מאמר שיטה

הדגשת המעבר של ציטוכרום C מיטוכונדריאלי על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של העברה חיסונית

DOI:

10.3791/68633

⸱

15 באוגוסט 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Medical Department, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Critical Care Medicine, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan, 3Sichuan Scientist Biotechnology Co., Ltd, 4Department of Critical Care Medicine, Deyang Hospital Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 6Department of Critical Care Medicine, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מתאר שיטות לחקר שינויים מיקרומורפולוגיים בתאי עצב ומעבר של ציטוכרום מיטוכונדריאלי c על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של העברה חיסונית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינויים במיקום החלבון במיקרו-מבנה מציגים לרוב מנגנון ויסות מדויק ברמת האברונים הפתולוגיים. כיצד ללכוד במדויק את המיקום של העברת חלבון אברון זה יש משמעות וערך חיובי לאבחון וטיפול במחלות. מיטוכונדריה ממלאים תפקיד מרכזי בנמק ובמסלול הפנימי של אפופטוזיס. בתנאים רגילים, ציטוכרום c (Cyt c) קיים רק בין הממברנות הפנימיות והחיצוניות של המיטוכונדריה ובגרעין. כאשר תאים עוברים אפופטוזיס, חדירות הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה משתנה, ו-Cyt c משתחרר מהמיטוכונדריה לציטופלזמה. במחקר זה, נקבע מודל חולדה של פגיעה באיסכמיה מוחית-רפרפוזיה, והשינויים המיקרומורפולוגיים של נוירונים העוברים אפופטוזיס הוצגו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של העברה חיסונית. בנוסף, הוא מראה את החזון של העברת Cyt c לתיוג אימונוגולד מהמטריצה המיטוכונדריאלית לציטופלזמה לאחר פגיעה באיסכמיה מוחית-רפרפוזיה מדויקת יותר. טכניקת מיקרוסקופ האלקטרונים המוצגת בפרוטוקול זה מתאימה להדגמה של כל מעברי מיקום חלבון ברמה המיקרוסקופית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על פי מחקר נטל המחלה העולמי משנת 2021, שבץ מוחי היה סיבת המוות השלישית והרביעיתהמובילה לשנות חיים מותאמות לנכות. היו 11.9 מיליון אירועי שבץ חדשים, שבהם שבץ איסכמי היווה 65.3% (7.8 מיליון)1. מוות עצבי מתרחש לאחר איסכמיה מוחית, כולל נמק ואפופטוזיס. רקמת המוח שנפגעה בצורה החמורה ביותר עוברת לאחר מכן מוות של תאים נמקיים. נוירונים באזור הפנומברה האיסכמית או באזור האוטם עשויים לעבור אפופטוזיס לאחר מספר שעות או ימים2. בנוסף לתפקודים ביו-אנרגטיים ומטבוליים, המיטוכונדריה ממלאים גם תפקיד מרכזי במסלול הפנימי של אפופטוזיס 3,4,5,6.

Cyt C הוא חלבון המקודד על ידי גנים גרעיניים. בתנאים רגילים, Cyt C קיים רק בין הממברנות הפנימיות והחיצוניות של המיטוכונדריה ובגרעין. המסלול האפופטוטי המתווך על ידי שחרורו קשור לבקרה הרגולטורית של בני משפחת Bcl-2. לאחר גירוי על ידי אפופטוזיס, אוליגומרים של Bax/Bak נוצרים ומוחדרים לנקבוביות הממברנה החיצונית המיטוכונדריאלית, וכתוצאה מכך שינויים בלחץ האוסמוטי המיטוכונדריאלי ואובדן פוטנציאל טרנסממברני. Cyt C משתחרר מהמיטוכונדריה לציטופלזמה, שם הוא נקשר למפעיל של אפופטוזיס 1 כדי ליצור את הקומפלקס האפופטוטי ולהפעיל פרו-קספאז-9. בתורו, caspase-3 ו-caspase-7 מופעלים, מה שמתחיל את מפל Caspase וגורם לאפופטוזיסתאים 7.

מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה (TEM) יכול לראות בבירור את השינויים במבנה התא בשלבים שונים של אפופטוזיס. תצפית מורפולוגית במיקרוסקופ אלקטרונים היא שיטה אמינה לקביעת אפופטוזיס8. עם זאת, הוא אינו יכול להבחין בשינויים ב-Cyt C באולטרה-מבנה. ישנן מספר טכניקות לאיתור חלבונים ספציפיים באולטרה-מבנה: ציטומטריית זרימה, בדיקת אימונוסורבנט מקושר לאנזים, בדיקת אימונוסורבנט מקושר לאנזים, ספקטרופוטומטריה וכתמים מערביים. עם זאת, הם אינם יכולים ללכוד במדויק את שינויי המיקום של החלבון במיקרו-מבנה. לזהב קולואידי יש חלקיקים בגדלים שונים, וצפיפות האלקטרונים של זהב קולואידי גבוהה. טכנולוגיית Immunogold מתאימה במיוחד למחקרי לוקליזציה של מיקרוסקופיה אימונו-אלקטרונית. בשל צבעו האדום הבהיר עד כהה, זהב קולואידי ניתן גם לתצפית במיקרוסקופ אור. כאשר חלבונים ספציפיים מסומנים ב-Immunogold, ניתן להמחיש את שינויי המיקום באמצעות TEM ברזולוציה תת-תאית9.

פרוטוקול זה מתאר הדגשת המעבר של Cyt C המיטוכונדריאלי על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים להעברה חיסונית (IEM). המטרה הכוללת של שיטה זו היא לדמיין את הטרנסלוקציה התת-תאית של Cyt C במהלך אפופטוזיס המושרה על ידי איסכמיה באמצעות IEM. הרציונל של IEM הוא לתייג את Cyt C בזהב קולואידי ולהמחיש את שינויי הלוקליזציה שלו ברזולוציה תת-תאית באמצעות TEM9. IEM יכול לצפות בשינויים הדינמיים של חלבונים ברמה המרחבית, ומספק אמצעי רב עוצמה להסבר פעילויות פיזיולוגיות ופתולוגיות10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוכנית בעלי החיים אושרה על ידי הוועדה האתית של SLAS (גיליון IACUC מס': SYST-2024-018). כאן, 6 חולדות SD זכרות נטולות פתוגנים (200-220 גרם) גודלו בכלובי אוורור עצמאיים, תוך שמירה על סביבת המעבדה בטמפרטורה של 22-25 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 45%-65%. כל החולדות עברו הזנה אדפטיבית במשך שבוע עם מים ודיאטה בחינם במהלך התקופה.

1. הקמת מודל חסימת עורק המוח האמצעי (MCAO).

  1. חלקו את החולדות באופן אקראי לקבוצת MCAO ולקבוצת פעולת הדמה, עם שלוש חולדות בכל קבוצה. ראה איור 1 לתרשים הזרימה הניסיוני.
  2. ודא את הציוד המעורב בפרוטוקול זה בהתאם לרשימה באיור 2.
  3. כדי לבסס מודל של MCAO של פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה של חולדות, השתמש בהליך התפר התוך-לומינלי.
  4. צמו את החולדות במשך 12 שעות לפני הניתוח עם מים נגישים.
  5. להרדים חולדות SD עם 2% איזופלורן (ראה טבלת חומרים) בתערובת אוויר-חמצן ב-0.6 ליטר לדקה. אשר הרדמה נכונה על ידי חיתוך עור הגפיים במלקחיים; לחולדות לא צריכה להיות נסיגה או רפלקס רגליים. מהדקים את החולדות חסרות ההכרה לחלוטין על שולחן הניתוחים ושומרים על טמפרטורת הגוף על 37 מעלות צלזיוס באמצעות שומר טמפרטורה של בעלי חיים. הדביקו את עיניהם במהלך הניתוח כדי למנוע יובש.
  6. הסר את הפרווה סביב הצוואר בעזרת מכונת גילוח חשמלית וחטא את העור בבטדין. בצע חתך בקו האמצע של 1.5 ס"מ עם מספריים כירורגיות (ראה טבלת חומרים), בצע דיסקציה קהה על השריר והפאשיה הפרי-וסקולרית, וחשוף את קנה הנשימה כדי לאתר את עורק הצוואר המשותף הימני (CCA), עורק הצוואר החיצוני (ECA) ועורק הצוואר הפנימי (ICA). יש לעקר כלים כירורגיים כדי למנוע זיהום.
  7. קשרו את הקצה הדיסטלי של ה-ECA עם תפר כירורגי 6-0 והניחו תפר כירורגי נוסף באופן רופף סביב הקצה הפרוקסימלי של ה-ECA עד לנקודת ההתפצלות. הקפד לא לפגוע בעצב הנרתיק.
  8. הצמידו את ה-CCA וה-ICA עם קליפסים לכלי הדם ובצעו חתך קטן ב-ECA בין שני תפרים כירורגיים.
  9. הכנס את תפר המונופילמנט ללומן ה-ECA כלפי מטה לכיוון ה-CCA, הדק את התפר הניתוחי סביב גדם ה-ECA כדי לאבטח את התפר התוך-לומינלי ולמנוע דימום. ודא שתפר המונופילמנט תואם את משקל החיה כדי למזער נזק ולהשיג נפח אוטם מטרה של 40% בחצי הכדור המקביל.
  10. חותכים את החלק הנותר של ה-ECA כדי לשחרר את הגדם ולמקם את גדם ה-ECA מתחת לנקודת ההסתעפות כך שהוא יהיה בערך בקו אחד עם ה-ICA.
  11. הסר את הקליפ המיקרו-וסקולרי מה-ICA, המשך לקדם את התפר עד שמורגשת התנגדות קלה, המעידה על חסימה של עורק המוח האמצעי; אורך זה הוא בדרך כלל בסביבות 2 ס"מ. קושרים את התפר סביב המונופילמנט בחוזקה. הסר את הקליפ המיקרו-וסקולרי השני מה-CCA.
  12. סגור את החתך בתפר כירורגי והכניס את החולדה לכלוב התאוששות, טפל בבעל החיים עד שעתיים לאחר איסכמיה.

2. שיקום זרימת הדם בעורק המוח האמצעי

  1. לפני הרדמה חוזרת, בדוק את הציון העצבי עם סולם ציון לונגה כדי להעריך את הצלחת הניתוח כמתואר בשלב 3.
  2. הרדמו את החולדה כאמור לעיל ופתחו מחדש את החתך. הנח קליפס מיקרו-וסקולרי על ה-CCA, משוך את התפר החוסם בחלק מה-ICA עד שקצה התפר נראה דרך ה-ICA.
  3. הניחו קליפס מיקרו נוסף על ה-ICA מעל מיקום התפר התוך-לומינלי, הסירו לחלוטין את התפר החוסם וקשרו את גדם ה-ECA. Reperfusion למשך 24 שעות.
  4. הסר את הקליפים מה-CCA וה-ICA. סגור את החתך בתפר כירורגי. יש לתת בופרנורפין (0.05 מ"ג/ק"ג; ראה טבלת חומרים) תת עורית.
  5. החזירו את החולדה לכלוב, ספקו מים ומזון מעוך, והקפידו עד שתחזור להכרה. שמור על טמפרטורת הגוף של החולדות על 37± 0.5 מעלות צלזיוס במהלך כל הליך הניסוי.

3. הערכת נוירו-ציון

  1. ציון ליקויים נוירולוגיים לאחר הניתוח ו-24 שעות לאחר הרפרפוזיה באמצעות סולם ציון לונגה11: (0) ללא גירעון; (1) אי הארכת כף היד הקדמית השמאלית (המשותקת) במלואה; (2) סיבוב שמאלה (צד משותק); (3) נפילה שמאלה (צד משותק); (4) ללא הליכה ספונטנית וירידה בהכרה; (5) מתים.
    הערה: שלושה מפעילים הוערכו על פי התקנים לעיל.

4. איסוף רקמות מוח

  1. אסוף רקמות מוח 24 שעות לאחר רפרפוזיה לאחר ניקוד והערכה של ליקויים נוירולוגיים.
  2. להרדים את החולדה כמתואר לעיל. חותכים את העור כדי לחשוף את הראש והצוואר וחותכים את חוט הרחם מעמוד השדרה הצווארי בעזרת מספריים כירורגיים (ראה טבלת חומרים).
  3. הפרד והסר את שרירי הצוואר האחוריים. הסר בזהירות את הגולגולת בעזרת מלקחיים מעוקלים (ראה טבלת חומרים). שימו לב לדורה בעת הפרדת הגולגולת כדי להימנע מגירוד רקמות המוח. הסר את רקמות המוח לחלוטין.
  4. הנח את רקמות המוח בקיבוע TEM ו-IEM מקורר מראש ב-4 מעלות צלזיוס, ואחסן במקרר ב-4 מעלות צלזיוס.

5. מבצע מזויף

  1. עבור פעולות דמה, בצע את כל ההליכים כאמור לעיל למעט שהחסימה לא נעשתה.

6. הכנה והדמיה של חתך דק במיוחד

  1. הכנת חתך אולטרה-דק של TEM
    1. קיבוע: קבע את אתר הדגימה של רקמה טרייה כדי למזער נזק מכני כגון מתיחה, חבלה ושחול, וודא שעובי הרקמה לא יעלה על 2 מ"מ. ודא שנפח הרקמה אינו עולה על 1 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ"מ.
    2. יש לקבע עם קיבוע TEM בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. שטפו 3 פעמים למשך 15 דקות כל אחד במאגר פוספט 0.1 M PB (pH 7.4; ראה טבלת חומרים).
    3. לאחר קיבוע: הוסף 1% חומצה אוסמית·0.1 M PB (ראה טבלת חומרים) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס).
    4. התייבשות: ייבשו את הרקמה ברצף ב-30% אתנול למשך 10 דקות, 50% אתנול למשך 10 דקות, 70% אתנול למשך 15 דקות, 90% אתנול למשך 15 דקות, אתנול מוחלט למשך 15 דקות ו-100% אצטון למשך 15 דקות.
    5. טבילת חניכיים: טבילה ברציפות של רקמות בתמיסה שרף אפוקסי SPI-Pon 812: אצטון = 1:3 למשך 30 דקות, תמיסה SPI-Pon 812: אצטון = 1:1 למשך 30 דקות, ותמיסה SPI-Pon 812: אצטון = 3:1 למשך שעה (ראה טבלת חומרים).
    6. פילמור והטמעה: טבלו את הדגימה ב-SPI-Pon 812 טהור למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס, החליפו ל-SPI-Pon 812 טרי למשך 8 שעות, ופלמרו ב-60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות (ראה טבלת חומרים).
    7. חתך: פורסים את הבלוק המוטבע דק למחצה בעובי של 0.8 מיקרומטר בעזרת סכין יהלום, מכתימים בכחול אמינוטולואן ב-25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. אתר ובחר אזורים עם נוירונים צפופים עם מיקרוסקופ אור לתצפית בהגדלה גבוהה. צור חלקים דקים במיוחד עם מיקרוטום בעובי 90 ננומטר. שים את הדגימות על רשתות נחושת מצופות פורמבר 200 רשת (ראה טבלת חומרים).
    8. לאחר צביעה: מכתימים רשתות באורניל אצטט ב-25 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן מכתימים רשתות בציטראט עופרת ב-25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  2. הכנת מקטע אולטרה-דק של IEM
    1. בצע את שלב 6.1.1-6.1.4.
    2. טבילת חניכיים: טבלו רקמות ברציפות בתמיסה L. R. שרף לבן: אתנול = 1: 3 למשך שעתיים, תמיסה L. R. שרף לבן: אתנול = 1: 1 למשך שעתיים, ותמיסה L. R. שרף לבן: אתנול = 3: 1 למשך 2 שעות.
    3. פילמור והטמעה: טבלו את הדגימה בשרף לבן טהור למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס, החליפו לשרף לבן טרי למשך 4 שעות ב-25 מעלות צלזיוס ופלמרו ב-55 מעלות צלזיוס למשך 78 שעות.
    4. חתך (כפי שנעשה בשלב 6.1.7): פורסים את הבלוקים המוטבעים דק למחצה בעובי של 0.8 מיקרומטר, מכתימים בכחול אמינוטולואן ב-25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. צור חתכים דקים במיוחד בעובי 90 ננומטר. שים את הדגימות על רשתות נחושת.

7. תיוג Immunogold

  1. שטפו פעמיים עם PBS ו-1x עם מאגר גליצין ב-25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן הוסיפו 2% מאגר פוספט של אלבומין בסרום בקר (PBS-BSA) ודגרו למשך 30 דקות.
  2. דגירה בתמיסת הנוגדן הראשוני (נוגדן רב-שבטי של ארנב לציטוכרום C) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. הנוגדן העיקרי מדולל ב-PBS-BSA ביחס של 1:50.
  3. יש לשטוף עם PBS בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 5 פעמים למשך 5 דקות כל אחד. דגירה בתמיסת נוגדן משני קולואידית עם תווית זהב (IgG נגד ארנב עז מצומד זהב) בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך שעה. הנוגדן המשני מדולל ב-PBS-BSA ביחס של 1:20 (ראה טבלת חומרים).
  4. יש לשטוף עם PBS בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 5 פעמים למשך 5 דקות כל אחד. יש לשטוף במים מזוקקים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 5 פעמים למשך 5 דקות כל אחד (ראה טבלת חומרים).
  5. לאחר צביעה: מכתימים רשתות באורניל אצטט ב-25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן מכתימים רשתות בציטראט עופרת ב-25 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות (ראה טבלת חומרים).
  6. צלם את החלק האולטרה-דק וצלם במיקרוסקופ אלקטרונים שידור ב-80 קילו וולט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכת הציון העצבי מאשרת את ההצלחה של MCAO, על פי סולם ציון לונגה, חולדות בקבוצת MCAO הציגו לפחות סיבוב שמאלה (ציון עצבי 2). חולדות מקבוצת ניתוח הדמה לא הראו תפקוד נוירולוגי ברור (ציון נוירולוגי 0). לא נצפתה תמותה במהלך יום הניתוח. הציון העצבי של החיות מפורט בטבלה 1.

ניתוח IEM של קבוצת MCAO חשף נוירונים עם גרעינים מכווצים וצפיפות אלקטרונים ציטופלזמית מוגברת, מלווים בהפרעה מבנית מיטוכונדריאלית חלקית. באופן קריטי, ה-Cyt c המסומן על ידי אימונוגולד הציג התפלגות מחדש ניכרת: בהשוואה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה העיקרית של טיפול רפרפוזיה בשבץ איסכמי חריף היא להחזיר את זלוף הדם לאזור האיסכמי. כעת אנו יכולים להשיג מטרה זו באמצעות פקקת תוך ורידית, טיפול אנדווסקולרי וטיפול אנטי-טרומבוטי. עם זאת, שיקום זלוף הדם מוביל לפגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה, מחמיר נמק עצבי ואפופטוזיס, מה שמוביל לפגיעה נוירולוגית. במהלך איסכמיה-רפרפוזיה, דליפה חריגה של אלקטרונים משרשרת הובלת האלקטרונים המיטוכונדריאלית מובילה לייצור כמות גדולה של מיני חמצן תגובתי מיטוכונדריאליים, הפוגעים בקרום המיטוכונדריאלי ומשחררים Cyt c ו-DNA...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט המחקר המדעי המיוחד על רפואה סינית מסורתית של מינהל מחוז סצ'ואן לרפואה סינית מסורתית (2021MS414).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.9% מי מלח רגיליםסצ'ואן קלון פרמצבטיקה ושות', בע"מ
200 רשתות נחושת מצופות Mesh formvarZhongjingkeyi Technology Co., Ltd.BZ10262a
220-230 גרם MCAO מונופילמנטיםבייג'ינג Cinontech ושות', בע"מA4-243250
אתנול מוחלטצ'נגדו  קלונג  כימיקלים ושות', בע"מ
אצטוןצ'נגדו  קלונג  כימיקלים ושות', בע"מ
2023120501 מערכת הרדמה לבעלי חייםRayward Life Technology Co., Ltd.R500
שומר טמפרטורת בעלי חייםRayward Life Technology Co., Ltd.69020
שולחן אפייהשנזן Bangqi Chuangyuan טכנולוגיה ושות', בע"מCT-946
גזירת עצםFine Science Tools16102-11
תבניות הטמעה קפסולהZhongjingkeyi Technology Co., Ltd.GP130-B
SCILOGEXD3024R
מיקרוסקופיה אופטית קונבנציונלית בשדה בהירZeiss (גרמניה)Primo Star
מלקחיים עיניים מעוקלים (10 ס"מ)Shanghai Medical Equipment Co., Ltd.
סכין יהלוםדיאטום (שוויץ)DU4530
מלקחיים לניתוחRayward Life Technology Co., Ltd.F12018-10
ניתוח מלקחייםRayward Life Technology Co., Ltd.F12010-10
תנור ייבוש פיצוץ חשמלישנחאי YiHENG Scientific Instrument Co., Ltd.DHG-9030A
Yiwu Kemei Electric Appliances Co., Ltd.KM-PG5002
נוזל קיבועסצ'ואן מדען ביוטכנולוגיה ושות', בע"מSC0001
מגלשת זכוכיתNantong Mevid מדעי החיים ושות', בע"מ
זהב מצומד עז אנטי ארנב lgGסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ
מלקחיים המוסטטיים (12.5 ס"מ)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL068
מלקחיים המוסטטיים (14 ס"מ)Anqisheng Biotechnology Co., Ltd.PL002
איזופלורןרייוורד לייף טכנולוגיה ושות', בע"מ
L. R. שרף לבןטיאנג'ין Tainuo מדע וטכנולוגיה ושות', בע"מ
ציטראט עופרתSPI (ארה"ב)GA10701
מחזיק מחט ג'יאצ'י טכנולוגיה רפואית ושות', בע"מ
אוסמיום טטרוקסידטד פלה (ארה"ב)4008-220501
PBSServicebioG4202
נוגדן פוליקלונלי ארנב לציטוכרום c   Affinity Biosciences, Ltd.AF0146
חולדותבייג'ינג Huafukang ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ
110322241102187881 SPI-Pon 812 ערכת שרף הטמעהSPI (ארה"ב)GS02660
סטריאומיקרוסקופסאני אופטי טכנולוגיה ושות', בע"מSoptop SZMN
מספריים עם ראש ישר (10 ס"מ)Anqisheng ביוטכנולוגיה ושות', בע"מPL063
מלקחיים עיניים ישרים (10 ס"מ)שנחאי ציוד רפואי ושות', בע"מ
מספריים כירורגייםRayward Life Technology Co., Ltd.S14001-10
מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכיםהיטאצ'י (יפן), בע"מHT7800
אולטרה-מיקרוטוםLeica (גרמניה)UC7
אורניום אצטטSPI (ארה"ב)GS02624
H200834002023101201צנטריפוגה 211001מכונת גילוח חשמלית 220518001D1110942024071201AGR1281A10044036898028211001

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBD 2021 Nervous System Disorders Collaborators. Global, regional, and national burden of disorders affecting the nervous system, 1990-2021: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. Lancet Neurol. 23 (4), 344-381 (2024).
  2. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (3), 231-341 (2008).
  3. Li, G. R., et al. Albiflorin: a promising natural monoterpene glycoside with potential therapeutic benefits for multiple physiological systems. Food Med Homol. , (2025).
  4. Ye, X. S., et al. The food and medicine homologous Chinese Medicine from Leguminosae species: A comprehensive review on bioactive constituents with neuroprotective effects on nervous system. Food Med Homol. 2 (2), 9420033(2025).
  5. Mubeen, M., Sakarwala, A. S., Bijarani, A. I., Kamal, M. T. Enhancing heart health: expanding the use of SGLT2 inhibitors in cardiovascular disease. Med Adv. 3 (2), 122-126 (2025).
  6. Zhang, Y. C., et al. Comprehensive analyses of nuclear mitochondria-related genes in the molecular features, immune infiltration, and drug sensitivity of clear cell renal cell carcinoma. Med Adv. 2 (3), 238-253 (2024).
  7. Broughton, B. R., Reutens, D. C., Sobey, C. G. Apoptotic mechanisms after cerebral ischemia. Stroke. 40 (5), e331-e339 (2009).
  8. Guo, M. J., Lu, B., Gan, J. L., Wang, S. C., Jiang, X. J., Li, H. H. Apoptosis detection: a purpose-dependent approach selection. Cell cycle. 20 (11), 1033-1040 (2021).
  9. Squarzoni, S. Immunoelectron Microscopy Methods. Methods Mol Biol. 2655, 201-210 (2023).
  10. Liu, Y., Ohgaki, R., Okanishi, H., Xu, M., Kanai, Y. Amino acid transporter LAT1 is expressed on cancer cell-derived exosomes with potential as a diagnostic and prognostic biomarker. Sci Rep. 14 (1), 28458(2024).
  11. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  12. Sanderson, T. H., Reynolds, C. A., Kumar, R., Przyklenk, K., Hüttemann, M. Molecular mechanisms of ischemia-reperfusion injury in brain: pivotal role of the mitochondrial membrane potential in reactive oxygen species generation. Mol Neurobiol. 47 (1), 9-23 (2013).
  13. Lesnefsky, E. J., Chen, Q., Tandler, B., Hoppel, C. L. Mitochondrial Dysfunction and Myocardial Ischemia-Reperfusion: Implications for Novel Therapies. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 57, 535-565 (2017).
  14. Hetz, C., et al. channel inhibitors prevent mitochondrion-mediated apoptosis and protect neurons in a model of global brain ischemia. J Biol Chem. 280 (52), 42960-42970 (2005).
  15. Sanderson, T. H., Kumar, R., Sullivan, J. M., Krause, G. S. Insulin blocks cytochrome c release in the reperfused brain through PI3-K signaling and by promoting Bax/Bcl-XL binding. J Neurochem. 106 (3), 1248-1258 (2008).
  16. Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold labelling for scanning electron microscopy. Methods Mol Biol. 657, 297-313 (2010).
  17. Sachse, M., de Castro, I. F., Fournier, G., Naffakh, N., Risco, C. Metal-Tagging Transmission Electron Microscopy and Immunogold Labeling on Tokuyasu Cryosections to Image Influenza A Virus Ribonucleoprotein Transport and Packaging. Methods Mol Biol. 1836, 281-301 (2018).
  18. Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P. Immunogold cytochemistry in neuroscience. Nat Neurosci. 16 (7), 798-804 (2013).
  19. Veeramachaneni, R., Gu, X., Herrera, G. A. Atypical amyloidosis: diagnostic challenges and the role of immunoelectron microscopy in diagnosis. Ultrastruct Pathol. 28 (2), 75-82 (2004).
  20. Fossmark, R., et al. Ultrastructure and chromogranin A immunogold labelling of ECL cell carcinoids. APMIS. 113 (7-8), 506-512 (2005).
  21. Page, L. J., et al. Secretion of amyloidogenic gelsolin progressively compromises protein homeostasis leading to the intracellular aggregation of proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (27), 11125-11130 (2009).
  22. Vainer, B., Sørensen, S., Nielsen, O. H., Horn, T. Subcellular localization of intercellular adhesion molecule-1 in colonic mucosa in ulcerative colitis. Ultrastruct Pathol. 26 (2), 113-121 (2002).
  23. Cheng, X. T., et al. Revisiting LAMP1 as a marker for degradative autophagy-lysosomal organelles in the nervous system. Autophagy. 14 (8), 1472-1474 (2018).
  24. Karreman, M. A., van Donselaar, E. G., Gerritsen, H. C., Verrips, C. T., Verkleij, A. J. VIS2FIX: a high-speed fixation method for immuno-electron microscopy. Traffic. 12 (7), 806-814 (2011).
  25. Wang, X. B., et al. Mechanistic Insights into salidroside's mitochondrial protection via AMPK/Sirt1/HIF-1α pathway in hypoxic HT22 Cells. J Vis Exp. (218), e66923(2025).
  26. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  27. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

C
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים