיום.
פתחו את הכרטיסייה 'דחיפות ' כדי להציג מופעי מיקרו-בועות ובחרו בין 'צפיפות מוחלטת ' (ספירה לפיקסל) לבין 'צפיפות כיוונית ' (משוקללת צירית).
השתמש בכרטיסייה מהירות כדי להציג מהירות מיקרו-בועות במ"מ לשנייה במספר מצבים: מוחלט, כיווני, צירי ורוחבי. התאימו את הניגודיות, הדחיסה וסף המהירות כדי לשפר את ההדמיה.
חקור את הכרטיסייה BSA כדי להמחיש רפלקטיביות מיקרו-בועות, המספקת מנגנון ניגודיות חלופי המדגיש מבנים מיקרו-וסקולריים ותנועה מחוץ למישור. ייצאו צילומי מסך PNG ברזולוציה גבוהה או צרו קובצי TIFF לניתוח כמותי עם הגדרות גודל פיקסלים וסוג נתונים הניתנות להתאמה אישית.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדוגמאות המייצגות באיור 5 מציגות דוגמה טיפוסית לנתוני ULM של מוח חולדה שנרכש במשך דקה אחת של הקלטה לאחר 200 מיקרוליטר של הזרקת בולוס מיקרו-בועות, ברזולוציה של 10 מיקרומטר.

figure-results-1
איור 5: יציאות ULM מייצגות המתקבלות מחולדה קרניוטומית לאחר הזרקת מיקרו-בועה יחידה. מפות לדוגמה של צפיפות מיקרו-בועות (MB) (משמאל), מהירות (מרכז) ומשרעת מפוזרת לאחור (מימין) מוצגות עבור פרוסת מוח קורונלית מלאה, שנרכשה במשך דקה אחת של הקלטה לאחר הזרקת בולוס של 200 מיקרוליטר של מיקרו-בועות. סרגל קנה מידה: 2 מ"מ. כניסות מוגדלות מדגישות את המיקרו-כלי דם בקליפת המוח השמאלית (סרגל קנה מידה: 0.5 מ"מ). מפת הצפיפות משקפת את ההתפלגות המרחבית של מופעי MB, וחושפת את מבנה רשת כלי הדם. מפת המהירות ממחישה את מהירות הזרימה והכיווניות של MBs בודדים, ומאפשרת בידול בין סוגי כלי שיט. מפת המשרעת מציגה את אות האולטרסאונד המפוזר לאחור מ-MBs, ומספקת מנגנון ניגודיות נוסף המשפר את ההדמיה של מורפולוגיה של כלי הדם ותנועה מחוץ למישור. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

המפות המתקבלות ממחישות שלוש תצוגות משלימות של המיקרו-כלי דם במוח: צפיפות מיקרו-בועה (MB) (משמאל), מהירות (מרכז) ומשרעת מפוזרת לאחור (מימין). כל מפה מתאימה לפרוסה עטרתית מלאה של המוח, עם שיבוצים מוגדלים המדגישים את כלי הדם המיקרו-קליפתיים השמאליים (פסי קנה מידה: 2 מ"מ ו-0.5 מ"מ, בהתאמה).

מפת הצפיפות מציגה את ההתפלגות המרחבית של מופעי MB על פני שדה הראייה. מורפולוגיה של כלי הדם נפתרה הרבה מתחת לגבול העקיפה, וחושפת גם כלים גדולים וגם מבנים נימיים עדינים. סוג זה של מפה מאפשר הדמיה ברורה של טופולוגיית רשת כלי הדם, כולל הסתעפויות ודפוסי הסתעפות, אפילו באזורים עמוקים בקליפת המוח.

מפת המהירות מציגה את מהירות הזרימה של MBs בודדים המוקרנים לאורך הכיוון הצירי (z). הקרנה זו מייצרת ערכי מהירות מסומנים, כאשר מהירויות שליליות משקפות זרימה כלפי מעלה לתוך קליפת המוח וערכים חיוביים משקפים זרימה כלפי מטה. בקליפת המוח של המכרסמים, ארכיטקטורת כלי הדם היא סטריאוטיפית מאוד: עורקים חודרים יורדים משטח הפיאל לשכבות קליפת המוח, בעוד ורידים עולים מקליפת המוח חזרה אל פני השטח כדי לנקז דם לא מחומצן¹⁶. סידור אנטומי עקבי זה מאפשר שימוש במדידות מהירות כיווניות כדי להבחין בין סוגי כלי דם, כאשר מהירויות ציריות חיוביות מצביעות בדרך כלל על זרימה עורקית ומהירויות שליליות מצביעות על ניקוז ורידים. בסך הכל, ערכי המהירות שנמדדו עם ULM תואמים לטווחים שדווחו בעבר בספרות^10,17, המשתרעים בין 10-20 מ"מ לשנייה בעורקים חודרים למספר סנטימטרים לשנייה בעורקים תוך גולגולתיים עיקריים. ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם תצפיות קודמות כי מיקרו-בועות זורמות מחקות מקרוב את ההתנהגות הריאולוגית של כדוריות דם אדומות¹⁸, ומאמתות את השימוש ב-ULM לכימות דינמיקת זרימת דם פיזיולוגית בקנה מידה מיקרו.

מפת המשרעת המפוזרת לאחור (BSA) מספקת ייצוג מרחבי של עוצמת אות האולטרסאונד המוחזרת על ידי כל MB. מכיוון שהאנרגיה המפוזרת לאחור מקסימלית כאשר MBs עוברים דרך אזור המוקד, מפה זו מציעה ניגודיות המבוססת על מיקום הגובה. זה עוזר לחדד את הפילוח על ידי זיהוי תנועה מחוץ למישור או כלי שיט בעלי משרעת נמוכה, במיוחד בעומקים גדולים יותר או ליד קצוות המוקד. מפות BSA הן בעלות ערך גם לאיתור הנחתת אות הקשורה לעומק או לזיהוי אי התאמות ביישור מוקד¹⁵.

כדי להדגים את יכולת השחזור של מיקוד מישורי עם מערכת מיקום המוח, איור 6A מציג מפות צפיפות כלי דם של ULM שנרכשו באותו עכבר בהרדמה ביום 0 (שבוע 1) וביום 7 (שבוע 2), המכוונות לאותו מישור עטרה. שכבת העל של שתי המפות מציגה התאמה מרחבית חזקה של אות כלי הדם, המאשרת את הדיוק של מיקום מחדש של המישור ואת האמינות של ניסויי אורך, כפי שהוצג קודם לכן¹⁹.

ניתן ליישם ניתוח כמותי על כל אחת מהתפוקות הללו. לדוגמה, משתמשים עשויים לפלח כלי דם באמצעות ספי עוצמה או אלגוריתמי אשכולות, ולאחר מכן לחלץ נתונים סטטיסטיים אזוריים כגון צפיפות כלי הדם, מהירות זרימה ממוצעת ופרמטרים מורפומטריים כולל רדיוס כלי הדם, אורך ממוצע, מספר ענפים ומתארים מבניים אחרים של רשת כלי הדם. השוואות בין אזורים בקליפת המוח או קבוצות ניסוי (למשל, הזרקת תרופה לעומת ביקורת) יכולות להתבצע ישירות על מפות אלה או באמצעות סטטיסטיקה פרמטרית נגזרת על כלי דם מזוהים בדרך כלל^20,21. כדוגמה לניתוח כזה, ביצענו כימות אזורי של פרמטרים וסקולריים בקליפת המוח הסומטוסנסורית השמאלית (S1BF, איור 6B) ובתלמוס השמאלי (איור 6C). מפות הצפיפות היו תחילה בינאריות, שלדיות, ורדיוסי כלי השיט הוערכו באמצעות טרנספורמציה של מרחק אוקלידי. מהירויות הזרימה התקבלו ישירות ממסלולי ה-MB, וקצב הזרימה נגזר מרדיוס הכלי באמצעות חוק Poiseuille כפי שפורט קודם לכן²¹. אותה מתודולוגיה שתוארה במחקר זה יושמה כאן. עלילות שפם מציגות את ההתפלגות של רדיוס הכלי, המהירות וקצב הזרימה עבור d0 ו-d7, ומדגימות יכולת שחזור טובה על פני מפגשים. יחד, פלטי ULM רב-מודאליים אלה מאפשרים אפיון מקיף של הרשת המיקרו-וסקולרית של המוח, ומציעים תובנות אנטומיות ודינמיות ברזולוציה חסרת תקדים.

figure-results-2
איור 6: שחזור אורכי של מיקוד מישורי ודוגמה לכימות כלי דם באמצעות מערכת מיקום המוח. (A) מפות צפיפות כלי דם של ULM שהתקבלו מאותו עכבר מורדם ביום 0 (שבוע 1) וביום 7 (שבוע 2), שמכוונות לאותו מישור עטרה באמצעות מערכת מיקום המוח (סרגל קנה מידה = 1 סנטימטר). שכבת העל של שתי המפות מציגה התאמה מרחבית חזקה של אות כלי הדם, הממחישה את יכולת השחזור של מיקום המישור על פני מפגשים. (ב,ג) כימות מייצג של פרמטרים וסקולריים שחולצו משני אזורים מעניינים: קליפת המוח הסומטוסנסורי השמאלית (S1BF, B) והתלמוס השמאלי (C). עבור כל אזור, אנו מציגים את מפת צפיפות כלי הדם ב-d0 (סרגל קנה מידה = 0.5 ס"מ), יחד עם תרשימי שפם המציגות את התפלגות רדיוס הכלי (מיקרומטר), מהירות הזרימה (מ"מ^לשנייה) וקצב הזרימה (מ"מ 3/s) ב-d0 ו-d7 (חציון, אחוזון 25-75, שפם = 1.5×IQR, חריגים משורטטים בנפרד). תוצאות אלו ממחישות את יכולתו של הצינור לחלץ מדדים מורפומטריים והמודינמיים מנתוני ULM. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיית לוקליזציה של אולטרסאונד (ULM) מייצגת התקדמות טרנספורמטיבית בהדמיית אולטרסאונד, המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של המיקרו-כלי דם מעבר לגבול העקיפה הקונבנציונלי. דיון זה מדגיש את השלבים הקריטיים בפרוטוקול ULM, מתייחס לשינויים פוטנציאליים ואסטרטגיות לפתרון בעיות, בוחן את מגבלות השיטה, מעריך את משמעותה בהשוואה לשיטות הדמיה חלופיות, ושוקל את חשיבותה ויישומיה הפוטנציאליים במחקר ביו-רפואי.

שלבים קריטיים בפרוטוקול ULM

מספר שלבים חיוניים ליישום מוצלח של ULM, והשפעתם מודגמת באיור 7. אחד השלבים החשובים ביותר הוא מתן מיקרו-בועות, שכן גם הריכוז וגם איכות האספקה משפיעים ישירות על תוצאות ההדמיה. יש צורך בריכוז אופטימלי כדי לאזן את הרזולוציה המרחבית ויכולת הזיהוי. אספקה לא מספקת, כגון מיקום לקוי של קטטר או אקסטרוואזציה, עלולה לגרום לאות כלי דם נמוך מאוד ולשחזורים לא שלמים, כפי שמוצג באיור 7B, שבו רק מספר דליל של מיקרו-בועות מגיע לזרם הדם. הדמיה בקצב פריימים גבוה, בדרך כלל בתחום הקילו-הרץ, חיונית ללכידת התנועה המהירה של מיקרו-בועות ולאפשר מעקב אמין בין פריימים. כל חוסר יציבות במהלך הרכישה, כגון תנועה המוכנסת על ידי נשימה, קיבוע לקוי או הרדמה לא מספקת, עלולה לפגוע בדיוק הלוקליזציה. דוגמה לכך מודגמת באיור 7C, שבו תנועה מוגזמת במהלך הרכישה גורמת למפת צפיפות מטושטשת ובלתי שמישה.

לוקליזציה ומעקב אחר מיקרו-בועות תלויים באלגוריתמים מתקדמים לעיבוד תמונה המזהים בועות בודדות, מבצעים לוקליזציה של תת-פיקסלים ומשחזרים מסלולים בדיוק תת-עקיפה. אפילו עם רכישה ועיבוד נאותים, גורמים אנטומיים כגון סטיות הנגרמות על ידי גולגולת עדיין יכולים להשפיע על איכות התמונה. בהדמיה טרנס-גולגולתית, במיוחד בעכברים מבוגרים, עיבוי הגולגולת יכול להכניס עיוות אקוסטי. זה מוביל לחפצי הצללה אופייניים מתחת לתפר הסגיטלי, שבו לא מתגלות מיקרו-בועות, כפי שמתואר באיור 7D. סטיות כאלה מפחיתות את יחס האות לרעש ועלולות לטשטש מבני כלי דם אלא אם כן תוקנו באמצעות סינון אדפטיבי או על ידי חידוד מיקום הבדיקה.

כאשר כל השלבים מבוצעים בהצלחה, ניתן להשיג מפות ULM באיכות גבוהה, כפי שמוצג באיור 7A, שם רשת כלי דם צפופה ונפתרת היטב משוחזרת באמצעות גישה טרנס-גולגולתית.

figure-discussion-1
איור 7: דוגמאות ייחוס ופתרון בעיות עבור איכות הדמיית ULM בעכברים. לוח (A) מציג מפת צפיפות מיקרו-בועות ULM (MB) טרנס-גולגולתיות באיכות גבוהה שנרכשה בעכבר בוגר צעיר, הממחישה מיפוי כלי דם מוצלח על פני מישור העטרה המלא. פאנל (B) מציג דוגמה לאות כלי דם גרוע עקב אקסטרוואזציה של מיקרו-בועות או גישה ורידית לא מספקת, וכתוצאה מכך גילויי MB דלילים. לוח (C) מציג רכישה המושפעת מתנועה מוגזמת של בעלי חיים, ומייצר מפת צפיפות מטושטשת ובלתי ניתנת לפרשנות. פאנל (D) מדגיש סטייה אקוסטית הנגרמת על ידי גולגולת הנצפית בדרך כלל בעכברים מבוגרים, הנראית כחרוט צל מתחת לתפר הסגיטלי שבו לא מזוהים MBs עקב יחס אות לרעש מופחת. דוגמאות אלו משמשות כהפניות חזותיות לזיהוי וטיפול בחפצים ניסיוניים נפוצים בהדמיית ULM. סרגל קנה מידה: 1 מ"מ. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מגבלות השיטה

למרות יתרונותיו הרבים, ל-ULM יש מגבלות מובנות המשפיעות על תחולתו. הטיית כלי שיט מחוץ למישור היא נושא משמעותי בהדמיה דו-ממדית, מכיוון שכלי דם המשתרעים מחוץ למישור ההדמיה אינם משוחזרים כראוי, מה שמוביל למפות כלי דם לא שלמות. ניתן להקל על מגבלה זו על ידי מעבר לגישות הדמיה נפחיות (תלת מימד)²², אם כי הדבר מגביר את המורכבות החישובית. אתגרי צנתור תוך ורידי מהווים גם הם מכשול, במיוחד במודלים של בעלי חיים קטנים, שבהם השגת אספקת מיקרו-בועות עקבית יכולה להיות תובענית מבחינה טכנית. יציבות מיקרו-בועות היא גם גורם מגביל, במיוחד במהלך מפגשי הדמיה ממושכים. בשל מחצית החיים הקצרה של מחזור הדם, מיקרו-בועות עשויות לדרוש זריקות בולוס חוזרות או פרוטוקולי עירוי רציפים כדי לשמור על ניגודיות נאותה לאורך כל תקופת הרכישה. חפצי תנועה נותרו דאגה משמעותית, במיוחד עבור נבדקים ערים, שבהם אפילו תנועות לא רצוניות קטנות עלולות לפגוע בהדמיה ברזולוציה גבוהה. לבסוף, חדירת העומק ב-ULM מוגבלת מטבעה על ידי הנחתת אולטרסאונד. למרות שזה בדרך כלל לא בעייתי עבור הדמיית מכרסמים בתדרים גבוהים (למשל, 15 מגה-הרץ), זה הופך להיות מאתגר יותר בבעלי חיים גדולים יותר כמו חזירים או פרימטים לא אנושיים. במקרים אלה, ייתכן שיידרשו בדיקות בתדר נמוך יותר כדי להשיג עומק הדמיה מספיק, אך הדבר בא במחיר של רזולוציה מרחבית מופחתת - תוך הדגשת פשרה מרכזית בין עומק לפרטים שיש לקחת בחשבון בעת תרגום ULM למודלים פרה-קליניים גדולים יותר.

חשיבות ה-ULM בהשוואה לשיטות הקיימות

מיקרוסקופיית לוקליזציה של אולטרסאונד (ULM) מציעה יתרונות משמעותיים על פני שיטות הדמיה קונבנציונליות, במיוחד בהקשר של הדמיה מיקרו-וסקולרית. בין נקודות החוזק הבולטות שלו היא יכולתו לעבור את גבול העקיפה של אולטרסאונד מסורתי, ולהשיג הדמיית תת-עקיפה בקנה מידה מרחבי הדומה לטכניקות אופטיות כגון מיקרוסקופיה דו-פוטונית. עם זאת, בניגוד לשיטות אופטיות אלה, ULM מספק חדירה עמוקה יותר לרקמות, ומאפשר גישה לאזורים במוח שאחרת קשה לדמיין באופן לא פולשני.

ULM מציעה גם יכולות הדמיה פונקציונליות, המאפשרות הערכה כמותית של מהירות זרימת הדם, דינמיקת הזלוף ושיפוץ כלי הדם. תכונות אלו הופכות אותו למתאים ביותר לחקירת תהליכים פיזיולוגיים ושינויים פתולוגיים ברשתות נוירו-וסקולריות. בהשוואה ל-MRI ו-PET, ULM חסכוני יותר, אינו דורש תשתית כבדה ונמנע משימוש בחומרי ניגוד עם סיכוני רעילות ידועים, ומסתמך במקום זאת על מיקרו-בועות מלאות בגז עם פרופילי בטיחות נוחים.

השילוב של רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה הופך את ULM לבעל ערך מיוחד עבור מגוון יישומי מחקר. הוא חזק במיוחד במחקרים המתמקדים במבנים מיקרו-וסקולריים וגרעיני מוח עמוקים, שבהם השיטות המסורתיות נופלות לעתים קרובות. יתר על כן, בניגוד לגישות היסטולוגיות הדורשות קיבוע וצביעה של רקמות, ULM מאפשר הדמיה בזמן אמת בבעלי חיים חיים, ותומך בעיצובים אורכיים והתערבויות דינמיות כגון אתגרים פרמקולוגיים.

מעבר למיפוי כלי דם סטטי, ULM מאפשר גם הדמיה פונקציונלית ברזולוציה גבוהה על ידי לכידת דינמיקת זרימת דם מוחית בדיוק מרחבי וזמני יוצא דופן. ההתקדמות האחרונה הדגימה את היתכנותה להדמיה מוחית תפקודית של כל המוח במכרסמים, וחשפה שינויים מעוררי גירוי ותלויי פעילות ספונטניים בזרימת הדם ברמת הנימים על פני רשתות מוח מבוזרות². זה מציב את ULM ככלי רב עוצמה למחקרים פונקציונליים, המגשר ביעילות על הפער בין הדמיה המודינמית בקנה מידה בינוני למיפוי פעילות עצבית.

שיקולי שימושיות, יעילות ושחזור

זרימת העבודה של ULM המתוארת בפרוטוקול זה עברה אופטימיזציה כדי להקל על היישום ויכולת השחזור על פני הגדרות ניסיוניות שונות. השימוש ברכיבים זמינים מסחרית, כולל מיקרו-בועות שאושרו על ידי ה-FDA וה-EMA והליכי הרדמת מכרסמים סטנדרטיים, מבטיח נגישות רחבה. בנוסף, השילוב של כל צינור העיבוד בתוך התוכנה הייעודית (IcoLab) משפר מאוד את השימושיות על ידי אוטומציה של שלבים מורכבים כגון לוקליזציה של מיקרו-בועות, שחזור מסלול ויצירת מפות. ממשק יעיל זה מפחית את הצורך בקוד מותאם אישית וממזער את התערבות המשתמשים, ותומך בתוצאות עקביות בין משתמשים וניסויים. בעוד שעיבוד ULM ברזולוציה גבוהה הוא אינטנסיבי מבחינה חישובית, במיוחד עבור רכישות ארוכות או נתונים נפחיים, כלי עיבוד אצווה והאצת GPU מפחיתים משמעותית את זמן הניתוח. העיצוב המודולרי של הפרוטוקול תומך גם בשחזור, ומאפשר לחוקרים לכוונן פרמטרים של רכישה ועיבוד תוך שמירה על מסגרת אנליטית חזקה. הפרוטוקול כולל גם סעיף ייעודי על מיקום בדיקה באמצעות IcoScan ו-IcoStudio, המאפשר למשתמשים למקם מחדש את הגשושית באופן אמין באותה פרוסת הדמיה בדיוק על פני הפעלות, עם דיוק של כ-100 מיקרומטר. תכונה זו חשובה במיוחד עבור מחקרי אורך, שבהם עקביות מרחבית מדויקת חיונית למעקב אחר שינויים בכלי הדם לאורך זמן. תכונות אלה ביחד מורידות את מחסום הכניסה למשתמשים חדשים ותומכות בפריסה ניתנת להרחבה של ULM במחקרי הדמיה גישוש ואורך כאחד.

מסקנה

פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה מלאה ליישום מיקרוסקופיית לוקליזציה של אולטרסאונד (ULM) בהדמיית מוח מכרסמים, המכסה הכנה כירורגית, מתן מיקרו-בועות, רכישת תמונה ומיפוי כלי דם ברזולוציה גבוהה באמצעות פלטפורמת רכישה וניתוח סטנדרטית המותאמת למחקר פרה-קליני. ULM מייצג התקדמות משמעותית בהדמיה ביו-רפואית, ומציע הדמיה ברזולוציה גבוהה של המיקרו-כלי דם עם פירוט חסר תקדים. בהשוואה לשיטות הדמיה קיימות, ULM מספק שילוב ייחודי של רזולוציה מרחבית גבוהה, כימות זרימה פונקציונלית ונגישות, מה שהופך אותו למתאים במיוחד למחקרים של התפתחות כלי דם, צימוד נוירו-וסקולרי ופתופיזיולוגיה של מחלות. ככל שהטכנולוגיה ממשיכה להתבגר, ULM עומדת להפוך לאבן פינה הן במחקר פרה-קליני והן ביישומי הדמיה מוחית קלינית.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TD הוא מייסד שותף ויועץ מדעי של Iconeus, המשווק סורקי הדמיה מוחית באולטרסאונד. PP, SR, AB, TM, MN ו-JF הם עובדים של Iconeus. כל המחברים האחרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לפיליפ מתאו ולנטונירינה עבדול-אגיג' מפיזיקה לרפואה בפריז על תמיכתם בטיפול בבעלי חיים. איור 1 ואיור 2 נוצרו עם BioRender.com.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בקר טמפרטורת בעלי חיים (פלטת חימום בשילוב עם גלאי רקטלית)	פיזיטמפ	TCAT-2DF
Atipamezole	אוריון פארמה, צרפת	אנטיסדאן	תמיסה להזרקה של 5 מ"ג/מ"ל
עכברים C57BL/6	Janvier Labs	SC-C57J-M	עכברים זכרים C57BL/6Rj, בני 8 שבועות
מקדחה דנטלית	פורדום, ארה"ב	ערכת מנוע סיבובי מהיר K.1070
קרם הסרת שיער	וישי	לא זמין
משחת עיניים	TVM, בריטניה	אוקרי-ג'ל
גזום שיער	פימפ	ISIS GT 421 אסקולאפ
תוכנת עיבוד IcoLab (גרסה 1.2.0.0)	איקונאוס, צרפת	IcoLab
תצורת Iconeus One Xpand	איקונאוס, צרפת	IconeusOne Xpand
גלאי IcoPrime 15MHz	איקונאוס, צרפת	גלאי IcoPrime-15MHz
תוכנת רכישת IcoScan (v1.9.0)	איקונאוס, צרפת	IcoScan
תוכנת ניתוח IcoStudio (v2.2.0)	איקונאוס, צרפת	IcoStudio
תמיסת יוד	מיילן, צרפת	לא זמין
תחנת הרדמה איזופלורנית	מינרוב, אסטרנה, צרפת	לא זמין
קטמין	וירבאק, צרפת	Ketamine1000	תמיסה להזרקה של 100 מ"ג/מ"ל
מלוקסיקאם	בוהרינגר אינגלהיים	Metacam	תמיסה להזרקה של 0.5 מ"ג/מ"ל
מחטים	טרומו, צרפת	AN*1838R1	18 G x & frac12; ” מחט עם 8" צינורות
מים מלוחים	מעבדה גילברט פיזיודוזה, בית מרקחת, צרפת	לא זמין
סכין מנתח	DREXCO Medical, צרפת	80011
מיקרובועות SonoVue	בראקו אימג'ינג	SonoVue 8ul/ml
מרית	פימד, צרפת.	ערכת מנוע סיבובי מהיר K.1070
ספרג-דולי Rj:האן ראטס	Janvier Labs	RN-SD-M	RjHan:SD - עכברי זכר ספרג דולי, 200-300 גרם
מסגרת סטריאוטקסית	דיוויד קופף (טוג'ונגה, ארה"ב)	900-WA	שימוש במתאם עכבר (מקור: 922) ומוטות אוזניים ללא קרע (מקור: 922)
מזרק	DREXCO Medical, צרפת	2058
ג'ל אולטרסאונד	DREXCO Medical, צרפת	מדי'גל
סט אינפוזיית כנפיים	טרומו, צרפת	SV*27EL
זילזין 2%	באייר, צרפת	רומפון	תמיסה להזרקה של 20 מ"ג/מ"ל

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jamadar, S. D., Behler, A., Deery, H., Breakspear, M. The metabolic costs of cognition. Trends Cogn Sci. 29 (6), 541-555 (2025).
Renaudin, N., et al. Functional ultrasound localization microscopy reveals brain-wide neurovascular activity on a microscopic scale. Nat Methods. 19 (8), 1004-1012 (2022).
Agarwal, N., Carare, R. O. Cerebral Vessels: An overview of anatomy, physiology, and role in the drainage of fluids and solutes. Front Neurol. 11, 611485(2021).
Ahmad, A., Patel, V., Xiao, J., Khan, M. M. The role of neurovascular system in neurodegenerative diseases. Mol Neurobiol. 57 (11), 4373-4393 (2020).
Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders. Nat Neurosci. 21 (10), 1318-1331 (2018).
Kolinko, Y., Krakorova, K., Cendelin, J., Tonar, Z., Kralickova, M. Microcirculation of the brain: Morphological assessment in degenerative diseases and restoration processes. Rev Neurosci. 26 (1), 75-93 (2015).
Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. Functional ultrasound neuroimaging: A review of the preclinical and clinical state of the art. Curr Opin in Neurobiol. 50, 128-135 (2018).
Mace, E., et al. Functional ultrasound imaging of the brain: Theory and basic principles. IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 60 (3), 492-506 (2013).
Tanter, M., Fink, M. Ultrafast imaging in biomedical ultrasound. IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 61 (1), 102-119 (2014).
Errico, C., et al. Ultrafast ultrasound localization microscopy for deep super-resolution vascular imaging. Nature. 527 (7579), 499-502 (2015).
Réaux-Le-Goazigo, A., et al. Ultrasound localization microscopy and functional ultrasound imaging reveal atypical features of the trigeminal ganglion vasculature. Commun Biol. 5 (1), 330(2022).
Siepmann, M., Schmitz, G., Bzyl, J., Palmowski, M., Kiessling, F. Imaging tumor vascularity by tracing single microbubbles. IEEE Int Ultrason Symp. , 1906-1908 (2011).
Couture, O., Hingot, V., Heiles, B., Muleki-Seya, P., Tanter, M. Ultrasound localization microscopy and super-resolution: A state of the art. IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 65 (8), 1304-1320 (2018).
Dencks, S., Schmitz, G. Ultrasound localization microscopy. Z Med Phys. 33 (3), 292-308 (2023).
Renaudin, N., Pezet, S., Ialy-Radio, N., Demene, C., Tanter, M. Backscattering amplitude in ultrasound localization microscopy. Sci Rep. 13 (1), 11477(2023).
Blinder, P., et al. The cortical angiome: An interconnected vascular network with noncolumnar patterns of blood flow. Nat Neurosci. 16 (7), 889-897 (2013).
van Raaij, M. E., et al. Quantification of blood flow and volume in arterioles and venules of the rat cerebral cortex using functional micro-ultrasound. Neuroimage. 63 (3), 1030-1037 (2012).
Lindner, J., Song, J., Jayaweera, A. R., Sklenar, J., Kaul, S. Microvascular rheology of definity microbubbles after intra-arterial and intravenous administration. J Am Soc Echocardiogr. 15 (5), 396-403 (2002).
Nouhoum, M., et al. A functional ultrasound brain GPS for automatic vascular-based neuronavigation. Sci Rep. 11, 15197(2021).
Lowerison, M. R., et al. Super-resolution ultrasound reveals cerebrovascular impairment in a mouse model of Alzheimer's disease. J Endocrinol. 44 (9), 1-14 (2024).
Nyúl-Tóth, A., et al. Novel intravital approaches to quantify deep vascular structure and perfusion in the aging mouse brain using ultrasound localization microscopy (ULM). J Cereb Blood Flow Metab. 0 (0), 1-19 (2024).
Demeulenaere, O., et al. In vivo whole brain microvascular imaging in mice using transcranial 3D Ultrasound Localization Microscopy. EBioMedicine. 79 (1), 103995(2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Clutter Filtering

מיקרוסקופ לוקליזציה אולטרסאונד למיפוי ברזולוציה גבוהה של מיקרו-כלי דם במוח המכרסמים

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים