מאמר שיטה

מיון תאים מבוסס רוכסן לאוצין לטיהור תאים מתמרים וקטור כפול

DOI:

10.3791/68628

⸱

24 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1City of Hope Los Angeles and National Medical Center, 2Lymphoma and Cellular Therapy Services, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 3Department of Hematology and Hematopoietic Cell Transplantation, City of Hope National Medical Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לטיהור סלקטיבי של תאי T מתמרים כפולים מתערובת של תאי T שעברו התמרה משותפת. גישה זו משלבת שני וקטורים רטרו-ויראלים שכל אחד מהם מקודד מרכיב אחד של מתודולוגיית מיון תאים מבוססת רוכסן לאוצין מזווג המאפשרת טיהור אימונומגנטי סלקטיבי של תאים שעברו התמרת וקטור כפול.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפולים בתאי T מאמצים, כולל תאי T קולטני אנטיגן כימריים (CAR), הראו פעילות קלינית מרשימה נגד ממאירויות המטולוגיות ומראים הבטחה בטיפול בגידולים ממאירות מוצקים. למרות הצלחות אלה, זוהו מנגנונים מרובים של עמידות לאימונותרפיה של תאי T המגבילים את ההצלחה הטיפולית, כולל אובדן או ביטוי חלש של אנטיגנים מטרה, התפתחות תשישות תאי T ונוכחות של מיקרו-סביבת גידול מדכאת חיסון. פותחו אסטרטגיות הנדסת תאים מרובות כדי להתגבר על מנגנוני ההתנגדות הללו. עם זאת, מנגנוני עמידות מרובים יכולים להתרחש בו זמנית, מה שמחייב שילוב של אסטרטגיות הנדסיות מרובות כדי לייעל את הפעילות האנטי-גידולית. אילוצי אריזה וקטורית מגבילים את העברת כמויות גדולות של מידע גנטי לתאי T ומהווים אתגר בביטוי משותף של מבנים מהונדסים מרובים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להתמרה משותפת של תאי T עם שני וקטורים לקידוד טרנסגנים מרובים, ובכך להגדיל את מספר הפונקציות המהונדסות. על ידי ביטוי משותף של מתודולוגיית מיון תאים מבוססת רוכסן לאוצין, המכונה מיון Zip, אנו מכוונים טיהור אימונומגנטי סלקטיבי של תאים בעלי התמרה כפולה ששילבו שני וקטורים נפרדים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפול בתאי T CAR חולל מהפכה בטיפול בלוקמיה של תאי B, לימפומה ומיאלומה נפוצה 1,2. תאי CAR T נחקרים גם עבור ממאירויות גידול מוצק3. עם זאת, זוהו מנגנונים חוזרים ונשנים לכישלון הטיפול בתאי T CAR, כולל ביטוי לקוי או אובדן של מולקולת אנטיגן המטרה CAR, התפתחות תפקוד לקוי של תאי T (תשישות), דיכוי חיסוני פעיל על ידי מיקרו-סביבת הגידול, וסחר מוגבל של תאי T למיקרו-סביבת הגידולוהתמדה במיקרו-סביבה 3,4,5,6 . בעוד שפתרונות הנדסיים בודדים פותחו כדי לנסות להתגבר על כל אחד ממנגנוני ההתנגדות לתאי CART 3, הכנסת פונקציות מהונדסות מרובות למוצר טיפול תאי כדי להתגבר בו זמנית על מנגנוני עמידות מרובים היא מאתגרת בשל יכולת האריזה הגנטית המוגבלת של מערכות וקטור רטרו-ויראליות ולנטי-ויראליות7.

כדי להתגבר על מגבלות ביכולת האריזה הווקטורית, נעשה שימוש הולך וגובר בהתמרה משותפת של תאי T עם וקטורים מרובים. התמרה משותפת של וקטור שימשה לחקר אסטרטגיות הנדסת תאי T עם שער לוגי ומווסת תרופות במחקרים פרה-קליניים 8,9,10 ובניסוי קליני שנערך לאחרונה בהערכת תאי T כפולים CD19/CD22 כדי להתגבר על מגבלות אריזה וקטורית11. עם זאת, התמרה משותפת מייצרת תוצרי תאים מעורבים המכילים שילובים של תאי T מתמרים יחידים וכפולים, מה שעלול לפגוע בפונקציונליות של המוצר אם הוא תלוי ברכיבים המקודדים על ידי שני הווקטורים ועלול גם להוביל לתחרות בין תאי T מתמרים בודדים12.

כדי להתגבר על אתגרים אלה, פיתחנו מתודולוגיה הנקראת Zip-sort, המשתמשת ברוכסני לאוצין הטרודימריזציה - כל אחד מבוטא מאחד משני וקטורים מתמרים - כדי לכוון טיהור אימונומגנטי חד-שלבי של תאים כפולים13. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות לבניית וקטורים רטרו-ויראליים המשלבים את מתודולוגיית מיון ה-Zip שלנו, ייצור וריכוז סופרנטנטים רטרו-ויראליים, הפעלה וטרנסדוקציה משותפת של תאי T וטיהור אימונומגנטי של תאים מתמרים כפולים (Zip-sort).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסויים בבעלי חיים נערכו במעבדת המחקר בבעלי חיים של עיר התקווה (COH) פרווין תחת פרוטוקול #23145 שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של COH ובוויווריום של מרכז הסרטן ממוריאל סלואן קטרינג (MSKCC) תחת פרוטוקול #99-07-025 כפי שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של MSKCC. תאי T אנושיים בודדו מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) שעברו טיהור Ficoll-Paque ממסנני הפחתת לויקוציטים שהתקבלו ממרכז תורמי הדם של עיר התקווה ושימשו תחת פרוטוקול #24427 כפי שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של עיר התקווה. כל ההליכים בוצעו בהתאם לתקני בטיחות ביולוגית מוסדיים.

1. עיצוב וקטורי מיון zip

  1. בחר את וקטור הביטוי הנבחר לשינוי גנטי של תאים מעניינים.
    הערה: מתודולוגיית מיון הרוכסן כוללת רוכסנים מופרשים ורוכסנים לכידה, שניהם באים לידי ביטוי מווקטורים שונים, ואשר מתחברים תוך תאיים ותעבורה למשטח התא כדי לאפשר טיהור סלקטיבי של תאים המשלבים את שני הווקטורים (איור 1A-D)13. רוכסנים מופרשים מבוטאים מווקטור 1 ומכילים תג זיקה. רוכסני לכידה באים לידי ביטוי מווקטור 2 ושומרים על הרוכסן המופרש על פני התא. שינוי הרוכסן החוסם מורכב מרוכסן שני מקושר קוולנטית, החוסם זיווג רוכסן חוץ-תאי לא ספציפי של הרוכסן המופרש. שינוי הרוכסן החוסם נדרש כדי למנוע זיווג חוץ-תאי בעת הוספת רוכסן לכידה לחלבונים עם תחומים חוץ-תאיים מוארכים (בדרך כלל תחומים חוץ-תאיים גדולים מתחום ציר קצר).
  2. בחר קבוצה של רוכסנים מופרשים ולכידת רוכסנים מטבלה משלימה 1 ומקובץ משלים 1 כדי לבדוק ולבנות וקטורים.
  3. שיבוט רצפי רוכסן לווקטורים של ביטוי מזווג באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות13- כל אחד משני הווקטורים יקודד את הרוכסן המופרש של תג הזיקה או את רוכסן הלכידה (איור 1D).
    1. ראה טבלה משלימה 1 וקובץ משלים 1 לרצפי בניית רוכסן. רצפי הרוכסן הוצבו בקצה 5' (N) של הודעה פוליציסטרונית כדי לשפר את הביטוי שלהם ובכך להגביר את תפוקת המיון. הניחו את הטרנסגנים הבאים במורד הזרם, מופרדים על ידי פפטידים 2A שדבקים את עצמם (איור 1D). עם זאת, ניסויים קודמים הצליחו למקם את הרוכסנים בתצורת 3' אם נשמר ביטוי גבוה.

2. ייצור רטרו-וירוס

  1. הכן תאי Phoenix-Eco (ATCC CRL-3214, וירוס טרופי עכבר) או Phoenix-Eco ɑ-V β-3 תאים13 (תוספת של ɑ-V β-3 שנועדה לשפר את ההידבקות של Phoenix-Eco) או 293Vec-RD11414 (וירוס אנושי-טרופי) או 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 תאים (תוספת של ɑ-V β-3 שנועדה לשפר את ההדבקה של 293Vec-RD114) יום אחד לפני הטרנספקציה.
    הערה: פרוטוקול זה אינו דורש שינוי של קווי אריזה עם אינטגרינים ɑ-V β-3, אך שינוי זה משפר את ההידבקות של קו תאים זה לצלוחיות תרבית רקמות ומקל על איסוף סופרנטנטים רטרו-ויראליים.
    1. טריפסין תאים בבקבוק T175 המכיל תאי פניקס או 293Vec-RD114 במפגש ~80% עם 0.25% טריפסין-EDTA.
      1. הסר מדיה, שטוף תאים דבקים עם 10 מ"ל PBS, תוך שמירה על תאים ללא הפרעה כדי להסיר רכיבי סרום המעכבים טריפסין, הוסף 5 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA, ודגר תאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      2. להפריד ולאסוף את התאים ב-5 מ"ל של DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-1% GlutaMAX (המכונה DMEM מלא).
      3. גלולה את התאים בצינור חרוטי של 15 מ"ל על ידי צנטריפוגה ב-340 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. מזלזל במדיה.
    2. השעו מחדש תאים עם כדורי צנטריפוגה ב-10 מ"ל של DMEM שלם וצלחת על צלחת תרבית רקמה בגודל 10 ס"מ כ-1.5 x 106 תאי Phoenix-Eco, תאי Phoenix-Eco ɑ-V β-3, 293Vec-RD114, או 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 תאים שנספרו עם המציטומטר.
    3. יש לנער או לסובב בעדינות את הצלחת כדי לפזר תאים באופן שווה ולדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לתאים להיצמד לצלחת.
  2. כ-18-24 שעות לאחר מכן, ודא שהתאים מתכנסים ב-60%-70%, כאשר תאים בריאים ודבקים מציגים הקרנות דנדריטיות.
  3. תאי Phoenix-Eco, Phoenix-Eco ɑ-V β-3, 293Vec-RD114 או 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 עם מבנים וקטוריים רטרו-ויראלים של LZRS (Addgene Plasmid #31601, טרנספקציה יציבה אפיזומלית מבוססת EBNA) או מבני וקטור PB13 (אינטגרציה יציבה גנומית מבוססת טרנספוזון piggyBac, קובץ משלים 1) באמצעות ערכת הטרנספקציה (טבלת חומרים) כמתואר להלן.
    1. שלב 2 מיקרוגרם DNA וקטורי LZRS או DNA וקטורי PB ו-16 מיקרוליטר של מגיב משפר ב-300 מיקרוליטר של מאגר EC בצינור מיקרו-צנטריפוגה עבור כל תגובת טרנספקציה.
    2. לאינטגרציה יציבה של מבנים וקטוריים PB, הוסף גם 1 מיקרוגרם של וקטור הטרנספוזאז ההיפראקטיבי pCMV-hyPBase15 (מכון סנגר).
    3. מערבולת בעדינות למשך 5 שניות ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הוסף 20 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה, מערבולת למשך 10 שניות ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי ליצור קומפלקסים של מיצלה DNA.
    4. הוסף 300 מיקרוליטר של DMEM שלם לצינור, פיפטה מספר פעמים כדי לערבב היטב, והוסף תרחיף מיצלה טיפה לתאי קו האריזה המצופים באמצעות פיפטה של 1 מ"ל.
    5. יש לסובב בעדינות כדי להבטיח שקיעה אחידה של המיצלות. לאחר 24 שעות, יש לנסוע בתאים שעברו טרנספטציה ולהעריך את ביטוי המבנה המקודד הרטרו-ויראלי הראשוני על ידי ציטומטריית זרימה.
    6. העבירו תאים טריפסינים לבקבוק T75 עם 20 מ"ל של DMEM מלא והוסיפו 2 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין או 10 מיקרוגרם/מ"ל בלסטיצידין, בהתאם לגנים העמידים לאנטיביוטיקה, כדי לבחור את התאים שעברו טרנספקציה. ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 70%-75%, יש לנסוע ולהעביר לבקבוק T175 עם 40 מ"ל של DMEM מלא. שמור על בחירת אנטיביוטיקה במדיה במהלך הרחבת קו האריזה.
    7. כאשר התאים מתכנסים 80%-85%, נסה שוב ואשר את ביטוי המבנה על ידי ציטומטריית זרימה. הקפיאו כמות גדולה של תאים באמצעות אמצעי הקפאה (50% DMEM שלם, 40% FBS, 10% DMSO) ותאי מעבר לשני צלוחיות T175 (יחס פיצול של 1:10-1:12) עם 40 מ"ל של DMEM שלם.
  4. יש לאסוף ולרכז סופרנטנט רטרו-ויראלי מקווי אריזה יציבים שנבחרו במלואם הגדלים בצלוחיות T175 כאשר התאים מגיעים למפגש של 80%-85%.
    1. הסר אנטיביוטיקה מהמדיה לפני הקציר הראשון על ידי החלפת המדיה ב-T175 ב-40 מ"ל DMEM טרי ושלם 24 שעות לפני האיסוף המיועד הראשון.
    2. יש לאסוף ולסנן סופרנטנטים 24 שעות לאחר החלפת המדיה על ידי העברת סופרנטנט שנאסף דרך מזרקים של 50 מ"ל המצוידים במסנני מזרק (0.45 מיקרומטר, פוליווינילידן פלואוריד). אוספים בצינור חרוטי של 50 מ"ל.
    3. יש להוסיף 5x תרכיז תמיסת פוליאתילן גליקול (PEG) (40% (משקל/נפח) PEG 8,000 מגה-וואט המכיל 2.4% (משקל/נפח) NaCl) סופרנטנט מסונן ולהפוך את הצינור מספר פעמים לערבוב יסודי (שלב משקעים PEG).
    4. הוסף 40 מ"ל של DMEM מלא בחזרה לבקבוק T175 המקורי שנקטף, דגר למשך 24 שעות נוספות ואסוף סופרנטנט ויראלי מדי יום במשך יומיים רצופים נוספים בסך הכל.
    5. לזרז את הנגיף למשך 1-2 ימים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הנגיף המשקע יופיע כחומר פלוקולנטי, צף או משקע.
    6. תרחיף וירוסים עם צנטריפוגה PEG ב-2,100 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו סופרנטנט שאינו משקע.
    7. יש להשעות כל גלולה נגיפית עם PEG ב-500 מיקרוליטר של RPMI בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1% GlutaMAX, 1% נתרן פירובט, 1% חומצות אמינו לא חיוניות ו-0.1% β-מרקפטואתנול (המכונה RPMI מלא).
    8. השתמש בנגיף המושעה באופן מיידי לצורך העברה או העברה לצינור מיקרו-צנטריפוגה ואחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

3. יום 0: העשרה והפעלה של תאי T בעכבר

  1. מצפים צלחת 6 בארות שטופלה בתרבית רקמות ב-1.5 מ"ל PBS לבאר המכילה 2 מיקרוגרם/מ"ל אנטי-CD3 (שיבוט 145-2C11) ו-2 מיקרוגרם/מ"ל אנטי-CD28 (שיבוט 37.51). יש לדגור למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  2. קצרו טחול מעכבר תורם, נתקו תאים דרך מסנן של 40 מיקרומטר ואספו טחול ב-RPMI מלא. גלולה טחול על ידי צנטריפוגה ב-340 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: נקבות עכברי BALB/cJ בין הגילאים 6-8 שבועות שימשו כעכברים תורמים במחקר זה.
  3. השליכו סופרנטנט, מערבולת בעדינות גלולה, הוסיפו 1 מ"ל של מאגר ליזה RBC, פיפטה 3x-5x לערבוב, דגרו בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת, הרוו עם 10 מ"ל של RPMI מלא, וסובבו תאים על ידי צנטריפוגה ב-340 x g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  4. השליכו סופרנטנט, הוסיפו 800 מיקרוליטר של PBS עם 0.5% BSA ו-2 mM EDTA (המכונה מאגר MACS), והוסיפו 200 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזי CD19 של עכבר. פיפטה לערבב ולדגור במשך 15 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס.
  5. הכן עמודת LD אחת לכל טחול עכבר. תקן את עמודת ה-LD למפריד MACS. הנח צינור חרוטי של 15 מ"ל מתחתיו כדי לאסוף טחול מדולדל CD19. הרטיבו את העמודה עם 2 מ"ל של מאגר MACS.
  6. לאחר הדגירה עם מיקרו-חרוזי CD19, שטפו תאים עם 5 מ"ל של מאגר MACS קר, תאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב-340 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש ב-1 מ"ל של מאגר MACS והוסיפו תאים לעמודת ה-LD. המתן עד שהמתלה יעבור לפני הכביסה עם 1 מ"ל ולאחר מכן 2 מ"ל של מאגר MACS.
  7. אסוף זרימה של הטחול המדולדל CD19 לשימוש במורד הזרם. השליכו את עמודת ה-LD, סובבו את הטחול המדולדל CD19 על ידי צנטריפוגה ב-340 x g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו סופרנטנט והשעו מחדש ב-18 מ"ל של RPMI מלא. הוסף IL-2 אנושי רקומביננטי (rhIL-2) לריכוז סופי של 50 IU/mL.
  8. השלך את תמיסת הנוגדנים מצלחת 6 הבארות המצופה בנוגדנים. הוסף 3 מ"ל של טחול מדולדל תאי B מרחף לכל באר של צלחת 6 הבארות המצופה בנוגדנים.

4. יום 1: התמרה רטרו-ויראלית של תאי T של עכבר

  1. מצפים צלחת 6 בארות שאינה מטופלת בתרבית רקמות ב-1.5 מ"ל PBS לבאר המכילה 2 מיקרוגרם/מ"ל אנטי-CD3 (שיבוט 145-2C11), 2 מיקרוגרם/מ"ל אנטי-CD28 (שיבוט 37.51) ו-20 מיקרוגרם/מ"ל RetroNectin.
    הערה: במהלך ציפוי RetroNectin נעשה שימוש בפלטות שאינן תרבית רקמות בהתאם להמלצות היצרן.
  2. יש לדגור למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. יש להשליך את תמיסת הציפוי או לשמור לשימוש חוזר (ניתן לעשות שימוש חוזר פעם אחת). צלחת בלוק עם 1 מ"ל PBS עם 2% BSA לבאר, דגירה למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס והשליכו את תמיסת החסימה.
  3. בינתיים, הפשירו סופרנטנט ויראלי עם משקעים PEG באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: 500 מיקרוליטר מכל רטרו-וירוס מרוכז PEG שנוצר מבקבוק T175 אמור להספיק כדי להמיר עד 2 x 106 תאי T מופעלים לבאר עם יעילות התמרה כפולה של > 20%.
  4. הוסף סופרנטנטים נגיפיים לבאר הצלחת של 6 בארות בהתאם לתנאים הרצויים, העלה את הנפח הסופי ל-2 מ"ל לפחות עם RPMI מלא ו-50 IU/mL rhIL-2, וסובב במשך שעה אחת ב-2,100 x g ו-32 °C.
  5. הוסף 0.5-2 x 106 תאי T מופעלים לבאר וסובב צלחת ב -340 x גרם למשך 10 דקות ב -32 מעלות צלזיוס. אם התאים אינם נדבקים, חזור על הסיבוב ב-340 x גרם למשך 10-20 דקות נוספות ב-32 מעלות צלזיוס. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

5. יום 2: הערכת ביטוי וקטורי והתמרה חוזרת אופציונלית

  1. לשבש 100-200 מיקרוליטר של תאים דבקים לכל מצב מלוח הטרנסדוקציה לציטומטריית זרימה. על המשתמש לזהות סמן הניתן לזיהוי ציטומטריית זרימה עבור כל וקטור בודד ותג זיקה ולהשתמש בהם כדי להעריך את יעילות התמרת וקטור יחיד, יעילות התמרה וקטורית כפולה והצגת תג זיקה באמצעות ציטומטריית זרימה.
  2. בצע ציטומטריית זרימה על תאים שעברו התמרה משותפת כמתואר להלן.
    1. הגדר צירי פרמטרי רכישה להצגת מדווחים וקטוריים עבור וקטור 1 ווקטור 2 (איור 1C).
    2. התווה היסטוגרמות עבור צביעת רוכסן תג זיקה (למשל, FLAG או CD34) עבור כל אחד מארבעת רבעי הביטוי וקטור 1 ווקטור 2 כדי להבטיח שצביעת תג הזיקה מוגבלת לתאים המבטאים במשותף מדווחי התמרה של וקטור 1 ווקטור 2.
  3. אם התאים עוברים התמרה כפולה מספיק כדי להבטיח מספיק תאים לניסויים במורד הזרם (בדרך כלל התמרה כפולה של 20% ומעלה), בצע את השלבים הבאים.
    1. יש להכפיל את מספר הבארות הראשוניות המשמשות להתמרת כל קו תאי T עם PBS המכיל 2 מיקרוגרם/מ"ל נוגדנים נגד CD3 ואנטי-CD28 כדי לשמור על גירוי תאי T. יש לדגור למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    2. העברת תאים לבארות חדשות עם RPMI מלא עם 50 IU/mL rhIL-2 (שומר על גירוי תאי T).
  4. אם התאים אינם מתמרים כפולים מספיק כדי להבטיח מספיק תאים לניסויים במורד הזרם (בדרך כלל < 20% התמרה כפולה), בצע את השלבים הבאים.
    1. התמר מחדש באמצעות אותו פרוטוקול כמו היום הראשון, אך גדל כדי להכפיל את מספר הבארות ששימשו בתחילה כדי להסביר את התרחבות תאי ה-T.
    2. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. חזור על ציטומטריית הזרימה 24 שעות לאחר מכן.
      הערה: מבנים מקודדים וקטור, כולל רוכסן תג הזיקה, מציגים ביטוי מקסימלי יומיים לאחר ההתמרה הראשונית.

6. יום 3: ברירה אימונומגנטית של תאי T (מיון רוכסן)

  1. מאגר בארות של התאים שנוצרו באמצעות אותם תנאי התמרה משותפת לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
  2. תאי צנטריפוגה ב-340 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו תאי סופרנטנט ודגירה ב-500 מיקרוליטר של מאגר MACS המכיל 30 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים (DYKDDDDK (FLAG) או CD34 אנושי) לכל 1 x 107 תאים למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  3. לאחר הדגירה יש לשטוף תאים עם 5 מ"ל של מאגר MACS קר. תאי צנטריפוגה ב-340 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את ה-supernatant והשעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מאגר MACS.
  4. בחר באופן חיובי תאי T שהומרו באמצעות עמודת LS כמתואר להלן.
    1. הרטיבו את העמודה עם 2 מ"ל של מאגר MACS. החל מתלה תאים על עמוד ה-LS במעמד המגנטי.
    2. שטפו ברצף עם מאגר MACS (1 מ"ל, 2 מ"ל, 3 מ"ל). הוצאת תאים שנשמרו מהעמודה על ידי הסרת העמודה מהמעמד המגנטי, הוספת 5 מ"ל של RPMI שלם לעמודה והכנסת בוכנת התאים.
    3. לכוד תאים בצינור חרוטי של 15 מ"ל או ישירות בבקבוק T25. שיווי משקל של תאים ב-0.5 x 106 תאים/מ"ל ב-RPMI מלא עם 50 IU/mL rhIL-2.
    4. אם מתחילים < 20% התמרה כפולה, אופציונלי להוציא תאים לעמודת LS שנייה לבחירה חיובית רציפה כדי להגביר את הטוהר שלאחר המיון.
  5. תרבית תאי CAR T בצלוחיות T25 או T75 בכ-0.5 x 106 תאים/מ"ל של RPMI מלא ו-50 IU/mL rhIL-2.
  6. אופציונלי: אם תאי T ישמשו לניסויים in vivo, שקול תרבית ב-1 מיקרומטר dasatinib כדי להחליש תפקוד לקוי הנגרמת על ידי איתות טוניק של תאי CAR T שנתקלו בו במהלך תקופת התרבית הראשונית13,16.
  7. בצע ציטומטריית זרימה לפי שלבים 2.1 ו-2.2 לעיל עבור תאי T ממוינים מראש ואחרי מיון כדי להעריך את התשואה והטוהר שלאחר מיון Zip (% תמרוץ כפול).
    תשואה = 100 x סה"כ תאים מתמרים כפולים שהוחזרו / סה"כ תאים מתמרים כפולים הקיימים באוכלוסיית טרום מיון)

7. יום 4: המשך תרבית תאי T

  1. הוסף RPMI שלם טרי ו-50 IU/mL rhIL-2 עבור כל נפח התרבית כדי לשמור על ריכוז תאי T ב-0.5-1 x 106 תאים/מ"ל.
  2. אופציונלי: אם תאי T ישמשו לניסויים in vivo , הוסף dasatinib טרי של 1 מיקרומטר.

8. יום 5: אפיון תאי T ממוינים ברוכסן

  1. אופציונלי: הכן 100-200 מיקרוליטר של תרחיף תאי T לכל מצב מוכתם בנוגדנים כדי לזהות CARs או מוצרי חלבון אחרים המקודדים על ידי וקטורי מיון Zip באמצעות ציטומטריית זרימה.
  2. בצע ניסויים במבחנה או in vivo עם תאי CAR T.
  3. אופציונלי: אם תאי T ישמשו לניסויים in vivo , שטפו תאים כדי להסיר dasatinib. השעיית תאים בריכוז הנדרש להזרקת רטרו-אורביטל או וריד זנב בהתאם להנחיות המוסדיות.

9. יום 0: טיהור וגירוי של תאי T אנושיים

  1. הפשירו במהירות בקבוקון של תאים חד-גרעיניים מדם היקפי אנושי (PBMCs) שנשמרו בהקפאה באמבט מים (או השתמשו ב-PBMCs מבודדים טריים). הוסף PBMCs מופשרים לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מאגר MACS, הכן אליקוט לספירה, ותאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב-340 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  2. השלך תאים סופרנטנטים והשהה מחדש במאגר MACS (השתמש ב-40 מיקרוליטר של מאגר לכל 1 x 107 תאים בסך הכל). המשך בבידוד תאי T באמצעות ערכת בידוד תאי Pan T, אנושית, לפי הוראות היצרן.
    1. בקצרה, הוסף 10 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים ביוטין של תאי Pan T לכל 1 x 107 תאים בסך הכל. יש לדגור במשך 5 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס.
    2. הוסף 30 מיקרוליטר של מאגר MACS לכל 1 x 107 תאים בסך הכל. הוסף 20 מיקרוליטר של קוקטייל Pan T Cell MicroBead לכל 1 x 107 תאים בסך הכל.
    3. יש לדגור במשך 10 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס. מלא את נפח מתלה התאים באמצעות מאגר MACS ל-500 מיקרוליטר לפחות.
    4. המשך להפרדת תאים מגנטיים באמצעות עמודת LS ואסוף את הזרימה דרך תאי T מועשרים (שלא נגעו בהם).
  3. ספרו את תפוקת תאי ה-T ותאי הגלולה על ידי צנטריפוגה ב-340 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו סופרנטנט. השעו מחדש תאי T אנושיים ב-RPMI מלא ב-1 x 106 תאים/מ"ל עם rhIL-2 ב-50 IU/mL.
  4. לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל של PBS, הוסף את הנפח הנדרש של Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 להרחבה והפעלה של תאי T (25 חרוזי מיקרוליטר לכל 1 x 106 תאים, תוך שימוש ביחס של 1:1 חרוז לתאי T) וסובב מטה ב-340 x g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לשטוף את החרוזים. השליכו סופרנטנט.
  5. מערבבים תאי T תלויים עם חרוזים שטופים ומעבירים לבקבוק T25 לתרבית.

10. יום 3: התמרה רטרו-ויראלית של תאי T אנושיים

  1. מצפים צלחת 6 בארות שאינה תרבית רקמות ב-1.5 מ"ל PBS לבאר המכילה 20 מיקרוגרם/מ"ל RetroNectin.
  2. יש לדגור למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. יש להשליך את תמיסת הציפוי או לשמור לשימוש חוזר (ניתן לעשות שימוש חוזר פעם אחת).
  3. בינתיים, יש להפשיר סופרנטנטים נגיפיים המשקעים PEG לצורך התמרה משותפת באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
  4. הוסף סופרנטנט ויראלי של התמרה משותפת לבארות של צלחת 6 בארות מצופה RetroNectin בהתאם לתנאי ההתמרה הרצויים, ספור והוסף כמות רצויה של תאי T (בדרך כלל 0.5 - 2 x 106 תאי T לבאר), הביא נפח עד 3 מ"ל עם RPMI מלא המכיל rhIL-2 וסובב במשך 45 דקות ב-340 x גרם ב-32 מעלות צלזיוס.
  5. לאחר 24 שעות, שמור על תאי T ב-1 x 106 תאים/מ"ל ב-RPMI מלא עם 50 IU/mL rhIL-2.
  6. העבר תאים מצלחת 6 בארות לבקבוק T25 אם הנפח הדרוש לשמירה על הריכוז הרצוי של תאי T עולה על קיבולת הנפח של צלחת 6 הבארות.

11. יום 6: מיון תאי CAR T אנושיים

  1. הסר Dynabeads מתאי T לפני טיהור אימונומגנטי מבוסס תג זיקה (מיון רוכסן) כדי למנוע שימור אפשרי הקשור ל-Dynabead בעמודה המגנטית ולפני זרימה ציטומטרית כדי למנוע הפרעה פוטנציאלית לניתוח זרימה ציטומטרי.
  2. מערבולת קצרה כדי לנתק את Dynabeads ולהעביר תאי T לצינור חרוטי של 15 מ"ל ולהכניס למגנט Dynabead. הפוך את הצינור מספר פעמים והמתן 5 דקות עד שה-Dynabeads נקשרים למגנט.
  3. העבירו בזהירות את תרחיף התאים ללא Dynabeads לצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל על ידי שאיבה עם פיפטה. ספור את ריכוז התאים המשוחזר והשתמש בנפח כדי לחשב את תפוקת התאים הכוללת.
  4. הערך את ביטוי CAR באמצעות זרימה ציטומטרית לפי פרוטוקול התמרת העכבר לעיל.
  5. סובב תאים על ידי צנטריפוגה ב-340 x g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ודגירה במאגר MACS של 500 מיקרוליטר המכיל 30 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים (DYKDDDDK (FLAG) או CD34 אנושי) לכל 1 x 107 תאים.
  6. בצע את שלבים 6.3-6.5 כדי להשיג תאי CAR T אנושיים ממוינים ברוכסן.
  7. הערך את הכדאיות לאחר המיון על ידי בדיקת כדאיות המציטומטר באמצעות אי הכללה כחולה של טריפאן. כדאיות המיון מראש צפויה להיות >-80%. זה עשוי לרדת מתחת ל-80% לאחר מיון מיקוד אך מתאושש תוך 4-5 ימים.
  8. הרחב תאי T אנושיים ב-RPMI מלא עם 50 IU/mL rhIL-2 ושמור על ריכוז תאי T בכ-1 x 106 תאים/מ"ל. ניתן להתאים את ההרחבה והתחזוקה של תאי T לאחר המיון בהתאם לפרוטוקולי ההרחבה והשימוש הסטנדרטיים של המשתמש.
  9. בצע בדיקות ניסיוניות במורד הזרם כגון בדיקות הריגה, ייצור ציטוקינים, ניתוח in vivo באמצעות תאי T בדרך כלל לאחר היום השמיני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים התמרה משותפת וברירה אימונומגנטית חד-שלבית של תאי T שעברו התמרה כפולה עם שני וקטורים רטרו-ויראלים מובהקים (המכונים Zip-sort, איור 1)13. כל וקטור מקודד חלק אחד של זוג רוכסן לאוצין הטרודימרי המוצג באופן סלקטיבי על פני השטח של תאי T עם התמרה כפולה (איור 1A). רוכסן המופרש מתג זיקה מתבטא מווקטור 1 ומזווג תוך תאי עם רוכסן לכידה קשור לממברנה המתבטא מווקטור 2. עיצובי רוכסנים לכידת מיון רוכסן עם מרווחי צירים קצרים (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, תיארנו פרוטוקול ליצירת ערכות וקטוריות של מיון Zip, ייצור רטרו-וירוס, התמרה משותפת של תאי T של עכבר ואנושי, וטיהור אימונומגנטי של תאים כפולים (מיון Zip). הפרוטוקול הנ"ל עבר אופטימיזציה עבור וקטורים רטרו-ויראליים ועבור תאי T של עכברים ובני אדם. בעוד שמתודולוגיית מיון ה-Zip לא הוערכה עם מערכות וקטוריות אחרות, באופן עקרוני, סביר להניח שמערכות וקטוריות אחרות יהיו תואמות, כולל lentivirus17, טרנספוזונים18, או שילוב תבנית תיקון מכוונת הומולוגי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.R., S.C., S.E.J. ו-M.V.D.B. הם ממציאים שותפים בבקשות פטנט הקשורות לטכנולוגיית Zip-soren. A.P.B. מספקת ייעוץ ל-Abbvie ולבריסטול מאיירס סקוויב. M.v.d.B קיבלה תמיכה מחקרית מ-Seres Therapeutics, ואופציות למניות מ-Seres Therapeutics ו-ThymoFox; הוא קיבל תמלוגים מוולטרס קלוור; הוא ייעץ, קיבל כבוד או השתתף בוועדות מייעצות עבור Seres Therapeutics, Vor Biopharma, Rheos Medicines, Frazier Healthcare Partners, Nektar Therapeutics, Notch Therapeutics, Ceramedix, Lygenesis, Pluto Therapeutics, GlaskoSmithKline, Da Volterra, ThymoFox, Garuda, Novartis (בן זוג), Synthekine (בן זוג), Beigene (בן זוג), Kite (בן זוג), MustangBio (בן זוג) ו-Cellectar (בן זוג); יש לו רישיון קניין רוחני עם Seres Therapeutics ו-Juno Therapeutics; הוא מחזיק בתפקיד נאמנות במועצת הקרן של DKMS (ארגון ללא מטרות רווח); והוא יו"ר המועצה המדעית המייעצת של Smart Immune.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.C. קיבלה תמיכה מקרן המחקר הגרמנית (Research Fellowship; Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG). S.E.J. מקבל תמיכה מפרס פיתוח קריירה מה-NCI (מספר פרס K08-CA252157). S.E.J. קיבלה גם תמיכה מהאגודה האמריקאית לאונקולוגיה קלינית (פרס החוקר הצעיר), התוכנית הלאומית לתורמי מח עצם (פרס תוכנית איימי) ומכון פארקר לאימונותרפיה בסרטן (פרס Bridge Scholar). המחקר במעבדת ואן דן ברינק נתמך על ידי פרסי המכון הלאומי לסרטן P01-CA023766, R35-CA284024, R01-CA228308; פרס המכון הלאומי ללב, ריאות ודם R01-HL164902, ופרס המכון הלאומי להזדקנות P01-AG052359. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי קרן היו"ר הבכיר של דיאנה וסטיב קמפבל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>קו תאי גידול קשור
C1498ATCCטיב-49
BM185-CD19אסמכתא 13
BM185-CD20אסמכתא 13
יחידת ליבת נוקלאופקטור 4DלונזהAAF-1003B
יחידת 4D-Nucleofector XלונזהAAF-1003X
ערכת חיץ Lonza SF
<ייצור חזק>וירוסים
צלחת תרבית תאים 10 ס"מ שטופלה בתרבית רקמות (TC)קורנינג353003
צינור חרוטי 50 מ"לתרמו סיינטיפיק339652
אפקטןקיגן301425
פלסמיד pENTR1aאדג'ן17398
LZRS-RFAאדג'ן31601
PB MMLV puro (וקטור ויראלי לתאי T של עכבר)אסמכתא 13
PB SFG blastR (וקטור ויראלי לתאי T אנושיים)אסמכתא 13
pCMV-hyPBaseמכון סנגר
פיניקס-אקוATCCCRL-3214
פיניקס-אקו אלפא V בטא 3אסמכתא 13Phoenix-Eco מותאם להיצמד לצלוחיות תרבית בהתלהבות גבוהה יותר
אינטרון PB-EF1a WPRE mCD4 P2A MCS אינטגרין בטא 3אסמכתא 13אופציונלי לשיפור ההידבקות של תאי קו אריזה לצלוחיות תרבית
אינטרון PB-EF1a WPRE hCD8a 2A אינטגרין אלפא Vאסמכתא 13אופציונלי לשיפור ההידבקות של תאי קו אריזה לצלוחיות תרבית
ביובק-RD113ביובק פארמה
Biovec-RD113 אלפא V בטא 3ביובק פארמהמחקר זה, שהועבר עם וקטורים אלפא V בטא 3
מסנני מזרק Millex-HV (0.45 μ m)מיליפורSLHVR33RRS
פוליאתילן גליקול 8000 (PEG)פישר סיינטיפיקBP233-1
נתרן כלוריפישר סיינטיפיקS271-500
פורומיציןסנטה קרוז ביוטקSC-108071B
בלסטיצידיןסנטה קרוז ביוטקSC-204655
צלוחיות T175 שטופלו ב-TC קורנינג353112
טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדוםג'יבקו25200056
<חזק>מדיה תאית
2-מרקפטואתנולג'יבקו21985023
RPMI1640ג'יבקו11-875-119
DMEMג'יבקו11-965-118
FBSסיגמאפ2442
גלוטמקסג'יבקו35050061
חומצות אמינו לא חיוניות MEMג'יבקו11140050
פניצילין-סטרפטומיציןג'יבקו15140-163
נתרן פירובטג'יבקו11360070
<גירוי/התמרה של תאי T חזקים>
צינור חרוטי 15 מ"לתרמו סיינטיפיק339650
צלחת 6 בארות שאינה TCג'יבקו351146
צלחת TC 6 בארותג'יבקו353046
מיקרו-חרוזים נגד CD19 מילטני ביוטק130-121-301
InVivoMab נגד עכבר CD28 (שיבוט 37.51)ביוקס צ'לBE0015-1
InVivoPlus נגד עכבר CD3ε (שיבוט 145-2C11)ביוקס צ'לBE0001-1
סרום בקר אלבומיןסיגמא אולדריץ'A4737-1G
דסטיניבקיימן כימיקלים11498
Dynabeads מפעיל T אנושי CD3/CD28ג'יבקו11131ד
EDTA (0.5 מ'), pH 8.0, נטול RNaseInvitrogenAM9260G
מאגר ליזה HybriMax RBCסיגמאR7757-100 מ"ל
עמודת LDמילטני ביוטק130-042-901
ערכת בידוד תאי Pan T, אנושיתמילטני ביוטק130-096-535
מגנט Dynamag-15Invitrogen12301ד
תמיסת מלח חומצה פוספט (1X)קורנינג21040קורות חיים
רטרונקטיןטאקארהT100B
rhIL-2פרולוקין (אלדסלוקין)
בקבוק תרבית תאים T25קורנינג353109
<חזק>מיון רוכסן
ומיקרו; ערכת בידוד MACS DYKDDDDKמילטני ביוטק130-101-591
ערכת MicroBead CD34, אנושיתמילטני ביוטק130-046-702
QuadroMACSמילטני ביוטק130-090-976
MACS MultiStandמילטני ביוטק130-042-303
עמודת LSמילטני ביוטק130-042-401
<ציטומטריית זרימה חזקה וניטור תאים>
אנטי-CD90.1 Thy1.1 APC (שיבוט OX-7)BD Biosciencesחתול# 561409; RRID:AB_10683163
נוגדן תג V5, (שיבוט 4C12E11) iFluor 488GenScriptCat# A01803, RRID:AB_2925231
מיק PEטכנולוגיית איתות תאיםחתול # 2233; RRID:AB_823474
מיק אלכסה 647טכנולוגיית איתות תאיםחתול # 2233; RRID:AB_823474
תג APC נגד DYKDDDK (שיבוט L5)ביולג'נדחתול# 637307; RRID:AB_2561496
נוגדן נגד CD34 לעכבר, Alexa Fluor 647, (שיבוט QBEnd/10)נובוס ביולוגיתחתול # NBP2-34713AF647; RRID:AB_2925234
סטרפטג FITCGenScriptחתול # A01736; RRID:AB_2622221
Incucyte SX5סרטוריוס
ציטומטר זרימת פנטאוןזריז

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. June, C. H., Sadelain, M. Chimeric Antigen Receptor Therapy. New Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
  2. Mikkilineni, L., Kochenderfer, J. N. CAR T cell therapies for patients with multiple myeloma. Nat Rev Clin Oncol. 18 (2), 71-84 (2021).
  3. Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614 (7949), 635-648 (2023).
  4. Berger, T. R., Maus, M. V. Mechanisms of response and resistance to CAR T cell therapies. Curr Opin Immunol. 69, 56-64 (2021).
  5. Labanieh, L., Majzner, R. G., Mackall, C. L. Programming CAR-T cells to kill cancer. Nat Biomed Eng. 2 (6), 377-391 (2018).
  6. Fucà, G., Reppel, L., Landoni, E., Savoldo, B., Dotti, G. Enhancing Chimeric Antigen Receptor T-Cell Efficacy in Solid Tumors. Clin Cancer Res. 26 (11), 2444-2451 (2020).
  7. Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. Viral Vector Systems for Gene Therapy: A Comprehensive Literature Review of Progress and Biosafety Challenges. Appl Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).
  8. Hyrenius-Wittsten, A., et al. SynNotch CAR circuits enhance solid tumor recognition and promote persistent antitumor activity in mouse models. Sci Transl Medi. 13 (591), eabd8836(2021).
  9. Tousley, A. M., et al. Co-opting signalling molecules enables logic-gated control of CAR T cells. Nature. 615 (7952), 507-516 (2023).
  10. Li, Y., et al. KIR-based inhibitory CARs overcome CAR-NK cell trogocytosis-mediated fratricide and tumor escape. Nat Med. 28 (10), 2133-2144 (2022).
  11. Ghorashian, S., et al. CD19/CD22 targeting with co-transduced CAR T-cells to prevent antigen negative relapse after CAR T-cell therapy of B-ALL. Blood J. , (2023).
  12. Qin, H., et al. Preclinical Development of Bivalent Chimeric Antigen Receptors Targeting Both CD19 and CD22. Mol Ther Oncol. 11, 127-137 (2018).
  13. James, S. E., et al. Leucine zipper-based immunomagnetic purification of CAR T cells displaying multiple receptors. Nat Biomed Eng. 8 (12), 1592-1614 (2024).
  14. Ghani, K., et al. Efficient Human Hematopoietic Cell Transduction Using RD114- and GALV-Pseudotyped Retroviral Vectors Produced in Suspension and Serum-Free Media. Human Gene Ther. 20 (9), 966-974 (2009).
  15. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc Natl Acad Sci U S Am. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  16. Weber, E. W., et al. Transient rest restores functionality in exhausted CAR-T cells through epigenetic remodeling. Science. 372 (6537), eaba1786(2021).
  17. Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct Targeted Ther. 6 (1), 1-24 (2021).
  18. Kahlig, K. M., Saridey, S. K., Kaja, A., Daniels, M. A., George, A. L., Wilson, M. H. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc Natl Acad Sci. 107 (4), 1343-1348 (2010).
  19. Shy, B. R., et al. High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails. Nat Biotechnol. 41 (4), 521-531 (2023).
  20. Liu, Z., et al. Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector. Sci Rep. 7 (1), 2193(2017).
  21. Cui, Z., Yuan, P., Zhao, Z., Zhao, F., Lu, L. Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro. J Vis Exp. (213), e66966(2024).
  22. Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J Clin Invest. 119 (4), 964-975 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Leucine ZipperCell SortingDual Vector TransductionT Cell EngineeringImmunomagnetic PurificationAdoptive T Cell TherapyCAR T CellsTumor MicroenvironmentTransgene CoexpressionCell Purification

מאמרים קשורים