מאמר שיטה

סליקה אופטית חולפת באמצעות מולקולות סופגות להדמיית ex vivo ו-in vivo

6.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68629

⸱

11 ביולי 2025

 ,  ,  , 
1Department of Physics, The University of Texas at Dallas, 2Department of Electrical and Computer Engineering, The University of Texas at Dallas

במאמר זה

סיכום

טכניקות ניקוי אופטי, כגון תמיסות ספיגת מולקולות, מפחיתות את פיזור האור באופן זמני כדי לשפר את ההדמיה הביולוגית ומציעות אסטרטגיות הדמיה in vivo תואמות ביולוגית והפיכות לאיברים משובצים עמוק. פרוטוקול זה מציג נהלי ניסוי מפורטים כמו גם עיבוד תמונה מתקדם להשגת הדמיה דינמית באיכות גבוהה לדינמיקה בזמן אמת בבעלי חיים חיים.

תקציר

הדמיה דינמית היא כלי בסיסי בביולוגיה וברפואה, אך היא מוגבלת על ידי פיזור אור ברקמות חיות הנגרם על ידי אי התאמות של מקדם השבירה, מה שמפחית את עומק החדירה והרזולוציה ברקמות ביולוגיות. עבודות קודמות הציגו גישה חדשה להשגת שקיפות אופטית בבעלי חיים על ידי שימוש במולקולות סופגות חזק. כאשר מולקולות סופגות אלה, כגון טרטרזין, צבע מאושר על ידי ה-FDA המשמש בדרך כלל במזון, מתמוססות במים, הן משנות את מקדם השבירה של המדיום המימי באמצעות יחסי קרמרס-קרוניג. אפנון זה מאפשר להפחית את אי ההתאמה של מקדם השבירה בין רכיבים נפרדים ברקמה עם מקדמי שבירה מובחנים, ובכך להפחית את הפיזור. מאמר זה מדווח על המתודולוגיה המפורטת של טכניקת ניקוי הרקמות באמצעות תמיסה מימית מבוססת טרטרזין, המיושמת הן על דגימות ex vivo והן על דגימות in vivo . גישה זו הופכת באופן הפיך גופי עכברים חיים לשקופים בספקטרום הנראה, ומאפשרת הדמיה ברורה ועמוקה יותר של תהליכים ומבנים פנימיים. לאחר מכן נעשה שימוש באלגוריתם עיבוד תמונה מתקדם כדי לשפר את הניגודיות והפילוח של איברים מעניינים. בנוסף, מוצגת שקיפות גבוהה בדגימות ex vivo , כגון חזה עוף, שטופל בתמיסה מבוססת טרטרזין. שיטה זו מציעה גישה רב-תכליתית ונגישה לשיפור יכולות ההדמיה בשיטות שונות וסוללת את הדרך להתקדמות בהבנת מערכות ביולוגיות מורכבות.

מבוא

הדמיה ביולוגית מאותגרת זה מכבר על ידי פיזור האור, המטשטש מבנים מעניינים1. טכניקות ניקוי אופטי שואפות להפחית את פיזור האור ולשפר את הבהירות החזותית, מה שמאפשר הדמיה של מבנים שהוסתרו בעבר2. פיתוח טכניקות אלה הוביל למגוון רחב של שיטות שנועדו לשפר את ההדמיה האופטית של רקמות ביולוגיות ex vivo, אפילו בעלי חיים שלמים, ללא ניתוח פיזי של הדגימות3. עם זאת, הפיתוח של טכניקות דומות ליישומי in vivo היה מאתגר. טכניקות כגון CLARITY Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging / Immunostaining / in situ-hybridization-compatible Tissue hYdrogel), מציעות הדמיה ברזולוציה גבוהה אך חסרות הפיכות, מה שהופך אותן לבלתי מתאימות למחקרים בבעלי חייםחיים 4. קונסטנטיני ועמיתיו הראו התקדמות איטית יותר בהדמיה in vivo בהשוואה לבהירות הדמיה ex vivo, הנובעת מהמורכבות של שמירה על כדאיות הרקמה תוך הימנעות מרמות רעילות של חומרים הדרושים לשקיפות רקמות5. ג'נינה מדגישה את עתיד ניקוי הרקמות האופטיות כמסתמך על שיטות לא פולשניות והפיכות6. מחקרים אחרונים הוכיחו את יעילותם של צבעים סופגים מסיסים במים לניקוי אופטי in vivo. לדוגמה, מילר ועמיתיו הראו כי מריחה מקומית של טרטרזין שיפרה משמעותית את עומק ההדמיה הן ב-OCT והן במיקרוסקופיה פוטו-אקוסטית (PAM) של עור עכבר חי, על ידי הפחתת הפיזור והגדלת מקדם השבירה של רכיבי רקמת הביניים7. Jia et al. השתמשו בתמיסת טרטרזין של 15% w/w כדי לשפר הדמיית PAM in vivo של רקמת האוזן והבטן של העכבר, וחשפו מבנים מיקרו-וסקולריים עדינים עם רזולוציה תת-תאית שאחרת היו מטושטשים8. Zuo ואחרים הדגימו עוד הדמיית מוח באמצעות קרקפת וגולגולת שלמות בעכברים חיים באמצעות 0.6 M טרטרזין, והשיגו עוצמת אות גבוהה פי 4 ורזולוציה משופרת פי 3.5 בהשוואה לרקמה לא מטופלת9. ביישום אחר, Narawane et al. אפשרו הדמיית OCT טרנססקלרלית עמוקה בעיני חזיר על ידי מריחת טרטרזין, והשיגו הדמיה ברורה של החלל הסופרכורואידי, שקודם לכן לא היה נגיש עקב פיזור סקלרלי חזק10. למרות ששיטות ניקוי רקמות ex vivo כמו CLARITY ו-iDISCO (הדמיה תלת מימדית המאפשרת תיוג חיוני של איברים מנוקים ממסים) משיגות שקיפות אופטית גבוהה ורזולוציה תת-תאית באמצעות הסרת שומנים או ניקוי מבוסס ממס, הן לרוב אינן מתאימות להדמיה in vivo עם בעלי חייםחיים 4,11,12. מגבלה זו משפיעה על הדמיה דינמית, שהיא חיונית להדמיה ביו-רפואית של תהליכים דינמיים בתוך בעלי חיים חיים, כגון התפתחות מחלות וטיפולים.

מולקולות סופגות בעלות מסיסות מימית גבוהה וצורות פס ספיגה מובהקות, כגון טרטרזין, צבע המתאים למזון, מציעות יתרונות מבטיחים להשגת שקיפות אופטית בבעלי חיים13. על ידי הכנסה ספציפית של טרטרזין, הרקמה סופגת באופן סלקטיבי אורכי גל אולטרה סגול וכחול בשל המאפיינים הספקטרליים הייחודיים של הצבע, וכתוצאה מכך פרופיל מקדם שבירה שונה המפחית את הפיזור באורכי גל ארוכים יותר. טכניקת ניקוי רקמות אופטית מנוגדת לאינטואיציה זו מותאמת להדמיה in vivo, ויחסי קרמרס-קרוניג מספקים בסיס מדעי לשקיפות הנצפית בעת שימוש במולקולות סופגות חזק כמו טרטרזין14,15. להדמיה in vivo, טרטרזין משולב עם חלקיקי אגרוז מחוממים ומים ליצירת תמיסה מגובשת שנדבקת טוב יותר לעור. האופי המסיס במים של טרטרזין מקל גם על הסרה קלה של התמיסה מבוססת הצבע מבעלי חיים חיים, ומפחית את ההשפעות הפוטנציאליות של חשיפה ממושכת לתמיסות צבע. בנוסף, השיטה הותאמה ליישומים ביו-רפואיים שונים כדי לשפר את עומק ההדמיה, הרזולוציה והרגישות, כולל טומוגרפיה קוהרנטית אופטית 7,16 והדמיה פוטו-אקוסטית 7,9, מה שמדגים את הפוטנציאל שלה עבור קהילת ההדמיה הביו-רפואית הרחבה יותר.

עם העניין הגובר ביישום מולקולות סופגות בהדמיה ביו-רפואית17,18, הפרוטוקול מציג נוהל מפורט של שימוש בצבעי מאכל ליישומי ex vivo ו-in vivo, יחד עם עיבוד תמונה והדמיה הפיכה in vivo. פרוטוקול זה מוחל על רקמת חזה עוף כדי להפגין שקיפות ex vivo ולאחר מכן שונה להדמיית ראש ובטן in vivo של עכברים, המראה הפיכות. תמיסה שנמרחת על עור העכבר in vivo יוצרת שקיפות זמנית והפיכה מבלי לפגוע בשלמות העור או הרקמות. ניתן לשלב טכניקה זו עם צינור עיבוד תמונה, כולל דה-נוז, כדי ליצור פרוטוקול הדמיה אופטימלי להדמיה אופטית in vivo של איברים פנימיים. בשילוב, טכניקות אלה מאפשרות הדמיה אורכית לא פולשנית טובה יותר לתצפיות בזמן אמת על תהליכים ביולוגיים. השימוש בחומרים בטוחים יותר המדגימים הפיכות מתגבר על מגבלות קודמות ומספק שיטה מתאימה יותר להדמיה ביולוגית דינמית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים שנערכו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת טקסס בדאלאס (IACUC) בהתאם למדריך ה-NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים. קוד עיבוד תמונה זמין ב-Github: https://github.com/ou-group-utd/JoVE-2025-Image-Processing

1. הכנת תמיסת טרטרזין

  1. לדוגמאות ex vivo
    1. להכנת תמיסות צבע, חישבו את המסה הנדרשת של אבקת צבע (טרטרזין) להכנת הנפח הרצוי של התמיסה. השתמש בנוסחה:
      מסה (גרם) = מולריות (מ') × משקל מולקולרי (גרם/מול) × נפח (L)
      הערה: כדי לכייל את המולריות בפועל, מדוד את הספיגה של תמיסות מוכנות באמצעות ספקטרומטר UV-VIS והחל את חוק באר-למברט19.
      זהירות: השתמש באיזון אנליטי כדי לשקול את הכמות המדויקת של האבקה. ללבוש PPE (ציוד מגן אישי) מתאים, כולל מעיל מעבדה, כפפות ומשקפי מגן, בעת עבודה עם אבקות צבע. הימנע משאיפה או מגע בעור.
    2. העבירו את אבקת הצבע לבקבוקון זכוכית נקי והוסיפו את הנפח הנדרש של מים נטולי יונים (DI) באמצעות פיפטה נפחית כדי להבטיח דיוק נפחי.
    3. אם האבקה אינה מתמוססת במלואה בטמפרטורת החדר, הכניסו את בקבוקון הזכוכית לתנור מעבדה או תנור שחומם מראש ל-40 מעלות צלזיוס וחממו למשך 10 דקות או עד שהאבקה מומסת לחלוטין (איור 1A).
      הערה: תמיסות מולריות נמוכות מסיסות לחלוטין בטמפרטורת החדר ונשארות בצורה נוזלית, בעוד שתמיסות בריכוז גבוה (>0.37 מ') דורשות חימום.
      זהירות: חימום מוגזם יאדה מים וישנה את הריכוז בפועל של התמיסה.
    4. מערבבים על מערבל מערבולת למשך 30 שניות עד דקה אחת כדי להבטיח התמוססות מלאה.
    5. להכנת תמיסה של 0.65 מ ', ממיסים 427.5 מ"ג אבקת טרטרזין ב -1 מ"ל מים DI19. לריכוזים אחרים, עיין בטבלה 1.
      הערה: השלך תמיסות צבע שאינן בשימוש וחומרים מזוהמים בהתאם לנהלים סטנדרטיים לסילוק פסולת כימית.
  2. לדוגמאות in vivo
    1. חשב את המסה הנדרשת של מיקרו-חלקיקי אגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה וטרטרזין להכנת ריכוז של 0.65 M עם תמיסת הידרוג'ל אגרוז של 0.4% (4 מ"ג/מ"ל).
      הערה: פעל לפי אמצעי הבטיחות הסטנדרטיים כמתואר בשלב 1.1.1 בעת טיפול בכל הריאגנטים.
    2. מעבירים את האבקות המשוקללות לבקבוקון זכוכית נקי. הוסף מי DI באמצעות פיפטה נפחית.
    3. מכניסים את הבקבוקון לתנור מעבדה או לתנור שחומם מראש ל-75 מעלות צלזיוס למשך כ-10-15 דקות או עד שחלקיקי האגרוז מומסים לחלוטין.
    4. מערבבים מדי פעם בעזרת מערבל מערבולת בתהליך החימום לפירוק אחיד.
    5. הניחו לתמיסה להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש. אם הוא מתמצק לצורת ג'ל, השתמש במיקסר המערבולת למשך 30 שניות כדי להנזיל אותו מחדש.
    6. להכנת תמיסת הידרוג'ל של 0.65 M, ממיסים 427.5 מ"ג אבקת טרטרזין ו -4 מ"ג אגרוז ב -1 מ"ל מי DI. להכנת תמיסות בריכוזים אחרים, שמור על ריכוז האגרוז על 0.4% (4 מ"ג/מ"ל) ועיין בטבלה 1 עבור מסת טרטרזין17 המתאימה.

2. ניקוי אופטי של רקמות ex vivo

  1. הכנת מדגם
    1. להכנת רקמת ex vivo פורסים רקמת חזה עוף לעובי הרצוי במקביל לסיבי הקולגן.
    2. נקו את הרקמה הפרוסה בעדינות במים.
    3. מדוד את העובי על ידי הנחת הרקמה בין שתי שקופיות מיקרוסקופ נקיות. לחץ בעדינות את השקופיות יחד והשתמש בקליפר Vernier כדי למדוד את המרחק בין השקופיות במרכז הרקמה.
    4. משרים את הרקמה בתמיסת הצבע.
      התראה: ודא שנפח התמיסה גדול מנפח הדגימה ושהרקמה שקועה לחלוטין.
    5. הניחו את המיכל על שייקר מסלולי ונערו במהירות של 100 סיבובים לדקה למשך 10 דקות.
    6. תנו לרקמה להישאר בתמיסה למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר לריכוזים נמוכים ≤0.4 מ' וב-40 מעלות צלזיוס לריכוזים גבוהים יותר >0.4 מ'.
  2. דימות
    1. הסר את הרקמה מתמיסת הצבע באמצעות מלקחיים נקיים.
    2. הניחו את הדגימה בין שתי שקופיות זכוכית שקופות וצלמו את התמונות באמצעות מצלמה דיגיטלית או מדעית עם רזולוציה והגדרות הגדלה מתאימות.
    3. בצע את תהליך ההדמיה בסביבת אור מבוקרת כדי למזער הפרעות אור חיצוניות.
    4. חזרו על תהליך ההדמיה עבור דגימות רקמה בעוביים שונים וריכוזי תמיסת צבע שונים (איור 2B).
      הערה: השתמש במקור אור LED לתאורה אחורית. עם זאת, זה עובד בדיוק באותו אופן גם עבור מקור אור תאורה עליון.
  3. מדידות שידור אופטי
    1. כדי למדוד את השידור האופטי, סנדוויץ' את רקמת העוף בין שתי שקופיות זכוכית שקופות ומדוד את השידור באמצעות ספקטרומטר UV-Visible-NIR (איור 2C).
    2. ודא שהמערכת מבוססת כהלכה, וקרן האור עוברת דרך אותו אזור ברקמה לפני ואחרי הטיפול בה בתמיסות צבע כדי לשמור על עקביות.
      הערה: הקלט את ספקטרום השידור על פני טווח אורכי גל של 400 ננומטר עד 2000 ננומטר, באמצעות מהירות סריקה בינונית ומרווח נתונים של 1.0 ננומטר. הסריקה הספקטרלית המלאה אורכת כ-5 דקות לכל דגימה.

3. שקיפות אופטית בבעלי חיים

  1. הכנת בעלי חיים
    1. לפני הניסוי, מדדו את משקל החיה ורשמו את רמת הפעילות הכללית כדי לקבוע קו בסיס פיזיולוגי.
    2. השתמש בכרית חימום כשהטמפרטורה מוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החיה במהלך הניסוי.
      זהירות: עקוב באופן רציף אחר החיה כדי למנוע התחממות יתר.
    3. מתן הרדמה (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד) להדמיה אופטית של בעלי חיים על בסיס אתרי הדמיה. להדמיית בטן, השתמש בחומרי הרדמה באינהלציה להחלמה מהירה, ובהרדמה בהזרקה להדמיית מוח.
    4. להרדמה באינהלציה, יש להשרות עם איזופלורן ב-1.5%-3% וקצב זרימה של 0.8 ליטר/דקה למשך כ-5 דקות לפני ניסוי ההדמיה ולשמור אותו על 1%-2% לאורך כל הניסוי.
      זהירות: עקוב אחר דפוס הנשימה והעומק של בעל החיים ברציפות. השתמש באזור מאוורר היטב כדי למזער את החשיפה להרדמה לצוות.
    5. להרדמה בהזרקה, הכינו קוקטייל המכיל קטמין HCL (16 מ"ג/מ"ל) ו-Dexmedetomidine HCL 0.2 מ"ג/מ"ל. מינון בהתאם למשקל בעלי החיים ולפרוטוקולים מוסדיים מאושרים.
    6. חתוך את הפרווה באמצעות קוצץ של בעלי חיים קטנים מאזור ההדמיה הרצוי.
    7. מרחו קרם הסרת שיער על אזור העור הקצוץ למשך פחות מ-60 שניות כדי להסיר שאריות שיער. הסר מיד את הקרם ונקה את העור באמצעות מגבוני אלכוהול כדי למנוע גירוי בעור.
    8. השתמש ב-Atipamezole כתרופת היפוך להרדמה בהזרקה לאחר הניסוי. עקוב אחר בעל החיים במהלך ההתאוששות וודא שהוא חוזר לנשימה וניידות רגילה לפני שהוא חוזר לכלוב הביתי שלו.
  2. נוהל הפיכת רקמות לשקופות
    1. הכן את מערך ההדמיה על-ידי הנחת כרית חימום המכוונת ל-37 מעלות צלזיוס מתחת לבעל החיים כדי למנוע היפותרמיה. יישר את מקור האור והמצלמה כדי ללכוד את התמונות.
    2. השתמש בתמיסת הידרוג'ל טרטרזין 0.65 M מעורבבת עם ג'ל אגרוז 0.3%-0.4% למריחה (שלב 1.2).
    3. מרחו את התמיסה על העור (בטן או ראש, כתלות באופי הניסוי) באמצעות טפטפת, והניחו לה לשבת במשך כמה שניות כדי להתחיל את הספיגה (איור 3A).
    4. יש לשפשף בעדינות את האזור באמצעות צמר גפן לפיזור אחיד של תמיסת הצבע ולהקל על ספיגת העור.
    5. עסו את האזור בעדינות בעזרת צמר גפן נקי ומרחו תמיסה נוספת עד שהעור מתחיל להראות שקיפות והאיברים הפנימיים נראים לעין. במהלך הספיגה, העור יראה תחילה מראה של נקודות כתומות-אדומות, המתמזגות בהדרגה לצבע אחיד. שינוי צבע זה הוא אינדיקטור ויזואלי מרכזי לחדירת צבע נאותה ותחילת ניקוי אופטי.
      זהירות: ודא שהתמיסה לא מתגבשת על אזור המריחה - התגבשות עלולה לחסום את מעברי העור, ולעכב את ספיגת מולקולות הצבע בעור, דבר חיוני ביותר להשגת שקיפות. ספיגה מספקת של מולקולות צבע הופכת את צבע העור לכתום-אדום.
    6. המשיכו לעסות את האזור בעדינות עד שהעור מתחיל להראות שקיפות והאיברים הפנימיים נראים לעין. תהליך זה לוקח בדרך כלל כ-3-5 דקות של עיסוי לאזור קטן, אך משך הזמן עשוי להשתנות בהתאם לגודל החיה ולעובי העור.
    7. צלם תמונות באמצעות המצלמה המיושרת. התאם את המיקוד, החשיפה ואיזון הלבן כדי לייעל את איכות התמונה.
    8. הנח בעדינות מגלשת זכוכית או כיסוי על העור כדי למזער את הברק ולהפחית את ההשתקפות לקבלת תמונות באיכות טובה יותר.
      זהירות: טפל בכל התמיסות הכימיות עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, כפפות והגנה על העיניים), והשליך חומרים משומשים בהתאם לפרוטוקולי פינוי הפסולת הכימית של המוסד.

4. הגדלת נראות האיברים באמצעות עיבוד תמונה

  1. שלבי עיבוד תמונה
    1. Python עם OpenCV משמש לעיבוד תמונה. ייבא OpenCV, numpy, matplotlib ו-PyWavelets.
    2. טען ונרמל את התמונה המקורית. טען את תמונת .tif המקורית בעומק סיביות גבוה. אם ערך פיקסלים כלשהו עולה על 255, נרמל את כל הפיקסלים לטווח [0, 255].
    3. חתוך את אזור העניין (ROI). הפעל את בורר ה-ROI של OpenCV כדי לצייר תיבה תוחמת סביב אזור העוגב. המשך רק באמצעות הגרסה החתוכה עבור כל השלבים הבאים.
      הערה: ודא שהתיבה התוחמת סוגרת היטב את אזור היעד מבלי לנתק מבנים רלוונטיים.
    4. פיצול לערוצי LAB. המירו את התמונה הצבעונית שנחתכה למרחב הצבעים LAB ופוצלו לערוצים L (בהירות), A ו-B.
      הערה: התמונות מעובדות בצבע, ולכן נעשה שימוש במרחב הצבעים של המעבדה עם טכניקות עיבוד תמונה שיושמו רק בערוץ L, שבו ממוקמות עוצמות הפיקסלים.
    5. נתח את התפלגות עוצמת הפיקסלים. התווה היסטוגרמה של ערוץ L כדי להעריך את הניגודיות והתפשטות העוצמה.
      הערה: השתמש בהיסטוגרמה כדי לוודא אם יש צורך בשיפור ניגודיות וכדי להנחות את בחירת הפרמטרים לשיפור הניגודיות. אתה רוצה שההיסטוגרמה שלך תהיה מפוזרת על פני [0, 255].
    6. החל CLAHE (השוואת היסטוגרמה אדפטיבית מוגבלת ניגודיות) לשיפור ניגודיות מקומית. צור אובייקט CLAHE עם clipLimit = 5.0 ו- tileGridSize = (16,16). הפעל את CLAHE בערוץ L ומזג את ערוץ L המשופר עם CLAHE עם ערוצי A ו-B המקוריים. המרת CLAHE מ-LAB ל-RGB להדמיה במידת הצורך.
      הערה: אם ההיסטוגרמה מציגה רעש מוגבר יתר על המידה (קוצים), התאם את 'clipLimit' או 'tileGridSize' והחל מחדש כדי להשיג ניגודיות מקומית מאוזנת.
    7. הפחת רעש מהתמונה המשופרת עם ניגודיות. בצע פירוק גל בדיד בן 2 רמות בערוץ CLAHE L מנורמל (בקנה מידה [0, 1]) עם סף רך של 0.1. שחזר את ערוץ L המנוטרל, קנה מידה בחזרה ל-[0, 255], ומזג את ערוץ L המנוטרל עם ערוצי A ו-B המקוריים. הציגו את התמונה הצבעונית המקורית שנחתכה לעומת התוצאה ללא רעש גלים.
      הערה: הפחתת רעשים של Wavelet מפחיתה תנודות קטנות שעלולות להתפרש באופן שגוי כחזית באזורים אחידים.
    8. פלח איברי עניין באמצעות הסף האדפטיבי של Otsu. חשב את הסף של אוטסו בערוץ L המנוטרל. הפחיתו הטיה של 15 מהסף כדי לכלול אזורי איברים בעצימות נמוכה.
      1. החל סף בינארי עם ערך ההטיה כדי לקבל מסיכה של פיקסלי האיבר. מזגו את המסיכה עם ערוצי A ו-B המקוריים והמירו ל-RGB לתצוגה.
        הערה: התאמת ההטיה מאלצת הכללה של אזורי איברים מתחת לכלים. כוונן מחדש את ההטיה במידת הצורך עבור מערך נתונים אחר.
    9. המשך לניתוח כרצונך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הדגמת שקיפות אופטית ברקמת חזה עוף ex vivo
כדי לחקור את התפשטות האור דרך רקמת ex vivo , השתמשנו בחתיכות חתוכות של חזה עוף גולמי ללא עצמות בעובי של 1.5 מ"מ, 2.5 מ"מ ו-3.5 מ"מ (איור 2B). הרקמות נחתכו במקביל לסיבי הקולגן, מה שמבטיח כיוון עקבי של סיבי השריר. התמונות צולמו באמצעות תבנית רשת רשת ולוגו "UT Dallas" מתחת לרקמה לפני ואחרי טיפול בריכוזי תמיסה שונים (איור 2B

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עבודה זו מציגה שיטת פרוטוקול מקיפה וניתנת לשחזור להשגת שקיפות אופטית ברקמות ביולוגיות תוך שימוש במולקולות סופגות, במיוחד צבע מאכל טרטרזין המאושר על ידי ה-FDA (מאושר לשימוש במוצרי מזון, לא ביישומים רפואיים). שיטה זו ממזערת ביעילות את הפיזור הפנימי ברקמה על ידי שינוי מקדם השבירה בתוך המיקרו-סביבה של הרקמה, מה שמשפר את השקיפות האופטית. מחקר זה הוכיח את יעילותה של שיטה זו הן באמצעות הדמיה ex vivo והן באמצעות הדמיה in vivo . לצורך הדמיה ex vivo נבדקה ההשפעה של ריכוז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

תודות

ZO מודה על תמיכתה של אוניברסיטת טקסס בדאלאס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
איזון אנליטיהאז"קFA220S
מכונת הרדמה לבעלי חייםRWD מדעי החייםטאיג'י-אייחומרי הרדמה באינהלציה
הזרקת אטיפמזול HCL 5 מ"ג/מ"לקוברטוס82124הרדמה בהזרקה
מצלמת CMOSמעבדות תורCS165CU/M, זלוקס
הזרקת Dexmedetomidine HCL 5 מ"ג/10 מ"לקוברטוס72960הרדמה בהזרקה
תאורת אור סיביםRWD מדעי החיים76301מקור אור לתאורה עליונה
מגלשות זכוכיתCravitySci0303-2122שקופיות מיקרוסקופ בדרגה סופר
שמיכה HomeothermicRWD מדעי החיים69027בקר טמפרטורת בעלי חיים
עיבוד תמונהOpenCVפיתוןתוכנה
מזרק אינסולין 0.5 מ"ל 29 גרםנקודת נוחות26028הרדמה בהזרקה
איזופלורןקוברטוסמק"ט 029405חומרי הרדמה באינהלציה
הזרקת קטמין HCL 100 מ"ג/מ"לדצ'רה20042240הרדמה בהזרקה
מקור אור LEDGGE corpTLB-01מקור אור לתאורה עליונה
עדשהמעבדות תורMVL4WAאורך מוקד של 3.5 מ"מ וצמצם f/1.4
נאירכנסייה & דווייטL 1224קרם להסרת שיער
PBS PH 7.4 (1x)ג'יבקו2902869הרדמה בהזרקה
Q-Tipחברת מוצרים רפואיים פוריטניתבית חולים 806-WC
SeaPlaque Agaroseלונזה50101כימי
טרטרזיןמיליפורסיגמאמספר CAS: 1934-21-0כימי
העברת פיפטהפישרברנד13-711-9AMMD
ספקטרופוטומטר UV-VIS-NIRשימדזוSolidSpec-3700iכלי
בקבוקוניםקורפאק242633
פיפטות נפחיותמחקר אפנדורף פלוס3123000063100-1000&מיקרו; L
מערכת טיהור מיםמדע Avidityסולו שכלי

מקורות

  1. Yun, S. H., Kwok, S. J. J. Light in diagnosis, therapy and surgery. Nat Biomed Eng. 1 (1), 0008(2017).
  2. Tuchin, V. V. Optical clearing of tissues and blood. , SPIE Publications. (2005).
  3. Ertürk, A. Deep 3D histology powered by tissue clearing, omics and AI. Nat Methods. 21 (7), 1153-1165 (2024).
  4. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  5. Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In vivo and ex vivo optical clearing methods for biological tissues: Review. Biomed Opt Express. 10 (10), 5251-5267 (2019).
  6. Genina, E. A. Tissue optical clearing: State of the art and prospects. Diagnostics. 12 (7), 1534(2022).
  7. Miller, D. A., et al. Enhanced penetration depth in optical coherence tomography and photoacoustic microscopy in vivo enabled by absorbing dye molecules. Optica. 12 (1), 24-30 (2025).
  8. Jia, C., et al. Tartrazine-enabled optical clearing for in vivo optical resolution photoacoustic microscopy. Biomed Opt Express. 16 (6), 2504-2515 (2025).
  9. Zuo, T., Tao, C., Liu, X. Absorbing molecules as optical clearing agents improve the resolution and sensitivity of photoacoustic microscopy. Opt Lett. 50 (7), 2282-2285 (2025).
  10. Narawane, A., et al. Optical clearing with Tartrazine enables deep transscleral imaging with optical coherence tomography. J Biomed Photonics Eng. 29 (12), 120501(2024).
  11. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21 (2), 61-79 (2020).
  12. Mai, H., et al. Whole-body cellular mapping in mouse using standard IgG antibodies. Nat Biotechnol. 42, 617-627 (2024).
  13. Ou, Z., et al. Achieving optical transparency in live animals with absorbing molecules. Science. 385 (6713), eadm6869(2024).
  14. Sai, T., Saba, M., Dufresne, E. R., Steiner, U., Wilts, B. D. Designing refractive index fluids using the Kramers-Kronig relations. Faraday Discuss. 223, 136-144 (2020).
  15. Yu, T., Zhu, D. Strongly absorbing molecules make tissue transparent: A new insight for understanding tissue optical clearing. Light Sci Appl. 14 (1), 10(2025).
  16. Drexler, W., et al. Optical coherence tomography: Technology and applications. Drexler, W., Fujimoto, J. G. , Springer International Publishing. Cham. 277-318 (2015).
  17. Wang, F., Zhou, C. Transparent mice': Deep-tissue live imaging using food dyes. Commun Biol. 7 (1), 1307(2024).
  18. Yu, H., Liu, J. -B., Ma, Y. -S., Fu, D. Transparent live mice offer more possibilities for biomedical research. Innov Med. 2 (4), 100098(2024).
  19. Shabbir, M. W., Biswas, S., Kajla, R., Nadella, S., Ou, Z. Designing refractive index fluids of food dye for light propagation through scattering media. MRS Commun. , (2025).
  20. Scheele, C. L. G. J., et al. Multiphoton intravital microscopy of rodents. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 89(2022).
  21. Schmidt, E. L., et al. Near-infrared II fluorescence imaging. Nat Rev Methods Primers. 4 (1), 23(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Ex Vivo

מאמרים קשורים