מאמר שיטה

הגדרת תכנות מחדש של Xenofree של אבות דם טבורי לתאי גזע פלוריפוטנטיים ודמויי בלסטומיר מושרים

583 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68613

⸱

22 באוגוסט 2025

 ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, The Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטות מוגדרות כימית עבור xenofree (XF), ללא מזין (FF), תכנות מחדש אפיזומלי של אבות מיאלואידים מדם טבורי אנושי (CB) לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים קונבנציונליים (hiPSC). ניתן להחזיר ביעילות את ה-XF/FF CB-hiPSC (XF-hiPSC) לתאי גזע נאיביים מווסתים (TIRN-SC) דמויי בלסטומר (Tankyrase/PARP1) בעלי התמיינות מוגברת ופוטנציאל כימרה בין-מיני.

תקציר

ניתן להשיג תכנות מחדש של אב מיאלואיד מדם טבורי אנושי (CB) למצב של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSC) בנאמנות גבוהה באמצעות וקטורים אפיזומליים שאינם משתלבים ואותות סטרומליים. לאחר מכן ניתן להחזיר את קווי ה-CB-hiPSC הקונבנציונליים הללו עם יעילות גבוהה למצב תאי גזע נאיביים מווסת מעכב (TIRN-SC) דמוי בלסטומיר עם טוטיפוטנטיות תפקודית. TIRN-SCs המווסתים על ידי PARP הם תאי גזע אנושיים בעלי פלסטיות אפיגנטית גבוהה, טביעות אפיגנומיות יציבות, ובעלי עוצמת התמיינות גדולה יותר מאשר hiPSCs קונבנציונליים עם שושלת. כאן, שיטות XF/FF מותאמות לתכנות מחדש אפיזומלי יעיל המופעל על ידי סטרומה מזנכימלית של אבות מיאלואידים CD34+ CD33+ CB ל-XF/FF hiPSC קונבנציונלי. החזרת TIRN העצימה באופן חוזר את ה-hiPSC הקונבנציונלי XF/FF כדי לאמץ תכונות שעתוק, אפיגנטיות ופונקציונליות של תאי עובר אנושיים בשלב המחשוף עם ירידה בביטוי גנים מוכנים לשושלת. אימתנו כי XF-hiPSC שמקורו ב-CB שהוחזר על ידי TIRN הראה שיפור ניכר בהתמיינות מרובת שושלות מכוונות (כולל שושלות המטו-וסקולריות) על פני רפרטואר רחב של רקעים בלתי תלויים גנטית. שיטות אלו משמשות כצעד ראשון ליצירת קווי TIRN-SC תואמי cGMP עבור בנקים 'אוניברסליים' של תורמים 'אוניברסליים' המוגדרים על ידי HLA בדרגה קלינית. לגזירת קווי UTIRN-SC עם צדדיות התמיינות משופרת מאבות CD34+ CD33+ CB יכולה להיות השפעה רבה על הרפואה הרגנרטיבית. לדוגמה, UTIRN-SCs יכולים ליצור בנקי רקמות של אבות תורמים לבביים, כלי דם ועצביים המוגדרים על ידי HLA, משומרים בהקפאה עבור טיפולים תאיים מקיפים "מהמדף" מרובי שושלות.

מבוא

למרות שתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSCs) מציעים הזדמנויות מבטיחות לטיפולים תאיים מותאמים אישית, היישום הקליני שלהם עומד בפני אתגרים גדולים, כולל גידוליות, אימונוגניות והטרוגניות פנוטיפית ותפקודית1, המשפיעים על בטיחותם, יעילותם וחסכוניותם. יתר על כן, אבות המחויבים לשושלת שמקורם בקווי hiPSC קונבנציונליים ומוקדמים נוצרים עם יעילות התמיינות אינטרקווית משתנה מאוד2, ומציגים השתלה ופונקציונליות מוגבלת in vivo. עם זאת, ניתן להתגבר על מגבלות כאלה באמצעות שיטות תכנות מחדש אופטימליות3 או מצבי תאי גזע חלופיים 4,5.

למרות שיעילות התכנות מחדש של תאים סומטיים בעור או בדם ל-hiPSC נמוכה (~0.01%-2%)6, ניתן להשיג תכנות מחדש אופטימלי ביותר של ארבעה גורמים של אבות CB ויכול להגיע ליעילות בתפזורת של עד 50% בתנאי תרבית משותפת המופעלים על ידי גזע סטרומלי מזנכימלי (MSC)7. במערכת זו, תכנות מחדש תאי של אבות מיאלואידים CB הואץ על ידי אותות סטרומה מסיסים ותלויי מגע. קווי hiPSC אפיזומליים שמקורם בסטרומה (SP) התמיינו לאבות כלי דם (VP) עם יעילות גבוהה יותר מאשרhiPSC 3,5 שמקורו בפיברובלסטים קונבנציונליים. VP שמקורו ב-SP-CB-iPSC הפגין זהות שעתוק עוברית אותנטית יותר של VP, הזדקנות מופחתת ורגישות לנזק ל-DNA 3,4. VP שמקורו ב-SP-CB-iPSC הוכיח גם השתלה חזקה יותר in vivo מאשר VP קונבנציונאלי שמקורו ב-hiPSC לאחר השתלה מערכתית או ישירה לתוך הזגוגית של עכברים בוגרים פגועים באיסכמיה ברשתית 3,4.

צימרלין ועמיתיו הקימו מערכת תכנות מחדש כימית דו-שלבית ('LIF-5i -> LIF-3i') המעבירה תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים קונבנציונליים למצב TIRN-SC עם פוטנציאל התמיינות רב שושלותמשופר 5. אבות כלי דם מובחנים שמקורם ב-TIRN-SC הפגינו פונקציונליות גבוהה יותר, יציבות גנומית גדולה יותר והשתלת in vivo מעולה, כפי שמוצג על ידי יכולתם המשופרת לנדוד לשכבות העצביות העמוקות של הרשתית האיסכמית4. TIRN-SC עבר תכנות מחדש פרוטאוגנומי כדי לרכוש מצב דמוי בלסטומיר היברידי פונקציונלי עם תרומה גבוהה בבדיקת הכימרה הבין-ספציפית8. TIRN-SC שמרו על ביטוי DNMT1 והיו מוגנים מפני שחיקה באזורים מוטבעים גנומיים עם מתילציה של CpG. מעניין ש-SP-CB-hiPSC הוחזרו ל-TIRN-SC בצורה יעילה יותר מאשר hiPSC שנגזר בשיטות חלופיות ופחות יעילות 5,9.

לפיכך, TIRN-SCs הם מצב תאי גזע חלופי עם יכולת התמיינות רב-שושלת משופרת ותרומת כימרה יעילה. אופטימיזציה נוספת של
תכנות מחדש של TIRN-SC בתנאי תרבית מוגדרים התואמים ל-cGMP יקל על יצירת מגוון רחב של סוגי תאים ורקמות פונקציונליים הניתנים להשתלה לטיפולים. כדי לענות על הצורך באבות טיפוליים חסכוניים, ניתן ליישם שיטות אלה כדי לייצר בנקים בדרגת cGMP של 'תורם אוניברסלי' TIRN-SC (UTIRN-SC) באמצעות CD34+ CB המטופויאטי המוגדר על ידי HLA או אבות דם היקפיים. אבות שמקורם ב-UTIRN-SC המוגדרים על ידי HLA יכולים לשרת את הצרכים של מספר גדול יותר של חולים הזקוקים להתחדשות מיידית ורב-שושלת של רקמות מורכבות.

הפרדיגמות שפותחו להשתלת מח עצם קלינית (BMT) עשויות להנחות את הפיתוח של בנקים UTIRN-SC מתאי גזע המטופויאטיים תואמים חלקית ל-HLA, או זהים ל-HLA-haplo ממרשמי תורמים לאומיים. ניתוח חישובי גלובלי חזוי של 10 ההפלוטיפים המובילים המשולבים מ-18 מדינות, כולל ארה"ב, יספק כיסוי ממוצע של 68.4% למטופלים מ-hiPSC 'haplobanks' כאלה10. בנק UTIRN-SC מוגדר יכול לא רק לספק אבות המחויבים לשושלת, אלא גם לתמוך ביישומי TIRN-SC טיפוליים של מערכות השלמה בלסטוציסטיות בין-ספציפיות בתוך חיות בית (למשל, חזירים) לדור איברים שלמים11,12, כולל יצירת אבות המטופויאטיים מעוררי סבילות להפחתת דחיית השתל באוכלוסיות עם מגוון גנטי רחב (למשל, ארה"ב).

פרוטוקול תכנות מחדש מותאם זה ליצירת קווי XF/FF hiPSC מוכשרים ל-TIRN הוא צעד ראשון לפיתוח בנקים עתידיים תואמי cGMP UTIRN-SC. פרוטוקול זה מתאר תכנות מחדש של סטרומה ואימות פונקציונלי של אבות מיאלואידים CB אנושיים לקווי XF-hiPSC קונבנציונליים. XF-hiPSC אלה הדגימו חזרה קלה ל-TIRN-SC, עם יעילות דומה לשיטות שאינן XF7 והשיגו פלוריפוטנטיות תפקודית בלתי מוגבלת, כולל יכולת משופרת לייצר טרטומות מופחתות שושלת מעוצבות היטב (ביחס ל-XF-hiPSC איזוגני)4,5,9. אנו גם מתארים פרוטוקולים המאמתים XF-hiPSC שהוחזר על ידי TIRN עבור ההתמיינות הישירה המשופרת והחזקה שלהם לשושלות המטווסקולריות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ניסויי התכנות מחדש תאמו את ההנחיות שפורסמו על ידי האקדמיה הלאומית למדעים, והאגודה הבינלאומית לחקר תאי גזע (ISSCR). עבור יצירת hiPSC, פרוטוקולי איסוף תאי תורם והסכמה מדעת של התורם אושרו על ידי הפיקוח של מועצת הביקורת המוסדית (IRB) של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס (JHU). כל הניסויים נערכו תחת סמכותו של הפיקוח המוסדי על מחקר תאי גזע של JHU (ISCRO) ותואמים את הסטנדרטים המוסדיים לגבי הסכמה מדעת והערכת מוצא. בנוסף, כל השימוש בבעלי חיים וההליכים הכירורגיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC). כל הניסויים הכוללים פרוצדורות בבעלי חיים (למשל, הזרקות תת עוריות/תוך שריריות של NOD. עכברי Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ (NOG SCID) (מעבדות ג'קסון, בר הרבור, ME) לניתוח טרטומה והעברת בלסטוציסט לעכברים פסאודו-הריוניים ICR) נבדקו ואושרו על ידי JHU IACUC. סקירות אלה כללו שיקולים של הקרבה אתית, דיור הומני ואמצעים מתאימים למזעור אי הנוחות של בעלי החיים.

1. תכנות מחדש אפיזומלי hiPSC ללא מזין

  1. הכנת תאי אב המטופויאטיים של תורם
    1. השתמש בתאי גזע/אב המטופויאטיים CD34+ שמורים בהקפאה (למשל, 1x106 תאי CB יילודים) מיד עם המסירה או אחסן קריוביאלים במיכל אחסון חנקן נוזלי. ודא שהתאים נשמרו באופן רציף במצב קפוא במהלך ההובלה והטיפול.
      הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בתאי תורם שאינם שמורים בהקפאה מיד לאחר איסוף והעשרת CD34 באמצעות פרוטוקולים מאושרים.
    2. לפני הפשרת תאים באמבט המים, פתח בעדינות את הקריוביאל המעוקר בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי לשחרר כל גז כלוא בתוך הבקבוקון ולאחר מכן סגור היטב את הבקבוקון.
    3. מניחים את הבקבוקון באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 1 עד 2 דקות. סובבו בעדינות את הבקבוקון עד שכמעט ולא נשאר קרח. הוציאו את הבקבוקון מאמבט המים ועקרו אותו היטב (כלומר, תרסיס אתנול 70%).
      הערה: כל השלבים דורשים טכניקה אספטית נכונה ומבוצעים בתוך ארון קולט אדים ביולוגי סטרילי.
    4. העבירו בעדינות ובאיטיות את התאים לצינור חרוטי סטרילי ריק של 50 מ"ל. שטפו את הבקבוקון עם 1 מ"ל של מדיום הרחבה קר של אב המטופויאטי (XF-HP) (טבלה 1) ושלבו בעדינות (טיפה לאורך שולי הצינור) עם התאים כדי לדלל את חומר ההקפאה DMSO.
    5. השאירו את הצינור עומד במתלה למשך 30 שניות ולאט לאט הוסיפו 2 מ"ל של מדיום XF-HP קר. סובב בעדינות את תרחיף התאים תוך הוספת המדיום. חזור על שלב זה פעמיים על ידי הוספת 4, 8 ו-4 מ"ל ברצף של מדיום XF-HP קר (עד 20 מ"ל נפח כולל). צנטריפוגה את התאים המדוללים ב-100 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: אין לזרוק תאים למעלה ולמטה בתמיסת ההקפאה ובמהלך שלבי הדילול. הוסף XP-HP בינוני ולאט לאט עד שה-DMSO מדולל לפחות פי 10. השתמש במדיום קר מכיוון שדילול DMSO גורם לתגובה אקסותרמית.
    6. שאפו סופרנטנט נטול תאים בארון בטיחות ביולוגית. עקור בעדינות את כדור התא. השעו מחדש ב-2 מ"ל של מדיום הרחבה XF-HP לספירת תאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
    7. העבירו את התאים המופשרים לצלחות מרובות בארות של תרבית תאים בעלות חיבור נמוך במיוחד (למשל העבירו 2 מ"ל של תערובת בינונית של תאים/XF-HP לבאר אחת של צלחת של 6 בארות).
    8. עטפו היטב את הצלחת בניילון סרן לחיקוי מצבים היפוקסיים. מעבירים את הצלחת בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה לחה). לחלופין, הניחו את הצלחת הלא עטופה בחממה עם בקרת O2 (5% O2, 5% CO2, אווירה לחה).
    9. תרבית את האבות ההמטופויאטיים למשך 3 ימים במדיום XF-HP.
  2. הכנת תאי גזע מזנכימליים (MSC)
    1. הפשירו אליקוט (0.75 - 1x106 תאים) של MSC אנושי במעבר נמוך (p2 עד p3) על ידי דגירה של aliquot שמור בהקפאה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 1 עד 2 דקות. סובבו בעדינות את הבקבוקון עד שכמעט ולא נשאר קרח. מוציאים את הבקבוקון מאמבט המים ומעקרים היטב (כלומר, 70% אתנול).
      הערה: ניתן לרכוש או להכין MSC אנושי במעבר נמוך (p2) ממח עצם אנושי באמצעות פרוטוקולים קבועים ושימור בהקפאה. ניתן להפשיר MSC כ-7-10 ימים מראש ולהקרין/לצפות כשכבת הזנה יום לפני הגרעין (איור 1).
    2. בעדינות ובאיטיות (טיפה לאורך שולי הצינור) העבירו את התאים לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל מדיום תאי גזע מזנכימליים ללא סרום (XF-MSC) (טבלה 1) בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי לדלל את חומר ההקפאה DMSO לפחות פי 10 (למשל, להעביר 1 מ"ל תא שמור בהקפאה למדיום 9 מ"ל XF-MSC).
    3. השתמש ב-1 או 2 מ"ל של מדיום XF-MSC קר כדי לשטוף את השפופרת ולשלב לתוך הצינור החרוטי. צנטריפוגה את התאים המדוללים ב-100 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    4. שאפו סופרנטנט נטול תאים בארון בטיחות ביולוגית. השעו בעדינות את גלולת התא ב-1 מ"ל של מדיום XF-MSC לספירת תאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
    5. העבירו את התאים המופשרים לצלחות מרובות בארות תרבית תאים שטופלו ברקמות (למשל 5,000-6,000 תאים לס"מ2 או כ-50,000 תאים בבאר אחת של צלחת בת 6 בארות). מניחים צלחות בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה לחה). רענן את מדיום XF-MSC כל 2-3 ימים בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
    6. יום לפני הנוקלאופקציה יש לשאוב סופרנטנט נטול תאים בארון בטיחות ביולוגית. שטפו את MSC פעם אחת עם PBS (2 מ"ל/באר). שאפו PBS. הוסף 1 מ"ל/באר של מגיב דיסוציאציה של תאים (למשל, תמיסת 1X Trypsin-EDTA). דגירה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת CO2 .
    7. נטרל את מגיב הדיסוציאציה על ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום XF-MSC (דילול פי 2 לפחות) וטריטורציה בעדינות עם פיפטה למתלה תא בודד. אוספים את תרחיף התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 100 x גרם למשך 5 דקות.
    8. שאפו את הסופרנטנט. השעו מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של מדיום XF-MSC לספירת תאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
    9. הקרנה (2,000 רד) אבות מזנכימליים מתחת ל-5 מעברים באמצעות קרני רנטגן וצלחת על פני לוחות סינתטיים מצופים פפטיד Arg-Gly-Asp (RGD) (2x105 תאים לבאר) במדיום XF-MSC. שמור את הצלחות למשך הלילה באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה לחה).
  3. תכנות מחדש אפיזומלי של Xenofree
    1. אסוף תרביות CB HP בנות 3 ימים במדיום הרחבה XF-HP לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל בארון בטיחות ביולוגית. צנטריפוגה ב 200 x גרם למשך 5 דקות.
    2. שאפו סופרנטנט נטול תאים בארון בטיחות ביולוגית.  השעו בעדינות את גלולת התא ב-1 מ"ל של מדיום הרחבה XF-HP לספירת תאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
    3. שלב 1x106 תאי HP מורחבים עם 100 מיקרוליטר של תמיסת נוקלאופקציה של תאי CD34+ אנושיים (ערכת נוקלאופקטור תאי CD34+ אנושיים). הוסף 6 מיקרוגרם של אפיזום מרוכז מטוהר (<5 מיקרוליטר) והעביר בזהירות לקובט נוקלאופקטור באמצעות צינור ההעברה הפלסטי של ערכת הנוקלאופקציה. הימנע מבועות. הנח את הקובט במכשיר הגרעין והשתמש בתוכנית U-008.
      הערה: הכן מלאי של וקטור pCEP4 מבוסס EBNA אפיזומלי pEP4 EO2S EM2K (OCT4, SOX2, MYC, KLF4) על ידי טרנספורמציה שגרתית ב-TOP10 E. coli וטיהור באמצעות ערכות הכנה Maxi-prep של פלסמיד. ביום הגרעין, יש לנקות ולרכז את הפלסמיד באמצעות ערכת טיהור PCR 7.
    4. מיד לאחר הגרעין יש להוסיף 500 מיקרוליטר של מדיום הרחבה XF-HP מחומם מראש לקובט ולהעביר את התאים ב-1 מ"ל של מדיום XF-HP לבאר אחת של צלחת 6 בארות תרבית תאים עם חיבור נמוך במיוחד באמצעות פיפט העברה סטרילי.
      הערה: תאים גרעיניים הם שבירים מאוד ולא ישרדו את מתח הגזירה מקצות פיפט רגילים של 1 מ"ל. העברה על לוחות תרבית הצמדה נמוכים במיוחד היא צעד המקדם התאוששות תאים לאחר נוקלאופקציה לפני ההצמדה הסופית ללוחות מצופים RGD.
    5. עטפו היטב את הצלחת בניילון נצמד לחיקוי תנאים היפוקסיים. מניחים את הצלחת בחממת CO2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה לחה). לחלופין, הניחו את הצלחת הלא עטופה בחממה עם בקרת O2 (5% O2, 5% CO2, אווירה לחה). דגירה למשך 4 עד 6 שעות.
      הערה: שלב זה יאפשר לתאי HP גרעיניים להתאושש לפני העברתם לחד-שכבות MSC.
    6. אסוף את התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל בארון בטיחות ביולוגית. צנטריפוגה ב 200 x גרם למשך 5 דקות.
    7. שאפו את הסופרנטנט בתוך ארון בטיחות ביולוגית. השהה מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של מדיום הרחבה XF-HP. תאי HP גרעיניים על MSC מוקרן בצפיפות של כ-17,500 תאיםלסמ" ר בלוחות מצופים RGD במדיום הרחבה XF-HP (2 מ"ל/באר) בתוספת מעכב ROCK Y-27632 (ריכוז סופי 10 מיקרומטר). מניחים את הצלחת בחממת CO2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה לחה).
    8. יומיים לאחר הנוקלאופקציה, הוסף 2 מ"ל (נפח שווה) של מדיום E8 בכל באר בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
    9. החלף מחצית מנפח מדיום התרבות כל יומיים במדיום E8. אוספים תאים צפים לצינור חרוטי של 15 מ"ל, צנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 5 דקות, ומוסיפים את התאים המשוחזרים בחזרה לתרבית.
    10. ביום ה-21, הכינו צלחות 6 בארות שטופלו בתרבית רקמות מצופות ויטרונקטין. הוסף 1 מ"ל של תמיסת ויטרונקטין מדוללת (למשל, 40 מ"ל/מ"ל עבור Vitronectin-XF) לבאר אחת של צלחת של 6 בארות ודגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר.
    11. בחרו ידנית מושבות XF-hiPSC בודדות באמצעות מיקרוסקופ הפוך בתוך ארון בטיחות ביולוגית. יש לשלש עם פיפט ולהעביר מושבות בודדות על צלחות מצופות ויטרונקטין במדיום E8 בתוספת מעכב ROCK Y-27632 (ריכוז סופי 5 מיקרומטר). מניחים את הצלחת בחממת CO2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה לחה).
    12. למחרת, החלף בזהירות את המדיום במדיום E8 ללא תוספת מעכב ROCK. החלף מדיום E8 כל יום לאחר מכן (2 מ"ל/באר) בארון בטיחות ביולוגית.

2. תרבית ותחזוקה שוטפת של hiPSC

  1. כאשר המושבות גדלות 5 עד 6 ימים לאחר מכן (כלומר, קוטר של 0.5 עד 1 מ"מ או כ-80% מפגש), שאבו את המדיום בארון בטיחות ביולוגית.
  2. הוסף 2 מ"ל/באר PBS כדי לשטוף את התאים. שאפו את ה-PBS. הוסף תמיסת דיסוציאציה של תאים מבוססת EDTA בנפח 1 מ"ל. דגירה למשך 5 דקות בחממת CO2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה לחה). בדוק שהתאים מחוברים באופן רופף (למשל, תאים עגולים מבריקים, אך עדיין מחוברים לצלחת) באמצעות מיקרוסקופ.
  3. שאפו בעדינות את תמיסת הדיסוציאציה בתוך ארון בטיחות ביולוגית מבלי לשבש את התאים.
  4. אסוף את התאים ב-1-2 מ"ל של מדיום E8 בתוספת מעכב ROCK Y-27632 (ריכוז סופי של 5 מיקרומטר) עם פיפטינג לא נמרץ לשמירה על גושי התאים. העבירו גושי תאים לצלחות מצופות ויטרונקטין (ראה סעיף 1.3.11) שטופלו בתרבית תאים עם 6 בארות (שווה ערך ל-10 מושבות לבאר או פיצול 1:10). מניחים את הצלחת בחממת CO2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה לחה).
  5. המשך תת-תרבות באמצעות תמיסת דיסוציאציה תאית מבוססת EDTA כל 5-7 ימים.
    הערה: בדרך כלל אין צורך בתת-שיבוט נוסף או קטיף מושבות ידני לתכנות מחדש של SP-CB-hiPSC, אך אם שיבוטי hiPSC מכילים מושבות עם מורפולוגיה חריגה (למשל, התמיינות ספונטנית כגון פיברובלסטים או היווצרות גוף עוברי, הופעת מושבות לא שטוחות חריגות), בחר ידנית מושבות באמצעות מיקרו-פיפט ומיקרוסקופ בתוך ארון בטיחות ביולוגית או השליך שיבוטים חריגים. תכנות מחדש לא יעיל ולא יציב של hiPSC אינו תואם להחזרת TIRN-SC.

3. אימות פנוטיפי של שיבוטי XF-hiPSC

  1. הרחב את שיבוטי XF-hiPSC עבור לפחות 5-7 מעברים לאימות ראשוני (איור 2) כמתואר בסעיף 2, לפני שימור בהקפאה ארוך טווח ויישום במחקרים פונקציונליים. רשום את מספר המעברים על כל בקבוקון משומר.
    הערה: ניתן לאשר אפיון ראשוני של שיבוטי XF-hiPSC במעבר נמוך על ידי בדיקות מרובות כגון פעילות אקלין פוספטאז, ואנטיגן TRA-1 או זיהוי חיסוני NANOG.
  2. בצע אימות וספירה של XF-hiPSC עם צביעת פוספטאז אלקליין (איור 2A,B).
    הערה: ניתן לקבוע יעילות תכנות מחדש בתרביות בתפזורת ב-P0 3-5 שבועות לאחר נוקלאופקציות אפיזומליות על ידי ספירת מספר המושבות שתוכנתו מחדש במלואן לכל תאי קלט בודדים שצופו ביום 3 7,13.
    1. שאיבה של מדיום תרבית בארון בטיחות ביולוגית.
    2. שטפו תאים עם PBS (2 מ"ל לבאר). שאפו PBS. תקן תאים על ידי הוספת תמיסת 2% פרפורמלדהיד/PBS. דוגרים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. הסר והשליך תמיסת פרפורמלדהיד/PBS בהתאם להנחיות בטיחות הפסולת הכימית.
    4. שטפו תאים עם PBS (2 מ"ל לבאר). שאפו PBS. הוסף 1-2 מ"ל של מצע פוספטאז אלקליין ודגר במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה איטית.
    5. שטפו 3 פעמים עם PBS כדי לעצור את התגובה. פוטומיקרוגרף וספירה.
      הערה: הימנע מזמן דגירה או טמפרטורה מוגזמים מכיוון שהוא עלול לגרום להכתמה חיובית כוזבת.
  3. בצע אימות וספירה של צביעת XF-hiPSC עם צביעות אימונולוגיות של אנטיגן TRA-1 (איור 2C).
    הערה: עבור תכנות מחדש אפיזומלי, זיהוי ביטוי טרנסגני ועמוד שדרה וקטורי EBNA1 במהלך מעברים ראשוניים צריך להתבצע באמצעות פרוטוקולים שפורסמו7. אימות שגרתי כולל קריוטיפ על ידי G-banding (איור 2D) או מבחני כיסוי מבוססי מערך גנום שלם. ניתן לבחון פלוריפוטנטיות תפקודית בסיסית גם באמצעות פרוטוקולי התמיינות טרטומה (איור 2E) או כרטיסי ניקוד כמותיים מרובי גנים של התמיינות גוף עוברי לא מכוונת14.
    1. בארון בטיחות ביולוגית, אימונוסטיין משכפל בארות עבור אנטיגנים TRA-1-60 או TRA-1-81 למשך 30 דקות על ידי הוספת נוגדנים לכתמים חיים מצומדים פלואורוכרום למדיום E8 בריכוז המתאים.
    2. שאפו את המדיום התרבותי. יש לשטוף פעמיים עם E8 בינוני (2 מ"ל לבאר).
    3. פוטומיקרוגרף וספירת מדיום E8 או מדיום פנול אדום.
      הערה: לחלופין, תקן תאים באמצעות תמיסת 2% פרפורמלדהיד/PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ואימונוסטיין עבור אנטיגנים TRA-1 באמצעות נוגדנים סטנדרטיים.
  4. אמת אימונופנוטיפ XF-hiPSC על ידי ציטומטריית זרימה.
    1. בארון בטיחות ביולוגית, שאפו מדיום תרבית.
    2. שטפו תאים ב- PBS (2 מ"ל לבאר). שאפו PBS. הוסף ריאגנט דיסוציאציה אנזימטי (למשל, Accutase, 1 מ"ל לבאר). דגרו את הצלחת למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת CO2 (5% CO2, אווירה לחה).
    3. אוספים תאים על ידי הוספת נפח שווה של מדיום תרבית ועוברים דרך מסננת תאים (פילטר 40-70 מיקרומטר). תאי צנטריפוגה ב 200 x גרם למשך 5 דקות.
    4. השהה מחדש את כדור התא ב-PBS עם 5% FBS (1 מ"ל לכל שווה ערך). ספור את מספר התאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי. הפץ כ-100,000-200,000 תאים בצינורות תחתונים עגולים לכל בדיקת FACS (שמירה על נפחים של כ-100 מיקרוליטר לבדיקה).
    5. לצביעה חוץ-תאית, לאחר שלב חסימה אופציונלי באמצעות סרום עכבר מסודר (הוסף 5 מיקרוליטר לכל בדיקה, 5 דקות בטמפרטורת החדר), דגירה עם נוגדנים מצומדים פלואורוכרום (למשל, TRA-1-81 PE, SSEA4 APC) בהתאם להוראות היצרן. שוטפים עם 3 מ"ל PBS. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-300 x גרם. השעו מחדש במאגר FACS (למשל, PBS עם 5% FBS) ורכשו באמצעות מכשיר FACS.
      הערה: השתמש תמיד בבקרות איזוטיפ מתאימות וצבוע דגימות מקבילות כדי לאמת את הספציפיות של החלבונים שזוהו חיסונית.
    6. עבור כתמים תוך-תאיים (למשל, NANOG-PE, OCT3/4-PE, SOX2-PE), עקוב אחר הוראות היצרן לשלבי קיבוע/חדירות. דגירה עם נוגדנים מצומדים פלואורוכרום או בקרות איזוטיפ תואמות. רכוש באמצעות מכשיר FACS.

4. שימור בהקפאה והפשרה של שיבוטי XF-hiPSC

  1. הרחב את שיבוטי XF-hiPSC עבור לפחות 5-7 מעברים כדי לבצע אימות ראשוני (איור 2) לפני שימור בהקפאה ארוך טווח ויישום במחקרים פונקציונליים. רשום את מספר המעברים על כל בקבוקון משומר.
    1. שאיבה של מדיום תרבית בארון בטיחות ביולוגית.
    2. שטפו תאים עם PBS (2 מ"ל לבאר). שאפו PBS.  הוסף תמיסת ניתוק תאים מבוססת EDTA (1 מ"ל לבאר) כדי לפרק מושבות XF-hiPSC לגושי תאים. דגרו את הצלחת למשך 5 דקות בחממת CO2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה לחה). בדוק שהתאים מחוברים באופן רופף (למשל, תאים עגולים מבריקים) באמצעות מיקרוסקופ.
    3. שאפו בעדינות תמיסת דיסוציאציה מבלי לשבש את מושבות התאים החד-שכבתיות ואספו את התאים במדיום E8 של 1-2 מ"ל עם פיפטינג לא נמרץ לשמירה על גושי תאים (10-50 תאים לגוש). אסוף XF-hiPSC לתוך צינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל. תאי צנטריפוגה ב 200 x גרם למשך 5 דקות.
    4. שאפו את הסופרנטנט בארון בטיחות ביולוגית. השעו מחדש את כדור התא בתמיסת הקפאה (טבלה 2, ~ 1 שווה ערך למ"ל).
    5. העברת תאים לצינורות קריוגניים לאחסון לטווח ארוך. מניחים את הצינורות בכלי הקפאה איטי ומניחים לדגימות להקפיא למשך הלילה במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. למחרת, הכניסו את הקריוביאלים למקפיא חנקן נוזלי לאחסון לטווח הארוך.
  2. להפשרה, הכינו צלחת על ידי ציפוי מראש בוויטרונקטין (ראה סעיף 1.3.11).
    1. מניחים את הבקבוקון הקפוא באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ומפשירים את התאים למשך ~1-2 דקות.
    2. העבירו לאט את XF-hiPSC לתוך צינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל המכיל 9 מ"ל של מדיום הפשרה (טבלה 2) כדי לדלל לאט תאים פי 10 בתוך ארון קולט אדים ביולוגי סטרילי.
      הערה: אין לזרוק נמרצות.
    3. צנטריפוגה ב 200 x גרם למשך 5 דקות.
    4. שאפו את הסופרנטנט נטול התאים בארון בטיחות ביולוגית. השעו מחדש את כדור התא במדיום E8 (1-2 מ"ל) בתוספת מעכב ROCK (ריכוז סופי 5 מ"מ).
      הערה: אי הכללת Y-27632 תגרום ליעילות התאוששות ירודה לאחר ההפשרה.
    5. העבירו את התאים המופשרים לבארות מצופות ויטרונקטין אחת או שתיים של צלחת בת 6 בארות. למחרת, החלף מדיום עם מדיום E8 רגיל ללא מעכב ROCK להרחבת תאים.

5. התמיינות המטווסקולרית של Xenofree של XF-hiPSC

  1. להבדיל בין XF-hiPSC באמצעות פרוטוקול ההתמיינות ההמטו-וסקולרי הממוטב שלנו (איור 3)4.
    הערה: פרוטוקול זה שונהמ-15.
    1. יש להכין את XF-hiPSC במפגש של ~40-50% (1-3 ימים לאחר המעבר).
    2. שאפו מדיום תרבית והוסיפו מדיום קביעה מזודרמלי של 2 מ"ל (טבלה 2) בארון בטיחות ביולוגית.
    3. לאחר יומיים, שאפו את המדיום והוסיפו 2 מ"ל/באר של מדיום התמיינות כלי דם (טבלה 2) בארון בטיחות ביולוגית. אם נראים הרבה תאים מתים או צפים בשלב זה, יש לשטוף פעם אחת עם 2 מ"ל PBS.
    4. החלף את אמצעי הבידול של כלי הדם כל יומיים בארון בטיחות ביולוגית עד היום ה-11.
      הערה: אם המדיום הופך לצהוב בגלל צפיפות תאים גבוהה ו-pH נמוך, הוסף 1 מ"ל של מדיום טרי או החלף כל יום.
  2. לאחר 7-10 ימים של תרבית במדיום התמיינות כלי דם, יש לטהר תאי כלי דם CD31+ או CD34+ מהחד-שכבה הדבוקה בשיטת מיון תאי חרוזים מגנטיים.
    הערה: כל שיבוט בודד עשוי להציג קינטיקה מובהקת של בידול. קביעת נקודת זמן שיא עבור ביטוי CD31/CD34 על ידי ניתוח FACS (איור 4A). נדרש ניתוח FACS להעשרת חרוזים לפני ואחרי העשרת חרוזים מגנטיים. אבות המטופויאטיים (HP) עשויים להתאושש בשלב זה מהסופרנטנט ולהעשיר אותם באמצעות מיקרו-חרוזי CD34. ניתן לאמת עוד יותר את HP הנגזר מ-CD34+ XF-hiPSC באמצעות בדיקת מתיל צלולוז (איור 4B-C)16.
    1. בארון בטיחות ביולוגית, שואבים מדיום תרבית ושוטפים תאים ב-PBS (2 מ"ל לבאר). שאפו PBS והפרידו מושבות hiPSC לתאים בודדים על ידי הוספת ריאגנט דיסוציאציה אנזימטי (למשל, Accutase, 1 מ"ל לבאר). דגרו את התאים למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת CO2 (5% CO2, אווירה לחה).
    2. בארון בטיחות ביולוגית, אסוף תאים על ידי הוספת נפח שווה של מדיום תרבית. תאי צנטריפוגה ב 200 x גרם למשך 5 דקות.
    3. השעו מחדש את כדור התא במדיום התמיינות כלי הדם (טבלה 2). ספור את מספר התאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי. הקצו כ-50,000-100,000 תאים לבדיקת FACS להעשרת חרוזים טרום מגנטיים באמצעות נוגדן מצומד ישירות נגד CD31 או אנטי-CD34.
    4. צנטריפוגה את התאים הנותרים ב -300 x גרם למשך 5 דקות. השעו מחדש את כדור התא במאגר העשרת חרוזים מגנטי (PBS pH 7.2, 0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA) ו-2 מ"מ EDTA) בארון בטיחות ביולוגית.
    5. העבירו את התאים דרך מסננת תאים (פילטר 40-70 מיקרומטר). צנטריפוגה ב -300 x גרם למשך 5 דקות. השעו מחדש במאגר העשרת חרוזים מגנטיים של 60 μL.
    6. הוסף 20 μL FcR Blocking Reagent, ולאחר מכן הוסף 20 μL CD31 או CD34 מיקרו-חרוזים ודגירה למשך 15-20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    7. שטפו תאים עם מאגר העשרת חרוזים מגנטיים של 2 מ"ל בארון בטיחות ביולוגית וצנטריפוגה (300 x גרם, 5 דקות).
    8. השעו מחדש את גלולת התא במאגר העשרת חרוזים מגנטיים של 1 מ"ל בארון בטיחות ביולוגית.
    9. הנח עמוד LS בשדה המגנטי של מפריד תאים מגנטיים בתוך ארון הבטיחות הביולוגית. עמוד כביסה עם מאגר העשרת חרוזים מגנטיים של 3 מ"ל.
    10. החלת תאים על עמודה.  אסוף תאים ללא תווית לצינור חרוטי של 15 מ"ל. שטפו את העמודה 3 פעמים עם מאגר העשרת חרוזים מגנטי של 3 מ"ל.
    11. הסר את העמוד מהמפריד והנח אותו על צינור חרוטי חדש של 15 מ"ל.
    12. שטוף את התאים המסומנים מגנטית על ידי הוספת מדיום גידול אנדותל של 3-5 מ"ל. צנטריפוגה ב 200 x גרם למשך 5 דקות.
    13. השעיה במדיום גידול אנדותל של 1 מ"ל בארון בטיחות ביולוגית. ספור את מספר התאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי. הקצו כ-50,000 תאים לטוהר מיון העשרת חרוזים פוסט-מגנטיים על ידי ניתוח FACS באמצעות נוגדן מצומד ישירות נגד CD31 או אנטי-CD34.
    14. ניתן להרחיב עוד יותר את ה-VP המבודד על צלחות צלוחיות שטופלו בתרבית רקמות מצופות פיברונקטין (10 מיקרוגרם/מ"ל) במדיום גידול אנדותל.

6. הנחיות תכנון ניסויי לאימות פונקציונלי של XF-hiPSC

  1. קבע מלאי של XF-hiPSC מאומת במעברים המוקדמים ביותר באמצעות שיטה מבוססת שאינה משתלבת, כגון אפיזומלי 7,17, וירוס סנדאי18 או תכנות מחדש של mRNA19.
    הערה: השוואה של היעילות והאמינות של שיטות שאינן תכנות מחדש ניתנת במקום אחר6. ניתן לאמת פינוי חומר טרנסגני בשיטות תכנות מחדש של נגיף אפיזומלי או סנדאי במהלך מעברים ראשוניים באמצעות שיטות PCR 7,20. שימור טרנסגנים אינו תואם לדור TIRN-SC.
  2. אמת קריוטיפ תקין בשיבוטי XF-hiPSC על ידי מבחני כיסוי מבוססי G-banding או מערך גנום שלם9.
  3. לאמת את ביטוי הגנים והשלמות האפיגנומית של קווי XF-hiPSC (כלומר, טביעות הורים, הפעלת X) באמצעות מערכי מתילציה וביטוי גנים של DNA או שיטות ריצוף 5,11,14.
  4. אמת פלוריפוטנטיות תפקודית בסיסית באמצעות פרוטוקולי התמיינות טרטומה (איור 2E), מבחני התמיינות גוף עוברי כמותי (EB) באמצעות מערכי RT-PCR14, או מבחני התמיינות מכוונים לעבר 3 שכבות הנבט9.
    הערה: שיטות כמותיות ליכולת התמיינות רב-שושלת ואינדקס פרוליפרטיבי תוך-שושלת של בדיקות טרטומה באמצעות אפיון היסטולוגי על ידי מיקרוסקופיה מסופקות במקום אחר4. פרוטוקולים להתמיינות מכוונת כלפי שושלות מזודרמיס ומפרט המטו-וסקולרי (איור 4A-C) פורטו בעבר 4,5,9, כמו גם בדיקת התמיינות מכוונת לאנדודרם סופי (איור 4D)5. דוגמאות לבדיקת התמיינות מכוונת כלפי אקטודרם ניתנות במקום אחר 4,5.

7. התאמה כימית של TIRN של XF-hiPSC

  1. רכשו או הכינו מזיני MEF במעבר נמוך מעוברי עכברים היברידיים CF1 או CF1 x DR4 E13.5 בהתאם לפרוטוקולים שפורסמו 9,21. צלחת 200,000 מזינים MEF לבאר בצלחת 6 בארות שטופלה בתרבית רקמות ג'לטין (0.1% ג'לטין במים, 1 מ"ל לבאר) לפחות יום אחד לפני שלב ההסתגלות של TIRN (פרוטוקולי TIRN מפורטים ניתנים במקום אחר 4,5,9).
  2. שמור והרחיב תרביות XF-hiPSC נטולות טרנסגנים עם קריוטיפים נורמליים מאומתים במערכת תרבית נטולת מזין (למשל, מדיום E8, ראה טבלה 1 לניסוח פנימי).
  3. החלף את E8 בינוני במדיום LIF-5i (2 מ"ל לבאר; טבלה 1) לאחר שתרביות XF-hiPSC הגיעו למפגש של ~50% (כלומר, 3-5 ימים לאחר הציפוי הראשוני) בארון בטיחות ביולוגית.
  4. למחרת, שאפו מדיום תרבית ושטפו XF-hiPSC מותאם LIF-5i פעם אחת עם PBS (2 מ"ל לבאר) בארון בטיחות ביולוגית. שאפו סופרנטנט והוסיפו 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה של תאים אנזימטיים לכל באר. דגירה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת CO2 .
  5. משולש בעדינות עם פיפטה לתוך תרחיף תא בודד בארון בטיחות ביולוגית. לנטרל עם מדיום LIF-5i (1 מ"ל לבאר). אוספים את תרחיף התאים לצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל.  צנטריפוגה ב 200 x גרם למשך 5 דקות.
  6. שאפו את הסופרנטנט בארון בטיחות ביולוגית. השעו מחדש את כדור התא ב-2 מ"ל של מדיום LIF-5i.
    הערה: במידת האפשר, קח ציטוט לספירת תאים. ניתן לנטרל פעילות אנזימטית עם מדיום LIF-5i/LIF-3i ללא תוספת של מעכבים או גורמי גדילה.
  7. שטפו את צלחת ה-MEF פעמיים עם PBS (2 מ"ל לבאר בצלחות של 6 בארות) והוסיפו תאים (1 שווה ערך לתאים מותאמים ל-LIF-5i על באר אחת של מזיני MEF במדיום LIF-5i של 2 מ"ל).
    הערה: אופטימיזציה של צפיפות הציפוי הראשונית עבור כל קו XF-hiPSC בודד היא אופציונלית. אם נספרו תאים בשלב הקודם, צלח מינימום של 1x106 תאים לבאר על מזינים.  העבירו את הצלחת בחממת CO2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה לחה).
  8. תרבית ותחזוקה של XF-hiPSC במשך 3-5 ימים ב-LIF-5i על MEF באינקובטור CO2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה לחה). החלף מדיום LIF-5i מדי יום.
  9. כאשר נוצרות מושבות TIRN-SC בצורת כיפה (לאחר 3-5 ימי תרבית על מזינים), שאפו מדיום תרבית בארון בטיחות ביולוגית. שוטפים כל באר עם 2 מ"ל PBS.
  10. שאפו PBS. הוסף 1 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים (למשל, Accutase) לכל באר. דגירה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת CO2 (5% CO2, אווירה לחה).
  11. הוסף 1 מ"ל של מדיום LIF-3i (טבלה 1) לכל באר בארון בטיחות ביולוגית כדי לנטרל את מגיב הדיסוציאציה. יש לשלש בעדינות ולאסוף תאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 200 x גרם למשך 5 דקות.
  12. שאפו את הסופרנטנט בארון בטיחות ביולוגית. השעיה מחדש במדיום LIF-3i (1 מ"ל לבאר) לספירת תאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי. צלחת ~ 5 x 105 תאים במדיום LIF-3i של 2 מ"ל לכל באר על MEF מוקרן בלוחות 6 בארות ג'לטין בארון בטיחות ביולוגית.
    הערה: חזור על שלבים 7.12 5o 7.16 עבור כל המעברים הבאים.  לאחר התרבית הראשונית המותאמת ל-LIF-5i, תרביות LIF-3i בצפיפות נמוכה יותר (2x105 תאים לבאר) ועוברים כל 3-4 ימים.
  13. מעבר XF-hiPSC שהוחזר על ידי TIRN עבור לפחות 6-7 מעברים רציפים במדיום LIF-3i לפני השימוש במחקרים פונקציונליים או שימור בהקפאה. רשום את מספר המעברים במדיום תרבית xenofree primed (למשל, E8) או במדיית LIF-5i/LIF-3i TIRN.
    הערה: היפוך TIRN של קווי XF-hiPSC בעלי מעבר גבוה (למשל, >p40) אינו יעיל ואינו מומלץ. קווי מעבר גבוהים מכילים לעתים קרובות פגמים כרומוזומליים או תת-כרומוזומליים, שאינם תואמים להיפוך TIRN יעיל, ויגרמו ליעילות החזרה ירודה וליציבות תרבית מוגבלת. כמו כן, השימוש בתרביות TIRN שעברו יותר מ-15 מעברים במדיום LIF-3i אינו מומלץ למחקרים פונקציונליים. ההשפעה התפקודית של היפוך TIRN של XF-hiPSC בולטת ביותר בין 7 ל-15 מעברים בתווך LIF-3i.

8. הנחיות לתכנון ניסוי לבידול מכוון של TIRN-SC הנגזר מ-XF/FF hiPSC.

  1. השתמש ישירות ב-TIRN-SC שמקורו ב-XF/FF hiPSC לפרוטוקולי התמיינות מכוונים מבוססים ללא כל שלב "הכנה מחדש" (כלומר, אין דרישה להחזיר תאי גזע של TIRN לתנאים "מוקדמים" קונבנציונליים לפני השימוש בהם במבחני התמיינות מכוונת).
  2. להערכה תפקודית של השפעת TIRN על XF-hiPSC, הגדר תרביות איזוגניות אחיות, במספר מעבר שווה ערך במקביל. שמור על תרביות XF-hiPSC איזוגניות של אחים מוקדמים/TIRN במקביל במדיה שלהן (למשל, E8 על ויטרונקטין לעומת LIF-3i על MEF), ובו זמנית לבצע בדיקת טרטומה (איור 5), או להתמיין באמצעות גוף עוברי זהה או פרוטוקולי התמיינות מכוונים וחומרים (איור 6).
  3. בצע הערכה תפקודית של שושלות מובחנות סופיות, במידת האפשר. לדוגמה, ניתן להעריך אבות כלי דם על ידי ביטוי חלבון, בדיקת ספיגת ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) מצומד DiI ובדיקת שפופרת מטריג'ל (איור 7).
    הערה: מבחנים פונקציונליים נוספים עבור VP שמקורו ב-CB-hiPSC ו-TIRN-SC (כלומר, מבחני קליטה/הזדקנות/התפשטות/נדידה של DiI-Ac-LDL, בדיקות שפופרת מטריג'ל במבחנה, בדיקת תקע מטריג'ל לבעלי חיים, מבחני השתלת זרים) מפורטים במקום אחר 3,4.
  4. כוונון ואופטימיזציה של צפיפויות הציפוי הראשוניות והקינטיקה (איור 6) עבור כל שיבוט XF-hiPSC בודד בכל מבחן התמיינות.
    הערה: ל-XF-hiPSC שהוחזר על ידי TIRN יש יכולת התפשטות והתמיינות חזקה יותר במבחני התמיינות מכוונים מאשר XF-hiPSC דרוך.תרביות TIRN דורשות בדרך כלל צפיפות ציפוי ראשונית נמוכה יותר מאשר תרביות E8, ואינן דורשות שימוש בתוספים אנטי-אפופטוטיים כדי לשפר את ההישרדות המשובטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה מייעל שיטות שפורסמו לתכנות מחדש יעיל של אב מיאלואיד למצב פלוריפוטנטי דרוך בנאמנות גבוהה באמצעות וקטורים אפיזומליים ואותות סטרומליים7. הפרוטוקול (איור 1) מתאר שיטות מוגדרות לתכנות מחדש אפיזומלי סטרומלי XF/FF של אבות CB CD34+ אנושיים לתוך XF-hiPSC, ומנחה כיצד לאמת את הפונקציונליות שלהם באמצעות מפרט המטו-וסקולרי מכוון, ואחריו החזרת TIRN לתאי גזע TIRN דמויי בלסטומיר בתנאי LIF-3i/MEF.

באמצעות פרוטוקול אופטימלי זה,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

קבוצת זמבידיס דיווחה במקור על שיטה אפיזומלית אופטימלית של ארבעה גורמים לתכנות מחדש של אבות מיאלואידים CB מחויבים לשושלת ל-CB-hiPSC עם יעילות בתפזורת המגיעה עד 50% בתאים מטוהרים המבטאים אפיזומים7. כאן, הצגנו גרסה שונה של פרוטוקול התכנות מחדש האפיזומלי המקורי של אב CB אנושי בתנאי סטרומה XF/FF. שיטה זו השתמשה ביכולת התכנות מחדש המוגברת של תאים מיאלואידים CD33+CD45+CD34− המחויבים לשושלת להשגת תכנות מחדש מהיר וכמעט מלא שאינו משולב בעקבו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין גילויים להצהיר.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מה-NIH/NEI (R01EY032113; ETZ), קרן המחקר של תאי הגזע של מרילנד (2023-MSCRFV-5995; 2024-MSCRFV-6248; 2025-MSCRFV-0005; 2025-R2-MSCRFV-0004 (ETZ) וקרן ליסה דין מוזלי (ETZ).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Amaxa Biosystems Nucleofector IIלונזהAAB-1001
נוגדן נגד CD143 (BB9), מצומד APC BD Biosciences557929השתמש ב-10-20 ומיקרו; L לכל בדיקה (FACS)
נוגדן נגד CD144, מצומד PE BD Biosciences560410השתמש ב-10-20 ומיקרו; L לכל בדיקה (FACS)
נוגדן נגד CD146, מצומד PE BD Biosciences550315השתמש ב-10-20 ומיקרו; L לכל בדיקה (FACS)
נוגדן אנטי-CD184/CXCR4, מצומד APC BD Biosciences555976השתמש ב-10-20 ומיקרו; L לכל בדיקה (FACS)
נוגדן נגד CD31BD Biosciences550389יש לדלל 1:100 בתמיסת חסימה לבדיקה אימונו-פלואורסצנטית
נוגדן נגד CD31, APC מצומד מדע אלקטרוני17-0319-42השתמש ב-2 ומיקרו; L לכל בדיקה (FACS)
נוגדן נגד CD34, APC מצומד BD Biosciences555824השתמש ב-5 ומיקרו; L לכל בדיקה (FACS)
נוגדן נגד CD45, מצומד PE BD Biosciences555483השתמש ב-10-20 ומיקרו; L לכל בדיקה (FACS)
נוגדן נגד NANOG, מצומד PEBD Biosciences560483השתמש ב-10-20 ומיקרו; L לכל בדיקה (FACS)
נוגדן נגד OCT4, מצומד PEמו"פ D מערכותIC1759Pהשתמש ב-10 ומיקרו; L לכל בדיקה (FACS)
נוגדן anti-SOX17, מצומד Alexa488 BD Biosciences562205השתמש ב-5 ומיקרו; L לכל בדיקה (FACS)
נוגדן נגד SOX2, מצומד PEמו"פ D מערכותIC2018Pהשתמש ב-10 ומיקרו; L לכל בדיקה (FACS)
נוגדן נגד SSEA-4, מצומד APC מו"פ מערכת DFAB1435Aהשתמש ב-5 ומיקרו; L לכל בדיקה (FACS)
נוגדן אנטי-SSEA-4 GloLIVE, מצומד NL493מו"פ מערכת DNLLC1435Gיש להשתמש בדילול של 1:50 (צביעה חיסונית חיה וקבועה)
ערכת מצומד נגד TRA-1-60 A488תרמו-פישר סיינטיפיקA25618
נוגדן אנטי-TRA1-60, מצומד PEBD Biosciences560193השתמש ב-10 ומיקרו; L לכל בדיקה (FACS)
נוגדן אנטי-TRA-1-60 GloLIVE, מצומד NL557 מו"פ D מערכותNLLC4770Rהשתמש ב-AT  דילול של 1:50 (צביעה חיסונית חיה וקבועה)
נוגדן anti-TRA-1-60 StainAlive, מצומד DyLight 488סטמג'נט09-0068לשימוש בדילול של 1:100 (צביעה חיסונית חיה וקבועה)
נוגדן אנטי-TRA1-81, מצומד PEBD Biosciences560161השתמש ב-10 ומיקרו; L לכל בדיקה (FACS)
נוגדן anti-TRA-1-81 StainAlive, מצומד DyLight 488סטמג'נט09-0069לשימוש בדילול של 1:100 (צביעה חיסונית חיה וקבועה)
ערכת MicroBead CD31, אנושיתמילטני ביוטק130-091-935
ערכת MicroBead CD34, אנושיתמילטני ביוטק130-046-702
CD34+ תורמים מעורבים,  דם טבורי, מיליון תאיםAllCellsCB, CR, CD34+, מעורב, PS, CS10, 1Mמקורות חלופיים לתאים כוללים כבד עוברי, מח עצם בוגר ודם היקפי מגויס
עכבר CF1Charles נהר023
CHIR99021מו"פ מערכת DL5283התארגנות מחדש ב-100 מ"מ ב-DMSO
צלחות 6 בארות שטופלו בתרבית רקמות קורנינג קוסטארקורנינג3506
מצע Corning Synthemax II-SC, בקבוקון של 10 מ"גקורנינג3535לשימוש ב-5 μ g/cm2 כתחליף לקורנינג 3978
קורנינג סינתמקס-R צלחת 6 בארותקורנינג3978הופסק והוחלף ל-3535
Costar 6 בארות שקוף תחתית שטוחה מצורף נמוך במיוחד צלחת 6 בארותקורנינג3471
רוזנת  שקופית תא ספירת תאיםתרמו פישר סיינטיפיקC10228
מונה סלולרי אוטומטי של הרוזנתתרמו פישר סיינטיפיקAMQAX1000
CryoStore CS10טכנולוגיות StemCell100-1061
DII-AC-LDLתרמו פישר סיינטיפיקL3484לשימוש ב-5-15 מיקרו; גרם/מ"ל
DMEM (מדיום הנשר השונה של Dulbecco) תרמו פישר סיינטיפיק11995065
DMEM/F-12 , תוסף GlutaMAXתרמו פישר סיינטיפיק10565018
DMEM/F-12, HEPESתרמו פישר סיינטיפיק11330032
DMSO (דימתיל סולפוקסיד)סיגמא אולדריץ'D2650
עכבר DR4מעבדת ג'קסון3208
חיוני 8 (E8) בינוניטכנולוגיות StemCell5940
סרום בובין עוברי (FBS)תרמו פישר סיינטיפיקSH30071.03
תיקון & ערכת חדירות תאים של PERMתרמו פישר סיינטיפיקגאס004
פורסקוליןסטמג'נט04-0025התארגנות מחדש ב-100 מ"מ ב-DMSO
ג'לטין (חזיר)סיגמא אולדריץ'G1890-100 גרםלהשעות במים ולעקר בעזרת חיטוי
נוקלאופקטור תאי CD34+ אנושיים  ערכתלונזהVPA-1003
עכבר איזוטיפ IgG1 PE מצומדBD Biosciences554680
עכבר איזוטיפ IgG2a PE מצומדBD Biosciences558595
חולדה איזוטיפ IgG2b PE מצומדמו"פ D מערכותIC013P
החלפת סרום נוקאאוטתרמו פישר סיינטיפיק10828-028
חומצה L-אסקורביתמיליפור סיגמאא8960
L-גלוטמין (פי 100)תרמו פישר סיינטיפיק25030-081
עמודות LSמילטני ביוטק130-042-401
מטריגלקורנינג356237השתמש ב-200 ומיקרו; L/באר בצלחות של 48 בארות
MEM חומצת אמינו לא חיונית (MEM NEAA) (100X)תרמו פישר סיינטיפיק11140-050
מתוקולט SF H4436טכנולוגיות StemCell04436
מפריד MidiMACSמילטני ביוטק130-042-302
mTeSR1 בינוניטכנולוגיות StemCell85850
בקבוקונים קריוגניים של Nalgeneתרמו פישר סיינטיפיק5000-0020
תמיסת פרפורמלדהיד, 4% ב-PBSתרמו פישר סיינטיפיקJ19943. K2לדלל לריכוז הנדרש באמצעות PBS
PD0325901סיגמא אולדריץ'PZ0162התארגנות מחדש ב-100 מ"מ ב-DMSO
פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)תרמו פישר סיינטיפיק15140-122
אפיזום pEP4 E02S EM2Kאדג'ן20923פלסמידים הופצו ב-TOP10 E.  קולי (Invitrogen) ומטוהר עם ערכות מקסי פלסמיד QIAGEN. 
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)תעשיות ביולוגיות02-023-1א
Poietics תאי גזע מזנכימליים אנושיים לונזהPT-2501ניתן להפשיר ולהרחיב 750,000 תאים במעבר 2 בהתאם להוראות היצרן עבור 1-2 מעברים לפני השימוש או בנקאות משנית
פורמורפמיןסטמג'נט04-0009התארגנות מחדש ב-10 מ"מ ב-DMSO
אקטיבין רקומביננטי Aפפרוטק120-14ההשעיית AT  (100 ומיקרו; גרם/מ"ל) ב-PBS סטרילי, 0.1% אלבומין בסרום אנושי או בקר
FGF2 אנושי רקומביננטיפפרוטק100-18 בהשעיית AT  (100 ומיקרו; גרם/מ"ל) ב-PBS סטרילי, 0.1% אלבומין בסרום אנושי או בקר
FGF בסיסי אנושי רקומביננטי (bFGF)פפרוטק100-18 בחידוש ב-100 ומיקרו; גרם/מ"ל ב-0.1% סרום בקר/אלבומין אנושי ב-PBS
ליגנד FLT3 אנושי רקומביננטימו"פ D מערכות308-FKHB או  308E-GMPהשעיית AT  (100 ומיקרו; גרם/מ"ל) ב-PBS סטרילי, 0.1% אלבומין בסרום אנושי או בקר
אינסולין אנושי רקומביננטיביוג'מים10-365
קיט ליגנד אנושי רקומביננטימו"פ D מערכותBT-SCF או BT-SCF-GMPהשעיית AT  (100 ומיקרו; גרם/מ"ל) ב-PBS סטרילי, 0.1% אלבומין בסרום אנושי או בקר
LIF אנושי רקומביננטיפפרוטק300-05חידוש ב-100 ומיקרו; גרם/מ"ל באלבומין 0.1% בקר/סרום אנושי ב-PBS
TGF ובטא אנושיים רקומביננטיים; 1פפרוטק  100-21חידוש ב-100 ומיקרו; גרם/מ"ל באלבומין 0.1% בקר/סרום אנושי ב-PBS
טרומבופויטין אנושי רקומביננטי מו"פ D מערכות288-TPN או 288E-GMPהשעיית AT  (100 ומיקרו; גרם/מ"ל) ב-PBS סטרילי, 0.1% אלבומין בסרום אנושי או בקר
טרנספרין אנושי רקומביננטימיליפור סיגמאT3705
BMP4 אנושי חוזרפפרוטק120-05השעיית AT  (100 ומיקרו; גרם/מ"ל) ב-PBS סטרילי, 0.1% אלבומין בסרום אנושי או בקר
SB431543סלקכםS1067התארגנות מחדש ב-10 מ"מ ב-DMSO
SIGMAFAST, מצע פוספטאז אלקליין, כרומוגני, טבליהמיליפור סיגמאB5655ממיסים טבליה אחת ב-10 מ"ל מים מטוהרים
נתרן סלניטמיליפור סיגמאS5261
Stemolecule Y27632 בתמיסהסטמג'נט04-0012-02מעכב ROCK בתמיסה (10 מ"מ)
StemPro Accutase מגיב דיסוציאציה של תאיםתרמו פישר סיינטיפיקA11105-01
StemPro MSC SFM XenoFree (XF-MSC)תרמו פישר סיינטיפיקA1067501הכן מדיום XF-MSC על ידי ערבוב של 5 מ"ל StemPro MSC SFM XenoFree תוסף עם 500 מ"ל StemPro MSC SFM מדיום בסיסי. ניתן לשמר את המדיום המצוטט בהקפאה ב-20 מעלות צלזיוס.
StemSpan SFEMטכנולוגיות StemCell9600
מיכל הקפאה של Thermo Scientific Mr. Frostyתרמו פישר סיינטיפיק5100-0001
Ulex Europaeus Agglutin I (UEA-1), ביוטינילציהמעבדות וקטורב-1065-2לדלל 1:200 בתמיסת חסימה לבדיקת פלואורסצנט
ווגףפפרוטק100-20השעיית AT  (100 ומיקרו; גרם/מ"ל) ב-PBS סטרילי, 0.1% אלבומין בסרום אנושי או בקר
פתרון Verseneתרמו פישר סיינטיפיק15040066
מטריצת ויטרונקטין XFטכנולוגיות StemCell7180לדלל ב-40 ומיקרו; L/mL במאגר דילול CellAdhere
XAV939סיגמא אולדריץ'X3004התארגנות מחדש ב-100 מ"מ ב-DMSO
&בטא;-מרקפטואתנולתרמו פישר סיינטיפיק21985-023רגיש לאור

מקורות

  1. Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy: Promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
  2. Kyttala, A., et al. Genetic variability overrides the impact of parental cell type and determines iPS cell differentiation potential. Stem Cell Rep. 6 (2), 200-212 (2016).
  3. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
  4. Park, T. S., et al. Vascular progenitors generated from tankyrase inhibitor-regulated naïve diabetic human iPS cells potentiate efficient revascularization of ischemic retina. Nat Commun. 11 (1), 1195(2020).
  5. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naïve pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
  6. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotechnol. 33 (1), 58-63 (2015).
  7. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), e42838(2012).
  8. Zimmerlin, L., et al. Proteogenomic reprogramming to a functional human blastomere-like stem cell state via a PARP-DUX4 regulatory axis. Cell Rep. 44 (5), 115671(2025).
  9. Park, T. S., Zimmerlin, L., Evans-Moses, R., Zambidis, E. T. Chemical reversion of conventional human pluripotent stem cells to a naive-like state with improved multi-lineage differentiation potency. J Vis Exp. (136), e57921(2018).
  10. Maiers, M., et al. Harnessing global HLA data for enhanced patient matching in iPSC haplobanks. Cytotherapy. 27 (3), 300-306 (2025).
  11. Thomas, J., et al. Running the full human developmental clock in interspecies chimeras using alternative human stem cells with expanded embryonic potential. NPJ Regen Med. 6 (1), 25(2021).
  12. Zheng, C., Ballard, E. B., Wu, J. The road to generating transplantable organs: From blastocyst complementation to interspecies chimeras. Development. 148 (12), 195792(2021).
  13. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  14. Bock, C., et al. Reference maps of human ES and iPS cell variation enable high-throughput characterization of pluripotent cell lines. Cell. 144 (3), 439-452 (2011).
  15. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion, and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  16. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
  17. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  18. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  19. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  20. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14234-14239 (2011).
  21. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854(2012).
  22. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing human naïve pluripotency in the embryo and in the dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
  23. Brunner, S., et al. Circulating angiopoietic cells and diabetic retinopathy in type 2 diabetes mellitus, with or without macrovascular disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4655-4662 (2011).
  24. Caballero, S., et al. Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells. Diabetes. 56 (4), 960-967 (2007).
  25. Jarajapu, Y. P., Grant, M. B. The promise of cell-based therapies for diabetic complications: Challenges and solutions. Circ Res. 106 (5), 854-869 (2010).
  26. Khullar, M., Cheema, B. S., Raut, S. K. Emerging evidence of epigenetic modifications in vascular complications of diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 8, 237(2017).
  27. Manzar, G. S., Kim, E. M., Zavazava, N. Demethylation of induced pluripotent stem cells from type 1 diabetic patients enhances differentiation into functional pancreatic beta cells. J Biol Chem. 292 (34), 14066-14079 (2017).
  28. French, A., et al. Enabling consistency in pluripotent stem cell-derived products for research and development and clinical applications through material standards. Stem Cells Transl Med. 4 (3), 217-223 (2015).
  29. Zimmerlin, L., Park, T. S., Bhutto, I., Lutty, G., Zambidis, E. T. Generation of pericytic-vascular progenitors from tankyrase/parp-inhibitor-regulated naïve (tirn) human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 2416, 133-156 (2022).
  30. Thorsell, A. G., et al. Structural basis for potency and promiscuity in poly(adp-ribose) polymerase (PARP) and tankyrase inhibitors. J Med Chem. 60 (4), 1262-1271 (2017).
  31. Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
  32. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  33. Theunissen, T. W., et al. Molecular criteria for defining the naïve human pluripotent state. Cell Stem Cell. 19 (4), 502-515 (2016).
  34. Pastor, W. A., et al. Naïve human pluripotent cells feature a methylation landscape devoid of blastocyst or germline memory. Cell Stem Cell. 18 (3), 323-329 (2016).
  35. Taapken, S. M., et al. Karyotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
  36. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
  37. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
  38. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
  39. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).
  40. Yang, Y., et al. Derivation of pluripotent stem cells with in vivo embryonic and extra-embryonic potency. Cell. 169 (2), 243-257.e25 (2017).
  41. Yang, J., et al. Establishment of mouse expanded potential stem cells. Nature. 550 (7676), 393-397 (2017).
  42. Gao, X., et al. Establishment of porcine and human expanded potential stem cells. Nat Cell Biol. 21 (6), 687-699 (2019).
  43. Liu, B., et al. Chemically defined and xeno-free culture condition for human extended pluripotent stem cells. Nat Commun. 12 (1), 3017(2021).
  44. Wu, J., et al. Interspecies chimerism with mammalian pluripotent stem cells. Cell. 168 (3), 473-486.e15 (2017).
  45. Yamaguchi, T., et al. Interspecies organogenesis generates autologous functional islets. Nature. 542 (7640), 191-196 (2017).
  46. Kobayashi, T., et al. Generation of rat pancreas in mouse by interspecific blastocyst injection of pluripotent stem cells. Cell. 142 (5), 787-799 (2010).
  47. Theunissen, T. W., et al. Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naïve human pluripotency. Cell Stem Cell. 15 (4), 471-487 (2014).
  48. Gafni, O., et al. Derivation of novel human ground-state naïve pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
  49. Fang, R., et al. Generation of naïve induced pluripotent stem cells from rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell. 15 (4), 488-496 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

XenofreePARP
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים