מאמר שיטה

טכניקת הזרקה תת-רשתית טרנססקלרלית זעיר פולשנית אופטימלית בעכבר

DOI:

10.3791/68631

⸱

25 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Duke University School of Medicine, 2Department of Cell Biology, Duke University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זריקות תת-רשתית הן טכניקה הכרחית לפיתוח פרה-קליני של טיפולים למחלות קולטני אור ו-RPE. אנו מתארים טכניקת הזרקה תת-רשתית טרנססקלרלית אופטימלית בעכברים המשפרת את שיעורי ההצלחה תוך ניתוחיים וממזערת נזק לרשתית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה המקובלת להעברת חומר לחלל התת-רשתית בעכבר כוללת ניקוב כפול של הרשתית העצבית, הגורם לנזק כירורגי נרחב. זה מוביל לשונות במדדי התוצאה הבאים של תפקוד הראייה, כגון הקלטות אלקטרורטינוגרמה (ERG) או מבחני ראייה התנהגותית, המבלבלים את הערכות היעילות של טיפולים ניסיוניים. כדי להתגבר על מחסומים אלה, ביצענו אופטימיזציה של טכניקת הזרקה תת-רשתית טרנססקלרלית זעיר פולשנית בעכברים. בטכניקה זו, ניגשים לפורניקס העליון באמצעות ספקולום עפעפיים חוט טונגסטן בהתאמה אישית לביצוע צמצם הלחמית וטנוטומיה. סקלרוטומיה מדויקת נעשית באמצעות סכין יהלום מבלי לחדור לרשתית, דרכה מוחדרת בזהירות מחט זכוכית דקה בזווית רדודה. המטען מועבר לחלל התת-רשתית באמצעות משאבת מיקרו-הזרקה. טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) משמשת להערכת הגודל והמיקום של הכתם התת-רשתית מיד לאחר ההזרקה. השווינו את התוצאות של טכניקה זו לשיטה הטרנס-רטינלית הקונבנציונלית המבוצעת באמצעות מזרק קפיצי עם טרשת מחט 33G. רישומי ERG הצביעו על שימור מצוין של תפקוד הרשתית בעכברים שהוזרקו דרך הזרקה, בהשוואה לזה של עכברי ביקורת שלא הוזרקו. לעומת זאת, נצפתה ירידה ניכרת באות ERG בקבוצות שהוזרקו באופן קונבנציונלי. לסיכום, ביצענו אופטימיזציה של טכניקה זעיר פולשנית להזרקה תת-רשתית בעכברים. אנו מדגימים כי טכניקה זו היא שיטה חזקה ויעילה למתן ריפוי גנטי הממזערת את הנזק האנטומי לרשתית ובעלת השפעה מינימלית על תפקוד הרשתית. שיטה זו מורידה את הסף לפיתוח טיפולים המכוונים הן לאפיתל הפיגמנטי ברשתית והן לקולטני אור לטיפול במגוון רחב של מחלות רשתית ומקולריה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הזרקה תת-רשתית היא הליך כירורגי עיני שבו מועבר חומר לחלל הפוטנציאלי בין הרשתית לאפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE). בהשוואה לשיטות אחרות להעברת תרופות למקטע האחורי, כגון זריקות תוך זגוגיות או סופרכורואידיות, זריקות תת-רשתית משיגות את הגישה המיידית ביותר הן לקולטני האור והן ל-RPE. להעברת חלקיקי טיפול גנטי ויראלי, הזרקה תת-רשתית משיגה שיעורים גבוהים בהרבה של התמרת קולטני אור ו-RPE, מה שמאפשר טיטרים נגיפיים נמוכים יותר והפחתת הסיכון לרעילות ויראלית1. בנוסף, החלל התת-רשתית מוגבל מבחינה אנטומית, מה שמגביל את ההתפשטות המערכתית של חלקיקים נגיפיים ומוריד את הסיכון לתגובות חיסוניות2. בבני אדם, פרופיל הבטיחות של הזרקות תת-רשתית חיובי מאוד, כאשר מבנה ותפקוד הרשתית מתאוששים לרמות הבסיס תוך חודש לאחר ההזרקה 3,4. הזרקות תת-רשתית משמשות במספר יישומים, כגון השתלת תאי גזע ואספקת תרופות במולקולות קטנות2, כאשר השימוש הנפוץ ביותר בהן הוא מתן וקטורים ויראליים לטיפולי ריפוי גנטי במחלות רשתית. הטיטר הנגיפי הנמוך יחסית, החשיפה המערכתית המינימלית והקצב והספציפיות הגבוהים של התמרה הקשורים להזרקות תת-רשתית הפכו אותם לטכניקה הכרחית בתחום הרשתית. זריקות תת-רשתית משמשות בהצלחה בחולים לטיפול בהפרעות תורשתיות ברשתית, כולל רטיניטיס פיגמנטוזה ואמאורוזיס מולדת של לבר 5,6.

בהתחשב בחשיבותה לתחום, היכולת לבצע הזרקות תת-רשתית בעכברים היא קריטית למחקרים פרה-קליניים החוקרים טיפולים למחלות רשתית תורשתיות. עם זאת, לשיטות הנוכחיות להזרקות תת-רשתית לעכברים יש שיעורי כישלון גבוהים ולעתים קרובות גורמות לנזק כירורגי לרשתית, מה שעלול להגביל את האמינות והעקביות של מדדי התוצאה התפקודית. באופן קונבנציונלי, הזרקות תת-רשתית במכרסמים מבוצעות דרך הרשתית, כך שהמחט חודרת לרשתית הקדמית, עוברת ליד העדשה ונכנסת לחלל התת-רשתית כתוצאה מחדירה שנייה של הרשתית 7,8 (איור 1A). למרות שהוא קל יחסית לביצוע, הליך זה מציג חוסר עקביות ניכר בתוצאות הניסוי בשל היקף הנזק הכירורגי המשתנה. זה מגביל במיוחד עבור מחקרים המשתמשים במדדי תוצאות ראייה התנהגותית ותפקודית. בנוסף, העדשה הגבישית גדולה באופן לא פרופורציונלי בעכברים בהשוואה לבני אדם; זה מגדיל משמעותית את הסיכון לנזק לעדשה במהלך הזרקה דרך הרשתית, מה שהופך את בעל החיים לבלתי שמיש להערכות ראייה תפקודיות4.

אפשרות חלופית היא מסלול ההזרקה הטרנססקלרלי, אשר נמנע מבעיות אלו על ידי גישה לחלל התת-רשתית בגישה אחורית, שבה המחט חודרת לסקלרה, לכורואיד, לממברנה של ברוך ול-RPE 4,9 (איור 1B). גישה זו ממזערת את הנזק לרשתית על ידי הימנעות מוחלטת מחדירת רשתית. זה קשור גם לריפלוקס מופחת של חומר מוזרק מהחלל התת-רשתית10, מה שמאפשר תוצאות עקביות יותר וקבוצות ניסוי קטנות יותר. למרות שהטכניקה להזרקה תת-רשתית טרנססקלרלית בעכברים תוארה בעבר בספרות, אימוץ נרחב שלה נותר מוגבל על ידי הקושי הטכני שלה, מה שעלול לעכב את שיעור ההצלחה4. כאן, אנו מתארים מספר שיפורים בהליך ההזרקה הטרנססקלרלית, המקלים על הביצוע ומהירים יותר, מפחיתים את השונות הניסיונית ומשפרים את שיעורי הצלחת ההזרקה. שיפורים אלה כוללים פיתוח ספקולום עפעפיים של עכבר, מתן טרום ניתוחי של אטרופין, יצירת סקלרוטומיה נקודתית באמצעות סכין יהלום, ואופטימיזציה של גודל המחט וגישת ההזרקה. טכניקה זו משיגה כיסוי טרנסדוקציה ויראלית מעולה של קולטני האור וה-RPE, מבלי לגרום לפגיעה כירורגית כלשהי הניתנת לזיהוי על ידי ERG.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בוצעו בהתאם לוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת דיוק והצהרת האגודה לחקר הראייה ורפואת העיניים לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה.

1. הכנת בעלי חיים

  1. יש לתת זריקה תוך-צפקית של 1 מ"ג/ק"ג אטרופין (בנפח כולל של 50 מיקרוליטר) 30 דקות לפני ביצוע ההזרקה התת-רשתית. שלב זה מגדיל מאוד את שיעורי ההצלחה על ידי מניעת רפלקסים אוקולו-לבביים ואוקולו-נשימתיים שעלולים להיות קטלניים המופעלים על ידי העלאת לחץ תוך עיני חולף במהלך ההזרקה11,12.
    הערה: מינון האטרופין שלנו מותאם לעכברי C57BL/6 וייתכן שיהיה צורך להתאים אותו לזני עכברים אחרים. לא ראינו הבדלי מין או גיל ניכרים במינון האטרופין.
  2. במהלך כל ההליך, שמור את העכבר על משטח חם כדי למקסם את נוחות בעלי החיים ולהפחית את התפתחות הקטרקט הקר.
  3. הרדמת עכבר באמצעות 2% איזופלורן בשאיפה בחמצן (2 ליטר לדקה) עד שנצפית שכיבה והחיה כבר לא מגיבה לצביטה בבהונות. מרחו טיפה של 0.5% פרופרקאין על העין להרדמה מקומית.
  4. מרחו טיפה מהתערובת של 0.2% ציקלופנטולאט ו-1% פנילפרין על העין כדי להרחיב את האישון להדמיה לאחר הניתוח של הכתם התת-רשתית על ידי OCT. פנילפרין משמש גם להפחתת דימום תוך ניתוחי על ידי כיווץ כלי דם שטחיים13.

2. סקלרוטומיה

  1. לפני תחילת ההליך, טען מיקרו-מחט זכוכית עם נפח התמיסה הרצוי להזרקה. חבר את המחט למיקרו-מזרק, כאשר לחץ הפיצוי מוגדר על 5 הקטופסקלים (hPa) כדי לנטרל את פעולת הנימים. בדרך כלל אנו משתמשים בנפחים של 1 מיקרוליטר להזרקות תת-רשתית.
  2. הנח את העכבר מתחת לסטריאומיקרוסקופ מנתח. השתמש בהגדלה של 20x עבור שלבים 2.3-2.6 ובהגדלה של 50x עבור שלבים 2.7-3.5.
  3. עבור עכברים צעירים, בצע קנתוטומיה רוחבית לפני ההליך, על מנת לספק גישה והדמיה נרחבת של אתר הניתוח.
  4. חשפו את הפורניקס העליון בעזרת ספקולום חוטים מיניאטורי בהתאמה אישית (איור 1C). יש לשתק את הספקולום כדי לאפשר נסיגה של העפעף העליון ללא ידיים.
  5. בעזרת מספריים זוויתיים של ואנאס, בצע חתך פרה-לימלימלי (~1 מ"מ אחורי הלימבוס) בלחמית העליונה ובקפסולה של טנון כדי לחשוף את 3-4 שעות השעון המעולות של הסקלרה. הקפד להימנע מניקוב הסינוס הוורידי הרטרו-אורביטלי. הסר את כל שאריות הקפסולה של טנון המכסה את אתר ההזרקה המיועד בזהירות אך ביסודיות.
  6. אחוז בקצה הקדמי של צרק הלחמית והטנטוטומיה בעזרת מלקחיים עם שיניים ננעלות ותחתן את הגלובוס בעדינות כדי לחשוף את הסקלרה העליונה. שתק את המלקחיים הנעולים כדי לאפשר אינפרודוקציה ללא ידיים.
  7. מרחו טיפה של מי מלח מאוזנים (BSS) מיד על העין כדי למנוע התייבשות של הסקלרה החשופה. אנו גם מוצאים שההגדלה האופטית המיוצרת על ידי טיפת ה-BSS מועילה.
  8. בעזרת סכין יהלום, בצע סקלרוטומיה מדויקת בשעה ~12 ו~1-2 מ"מ מהלימבוס. מקם את הלהב במישור משיקי ביחס לסקלרה כדי להבטיח שהסקלרוטומיה קטנה ורדודה ככל האפשר.
    הערה: זה נעשה משתי סיבות: (1) סקלרוטומיה קטנה מאפשרת התאמה הדוקה של מחט הזכוכית, ובכך מפחיתה ריפלוקס בשלב ההזרקה, ו-(2) כריתת טרשת רדודה היא קריטית כדי למנוע חדירה לרשתית. שימו לב שכמות קטנה של דם כורואידלי עשויה להופיע באתר הטרשת, מה שאינו מרמז על השלכות שליליות על תוצאות ההליך.

3. הזרקה תת-רשתית טרנססקלרלית

  1. כהכנה להזרקה, השתמש בספוג כירורגי כדי להסיר בעדינות את כל ה-BSS משטח העין.
  2. החזק את שיפוע המחט כלפי מטה בזווית רדודה לסקלרה והכנס את הקצה לאט ובזהירות לתוך הטרשת כדי לגשת לחלל התת-רשתית. על מנת להימנע מחדירה לרשתית, עשו זאת בזווית רדודה יחסית ועמוקה מספיק כדי לנקות את פתח הטרשת ב-0.5-1 מ"מ.
    הערה: שיפוע המחט ממוקם כלפי מטה על מנת למזער את האפשרות של לידה כורואידית ולהפחית את ההסתברות לנקב את הרשתית עם קצה המחט המתקדם.
  3. תוך כדי החזקת המחט במצב יציב, התחל הזרקה ב-500 hPa באמצעות דוושת רגל ושמור על לחץ ללא הפרעה למשך 15 שניות.
  4. לסיום ההזרקה, שמור על לחץ ההזרקה עד להסרת המחט לחלוטין מהסקלרוטומיה. אם הלחץ מופסק בטרם עת בזמן שהמחט עדיין בחלל התת-רשתית, חלק גדול מהמטען המוזרק יכול לצאת במהירות מהעין בחזרה למחט על ידי פעולה נימית.
  5. לאחר משיכת המחט, שימו לב לריפלוקס חלקי של התמיסה המוזרקת דרך אתר הטרשת. זה צפוי, בהתחשב בכך שנפח של 1 מיקרוליטר עולה על הקיבולת של החלל התת-רשתית אפילו בעכברים בוגרים. היעדר ריפלוקס עשוי להצביע על הזרקה כושלת עקב לידה כורואידית או תוך-זגוגית בשוגג.
  6. הסר את מלקחיים הנעילה ואת ספקולום העפעפיים מהעין. הקפד להימנע מהפעלת לחץ על הגלובוס, מכיוון שהוא עלול לגרום לריפלוקס נוסף של התמיסה המוזרקת.
  7. מיד לאחר ההזרקה, יש למרוח משחת עיניים בשפע על העין כדי לאפשר הדמיה של הגלם התת-רשתית עדה-14 באוקטובר.
  8. מרחו משחת אריתרומיצין מקומית על העין והעניקו טיפול כללי לאחר הניתוח לבעל החיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הזרקה מוצלחת בטכניקה טרנססקלרלית זו יוצרת בלב תת-רשתית שניתן להבחין בו ב-OCT מיד לאחר הליך ההזרקה (איור 2A). בהתחשב באתגר הטכני של טכניקה זו, שלב ההדמיה הוא הכרחי לזיהוי בעלי חיים שהוזרקו בהצלחה. לחוקרים שמתכננים להשתמש בטכניקה זו לניסויים בריפוי גנטי, אנו ממליצים לבצע זריקות תרגול עם חלקיקי נגיף הקשורים לאדנו-(AAV) הנושאים גן מדווח פלואורסצנטי. חלקיקי AAV המועברים באמצעות טכניקה זו משיגים שטח התמרה גדול מאוד של RPE (איור 2B), קולטני אור (אי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטכניקה המתוארת כאן מציגה מספר שיפורים בגישת ההזרקה הטרנססקלרלית שתוארה קודם לכן4, המשפרים את אמינות ההליך ומפחיתים עוד יותר את הנזק הניתוחי לעין. שיפור אחד כזה הוא השימוש בספקולום כדי למשוך את העפעף העליון, מה שמאפשר גישה יציבה, ללא מגבלות וללא ידיים לעין. ספקולות מסחריות לרוב אינן ממוטבות כראוי, אפילו עבור עכברים בוגרים, ואינן זמינות לחלוטין עבור צעירים. כדי להתגבר על מכשול זה, עיצבנו ספקולה בהתאמה אישית (איור 1C), שאותה אנו מייצרים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לג'ון פלאנרי (אוניברסיטת קליפורניה, ברקלי) על שסיפק לנו את וירוס AAV1-Best1-GFP. המימון שהתקבל: NIH R01 EY031748 (CBR), NIH P30 EY005722 (לאוניברסיטת דיוק); פרס AMD למשפחה בחינם של FFB (CBR); מענק בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון (מרכז העיניים דיוק); תוכנית האצת מחקר תרגומי של FFB TA-GT-0424-0875-DUKE-TRAP (VA), NIH K08 EY033857 (OA); פרס התחלה חזקה של רופא-מדען מאוניברסיטת דיוק (OA).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
הזרקת נתרן כלורי 0.9%, USPהוספירהPAA130066
1% תמיסת עיניים אטרופין סולפט, USPאקורןNDC 17478-215-05
30° סכין יהלוםצרפתK2-6560
AmScope 6W LED תאורת צוואר אווז כפולהAmScopeלד-11CR
מספריים זוויתיים של ואנאסרובוזRS-5618
תמיסת השקיה סטרילית BSSאלקון289010-0902
טיפות עיניים מרחיבות ציקלומידרילאלקון0065-0359-020.2% ציקלופנטולאט, 1% פנילפרין
epT.I.P.S. MicroloaderTM קצות פיפטהאפנדורף5242 956.003
מיקרו-מזרק FemtoJet 4iאפנדורףE5252000021מוצר שהופסק
משחת עיניים לסיכה GenTeal Tearsאלקון16027802
מחטי מיקרו-הזרקה מזכוכיתקלונברי סיינטיפיקB100-58-5030° שיפוע. קוטר: 50 ומיקרו; M חיצוני, 29 ומיקרו; M פנימי
תמיסת איזופלורןקובטרוס29405
מיקרוסקופ הדמיית רשתית MICRON IV עם OCT מונחה תמונהפניקסלא ישים
סטריאומיקרוסקופ SteREO Discovery.V8צייס495015-0001-000
שטרן-קסטרובייחו מלקחיים עם שיניים נעילהצרפתK5-2552
מלקחיים עם שינייםרובוזRS-5172
חוטי ניקוי טונגסטן למחטים מד 23 שניותהמילטון18306
Ultracell PVA Eye SpearsBVI רפואי40400-8
מזרקי אינסולין Ultra-Fine2015 ב.ד.3284383/10 מ"ל, 8 מ"מ (5/16 אינץ'), 31 גרם

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trapani, I., Banfi, S., Simonelli, F., Surace, E. M., Auricchio, A. Gene therapy of inherited retinal degenerations: prospects and challenges. Hum Gene Ther. 26, 193-200 (2015).
  2. Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Res. 58, 217-226 (2017).
  3. Simunovic, M. P., Xue, K., Jolly, J. K., MacLaren, R. E. Structural and Functional Recovery Following Limited Iatrogenic Macular Detachment for Retinal Gene Therapy. JAMA Ophthalmol. 135, 234-241 (2017).
  4. Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. J Vis Exp. (118), e54808(2016).
  5. Testa, F., et al. Three-year follow-up after unilateral subretinal delivery of adeno-associated virus in patients with Leber congenital Amaurosis type 2. Ophthalmology. 120, 1283-1291 (2013).
  6. Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Hum Genet. 135, 327-343 (2016).
  7. Bennett, J., Anand, V., Acland, G. M., Maguire, A. M. Cross-species comparison of in vivo reporter gene expression after recombinant adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Methods Enzymol. 316, 777-789 (2000).
  8. Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).
  9. Hejri, A., et al. A non-surgical method for subretinal delivery by trans-scleral microneedle injection. Bioeng Transl Med. 10 (3), e10755(2025).
  10. Sastry, A., et al. Microscope-Integrated OCT-Guided Volumetric Measurements of Subretinal Blebs Created by a Suprachoroidal Approach. Transl Vis Sci Technol. 10, 24(2021).
  11. Blanc, V. F., Jacob, J. L., Milot, J., Cyrenne, L. The oculorespiratory reflex revisited. Can J Anaesth. 35, 468-472 (1988).
  12. Dewar, K. M. The oculocardiac reflex. Proc R Soc Med. 69, 373-374 (1976).
  13. Katzung, B. G. Basic & clinical pharmacology. , 9th ed, Lange Medical Books/McGraw Hill. New York, USA. (2004).
  14. Mai, X., Huang, S., Chen, W., Ng, T. K., Chen, H. Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy. J Vis Exp. (179), e63421(2022).
  15. L'Abbate, D., Prescott, K., Geraghty, B., Kearns, V. R., Steel, D. H. W. Biomechanical considerations for optimising subretinal injections. Surv Ophthalmol. 69, 722-732 (2024).
  16. Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nat Protoc. 17, 1468-1485 (2022).
  17. Stockslager, M. A., et al. Optical method for automated measurement of glass micropipette tip geometry. Precis Eng. 46, 88-95 (2016).
  18. Li, Q., Rycaj, K., Chen, X., Tang, D. G. Cancer stem cells and cell size: A causal link. Semin Cancer Biol. 35, 191-199 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

OCTAAV

מאמרים קשורים