הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דור של מוטציות אימהיות באמצעות zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

1.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68642

⸱

22 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Animal Cell and Developmental Biology, School of Life Sciences Qilu Hospital (Qingdao), Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), UMR CNRS 8263, INSERM U1345, Development, Adaptation and Ageing, Sorbonne Université, 3College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, 4Key Laboratory for Experimental Teratology of the Ministry of Education, Shandong University, 5State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, 6Shandong University-Yuanchen Joint Biomedical Technology Laboratory

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת מוטציה אימהית המצמיד קו נוק-אין יציב של zpc:cas9 עם מסירה בתיווך Tol2 של קלטות ביטוי sgRNA.

תקציר

אוגנזה והתפתחות עוברית מוקדמת תלויים באופן קריטי ב-mRNA וחלבונים שמקורם באם. ביטול הגורמים האימהיים הללו מחייב מוטציות הומוזיגוטיות בנקבות דג הזברה, מה שגורם לעתים קרובות לפנוטיפים קטלניים או עקרים, המונעים רכישת עוברים מוטנטיים אימהיים. עבודתנו הקודמת הציגה גישה מהירה לעקיפת קטלניות זיגוטית באמצעות עריכת גנום ספציפית לביציות. עם זאת, הטרנסגן cas9 שדווח בעבר מפגין חוסר יציבות ועובר השתקה הדרגתית לאורך דורות עוקבים. יתר על כן, נוכחותם של אלמנטים הניתנים להעברה של Tol2 המאגפים את קלטת zpc:cas9 בקו זה מעכבת את הפוטנציאל לטרנסגנזה נוספת של sgRNA באמצעות מערכת Tol2, שהיא כיום המערכת הטרנסגנית היעילה ביותר בדגי הזברה. כתוצאה מכך, יש צורך קריטי בקו דגי זברה נטול Tol2 המבטיח ביטוי Cas9 יציב וחזק ספציפי לביציות. כאן, אנו מציגים קו עם zpccas9 במיקום rbm24a העונה על דרישה זו. באמצעות כלי משופר זה, אנו מספקים צינור לייצור מהיר של מוטציות אימהיות של גנים עם פנוטיפים מוטנטיים קטלניים זיגוטית בתוך מודל דג הזברה.

מבוא

ההתפתחות העוברית המוקדמת של בעלי חוליות מסתמכת במידה רבה על ה-RNA והחלבונים המאוחסנים בתוך הביצית, המכונים באופן קולקטיבי גורמים אימהיים. תוצרים אימהיים אלה מסונתזים בעיקר בשלב הדיפלוטן של מיוזה I 1,2,3. כדי לחקור את תפקידיהם התפקודיים, חיוני ליצור פרטים נקבות מוטנטיות הומוזיגוטיות, מכיוון שרק מוטציה הומוזיגוטית בביציות יכולה לרוקן לחלוטין את הגורמים האימהיים הללו. עם זאת, השגת נקבות מוטנטיות הומוזיגוטיות כאלה הופכת למאתגרת כאשר מוטציות הומוזיגוטיות זיגוטיות גורמות לקטלניות או עקרות 4,5. זה מהווה מחסום משמעותי להבהרת התפקודים של מוצרים אימהיים המקודדים על ידי גנים זיגוטיים, קטלניים או סטריליים. כדי להתגבר על מגבלה טכנית זו, פותחו מספר גישות חדשניות 6,7,8. עם זאת, טכניקות אלה סובלות לעתים קרובות מלוחות זמנים ניסויים ממושכים או מאתגרים טכניים משמעותיים.

בעבודה הקודמת שלנו, פיתחנו גם אסטרטגיית נוקאאוט מותנית המאפשרת יצירת מוטציות אימהיות בתוך דור יחיד 9,10. המערכת מורכבת משני מרכיבים עיקריים: דג זברה טרנסגני Tg(zpczcas9) ומערכת פלסמיד טרנסגנית I-SceI המכילה 3-4 קלטות ביטוי sgRNA. תוך מינוף מערכת זו, השגנו בהצלחה נוקאאוט מותנה של גורמים אימהיים בביציות 9,10, אך עדיין יש מקום לשיפור. ראשית, יעילות עריכת הגנום של הקו הטרנסגני Tg(zpczcas9) שדווח בעבר לא הייתה יציבה בשמירה על הביטוי הטרנסגני של Cas9. יתר על כן, מכיוון שקו טרנסגני זה נוצר באמצעות מערכת הטרנספוזון Tol2, לא ניתן להשתמש בטרנספוזיציה של Tol2 לשילוב קלטת הביטוי sgRNA; במקום זאת, נדרשת טרנסגנזה בתיווך I-Sce. עם זאת, גישה זו פחות יעילה מ-Tol2 והיא גם רגישה יותר להשתקה בין-דורית.

כדי להתגבר על מגבלות אלה, ביקשנו ליצור קו דפיקה המאפשר ביטוי Cas9 חזק ויציב ספציפי לביציות. קו זה מאפשר שימוש במערכת הטרנספוזון Tol2 לאספקה יעילה ביותר של פלסמידים לביטוי sgRNA בדגי זברה. תוך שימוש באסטרטגיית עריכת גנום מבוססת אינטרונים11, יצרנו בהצלחה קו דפיקה של zpccas9 עם האתר המשולב באינטרון האחרון של הגן rbm24a (איור 1A,B). בחרנו בלוקוס זה כנמל מבטחים גנומי מועמד לביטוי טרנסגנים אימהיים על בסיס שתי תצפיות בלתי תלויות. 1) אינטגרציה לא מזיקה: במחקר האחרון שלנו12, דגים הומוזיגוטיים הנושאים DNA אקסוגני באתר זה נותרו ברי קיימא ופוריים לחלוטין. 2) ביטוי חזק: כאשר קלטת zpccas9 הוכנסה באותו מיקום, Cas9 התבטא ברמות גבוהות, מה שהניב יעילות חזקה באופן עקבי בעריכת גנום לאורך דורות (איור 1C). כמרכיב ליבה של פלזמת נבט, החלבון קושר ה-RNA Rbm24a משתף פעולה עם Buc כדי לשלב RNA של פלזמת נבט בגרגירי נבט. כתוצאה מכך, מחסור אימהי ב-Rbm24a מוביל להיעדר מוחלט של תאי נבט קדמוניים (PGCs)12. כאן, על ידי התמקדות ב-rbm24a כדוגמה בעבודתנו האחרונה, אנו מספקים פרוטוקול וידאו משופר ליצירה ואפיון של מוטציות אימהיות לגנים קטלניים זיגוטיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ARRIVE ואושרו מבחינה אתית על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת שאנדונג (אישור מס. SYDWLL-2021-15). הסקירה הכללית של פרוטוקול זה מוצגת באיור 2.

1. דור קו הדפיקה rbm24a-RFP zpc: cas9

  1. מסך של sgRNA לדפיקה
    1. בחר וסינתז מועמדים ל-sgRNA
      1. שלח את רצף האינטרון האחרון של rbm24a ל-CRISPRscan (http://www.crisprscan.org) כדי לזהות מועמדים אופטימליים ל-sgRNA המציגים הן ציוני CRISPRscan גבוהים (המעידים על יעילות על המטרה) והן ציוני CFD נמוכים (המשקפים השפעות מחוץ למטרה). סנתז את האוליגו הארוך עבור כל sgRNA (sgRNA oligo).
        הערה: CRISPRscan מייצר אוליגוס sgRNA המכילים אלמנטים פונקציונליים חיוניים, כולל רצף מקדם T7, רצף המטרה sgRNA של 20 נוקלאוטידים ורצף פיגומי sgRNA של 16 נוקלאוטיד. כאן, בחרנו sgRNA עם הרצף הבא: 5′-taatacgactcactataGGGCTGCTGTCTCTCTGTTGG
        GTgttttagagctagaa-3′ (מקדם T7 באותיות קטנות, 20-nt guide uppercase, פיגום חלקי באותיות קטנות).
      2. כדי להשיג את תבנית ה-DNA לסינתזת sgRNA, הכינו 50 מיקרוליטר של תגובת PCR למילוי: 2x Taq Master mix 25 μL; פריימר sgRNA (10 מיקרומטר) 2 מיקרוליטר; פריימר אוניברסלי (10 מיקרומטר) 2 מיקרוליטר; H2O 21 מיקרוליטר נטול יונים.
        הערה: הרצפים של כל הפריימרים מוצגים בטבלת החומרים.
      3. מערבבים היטב ומעבירים את תערובת התגובה למחזור תרמי מתוכנת מראש ומתחילים את פרוטוקול ההגברה באמצעות פרמטרי הרכיבה כדלקמן: מחזור אחד ב-94 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 35 מחזורים (94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 50 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות) ומחזור אחד ב-72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      4. הכן את תערובת התגובה לסינתזה של sgRNA בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל; שלב את כל הרכיבים בטמפרטורת החדר בסדר הבא: 11 מיקרוליטר של מים מזוקקים, 2 מיקרוליטר של ATP/GTP/CTP/UTP (10 מ"מ כל אחד), 10 מיקרוליטר של תוצר PCR, 4 מיקרוליטר של מאגר תגובה של 10x RNA פולימראז, 2 מיקרוליטר של T7 RNA פולימראז ו-1 מיקרוליטר של מעכב RNase. נפח התגובה הכולל הוא 40 מיקרוליטר. מערבבים היטב על ידי החלקה ומבצעים צנטריפוגה קצרה.
      5. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי. הוסף 1 מיקרוליטר של DNase I, ערבב על ידי החלקה וצנטריפוגה קצרה. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להבטיח הסרה מלאה של תבנית DNA.
      6. הוסף 5 מיקרוליטר של חרוזי סיליקה מגנטיים, ואחריהם 120 מיקרוליטר (נפח 4x) של מאגר קשירת RNA (Gu-HCl 1 M 9.55 גרם, Tween-20 0.05%, אתנול 100 מ"ל). מערבבים היטב על ידי פיפטינג. דגירה על תרמו-מיקסר ב-1,500 סל"ד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
      7. הנח את הצינור על מעמד מגנטי והסר בזהירות את הסופרנטנט באמצעות פיפטה או מערכת ואקום.
      8. הוסף 400 מיקרוליטר של 90% אתנול ומערבולת כדי להשעות מחדש את החרוזים. הנח את הצינור על המעמד המגנטי והשליך את הסופרנטנט.
      9. חזור על שלבי שטיפת האתנול כדי להשלים בסך הכל שני מחזורי כביסה.
      10. הסר שאריות סופרנטנט וייבש באוויר את הצינור הפתוח על בלוק חימום של 50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
      11. הוסיפו 15 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז ודגרו על תרמו-מיקסר ב-1,500 סל"ד למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      12. הנח את הצינור על המעמד המגנטי והעביר את האלואט לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי.
      13. אשר את רצועת ה-sgRNA של 98 bp על ידי אלקטרופורזה של אגרוז. כמת את ריכוז ה-RNA על ידי מיקרו-ספקטרופוטומטר ואלקטרופורזה של אגרוז, תייג בבירור ואחסן ב-20 מעלות צלזיוס.
    2. בדיקת יעילות sgRNA
      1. כדי לקבוע את היעילות בפועל של sgRNAs, הכינו את קומפלקס הריבונוקלאופרוטאין (RNP) להזרקת מיקרו. מערבבים 1 מיקרוליטר מכל sgRNA (ריכוז סופי של 50 ננוגרם/מיקרוליטר) עם 1 מיקרוליטר של חלבון Cas9 (ריכוז סופי של 100 ננוגרם/מיקרוליטר) על קרח על ידי פיפטינג. העבירו 2 nL של קומפלקס RNP לכל עובר בשלב של תא אחד על ידי מיקרו-הזרקה.
      2. לאחר 24 שעות לאחר ההפריה (hpf), אספו 10 עוברים עבור כל Cas9 RNP מוזרק לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, והסירו בזהירות עודפי מדיום. הוסף 100 מיקרוליטר של 50 מ"מ NaOH (10 מיקרוליטר לעובר) ודגר בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות באמצעות בלוק חימום או מחזור. נטרל את הליזט על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של 1 M Tris-HCl (pH 7.0).
      3. השתמש בליזאט העובר המנוטרל ישירות כתבנית להגברת PCR. תכנן פריימרים להגברת שבר המכיל את אתר היעד עם רצפי אגף של ≥100 bp משני הצדדים. אמת מוצרי PCR על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז וטהר באמצעות מיצוי ג'ל במידת הצורך. בצע ריצוף סנגר של המוצרים המוגברים.
      4. כימות יעילות העריכה של CRISPR: ניתוח כרומטוגרמות רצף באמצעות כלי הניתוח ICE (Inference of CRISPR Edits) (https://ice.synthego.com/#/). נרמל את יעילות העריכה כנגד דגימות בקרה שלא הוזרקו בהתאם לפרוטוקולים המומלצים על-ידי אתר האינטרנט.
  2. בניית פלסמיד תורם לדפיקה
    1. השתמש במתודולוגיית TEDA (T5 exonuclease DNA Assembly) כדי לבצע את תגובת הקשירה13.
    2. השתמש באסטרטגיית הרכבה של גיבסון בת שלושה שברים לבניית פלסמיד תורם rbm24a-RFP KI zpc:cas9 . השבר הראשון כולל זרוע הומולוגיה של 1,704 bp 5' המקיפה את האזור הגנומי מיד במעלה הזרם של קודון העצירה rbm24a . השני הוא רצף הקידוד של GFP. השלישי מכיל זרוע הומולוגיה של 2,274 bp 3' במורד הזרם של קודון העצירה rbm24a , ואחריה קלטת הביטוי zpccas9 הממוקמת בכיוון 3' דיסטלי ל-rbm24a 3'-UTR.
    3. הרכיבו את שלושת השברים לאתר ApaI של וקטור pBluescript SK באמצעות הרכבת גיבסון.
    4. אמת את הפלסמיד הסופי באמצעות עיכול הגבלה ורצף סנגר.
  3. מיקרו הזרקה ובחירת עוברים עם אינטגרציה מוקדמת
    1. הכן את תערובת ההזרקה המכילה 12 pg של rbm24a-RFP KIzpc:cas9 פלסמיד תורם, 200 pg של sgRNA ו-600 ng של חלבון Cas9 רקומביננטי במים נטולי נוקלאז. העבירו 1-2 nL מהתערובת לתוך הבלסטודיסק של עוברים בשלב תא אחד באמצעות טכניקות מיקרו-הזרקה סטנדרטיות. ב-30 hpf, עוברים מסננים דפוסי ביטוי RFP המחקים את הביטוי האנדוגני של rbm24a, מה שמעיד על שילוב של הפלסמיד התורם כבר בשלב המחשוף. בחרו את העוברים האלה עם אינטגרציה מוקדמת לרבייה, שהראו אות RFP בעדשה, בלב, בשרירי השלד ובתאי השיער של האוזן הפנימית (איור 3A,B).
      הערה: טהר את הפלסמיד על ידי מיצוי פנול-כלורופורם לפני ההזרקה כדי לחסל שאריות RNases שהוכנסו במהלך הכנת הפלסמיד.
    2. לנתח את דפוסי הביטוי של Rbm24a-RFP אימהי בעוברים מדור F1 שמקורם בהכלאות rbm24a-RFP KIzpc:cas9 (איור 4A,B).
  4. הערכת ביטוי חלבון Cas9 ויעילות עריכה
    1. כדי להעריך את יעילות העריכה של Cas9, הזרקת מיקרו של 200 pg bmp2b sgRNA לעוברים של תא אחד rbm24a-RFP KIzpc:cas9 (איור 1C,D).
    2. כדי להעריך את היציבות של עריכת Cas9, כמת את מספר העוברים המציגים פנוטיפים של גב ובצע ניתוח ריצוף סנגר כדי להעריך את יעילות העריכה (איור 5A-D).
      הערה: למרות שלא זיהינו ירידה בביטוי Cas9 במשך שלושה דורות, אנו עדיין ממליצים לאמת את יעילות העריכה בכל דור של קו דפיקה זה.

2. טרנסגנזה sgRNA בקו rbm24a-RFP KI zpc cas9

  1. בחר וסנתז sgRNAs לנוקאאוט rbm24a .
    1. בחר וסנתז מועמדים sgRNA כמתואר בשלב 1.1.1.
      הערה: חיוני לבחור sgRNAs המכוונים למחצית הקדמית של אזור הקידוד כדי להבטיח אובדן תפקוד יעיל ביותר. בנוסף, אם מזוהים תחומי חלבון קריטיים באזור C-terminal, sgRNAs המכוונים לקצה ה-3' של רצף הקידוד מקובלים גם הם. CRISPRscan מייצר אוליגוס sgRNA המכילים אלמנטים פונקציונליים חיוניים, כולל רצף מקדם T7, רצף המטרה sgRNA של 20 נוקלאוטידים ורצף פיגומי sgRNA של 16 נוקלאוטיד. כדי להשיג נוקאאוט יעיל של הגן האימהי, מומלץ לתכנן 6-8 מועמדים לזיהוי אמין של 3-4 sgRNAs יעילים במיוחד. פרוטוקול מפורט ניתן למצוא במאמר קודם9.
    2. בדוק את יעילות ה-sgRNA בעובר מוקדם של דג הזברה כמתואר בשלב 1.1.2.
      הערה: עדיפות sgRNA עם יעילות עריכה העולה על 50%.
  2. בניית פלסמיד טרנסגני המבטא sgRNA
    הערה: כדי למקסם את יעילות העריכה, אנו ממליצים להשתמש בארבעה sgRNA נפרדים ולא חופפים, כל אחד מופרדים ב-36 bp לפחות. sgRNAs אלה נקשרים בנפרד לווקטורים pU6x:sgRNA (pU6x:sgRNA #1, #2, #3, #4), כל אחד מכיל מקדמי U6 ייחודיים יחד עם פיגום 3'14. לאחר מכן, ארבעת וקטורי ה-U6 הללו, שכל אחד מהם מכיל קלטת ביטוי sgRNA, מורכבים לווקטור היעד pGGDestISceIEB-4sgRNA באמצעות קשירת שער הזהב.
    יש לבחור את הווקטורים pU6x:sgRNA ברצף. לדוגמה, אם משבטים שלושה sgRNAs, השתמשו בווקטורים #1 עד #3; אם משכפלים ארבעה sgRNAs, השתמשו בווקטורים #1 עד #4.
    1. תת-שיבוט רצף יעד sgRNA לווקטורים pU6x:sgRNA
      1. על פי רצף ה-sgRNA שנבחר, סנתז את פריימרים החישול: פריימר קדימה: TTCGN(19); פריימר הפוך: AAAC[N(19)]*. כאשר GN(19) הוא רצף היעד של 20 nt של sgRNA. [N(19)]* מייצג את רצף המשלים ההפוך של 19 nt של יעד ה-sgRNA בכיוון 3'.
      2. כדי לחשל את הפריימרים, הכינו את התערובת באופן הבא: 1 מיקרוליטר של פריימר קדימה (100 מיקרומטר), 1 מיקרוליטר של פריימר הפוך (100 מיקרומטר), 2 מיקרוליטר של מאגר 10x ו-16 מיקרוליטר של H2O נטול יונים כדי להגיע לנפח כולל של 20 מיקרוליטר.
        הערה: רצפים של כל הפריימרים הוצגו בטבלת החומרים.
      3. מניחים את התערובת בתרמוסייקלר ומפעילים את התוכנית באופן הבא: מחזור אחד ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ואז מצננים בהדרגה ל-50 מעלות צלזיוס בקצב רמפה מבוקר של 0.1 מעלות צלזיוס לשנייה, ושומרים על טמפרטורה זו למשך 10 דקות; יש להחזיק בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
      4. הכן את תערובת התגובה לשיבוט רצף המטרה sgRNA המחוסל לווקטורים pU6x-sgRNA כמתואר: 1 מיקרוליטר של מאגר אנזים הגבלה פי 10, 1 מיקרוליטר של מאגר ליגאז 10x T4, 0.3 מיקרוליטר של T4 ליגאז, 0.3 מיקרוליטר של BsmBI, 0.2 מיקרוליטר של PstI, 0.2 מיקרוליטר של SalI, 1 מיקרוליטר של פריימר sgRNA מחוסל, 5 מיקרוליטר של pU6x:sgRNA#x (20 ננוגרם/מיקרוליטר), ו-1 מיקרוליטר של H2O נטול יונים, תוך התאמת נפח התגובה הסופי ל-10 מיקרוליטר.
      5. מערבבים היטב את רכיבי התגובה והפעל את תוכנית התרמו-סייקלר הבאה: 6 מחזורים (37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, 16 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות), מחזור אחד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, מחזור אחד ב-55 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, מחזור אחד ב-80 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      6. לצורך טרנספורמציה, יש להפשיר תאים מוכשרים DH5α על קרח, לערבב בעדינות 50 מיקרוליטר מהתאים עם תערובת הקשירה על ידי החלקת הצינור, ולדגור את התערובת על קרח למשך 30 דקות. בצע הלם חום ב-42 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, ולאחר מכן העבר מיד את הצינור בחזרה לקרח למשך 2 דקות. מורחים את התאים שעברו טרנספורמציה על צלחת LB המכילה ספקטינומיצין של 100 מיקרוגרם/מ"ל ודוגרים את הצלחת הפוכה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות לפחות כדי לאפשר היווצרות מושבה.
      7. עבור PCR של מושבה, בחר כל מושבת חיידקים עם קצה פיפטה והעביר ל-10 מיקרוליטר של H2O נטול יונים. השעו מחדש את המושבה ביסודיות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כדי להבטיח פיזור מלא לניתוח PCR במורד הזרם. הכן את תערובת תגובת ה-PCR על ידי שילוב של 5 מיקרוליטר של תערובת 2x Taq, 2 מיקרוליטר של נוזל מושבה, 0.4 מיקרוליטר כל אחד של פריימר קדימה M13 (10 מיקרומטר) ופריימר הפוך (10 מיקרומטר), ו-2.2 מיקרוליטר של H2O נטול יונים, מה שמניב נפח תגובה כולל של 10 מיקרוליטר.
      8. הפעל את התוכנית כפי שמוצג להלן: מחזור אחד ב-94 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 23 מחזורים (94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות) ומחזור אחד ב-72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      9. לחשוף את מוצרי ה-PCR לאלקטרופורזה. בחר את המושבה החיובית עם הגודל הצפוי של 482 bp (איור 6).
      10. יש לחסן את נוזל המושבה הנותר לתוך 3 מ"ל של מדיום LB בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל ספקטינומיצין. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-200 סל"ד למשך 14 שעות.
      11. חלץ פלסמידים מתרבית החיידקים באמצעות ערכת Plasmid Miniprep בהתאם להוראות היצרן. מדוד את ריכוז הפלסמיד באמצעות מיקרוספקטרופוטומטר.
      12. הכניסו את הפלסמידים שחולצו לריצוף סנגר באמצעות פריימר M13 קדימה. יישר את תוצאות הריצוף עם מפת הווקטור U6 הצפויה כדי לאמת את ההכנסה הנכונה של יעד ה-sgRNA.
    2. הרכבה של וקטור pGGestEB-4sgRNA
      הערה: כפי שמוצג באיור 7, ניתן לקשור ביעילות ארבע קלטות ביטוי sgRNA מונעות U6 לתוך וקטור עמוד השדרה pGGDestEB-4sgRNA באמצעות מכלול Golden Gate. מספר ה-sgRNAs שיש לקשור קובע את השימוש בווקטורים. לדוגמה, בעת הרכבת ארבע קלטות sgRNA, השתמש ב-pU6a:sgRNA#1, pU6a:sgRNA#2, pU6b:sgRNA#3, pU6c:sgRNA#4 ו-pGGDestEB-4sgRNA.
      1. הכן את 20 מיקרוליטר של תערובת תגובת שער הזהב המכילה: 2 מיקרוליטר של 10× מאגר אנזים הגבלה, 2 מיקרוליטר של מאגר ליגאז 10x T4 DNA, 100 ננוגרם מכל מבנה pU6x:sgRNA#x, 50 ננוגרם של וקטור יעד pGGDestIEB-4sgRNA, 1 מיקרוליטר של BsaI, 1 מיקרוליטר של T4 DNA ליגאז, ומים נטולי יונים כדי להתאים את הנפח הסופי ל-20 מיקרוליטר.
      2. הפעל את תגובת ההרכבה של שער הזהב דרך 3 מחזורים של 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן 15 דקות ב-16 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן השלם עם דגירה אחרונה של 15 דקות ב-80 מעלות צלזיוס להשבתת אנזימים.
      3. כדי לשנות, העבירו 5 מיקרוליטר מתערובת התגובה לתאים מוכשרים וצלחו על מדיום LB בתוספת אמפיצילין.
      4. בצע PCR מושבה על ידי סינון מושבות באמצעות פריימרים קדימה ואחורה של Dest (ראה טבלת חומרים) כדי לאשר את נוכחות התוספת (איור 8).
        הערה: הרצועה הראשית של 2,415 bp ודפוס סולם צריכים להיות נוכחים עבור שיבוט חיובי.
      5. חלץ פלסמידים ממושבות חיוביות ורצף באמצעות פריימרים קדימה ואחורה של Dest עבור כל יעד sgRNA.
      6. יישר את תוצאות ריצוף Sanger עם רצף הווקטור החזוי לצורך אימות.
  3. מיקרו-הזרקה וסינון מקדים של מייסדים טרנסגניים
    1. אסוף עוברים שנוצרו על ידי דגי rbm24a-RFP הומוזיגוטייםzpc:cas9 .
    2. הכן את תערובת ההזרקה על ידי שילוב של 1 מיקרוליטר של pGGDestEB-rbm24a-4sgRNA (12 ננוגרם/מיקרוליטר) עם 1 מיקרוליטר של Tol2 transposase mRNA (50 ננוגרם/מיקרוליטר).
      הערה: טהר את הפלסמיד באמצעות מיצוי פנול-כלורופורם לפני ההזרקה כדי להסיר כל שאריות RNase שאולי הוכנסו במהלך תהליך מיצוי הפלסמיד. הפלסמיד ו-Tol2 mRNA דוללו ישירות במים טהורים.
    3. מניחים כיסוי זכוכיתלהחליק בכלי בגודל 15 ס"מ. יישר את העוברים לאורך קצה הכיסוי והסר בזהירות עודפי מים באמצעות פיפטה. הזרקו 2 נ"ל מהתערובת לתוך הבלסטודיסק של כל עובר בשלב תא אחד. לאחר ההזרקה יש לשטוף בעדינות את העוברים במים כחולים ולהעביר אותם לכלי טרי. לבסוף, מניחים את המנה בחממה של 28 מעלות צלזיוס לגידול.
      הערה: הכן תמיסת עבודה מתילן כחול (מים כחולים) באופן הבא: ממיסים 180 גרם מלח ים ב-2.7 ליטר מים מזוקקים ומעקרים כדי ליצור מלאי מי ים פי 100. יש לדלל את המלאי הזה פי 200 במים מזוקקים סטריליים כדי לקבל פי 1/100 מי ים. הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת מלאי מתילן כחול של 5% (m/v) ל-1 ליטר של מי ים 1/100x אלה כדי להכין את פתרון העבודה הסופי.
    4. ב-24 hpf, עוברים נבחרים המציגים ביטוי BFP חזק ובכל מקום. ב-4 dpf, העלו רק את אלה ששומרים על אותות פלואורסצנטיים טרנסגניים חזקים (איור 9).

3. אפיון עוברים טרנסגניים כפולים

  1. פנוטיפ של עוברים טרנסגניים כפולים
    1. אסוף עוברים מנקבות מייסדות טרנסגניות פסיפס המזדווגות עם זכרים מסוג בר.
    2. הרם את העוברים החיוביים ל-BFP (BFP+) בשלב התא היחיד תחת סטרומיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    3. זהה פגמים התפתחותיים המתעוררים בעוברי BFP+ אך לא בעוברי BFP.
    4. תקן עוברים ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. בצע הכלאה שלמה באתר , צביעה אימונופלואורסצנטית או ניתוחים היסטולוגיים אחרים בעת הצורך.
      הערה: רק פנוטיפים פגומים המתעוררים אך ורק בעוברים המבטאים sgRNA חיוביים ל-GFP או BFP הם אמינים. יש להסיק מסקנות בזהירות, ויש לבסס פנוטיפים מוטנטיים אימהיים ביותר מ-10 מקרים.
  2. גנוטיפ של עוברים מוטנטיים אימהיים
    הערה: לזיהוי Mrbm24a עוברים, ניתן לאסוף אותם בקלות על ידי היעדר Rbm24a-RFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לעומת זאת, זיהוי מוטציות אימהיות של גנים אחרים מסתמך בעיקר על אסטרטגיית שאיבת תאים לפני הפעלת הגנום הזיגוטי, ואחריה ניתוח RT-PCR של mRNAs אימהיים בתאים שנאספו (איור 10).
    1. שאיבת תאים
      1. הכינו תמיסת אגרוז של 1.5% על ידי המסתה במאגר של 1/3x רינגר והרתחה עד להמסה. יוצקים את התמיסה לצלחת פטרי 90 מ"מ ומכניסים תבנית (WPI, תבניות z) לתוך האגרוז המותך. לאחר ההתמצקות, הסר בעדינות את התבנית, וכתוצאה מכך צלחת מוכנה לשימוש.
      2. השתמש בנימי זכוכית ומושך ליצירת מחטים אטומות נמסות. למחטי שאיבת תאים אופטימליות, הגדר שני משקולות קלות ואת עוצמת החימום ב-Lv1: 60 ו-Lv2: 90, ובחר בהליך שלב 2. חתוך את קצות הנימים בפינצטה מחודדת (ראה טבלת חומרים) כדי להשיג קוטר פתיחה של 30-40 מיקרומטר. לאחר מכן, צור ספייק בקצה המחט באמצעות מיקרו-זיוף, המסייע בחדירה וממזער את הנזק לעובר.
      3. הזדווגו מייסדים משוערים עם דג זברה מסוג בר ואספו את העוברים. לבודד עוברים חיוביים ל-BFP בשלב התא האחד.
      4. ב-3 hpf, יש לפרק את העוברים על ידי דגירה ב-1 מ"ג/מ"ל פרונאז ב-1/3x בופר של רינגר למשך 10 דקות ופיפטינג עדין, ולהניח בזהירות את העוברים על צלחת האגרוז המוצפת ב-1/3x בופר רינגר בתוספת 1x פניצילין-סטרפטומיצין. כוון מחדש את העוברים כך שהבלסטומר יופנה לכיוון קצה הנימים.
        הערה: חיוני להעביר את העוברים בזהירות, מכיוון שהם שבירים ביותר ללא הגנת הכוריון. אל תתנו להם לגעת במשטח המדיום!
      5. השתמש במיקרו-מזרק כדי לשאוב 20-40 תאים מכל עובר על ידי הפחתה זהירה של לחץ שיווי המשקל המפצה על כוח השאיפה מהפעולה הנימים15. שחרר תאים אלה ל-2 מיקרוליטר של H2O נטול יונים בקצה הפתיחה של צינורות PCR על ידי הגדלת לחץ שיווי המשקל.
        הערה: כדי למנוע זיהום צולב, יש לנקות את מחט הזכוכית על ידי יניקה ופליטה של H2O 3x לפני כל שאיפה.
      6. הוסף 200 מיקרוליטר של מגיב מיצוי RNA כדי לשטוף את התאים, ולאחסן באופן זמני את הצינורות על קרח. לאחר מכן, נתח את הגנוטיפים של תאים מעוברים עם או בלי פגמים התפתחותיים.
        הערה: ניתן לאחסן תאים שנשמרו במגיב המיצוי בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שהעוברים המתאימים מציגים פנוטיפים חריגים.
      7. השאירו את העוברים לאחר שאיבת התאים בצלחת האגרוז או הניחו אותם בנפרד בצלחות של 24 בארות מוצפות בתמיסת רינגר 1x המכילה 1x פניצילין-סטרפטומיצין.
        הערה: יש לנקוט בזהירות בהעברת העוברים המפורקים! בדרך כלל, אנו בוחנים 20-40 עוברים בניסוי אחד, שנמשך כשעה.
    2. ניתוח mRNA אימהי מעניין בתאים שאפתניים
      1. הוסף 40 מיקרוליטר כלורופורם לתאים במגיב המיצוי וערבב בעדינות. צנטריפוגה את התערובת בחום של 12,000 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      2. אוספים בזהירות את הסופרנטנט. הוסף 1 מיקרוליטר תמיסת גליקוגן (20 מ"ג/מ"ל) ונפח שווה של איזופרופנול (אם נפח הסופרנטנט הוא 100 מיקרוליטר, הוסף 100 מיקרוליטר איזופרופנול) וערבב היטב. דגרו את התערובת בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להקל על המשקעים.
        הערה: בשל הכמות הקטנה של ה-RNA הכולל בתאים הנשאבים, יש להוסיף גליקוגן כדי לשפר את יעילות המשקעים ולהקל על הדמיית המשקעים.
      3. צנטריפוגה את הדגימה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.
      4. שטפו את הגלולה פי 2 בתוספת של 500 מ"ל של 70% אתנול וצנטריפוגה בטמפרטורה של 12,000 × גרם למשך דקה.
      5. השליכו את הנוזל ופתחו את המכסה כדי לאפשר לגלולה להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
      6. הוסף 7 מיקרוליטר מים כדי להמיס את הגלולה. בצע שעתוק הפוך באמצעות ערכת סינתזת cDNA של גדיל ראשון, בהתאם לפרוטוקול המפורט המופיע במדריך ההוראות.
      7. להגביר את כל אזור הקידוד עם פריימרים מתאימים (ראה טבלת חומרים) ולהפעיל אלקטרופורזה של אגרוז.
      8. שיבוט תוצרי ה-PCR ורצף לפחות 30 שיבוטים עבור כל עובר כדי לנתח את המוטציה שהופיעה ב-mRNAs.
        הערה: כדי לאשר שנוכחותו של פנוטיפ פגום נגרמת על ידי מוטציה ממוקדת של הגורם האימהי המעוניין, כל העוברים (n > 5) עם פנוטיפים פגומים צריכים להראות היעדר תעתיקים אימהיים מסוג בר. לעומת זאת, mRNA אימהי מסוג פרא צריך להיות נוכח בכל העוברים המבטאים sgRNA המתפתחים באופן נורמלי (n > 5). יחד עם זאת, בעוברים שליליים sgRNA, ניתן לזהות רק mRNA מסוג בר (n > 5).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

יצירה מהירה של מוטציות אימהיות rbm24a
בנינו וקטור טרנסגני המאפשר ביטוי של סמן BFP אימהי וארבעה sgRNAs יעילים ביותר המכוונים לרצף הקידוד rbm24a. בעקבות הכנסת וקטור זה לעוברים הומוזיגוטיים rbm24a-RFP KIzpc:cas9 באמצעות טרנספוזיציה של Tol2, Mrbm24a זוהה בקלות ובמהירות בקרב עוברי F1 חיוביים ל-BFP עקב היעדר חלבון Rbm24a-RFP (איורe 11A-D). כ-...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מוטציות זיגוטיות קטלניות מעכבות את ניתוח התרומה האימהית של הגן. אסטרטגיות חלופיות, בעיקר החלפת קו נבט ומיקרו-הזרקת ביציות באתרה (OMIS), תובעניות מבחינה טכנית 6,8. בתהליך השתלת תאים של החלפת קו הנבט, העובר המקבל מקבל מעט מאוד PGCs, ולעתים קרובות מונע התפתחות נקבית תקינה 16,17,18. שימוש ב-PGCs מושרים (iPGCs) בהחלפת קו הנבט מציע שיפור מינימ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

פרוטוקול זה הוענק כפטנט על ידי מינהל הקניין הרוחני הלאומי של סין, אשר יקל על השימוש המוגבל בשיטה לאחר קבלת אישור המחברים. המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים או כלכליים אחרים.

תודות

אנו מודים לג'יאנלין שן, ייטנג שו וצ'ינגצ'ינג ווי מפלטפורמת הליבה של המתקן והשירות בבית הספר למדעי החיים. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענקים 32170816, 32370860, 32450630 ו-31871451), תוכנית של חוקרים מצטיינים בגיל העמידה וצעירים של אוניברסיטת שאנדונג, חוקרי טאי-שאן של מחוז שאנדונג.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2x M5 HiPer Taq PCR mixמיי5ביוחתול#MF001-BD-100
אגרוזמ.ד.ביוחתול#A006L
ערכת AxyPrep Plasmid Miniprepאקסיג'ןחתול#AP-MN-P-4
מכשיר אלקטרופורזה נימית (Qsep400)BiOpticלא ישים
תערובת תיוג DIGרושחתול#11277073910
דנאס ארושחתול#4716728001
DTTתרמו פישר סיינטיפיקחתול#R0861
ערכת סינתזת cDNA גדיל ראשוןטרנסג'ן ביוטקחתול#AT301
GenCrispr NLS-Cas9-NLS נוקלאזGenScriptחתול#Z03389
נימי זכוכית (1.0 x 100 מ"מ)מפעל ציוד חינוכי רנטאיחתול#OS-2B
גליקוגןBBI מדעי החייםחתול#28985
פריזמה GraphPad 9GraphPadhttps://www.graphpad.com/
תמונהJקוד פתוחhttps://imagej.net/software/fiji/
אגרוז נמס נמוךביוטכנולוגיהחתול#CA1351
Microforge (MF2)נארישיגהלא ישים
מיקרו-ספקטרופוטומטר (Nano-300)אלשנגלא ישים
אוליביהאולימפוסלא ישים
פניצילין-סטרפטומיציןג'יבקוחתול#15140122
מזרק פיקו-ליטר (PLI-100A) מנגנון הרווארדלא ישים
פינצטה מחודדתWPIחתול#500341
פינצטה מחודדת  WPI 500341
חולץ (PC-100)נארישיגהלא ישים
מעכב RiboLock RNaseתרמו פישר סיינטיפיקחתול#EO0381
rNTPתרמו פישר סיינטיפיקחתול#R0481
חרוזים מגנטיים סיליקון הידרוקסילסנגון ביוטקחתול#B518720-0001
T7 RNA פולימראזנבחתול#M0251L
זולדWPIתבניות Z של Cat#

מקורות

  1. Fuentes, R., et al. The maternal coordinate system: Molecular-genetics of embryonic axis formation and patterning in the zebrafish. Curr Top Dev Biol. 140, 341-389 (2020).
  2. Yan, L., et al. Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates. Science. 362 (6417), eaat1045(2018).
  3. Abrams, E. W., et al. Molecular genetics of maternally-controlled cell divisions. PLoS Genet. 16 (4), e1008652(2020).
  4. Shao, M., et al. Rbm24 controls poly(A) tail length and translation efficiency of crystallin mRNAs in the lens via cytoplasmic polyadenylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (13), 7245-7254 (2020).
  5. Weidinger, G., et al. dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol. 13 (16), 1429-1434 (2003).
  6. Ciruna, B., et al. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14919-14924 (2002).
  7. Xing, Y. Y., et al. Mutational analysis of dishevelled genes in zebrafish reveals distinct functions in embryonic patterning and gastrulation cell movements. PLoS Genet. 14 (8), e1007551(2018).
  8. Wu, X., Shen, W., Zhang, B., Meng, A. The genetic program of oocytes can be modified in vivo in the zebrafish ovary. J Mol Cell Biol. 10 (6), 479-493 (2018).
  9. Zhang, C., et al. Generation of zebrafish maternal mutants via oocyte-specific knockout system. Bio Protoc. 14 (21), e5092(2024).
  10. Zhang, C., et al. Rapid generation of maternal mutants via oocyte transgenic expression of CRISPR-Cas9 and sgRNAs in zebrafish. Sci Adv. 7 (32), abg4243(2021).
  11. Li, J., et al. Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Cell Res. 25 (5), 634-637 (2015).
  12. Zhang, Y., et al. Rbm24a dictates mRNA recruitment for germ granule assembly in zebrafish. EMBO J. 44 (11), 3121-3149 (2025).
  13. Xia, Y., et al. T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 47 (3), e15(2019).
  14. Yin, L., et al. Multiplex conditional mutagenesis using transgenic expression of Cas9 and sgRNAs. Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).
  15. Shao, M., Cheng, X. N., Liu, Y. Y., Li, J. T., Shi, D. L. Transplantation of zebrafish cells by conventional pneumatic microinjector. Zebrafish. 15 (1), 73-76 (2018).
  16. Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev Biol. 324 (2), 277-287 (2008).
  17. Aharon, D., Marlow, F. L. Sexual determination in zebrafish. Cell Mol Life Sci. 79 (1), 8(2021).
  18. Ye, D., et al. Abundance of early embryonic primordial germ cells promotes zebrafish female differentiation as revealed by lifetime labeling of germline. Mar Biotechnol (NY). 21 (2), 217-228 (2019).
  19. Wang, X., et al. Induced formation of primordial germ cells from zebrafish blastomeres by germplasm factors. Nat Commun. 14 (1), 7918(2023).
  20. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  21. Bertho, S., et al. Zebrafish dazl regulates cystogenesis and germline stem cell specification during the primordial germ cell to germline stem cell transition. Development. 148 (7), dev.187773(2021).
  22. Houwing, S., et al. A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in Zebrafish. Cell. 129 (1), 69-82 (2007).
  23. Shao, M., et al. Vegetally localised Vrtn functions as a novel repressor to modulate bmp2b transcription during dorsoventral patterning in zebrafish. Development. 144 (18), 3361-3374 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Tol2PCR
דור של מוטציות אימהיות באמצעות zpc:cas9 Knock-in Zebrafish
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.