Method Article

מיקרוסקופיה רב-הרמונית אוטופלואורסצנטית בו-זמנית ללא תוויות

DOI:

10.3791/68637

⸱

August 29th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Bioengineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 4NIH/NIBIB Center for Label-free Imaging and Multiscale Biophotonics, University of Illinois Urbana-Champaign

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג מדריך שלב אחר שלב לטכניקה המיקרוסקופית של אוטופלואורסצנציה רב-הרמונית (SLAM) סימולטנית, כולל פרטים כיצד ליצור את מקור אור הלייזר, להכין דגימת רקמה, לבצע הדמיה ולנתח את הנתונים. SLAM מקדם מיקרוסקופיה לא ליניארית על ידי מדידת ארבעה ניגודים משלימים ללא תוויות כדי לחקור את המיקרו-סביבה של הרקמה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיה אופטית לא ליניארית מצלמת דגימות ביולוגיות על ידי זיהוי אותות מהאינטראקציה הלא ליניארית של פולסי לייזר קצרים במיוחד עם מולקולות אנדוגניות. שיטה זו מאפשרת זיהוי כימי ומבני מהיר ברזולוציה תת-תאית ללא תווית או תג ולא הרסני, ובכך מאפשרת גישה רבת עוצמה לחקירת תאים ורקמות. ניגודים לא ליניאריים מובהקים אלה כוללים אוטופלואורסצנציה מעוררת רב-פוטונים ויצירת הרמוניה. מכיוון שכל אחד מהניגודים הללו מציע יתרונות ומגבלות ייחודיים, השילוב שלהם והרישום המשותף המרחבי-זמני שלהם מספקים פלטת ניגודיות משלימה המשפרת את היכולות האנליטיות של מיקרוסקופיה אופטית לא ליניארית. לכן, הקבוצה שלנו פיתחה מיקרוסקופיה אוטופלואורסצנטית מולטי-הרמונית (SLAM) סימולטנית, טכניקת הדמיה המודדת ארבעה או יותר אותות אופטיים לא ליניאריים הנוצרים בו זמנית, במטרה לזהות מאפיינים מורפולוגיים, מטבוליים ופונקציונליים מובהקים בדגימות ביולוגיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיית SLAM של רקמות, תוך התמקדות במרכיבים חיוניים של הטכניקה, כולל מקור הלייזר, דחיסת דופק ומיקרוסקופ. בנוסף, אנו דנים בהכנת הדגימה ומתארים את צינור עיבוד הנתונים עבור נתוני SLAM. זרימת העבודה המוצגת מתאימה לחקירת המצב המטבולי, הסידור, התגובות התאיות וההרכב של רקמות אנושיות ובעלי חיים כאחד מבלי להסתמך על תוויות אקסוגניות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיה אופטית לא ליניארית ממנפת את התגובה של דגימה לקרינה אופטית אינטנסיבית (אור עם שדות חשמליים גדולים מ-3 ×10 3 וולט/ס"מ) כדי להפיק ניגודיות תמונה, כאשר הקיטוב המושרה (ובכך האות שנוצר) תלוי באופן לא ליניארי בעוצמת האירוע 1,2,3. מכיוון שהניגודים המרובים הללו מתווכים כל אחד על ידי אינטראקציות אור-חומר שונות, מיקרוסקופיה לא ליניארית מספקת גישה בו זמנית למידע ייחודי הן לגבי המורפולוגיה והן לגבי הנוף הכימי של דגימה 1,2,3. בעוד שטכניקות מיקרוסקופיה מסורתיות הכוללות אינטראקציה ליניארית עם אור התאורה מאפשרות גם הדמיה כמותית, מיקרוסקופיה לא ליניארית מאפשרת גישה רב-מודאלית יותר, לעתים קרובות בעלת עומק הדמיה וחתך אופטי משופרים, תוך גרימת פחות נזק פוטו לדגימה4. בהקשר של יישומים ביו-רפואיים, כגון הערכה דמוית היסטולוגיה תוך ניתוחית של רקמות 5,6, טכניקה זו מאפשרת בדיקה ישירה של ביומולקולות מקומיות, מה שמקל על חקירות חלקות של תאים חיים ללא צורך בסמנים או שינויים חיצוניים. גישה זו נמנעת משימוש בתגים, תוויות7, מולקולות אקסוגניות, חלבונים פלואורסצנטיים המתבטאים גנטית או ננו-חלקיקים, אשר לא רק דורשים עבודה רבה אלא גם בעלי פוטנציאל לשבש את הביוכימיה הטבעית של הדגימה ולהשפיע לרעה על תאי מטרה או רקמות 8,9,10. לפיכך, המיקרוסקופ הלא ליניארי משמש ככלי אנליטי רב עוצמה ואמיתי המספק הדמיה רציפה של מבנים מיקרוסקופיים מבלי לשנות את השלמות הכימית והמבנית של הדגימה. יכולת זו פותחת מגוון רחב של יישומים, החל מאבחון וגילוי תרופות ועד איתות תאים וביולוגיה של מערכות.

ניגודים רב-פוטונים כגון אוטופלואורסצנציה דו-פוטונית (2PAF), אוטופלואורסצנציה תלת-פוטונית (3PAF), דור הרמוני שני (SHG) ודור הרמוני שלישי (THG) מעניקים כל אחד יתרונות אנליטיים באפיון דגימות. 2PAF נוצר על ידי פלבינים אנדוגניים, כאשר פלבין אדנוזין דינוקלאוטיד (FAD) הוא הנפוץ ביותר במערכות ביולוגיות11. 3PAF ממנף עירור קרוב לאינפרא אדום כדי להמחיש כרומופורים פנימיים כגון NAD(P)H ומאפשר הדמיה מטבולית תוך עקיפת בעיות פוטוטוקסיות והנחתה הקשורות ל-UV12. SHG חושף באופן ספציפי מבנים מולקולריים לא צנטרו-סימטריים כגון קולגן סיבי (סוגים I, II ו-III) ומערכי חלבונים 13,14,15,16,17, ומספק תובנות מבניות 1. לבסוף, THG, הרגיש לממשקים ולתכונות מבניות קטנות, מצטיין בהדמיית התפלגויות שומנים ושלפוחיות חוץ-תאיות 18,19,20,21,22.

כל אחד מאותות הניגוד הללו נחקר באופן עצמאי על ידי קבוצות מחקר, וביסס את הנישה למיקרוסקופיה לא ליניארית מרובת פוטונים ככלי אמין ורב-תכליתי ליישומים ביולוגיים 23,24,25,26. מאמצים אלה הובילו ממציאי מיקרוסקופ 2PAF, שרתמו את הטכנולוגיה החדשנית שלהם כדי להגיע לתובנות חדשות לגבי מורפולוגיה של רקמות, חילוף חומרים של תאים, ואפילו המאפיינים המורפו-פונקציונליים של פתולוגיות כמו מחלת אלצהיימר וסרטן23. עבודתם הניעה בסופו של דבר יישומים פורצי דרך במדעי המוח27,28. בשנים שלאחר מכן, מספר חוקרים הדגישו את רגישות ה-SHG לשינויים במטריצה החוץ-תאית, הפיגום המספק תמיכה מבנית לתאים ואשר עובר שינויים משמעותיים במהלך פתוגנזה של סרטן29. יש לציין כי Campagnola et al.14,24,30,31 הראו כי מיקרוסקופ SHG מאפשר הדמיה של מכלולים מקרומולקולריים וסופרמולקולריים, וחושף פרטים כגון סידור, ריכוז וסוג הקולגן שאינם ניתנים לזיהוי בטכניקות קונבנציונליות מבוססות פלואורסצנטיות. תוצאות אלו הדגישו את הפוטנציאל של מיקרוסקופיית SHG ככלי אבחון בר-קיימא במסגרות קליניות. לבסוף, מיקרוסקופ THG יושם בהצלחה כדי להמחיש שכבות רשתית במכרסמים ברזולוציה תת-תאית25, למפות מבני מוח32 וללכוד את הטופוגרפיה הרב-פנים של פלישת תאי מלנומה33.

יישומים היסטוריים אלה של מיקרוסקופיה לא ליניארית כללו בדרך כלל לייזר פמטו-שנייה נעול מצב (fs) המחובר למטרה של צמצם מספרי גבוה (NA) כדי ליצור ולאסוף את האותות הלא ליניאריים, אשר כוונו לאחר מכן עם מראה דיכרואית למסנן פס פס ונאספו עם שפופרת מכפיל פוטו (PMT)34. למרות יישומים דומים, רוב היישומים התמקדו ברכישת ניגוד אחד בלבד, או לכל היותר, שני ניגודים, תוך התעלמות מהאחרים. כדי לממש את מלוא הפוטנציאל של המיקרוסקופ הרב-פוטוני, Boppart et al. יישמו לראשונה את הרכישה הרציפה של ניגודים לא ליניאריים מרובים 21,35,36,37, ואחריהם את גילויים בו זמנית 4,22,38,39,40,41. הטכניקה המתקבלת, המכונה מיקרוסקופיה אוטופלואורסצנטית מולטי-הרמונית (SLAM) ללא תווית סימולטנית, רושמת מרחבית וזמנית את האותות הלא ליניאריים 2PAF, 3PAF, SHG ו-THG באמצעות עירור וזיהוי מולטיפלקס, ובכך משיגה כוח אנליטי מעולה. הלוקליזציה המרחבית-זמנית של ארבעת הערוצים הללו מספקת נתונים מדורגים ועשירים בתכונות42 המציעים יתרונות על פני נתונים שנרכשו ברצף על ידי ביטול חפצי תנועה והבטחת רישום תמונה משופר. כתוצאה מכך, SLAM מאפשר יצירת תכונות מרוכבות, כגון יחסי הפחתה-חמצון אופטיים, המאפיינים ביעילות תכונות מטבוליות 43,44,45. יתר על כן, הניתוח המשולב של אותות בין אופנים מקל על הנדסת תכונות נוספות המבוססות על מתאם ולוקליזציה של ערוצים. לדוגמה, Shi et al. הדגימו את החשיבות של תכונות הקולוקליזציה של מיקרוסקופ SLAM בסיווג מדויק של תאי שחלת אוגר סינית (CHO) המשמשים בייצור תרופות42. בדרך זו, SLAM מניח את היסודות למה שנחשב כיום למתקדם ביותר במיקרוסקופיה מרובת פוטונים, וסולל את הדרך להתקדמות עתידית בתחום46.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את מרכיבי המפתח של מיקרוסקופ SLAM (איור 1) ומתארים מתודולוגיה שלב אחר שלב ליישומה. זה כולל יצירה ועיצוב של פעימות העירור, הכנת דגימת רקמה מייצגת, הליכי הדמיה ועיבוד, כמו גם הצגת הנתונים המתקבלים. על ידי שימוש בטכנולוגיית מדף וטכניקות מבוססות, פרוטוקול זה הוא אוניברסלי, ניתן להעברה וניתן לשחזר אותו בקלות באמצעות מערכות אופטיות דומות במעבדות שונות.

figure-introduction-1
איור 1: התכן האופטי של מיקרוסקופ אוטופלואורסצנטי מולטי-הרמוני (SLAM) בו-זמנית-פלואורסצנטי נטול-תוויות. לייזר הפמטו-שנייה מוציא אור של 1040 ננומטר בפולסים של 370 fs בקצב חזרה של 10 מגה-הרץ. העוצמה והקיטוב של הלייזר נשלטים בקפידה לפני שאיבת גביש פוטוני ליצירת רצף-על. לאחר מכן הפולסים נדחסים פנימה על ידי מעצב פולסים ומכוונים למיקרוסקופ סריקת לייזר מותאם אישית (קופסה מקווקו). מראות דיכרואיות ומסנני פס-פס מבודדים את האותות הלא-ליניאריים הנוצרים על ידי הדגימה לפני שהם מזוהים על ידי גלאי פוטונים בעלי רגישות גבוהה כגון צינורות פוטו-מכפילים (PMTs) או פוטו-גלאים היברידיים (HPD). התכנון האופטי מבוסס על מערכת41 שתוארה קודם לכן. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו על פי הפרוטוקול UIUC#23031 שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אילינוי ועקבו בקפדנות אחר כל ההנחיות והתקנות הרלוונטיות.

1. חיתוך ויישור סיבי קריסטל פוטוניים (PCF)

  1. בעזרת חותכי סיבים או חותכי תיל, חותכים קטע של סיבי גביש פוטוניים (PCF, טבלת חומרים) לאורך של מעט יותר מ-15 ס"מ.
    הערה: אורכים של לפחות 1.5 ס"מ ייבקעו מכל קצה של ה-PCF מכיוון שאורך זה נדרש כדי להדק היטב את ה-PCF במהלך ה-PCF. האורך הסופי של ה-PCF (12 ס"מ) ששימש במחקר זה נקבע על סמך סימולציה קודמת באמצעות משוואת שרדינגר47 הלא ליניארית הכללית ובדיקות אמפיריות. באופן כללי, אורך ה-PCF הטוב ביותר עשוי להשתנות בהתאם לסוג ה-PCF, כניסת לייזר המשאבה ורצף העל הרצוי.
    זהירות: בעת חיתוך PCF, יש ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) כדי להגן על העיניים והעור של הנסיין. השלך מיד שאריות סיבים למיכל סילוק החדים.
  2. הסירו כ-3 ס"מ מציפוי הפלסטיק מכל קצה של ה-PCF באמצעות מסיר סיבים (טבלת חומרים) או סכין גילוח, ונקו את שאריות הפלסטיק עם נייר טישו (טבלת חומרים) ו-100% מתנול.
  3. הנח קצה אחד של ה-PCF לתוך המחזיק על קליבר סיבים אופטיים מדויק (טבלת חומרים) ויישר את הלהב 1.5 ס"מ מקצה ה-PCF. סגור בזהירות את המהדקים ולחץ על כפתור הניתוק .
    הערה: עקוב בקפידה אחר המדריך למשתמש של קליבר הסיבים, כולל הנחיות ספציפיות לפיצול PCF. ההגדרות, כגון מתח סיבים, עשויות לדרוש כוונון עדין לחריצים עקביים ואיכותיים עבור כל סוג של PCF.
  4. בדוק את הפנים והצד השסועים של ה-PCF באמצעות המיקרוסקופ המשולב (הגדלה של 10×) בתחנת עבודה לעיבוד סיבי זכוכית (טבלת חומרים), וודא שהחריץ באיכות טובה (איורים 2A,C). יש להיבקע מחדש אם יש פסולת (איור 2D), שריטות (איור 2E), או שהמשטח השסוע אינו שטוח ומאונך לאורך ה-PCF (איור 2B).
    הערה: יש לנקוט בזהירות רבה בשלב זה ובשלבים הבאים כדי להימנע מנגיעה בקצוות המפוצלים של ה-PCF במשטח כלשהו כדי למנוע גרימת נזק.
  5. חתכו את הקצה השני של ה-PCF, והבטיחו את האורך הסופי הרצוי.
    הערה: ה-PCF המשמש בפרוטוקול זה נחתך ל-12 ס"מ.
  6. כמו בשלבים הקודמים, בדוק את הקצה החדש של ה-PCF (עיין בשלב 1.4). אם החריץ נראה פגום או לא עקבי, השלך את ה-PCF הנוכחי וחזור על התהליך עם חדש.
  7. מהדק את קצה הקלט של ה-PCF על 3 ציריםtagה (טבלת חומרים) בערך באורך המוקד של עדשת צימוד הסיבים כפי שנמדד עם סרגל. תמכו בצורה מאובטחת בקצה השני של ה-PCF באמצעות עמוד או תושבת זמניים.
    הערה: אל clamp הפלט עדיין כדי למנוע שבירת ה-PCF במהלך ההתאמה הגסה.
    זהירות: תמיכה בקצה הפלט, והקפתו בבלוקים אלומתיים מספיקים, נחוצה כדי להפחית את הסיכון לחשיפה ללייזר.
  8. הנח מד כוח אופטי (טבלת חומרים) בנתיב האלומה ממש לפני ה-PCF כדי למדוד את הספק הכניסה. ודא שהלייזר הפמטו-שנייה (טבלת החומרים) חסום על ידי תריס 1 לפני הפעלת הלייזר.
    הערה: השלם תמיד את כל תוכניות ההדרכה הנדרשות לבטיחות לייזר כדי להבין את הסיכונים הכרוכים בשימוש בלייזר.
    זהירות: בעת הפעלת הלייזר, הרכיבו משקפי בטיחות לייזר מתאימים המדורגים במיוחד עבור אורך הגל והעוצמה של הלייזר בשימוש. לפני הפעלת הלייזר, הסר את כל התכשיטים, השעונים ופריטים מחזירי אור אחרים שעלולים לגרום להשתקפויות תועות מסוכנות.
  9. הפעל את הלייזר ואפשר לו להתחמם ל"זמן החימום הקר" שצוין על ידי הלייזר. פתח את תריס 1 וכוונן את הכוח באמצעות לוחית חצי הגל (HWP1) ממש לפני מפצל האלומה המקטבת עד שמד הכוח קורא 260 mW או פחות.
    הערה: השימוש ב-260 mW ליישור נקבע אמפירית כנמוך מספיק כדי למנוע נזק ל-PCF (גם כשהוא לא מיושר) תוך מתן אלומה בהירה להדמיה על צופה IR או מטרה פלואורסצנטית.
  10. חסום את הלייזר באמצעות תריס 1 והעבר את מד הכוח לקצה הפלט של ה-PCF.
  11. בטל את חסימת הלייזר והתאם את הציר האופטי של פני כניסת ה-PCF באמצעות 3 ציריםtagעד להופעת האות במד הכוח, המציין שחלק מהאור מחובר לליבה, לחיפוי או לציפוי הפלסטיק של ה-PCF. אם מיקום כניסת ה-PCF במוקד הקרן הוא מעבר לטווח של שלב 3 צירים, חסום את הלייזר ולאחר מכן כוונן והדק מחדש את ה-PCF.
    הערה: ניתן להשתמש במציג אינפרא אדום (IR) או במטרה פלואורסצנטית כדי לדמיין היכן ממוקדת האלומה.
  12. באמצעות השלב בעל 3 צירים, התאם מימד אחד של הציר האופטי של ה-PCF כדי למצוא את הטווח שעליו מחובר האור, חשב את אמצע הטווח הזה והעבר את ה-stage לשם. חזור על פעולה זו עבור הממד השני כדי למרכז בערך את הקרן על ליבת ה-PCF.
    הערה: סימני השנתות של מיקרומטר ב-3 צירים stage יכולים לעזור למדוד מרחקים ולמצוא את מרכז ה-PCF.
  13. התאם באופן איטרטיבי את שלושת הממדים של שלב 3 הצירים ברצף חוזר תוך אופטימיזציה של יעילות הצימוד כדי למרכז ולמקד במדויק את הקרן לתוך ליבת ה-PCF.
    הערה: אם יעילות הצימוד המרבית, כפי שנמדדה על ידי מד הכוח, נמוכה באופן ניכר מ-80% מהספק הכניסה סגור את תריס 1, שחרר את ה-PCF ובדוק אותו לאיתור נזק. אם ניזוק, הפעל מחדש משלב 1.1, אחרת, חסום את הלייזר, מהדק מחדש את ה-PCF והפעל מחדש את היישור משלב 1.11.
  14. חסום את הקרן עם תריס 1 והגדל את עוצמת הלייזר ל-1.6 וואט.
    הערה: השימוש ב-1.6 וואט נקבע באמצעות סימולציה ובדיקות אמפיריות ליצירת רצף-על רחב מספיק, תוך שמירה על מתחת לסף הנזק של ה-PCF.
  15. פתח את תריס 1 וכוונן שוב באופן איטרטיבי את 3 הצירים tagכדי לכוונן את מיקום כניסת ה-PCF כדי לייעל את יעילות הצימוד.
    הערה: מבחינה אמפירית, היעילות המקסימלית היא בדרך כלל כ-80%.
  16. סגור את תריס 1 והדק את פלט ה-PCF בערך באורך המוקד של המראה הפרבולית. הנח בלוק קרן בפלט המראה הפרבולית.
  17. הפחת שוב את עוצמת הלייזר ל-260 mW או פחות.
  18. פתח את תריס 1 והשתמש ב-3 הצירים של המראה הפרבולית stage כדי ליישר את הציר האופטי של המראה הפרבולית כדי למזער את עיוות האלומה. לאחר מכן, כוונן את המיקוד וקולימציה של הקרן בשדה הרחוק.
    הערה: השתמש ב-IR viewer או במטרה פלואורסצנטית כדי view אלומת הפלט.
  19. כוונן את המראות לאחר המראה הפרבולית כדי להבטיח שהקרן מיושרת לשאר המערכת האופטית.
    הערה: התקן יעדי יישור היפוך קבועים או קשתית כדי להפוך את השלב הזה לשחזור.
  20. סגור את תריס 1 והגדל את עוצמת הלייזר ל-1.6 W. פתח את תריס 1 וודא שנתיב האלומה ללא שינוי.
  21. מדוד את הספק המוצא של מעצב הדופק (טבלת חומרים) באמצעות מד כוח. סובב את לוחית חצי הגל מול מעצב הדופק (HWP3) כדי לייעל את יעילות השידור של מעצב הדופק.

figure-protocol-1
איור 2: קצוות מפוצלים של סיב הגביש הפוטוני (PCF). (א, ב) תמונות של צד השסע. (ג-ו) תמונות של פני השסע. (A) ל-PCF שסוע היטב יש פנים שטוחות ומאונכות. (B) PCF שסוע בצורה גרועה עם פנים זוויתיות וסדוקות. (ג) PCF שסוע היטב עם פנים נקיות. (ד) PCF שלא טופל כהלכה ויש לו לכלוך על פני השטח. (E) PCF שסוע בצורה גרועה עם שריטות על פני השטח שלו. (ו) PCF ישן שהוחלף. יש נזק גלוי לליבת ה-PCF כפי שניתן לראות על ידי הכתם הכהה במרכז ה-PCF. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

2. אפיון ואופטימיזציה של פולסים

  1. באמצעות ספקטרומטר או מנתח ספקטרום אופטי (OSA, טבלת חומרים), מדוד את הלייזר לאחר המראה הפרבולית כדי לאמת את יצירת הסופר-רצף של ה-PCF.
  2. סובב את לוחית חצי הגל לאחר מפצל האלומה המקטבת (HWP2) כדי לייעל את רוחב הסופר-רצף.
  3. הפעל את המתאם האוטומטי של המיקרוסקופיה (טבלת חומרים). באמצעות התוכנה, הגדר את הגלאי לגלאי הפנימי והגדר את טווח הסריקה ל-5 ps כדי להבטיח שכל רוחב המתאם האוטומטי של הדופק יילכד.
    הערה: עבור הגדרות עם רוחב פולסים ארוך יותר (לדוגמה, עקב פיזור ב-PCF ארוך), יש להגדיל את טווח הסריקה בהתאם. זכור שרוחב הדופק הנמדד על ידי מתאם אוטומטי של עוצמה אינו משך הדופק האמיתי, אך הוא עדיין יכול לשמש כהתייחסות שימושית לדחיסת דופק. לאפיון מדויק ומלא הן של משרעת הדופק והן של השלב, יש להשתמש בטכניקות שנפתרו ספקטרלית כגון שער אופטי נפתר בתדר (FROG)48 .
  4. בטל את חסימת הלייזר ויישר את המתאם האוטומטי לקרן היוצאת ממעצב הדופק עד להופעת אות.
    הערה: הצבת מראות זמניות (שתיים בכניסה ושתיים בפלט של המתאם האוטומטי) תאפשר יישור של האלומה למתאם האוטומטי מבלי להשפיע על שאר המערכת האופטית.
  5. ודא שתריס 2 סגור והחל את אמצעי הטבילה המתאים (כגון מים או שמן) על עדשת המטרה (טבלת חומרים). הנח את הגלאי החיצוני של המתאם האוטומטי על המיקרוסקופ stage (טבלת חומרים) והתאם את ה-stage כדי למקם את הגלאי ישירות מעל המטרה.
    הערה: בניגוד למטרות מיקרוסקופ טיפוסיות, המטרות המומלצות המשמשות למיקרוסקופ SLAM הן העברה אולטרה סגולה כדי לשפר את הזיהוי של THG38.
  6. הפעל את מראות הגלוונומטר הסורקות (טבלת חומרים) כדי להגדיר את המתח שלהן לאפס. פתח את התריס והשתמש ב-IR viewer או במטרה פלואורסצנטית כדי לוודא שהקרן מגיעה לגלאי החיצוני.
  7. הגדר את גלאי המתאם האוטומטי כגלאי החיצוני. כוונן את מיקום ה-stage עד להופעת האות.
    הערה: אם הגלאי רווי, הורד את הכוח באמצעות מסנן הצפיפות הנייטרלית.
  8. התאם את המקדמים הפולינומיים (סדרי פיזור) של מעצב הדופק כדי למזער באופן איטרטיבי את רוחב הדופק הנמדד על ידי המתאם האוטומטי. צמצם את טווח סריקת המתאם האוטומטי כראוי ככל שרוחב הדופק פוחת כדי לשפר את הדיוק וההדמיה של פונקציית המתאם האוטומטי.
    הערה: רוחב הדופק האופטימלי כפי שנמדד בהתאמה גאוס צריך להיות כמה עשרות פמטו-שניות (fs).

3. הכנת מדגם

הערה: לשם הפשטות, פרוטוקול זה מתאר הדמיית רקמות ex vivo . עם זאת, בשל האופי נטול התווית של SLAM, הליכי הדמיה in vivo מותאמים בקלות38.

  1. המתת חסד של בעל החיים באמצעות חנק CO2 או שיטת המתת חסד אחרת שאושרה על ידי IACUC.
  2. קצרו את האיברים המעניינים באמצעות הליך נתיחה סטנדרטי49 תוך 10 דקות לאחר המוות ושטפו עם מי מלח מקוררים מראש (PBS) כדי להסיר דם.
    הערה: במחקר זה נקצרו הכבד והריאות.
  3. נתח את האיבר אנכית או אופקית באמצעות להב, בהתאם לכיוון הנדרש לניתוח. ודא שהדיסקציה מתבצעת בדיוק כדי לשמור על שלמות מבנה הרקמה.
  4. מניחים את פיסת הרקמה בתבנית תרבית רקמה סטרילית מלאה במצע תרבית תאים מלא ללא פנול אדום. מקררים את הטישו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס אם לא אוספים תמונות מיד.
    הערה: אמצעי תרבית התאים ששימש במחקר זה היה HEPES buffered-Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 4 מ"מ גלוטמין ותוספי מדיום גדילת תאי אנדותל (טבלת חומרים). מדיה זו נבחרה בקפידה כדי לשמור על הכדאיות הפיזיולוגית של תאי האפיתל והאנדותל השוכנים בדגימת רקמת הכליה במהלך משך ההדמיה50.
  5. כדי להכין תקני כיול פלואורסצנטיים, אפס סולם מדויק למשקל של סירת שקילה אנטי סטטית ומדוד כ-5 מ"ג של מלח דיסודיום פלבין אדנין דינוקלאוטיד (FAD, טבלת חומרים) או 5 מ"ג מלח דיסודיום מופחת ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד (NADH, טבלת החומרים).
  6. השתמש בפיפטה חד-ערוצית כדי להוציא נפח מתאים של מאגר HEPES של 1 M לסירות השקילה המכילות אבקות FAD או NADH שקולות מראש להכנת תמיסות מלאי של 5 מ"מ. פיפטה למעלה ולמטה שוב ושוב כדי להמיס את האבקה.
  7. הכן פתרונות עבודה של 1 מ"מ מתמיסות המלאי על ידי דילול של 1:5 למאגר HEPES.
    הערה: ריכוז העבודה של 1 מ"מ ששימש במחקר זה נקבע אמפירית כמייצר אות גבוה תוך הימנעות מרוויה בגלאי.
  8. אחסן את פתרונות FAD ו-NADH במלאי בצינורות מיקרו-צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: ניתן לאחסן את תקני התמיסה בקירור במשך מספר ימים, אך מומלץ להכין פתרונות טריים לכל ניסוי.
  9. רגע לפני איסוף תמונות מיקרוסקופ SLAM, הנח את דגימות הרקמה בכלי הדמיה תחתון זכוכית 35 מ"מ (טבלת חומרים). לחלופין, השתמש בכיסוי זכוכית. ציטוט את פתרונות FAD ו-NADH לצלחות או כיסויים זהים.
    הערה: זכוכית לא מצופה או זכוכית מצופה פולי-D-ליזין מומלצת בחום עקב אות רקע מופחת. ודא שעובי הזכוכית מתאים למטרת המיקרוסקופ שבה נעשה שימוש (מחקר זה השתמש ב-#0).

4. הגדרה ותפעול של SLAM

  1. ודא שכניסת הלייזר ל-PCF חסומה על ידי תריס 1 והפעל את הלייזר. תן ללייזר להתחמם למשך "זמן החימום הקר" שצוין של הלייזר.
    הערה: זמן חימום קר של 30 דקות משמש ללייזר במחקר זה.
  2. ודא שנתיב האלומה נקי ממכשולים והנח מד כוח אופטי בנתיב האלומה ממש לפני ה-PCF. פתח את תריס 1 ומדוד את עוצמת הכניסה.
  3. סגור את תריס 1 והעבר את מד הכוח לפלט ה-PCF לאחר המראה הפרבולית. פתח תריס 1 ומקסם את פלט ה-PCF באמצעות הקלט 3 ציריםtagה.
  4. תן ל-PCF להתחמם למשך 10 דקות, ולאחר מכן מקסם שוב את עוצמת הפלט. הקלט את שידור ה-PCF. אם תיבת ההילוכים יורדת מתחת ל-50%, החלף את ה-PCF.
    הערה: במהלך פעולת מיקרוסקופ ה-SLAM (בשלבים הבאים), מומלץ למדוד את הספק המוצא של ה-PCF מדי שעה כדי להבטיח נתונים עקביים.
  5. הזז את מד הכוח לאחר מסנן הצפיפות הנייטרלית (ND) וסובב את המסנן כדי לשלוט בעוצמת הלייזר שמגיעה לדגימה.
    הערה: הכפל את ההספק הנמדד בהעברת הרכיבים האופטיים הנותרים. השידור נמדד על ידי הצבת מד הכוח לאחר עדשת האובייקט. למחקר זה נעשה שימוש בהספק לייזר ממוצע של 20 mW במדגם. עוצמת הלייזר נקבעה באופן אמפירי עבור הדגימה הנתונה, עומק ההדמיה ומערכת המיקרוסקופ כדי ליצור תמונות באיכות גבוהה תוך הימנעות מנזק לדגימה או אי-ליניאריות של הגלאי. אמנם אין תקן סופי, אך הדמיה טיפוסית ללא תוויות מוגבלת לכמה עשרות עד מאות מיליוואט 7,32,33,51,52.
  6. הפעל את הגלוונומטרים ואת הבמה. פתח את תוכנת הרכישה והזן את הפרמטרים הרצויים להדמיה.
    הערה: מחקר זה השתמש ב-512 פיקסלים ×-512 פיקסלים וזמן שהייה של פיקסלים של 13.65 מיקרומטר כדי לדמות שדה ראייה של 360 ×-360 מיקרומטר2 . חמש פריימים שצולמו ב-0.333 הרץ חושבו בממוצע למסגרת אחת באיכות גבוהה.
  7. הנח את הדגימה על הבמה באמצעות מדיית הטבילה המתאימה למטרה כפי ששימשה בעבר בשלב 2.5.
  8. כבו את אורות החדר וסגרו וילונות.
    הערה: כדי למנוע נזק לגלאים, לעולם אל תדליק את אורות החדר בזמן שהגלאים דולקים, או שתריסי הגלאים פתוחים.
  9. הפעל את ספקי הכוח והמגברים של הגלאי.
  10. סגור את תיבת האור המקיפה את הבמה.
  11. השתמש במתגי הבקרה האלקטרוניים כדי לפתוח ידנית את תריסי הגלאי (S3, S4, S5, S6).
  12. בתוכנת רכישת המיקרוסקופ, לחץ על לחץ כדי להתחיל ברכישה כדי להתחיל לאסוף תמונות SLAM. כוונן את המיקוד של המיקרוסקופ על ידי סיבוב הכפתור במיקרוסקופ tagבקר (טבלת חומרים) עד שהדגימה נכנסת למיקוד.
    הערה: כיסוי הזכוכית מייצר אות THG חזק, שניתן להשתמש בו כדי לקבוע במדויק את עומק ההדמיה באמצעות מיקום הבמה המוצג בבקר הבמה של המיקרוסקופ. לדוגמה, כל התמונות של תקני התמיסה שצולמו במחקר זה צולמו במישור מוקד 20 מיקרומטר מעל הכיסוי.
  13. השתמש בג'ויסטיק במיקרוסקופ tagבקר כדי לאתר את שדה הראייה הרצוי בדגימה, ולאחר מכן לחץ על עצור ואפס.
    הערה: אם התמונה רוויה, חזור לשלב 4.5 והורד את המתח. אם לתמונה יש יחס אות לרעש מתחת ל-10, ניתן להגדיל את ההספק בזהירות.
  14. תחת הכרטיסייה שמירה , לחץ על שמור נתונים כדי להעביר אותו למצב כן, ולאחר מכן לחץ על לחץ כדי להתחיל ברכישה. המתן עד לסיום הרכישה לפני שתמשיך.
  15. כדי לשנות או לתפעל את הדגימה במהלך ההדמיה, סגור את תריסי הגלאי והשתמש בפנס או פנס ראש לאור. לאחר שינוי הדגימה, חזור לשלב 4.10.
    הערה: כדי לאפשר חזרתיות וניתוח כמותני, אסוף תמונות SLAM של תקני פתרונות FAD ו-NADH. ודא ששדה הראייה, גודל התמונה ועוצמת העירור תואמים את מה ששימש לדגימות הביולוגיות.
  16. כדי לסיים את רכישת תמונת SLAM, סגור את תריסי הגלאי וכבה את הגלאים לפני הדלקת אורות החדר.
  17. חסום את הלייזר באמצעות תריס 1, ולאחר מכן כבה את הלייזר.
  18. כבה את הגלוונומטרים ואת הבמה. סגור את תוכנת רכישת המיקרוסקופ.
  19. השלך את הרקמה כראוי ונקה את מקום העבודה.

5. הדמיית נתונים

הערה: ניתוח התמונות הבא עשוי להתרחש בתוכנת ניתוח תמונות כגון ImageJ53 (טבלת חומרים) או בשפת תכנות עם יכולות ניתוח תמונה, כגון Python או MATLAB. השלבים הבאים מתארים כיצד לבצע תצוגה חזותית של נתונים באמצעות ImageJ.

  1. ודא שהתמונות מכל ערוץ הן בתבנית תמונה משמרת נתונים (לדוגמה, TIFF או PNG).
    הערה: תוכנת בקרת המיקרוסקופ המותאמת אישית המשמשת במחקר זה שמרה אוטומטית תמונות כקובצי TIFF. לשמירת תמונה כ-TIFF, פתחו אותה ב-ImageJ ובחרו File >-Save As >-Tiff.
  2. כדי ליצור תמונות סטנדרטיות של תאורה, פתח את תמונות ערוץ FAD ו-NAD(P)H של פתרונות FAD ו-NADH, בהתאמה, לתוך ImageJ. עבור כל תמונה, בחר Process > Filters > Gaussian Blur..., הגדר את Sigma (Radius) על 41 ולאחר מכן לחץ על OK.
    הערה: כוונן את הסיגמא (רדיוס) של המסנן הגאוסי לפי הצורך כדי להחליק את התמונה במידה מספקת.
  3. כדי לתקן בו זמנית תאורה לא אחידה ולנרמל את עוצמת הקרינה, פתח את תמונות ערוץ FAD ו-NAD(P)H של הדגימה. עבור כל תמונה, בחר עבד > מחשבון תמונה..., עבור תמונה1 בחר את התמונה לדוגמה, עבור פעולה בחר חלוקה, ועבור תמונה2 בחר את תמונת תקן התאורה המתאימה לערוץ התמונה לדוגמה ולאחר מכן לחץ על אישור.
    הערה: שלב זה הוא קריטי לתיקון שונות המערכת ושמירה על עקביות בהערכות כמותיות של אוטופלואורסצנטיות, כגון יחס חמצון חיזור אופטי (ORR).
  4. אם צולמו תמונות מרובות כדי ליצור שדה ראייה גדול יותר או ערימת z, תפר או שלב את התמונות יחד לתמונה אחת או לערימת תמונות.
  5. כדי ליצור תמונת ORR, סכם תחילה את תמונות FAD ו-NAD(P)H. בחר עבד > מחשבון תמונה..., עבור Image1 ו-Image2, בחר את תמונות הערוץ FAD ו-NAD(P)H בהתאמה, עבור פעולה בחר הוסף ולאחר מכן לחץ על אישור. כדי לחשב את תמונת ה-ORR, בחר Process > Image Calculator..., עבור Image1 בחר את תמונת ערוץ FAD, עבור Operation בחר Divide, ועבור Image2 בחר את התוצאה של הסכום של FAD ו-NAD(P)H, ולאחר מכן לחץ על אישור.
  6. כדי להחיל מפת צבע על תמונת ORR, בחר Image > Color > Edit LUT..., לחץ על Open, בחר את קובץ טבלת החיפוש הרצוי (.lut) ולחץ על OK. בחר תמונה > התאם > בהירות/ניגודיות והתאם את הניגודיות כרצונך.
    הערה: מומלץ להשתמש במפת צבע איזולומיננטית כגון מפת הצבעים (הפוכה) CET-I254,55 המשמשת במחקר זה. להיפוך מפת צבע ב- ImageJ לאחר החלתה על תמונה, בחר Image > Color > Invert LUTs.
  7. כדי לשפר את בהירות התכונות בתמונת ORR, קנה את קנה המידה של הבהירות לפי עוצמת ערוצי הקרינה. ראשית, בחר את התוצאה של הסכום של FAD ו-NAD(P)H ובחר עבד > שפר ניגודיות..., ודא שנורמליזציה מסומנת ולאחר מכן לחץ על אישור. בחר Edit > Copy כדי להעתיק תוצאה זו ללוח. לאחר מכן, בחר את תמונת ה-ORR ובחר Image > Type > RGB Color", ולאחר מכן בחר Image > Type >-HSB (32 סיביות). הזז את המחוון בתחתית התמונה עד הסוף ימינה כדי להציג את ערוץ הבהירות , בחר ערוך > הדבק ולאחר מכן בחר תמונה > סוג > צבע RGB.
  8. כדי לדמיין את תמונת ה-SLAM כקומפוזיציה, פתח את ארבעת ערוצי ה-SLAM ב-ImageJ ובחר: תמונה > צבע > מיזוג ערוצים... באפשרות C2 (ירוק) בחרו בתמונת ערוץ SHG, באפשרות C5 (ציאן) בחרו בתמונת ערוץ NAD(P)H, באפשרות C6 (מגנטה) בחרו בתמונת ערוץ THG, וב- C7 (צהוב) בחרו בתמונת ערוץ FAD. ודא שהאפשרות Create composite מסומנת ולחץ על OK.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגישה הרב-ערוצית והרב-מודאלית המורכבת של מיקרוסקופ SLAM (איור 1) יכולה להקשות על משתמשים חדשים לפתור בעיות ולהבין את התוצאות. ראשית, PCF שסוע היטב כולל פנים נקיות (איור 2C) עם משטח שטוח הניצב לאורך ה-PCF (איור 2A). פנים שסדוקות בזווית (איור 2B) ונוכחות של שריטות (איור 2E) מצביעים על שסע גרוע. לכלוך או פסולת על פני ה-PCF המוצג באיור 2D מעיד על ס...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יצירת סופר-רצף מתאים היא חיונית להדמיית SLAM מוצלחת, אך היא יכולה להיות מאתגרת בשל המורכבות של הגדרת ה-PCF. הקפדה על הדבקה מדויקת וטיפול זהיר ב-PCF חיונית לשמירה על משטחים נקיים ללא פסולת, לכלוך או שריטות, כל אלה עלולים להפריע לצימוד יעיל, יצירת סופר-רצף ואף לקצר את תוחלת החיים של ה-PCF. מכיוון שה-PCF דורש החלפה קבועה, תרגול של חיתוך סיבים וכוונון עדין של הגדרות הקליבר יכול לעזור להשיג חריצים אופטימליים. בנוסף, יישור מדויק של ה-PCF ויישור מחדש תקופתי לפני כל שימוש הם קריטיים כדי להבטיח א...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המימון לציוד ששימש במחקר זה סופק בחלקו על ידי GSK באמצעות המרכז להדמיה מולקולרית אופטית במכון בקמן למדע וטכנולוגיה מתקדמים. עבודה זו נתמכה בחלקה גם על ידי המרכז להדמיה ללא תוויות וביופוטוניקה רב-ממדית (CLIMB) (P41EB031772) ומרכז המדע והטכנולוגיה של NSF לביולוגיה כמותית של התא. K.K.D.T נתמך על ידי תוכנית ההכשרה המחקרית של NIEHS בטוקסיקולוגיה ובריאות סביבתית (5T32ES007326-25), A.D.C נתמך על ידי תוכנית העמיתים לפוסט-דוקטורט של מכון בקמן למדע וטכנולוגיה מתקדמים, ו-A.H. נתמך על ידי תוכנית ההכשרה למיקרו-סביבת רקמות NIBIB (T32EB019944). המחברים מודים לדארולד ספילמן על ניהול חללי המעבדה, הציוד והטכנולוגיה ומודים לד"ר ג'נט א. סורלס ורישיאשינג ר. אייר על תרומתם בעבר למערכת מיקרוסקופ SLAM ששימשה במחקר זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
שלב 3 ציריםמעבדות תורמקס 316הופסק.
צלחת הדמיה תחתונה מזכוכית 35 מ"ממטקP35G-0-14-Cכיסוי #0 לא מצופה.
DMEMג'יבקו21063029גלוקוז גבוה, HEPES, ללא פנול אדום.
תוספי מדיום לצמיחת תאי אנדותלפרומוסלג-39210השמיט סרום עגל עוברי.
לייזר פמטו-שניות FemtoTrainספקטרה-פיזיקה1040-5הספק ממוצע: >5.0 W, אנרגיית דופק: >500 nJ, אורך גל: 1040 ננומטר ± 8 ננומטר, קצב חזרה: 10 מגה-הרץ, רוחב פולס (FWHM): < 220 fs.
סרום בקר עובריציטיבהSH30071.03HyClone מאופיין.
חשפנית סיביםמעבדות תורT10S13
פלבין אדנין דינוקלאוטיד מלח דיסודיום הידרטסיגמא-אולדריץ'F6625
מראות גלוונומטרטכנולוגיית קיימברידג'6215חהופסק.
תחנת עבודה לעיבוד זכוכיתVytranGPX3800
תמונהJמעבדת אליסירי באוניברסיטת ויסקונסין מדיסוןגירסה 2.16.0הפצת פיג'י.
נייר טישו של Kimwipeקימברלי-קלארק פרופשיונל34120
ל-גלוטמיןציטיבהSH30034.01
שלב מיקרוסקופמכשור מדעי יישומיFTP-2050
בקר שלב מיקרוסקופמכשור מדעי יישומיMS-2000-500-UDSW
מתאם אוטומטי של מיקרוסקופיהAngewandte Physik und Elektronik GmbHקארפ
עדשת אובייקטאולימפוסXLPLN25XWMP2טבילה במים, הגדלה פי 25, 1.05 NA.
מד כוח אופטיניופורט919פ-003-10600 - 1700 ננומטר.
מנתח ספקטרום אופטימעבדות תורOSA202C
סיבי קריסטל פוטונייםNKT פוטוניקהLMA-PM-15 NKTשטח מצב גדול, שמירה על קיטוב. קוטר ליבה: 15 &m.
קליבר סיבים אופטיים מדויקפוג'יקורהCT-101
מעצב דופקפתרונות ביופוטוניקה בע"מפמטו-ג'וק-דיהופסק.
&בטא;-ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד, מלח דיסודיום מופחת הידרטסיגמא-אולדריץ'10128023001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boyd, R. W. Nonlinear optics. , Academic Press. Amsterdam. (2008).
  2. Potma, E. O. Foundations of nonlinear optical microscopy. , John Wiley and Sons. (2024).
  3. Mukamel, S. Principles of nonlinear optical spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1999).
  4. Boppart, S. A., You, S., Li, L., Chen, J., Tu, H. Simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy and beyond. APL Photonics. 4 (10), 100901(2019).
  5. Sun, Y., et al. Real-time three-dimensional histology-like imaging by label-free nonlinear optical microscopy. Quant Imaging Med Surg. 10 (11), 2177-2190 (2020).
  6. Yang, L., et al. Intraoperative label-free multimodal nonlinear optical imaging for point-of-procedure cancer diagnostics. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 27 (4), 6801412(2021).
  7. Talone, B., et al. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals features of bone composition in pathophysiological conditions. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1042680(2022).
  8. Liu, H. S., Jan, M. S., Chou, C. K., Chen, P. H., Ke, N. J. Is green fluorescent protein toxic to the living cells. Biochem Biophys Res Commun. 260 (3), 712-717 (1999).
  9. Tsoi, K. M., Dai, Q., Alman, B. A., Chan, W. C. W. Are quantum dots toxic? Exploring the discrepancy between cell culture and animal studies. Acc Chem Res. 46 (3), 662-671 (2013).
  10. Alford, R., et al. Toxicity of organic fluorophores used in molecular imaging: Literature review. Mol Imaging. 8 (6), (2009).
  11. Macheroux, P., Kappes, B., Ealick, S. E. Flavogenomics - a genomic and structural view of flavin-dependent proteins. FEBS J. 278 (15), 2625-2634 (2011).
  12. Xu, C., Webb, W. W. Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy. Top Fluoresc Spectrosc. 5, 471-540 (2002).
  13. Ranjit, S., et al. Imaging fibrosis and separating collagens using second harmonic generation and phasor approach to fluorescence lifetime imaging. Sci Rep. 5 (1), 13378(2015).
  14. Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
  15. Cox, G. Biological applications of second harmonic imaging. Biophys Rev. 3 (3), 131(2011).
  16. Aghigh, A., Bancelin, S., Rivard, M., Pinsard, M., Ibrahim, H., Légaré, F. Second harmonic generation microscopy: A powerful tool for bio-imaging. Biophys Rev. 15 (1), 43-70 (2023).
  17. Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88 (2), 1377-1386 (2005).
  18. Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt Express. 5 (8), 169-175 (1999).
  19. Oron, D., et al. Depth-resolved structural imaging by third-harmonic generation microscopy. J Struct Biol. 147 (1), 3-11 (2004).
  20. Débarre, D., et al. Imaging lipid bodies in cells and tissues using third-harmonic generation microscopy. Nat Methods. 3 (1), 47-53 (2006).
  21. Tu, H., et al. Stain-free histopathology by programmable supercontinuum pulses. Nat Photonics. 10 (8), 534-540 (2016).
  22. You, S., et al. Label-free visualization and characterization of extracellular vesicles in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (48), 24012-24018 (2019).
  23. Zipfel, W. R., et al. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7075-7080 (2003).
  24. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  25. Masihzadeh, O., et al. Third harmonic generation microscopy of a mouse retina. Mol Vis. 21, 538-547 (2015).
  26. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  27. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: Why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
  28. Maiti, S., Shear, J. B., Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Measuring serotonin distribution in live cells with three-photon excitation. Science. 275 (5299), 530-532 (1997).
  29. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nat Commun. 11 (1), 5120(2020).
  30. Campagnola, P. J., Dong, C. Y. Second harmonic generation microscopy: Principles and applications to disease diagnosis. Laser Photonics Rev. 5 (1), 13-26 (2011).
  31. Pavone, F. S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging. , CRC Press. Boca Raton. (2016).
  32. Witte, S., et al. Label-free live brain imaging and targeted patching with third-harmonic generation microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 5970-5975 (2011).
  33. Weigelin, B., Bakker, G. J., Friedl, P. Intravital third harmonic generation microscopy of collective melanoma cell invasion: Principles of interface guidance and microvesicle dynamics. Intravital. 1 (1), 32-43 (2012).
  34. Carriles, R., et al. Imaging techniques for harmonic and multiphoton absorption fluorescence microscopy. Rev Sci Instrum. 80 (8), 081101(2009).
  35. Graf, B. W., Jiang, Z., Tu, H., Boppart, S. A. Dual-spectrum laser source based on fiber continuum generation for integrated optical coherence and multiphoton microscopy. J Biomed Opt. 14 (3), 034019(2009).
  36. Graf, B. W., et al. In vivo multimodal microscopy for detecting bone-marrow-derived cell contribution to skin regeneration. J Biophotonics. 7 (1-2), 96-102 (2014).
  37. Liu, Y., Tu, H., Benalcazar, W. A., Chaney, E. J., Boppart, S. A. Multimodal nonlinear microscopy by shaping a fiber supercontinuum from 900 to 1160 nm. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 18 (3), (2012).
  38. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nat Commun. 9 (1), 2125(2018).
  39. You, S., Chaney, E. J., Tu, H., Sun, Y., Sinha, S., Boppart, S. A. Label-free deep profiling of the tumor microenvironment. Cancer Res. 81 (9), 2534-2544 (2021).
  40. Cadena, A. D. L., Park, J., Tehrani, K. F., Renteria, C. A., Monroy, G. L., Boppart, S. A. Simultaneous label-free autofluorescence multi-harmonic microscopy driven by the supercontinuum generated from a bulk nonlinear crystal. Biomed Opt Express. 15 (2), 491-505 (2024).
  41. Lee, J. H., et al. Simultaneous label-free autofluorescence and multi-harmonic imaging reveals in vivo structural and metabolic changes in murine skin. Biomed Opt Express. 10 (10), 5431-5444 (2019).
  42. Shi, J., et al. Accelerating biopharmaceutical cell line selection with label-free multimodal nonlinear optical microscopy and machine learning. Commun Biol. 8 (1), 157(2025).
  43. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Label-free optical metabolic imaging in cells and tissues. Annu Rev Biomed Eng. 25, 413-443 (2023).
  44. Alhallak, K., Rebello, L. G., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N. Optical redox ratio identifies metastatic potential-dependent changes in breast cancer cell metabolism. Biomed Opt Express. 7 (11), 4364-4374 (2016).
  45. Ostrander, J. H., et al. Optical redox ratio differentiates breast cancer cell lines based on estrogen receptor status. Cancer Res. 70 (11), (2010).
  46. Cadena, A. D. L., Renteria, C. A., Aksamitiene, E., Boppart, S. A. Label-free hyperspectral multiphoton microscopy. Opt Lett. 50 (5), 1484-1487 (2025).
  47. Agrawal, G. Nonlinear fiber optics. , 5th ed, Academic Press. 553-612 (2013).
  48. Trebino, R., et al. Measuring ultrashort laser pulses in the time-frequency domain using frequency-resolved optical gating. Rev Sci Instrum. 68 (9), 3277-3295 (1997).
  49. Stewart, K., Schroeder, V. A. Diagnostic necropsy and tissue harvest in rodents. J Vis Exp. , e10294(2020).
  50. Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney Int. 65 (6), 2223-2227 (2004).
  51. Huttunen, M. J., et al. Multiphoton microscopy of the dermoepidermal junction and automated identification of dysplastic tissues with deep learning. Biomed Opt Express. 11 (1), 186-199 (2020).
  52. Fung, A. A., et al. Label-free multimodal optical biopsy reveals biomolecular and morphological features of diabetic kidney tissue in 2D and 3D. Nat Commun. 16 (1), 4509(2025).
  53. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  54. Kovesi, P. Good colour maps: How to design them. arXiv. , (2015).
  55. Kovesi, P. ColorCET perceptually uniform colour maps. , https://colorcet.com (2025).
  56. Tian, Z., Liang, M. Renal metabolism and hypertension. Nat Commun. 12 (1), 963(2021).
  57. Wang, G., Shi, J., Iyer, R. R., Sorrells, J. E., Tu, H. Fiber-optic nonlinear wavelength converter for adaptive femtosecond biophotonics. arXiv. , (2024).
  58. Lozovoy, V. V., Pastirk, I., Dantus, M. Multiphoton intrapulse interference. IV. Ultrashort laser pulse spectral phase characterization and compensation. Opt Lett. 29 (7), 775-777 (2004).
  59. Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. Eur J Histochem. 58 (4), (2014).
  60. Theodossiou, A., et al. Autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism. J Vis Exp. (177), e63282(2021).
  61. Yang, L., et al. Label-free multimodal polarization-sensitive optical microscope for multiparametric quantitative characterization of collagen. Optica. 11 (2), 155-165 (2024).
  62. Smith, H. E., et al. The use of NADH anisotropy to investigate mitochondrial cristae alignment. Sci Rep. 14 (1), 5980(2024).
  63. Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (4), (2011).
  64. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr Protoc Cytom. 61 (1), 9.39.1-9.39.18 (2012).
  65. Sorrells, J. E., et al. Label-free nonlinear optical signatures of extracellular vesicles in liquid and tissue biopsies of human breast cancer. Sci Rep. 14 (1), 5528(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Label Free MicroscopyNonlinear Optical MicroscopyMultiphoton MicroscopyHarmonic GenerationAutofluorescence ImagingPhotonic Crystal FiberPulse CompressionTissue ImagingMetabolic ImagingRedox Ratio

Related Articles