מאמר שיטה

צמצום להשפעה גדולה: ייצור יעיל של וירוסים רקומביננטיים הקשורים לאדנו בתפוקה גבוהה

DOI:

10.3791/68646

⸱

12 בספטמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Roche Pharma Research and Early Development, Therapeutic Modalities, Roche Innovation Center Basel, Hoffmann-La Roche Ltd, 2Roche Pharma technical development Cell and Gene Therapy, Roche Innovation Center Munich, Roche Diagnostics GmbH, 3Center of Biomedical Education and Research - ZBAF, University of Witten/Herdecke, 4Roche Pharma Research and Early Development, Therapeutic Modalities, Roche Innovation Center Munich, Roche Diagnostics GmbH, 5Biozentrum, University of Basel

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות היותם בשימוש נרחב בהעברת גנים, וקטורים נגיפיים רקומביננטיים הקשורים לאדנו-(rAAV) מתמודדים עם אתגרי ייצור בולטים. פרוטוקול זה מתאר שיטות ייצור בקנה מידה מיקרו ומיני-סקאלה באמצעות תאים נצמדים ותרחיפים כאחד. השיטות מייעלות את היצירה, הטיהור והאופטימיזציה של וקטורים, ובכך מאיצות את המחקר הפרה-קליני ומקלות על ההתקדמות בצנרת הריפוי הגנטי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנים האחרונות, וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו-רקומביננטיים (rAAV) התגלו כפלטפורמה מובילה ליישומי ריפוי גנטי. עם זאת, תהליכי הייצור והטיהור המסורבלים נותרו צווארי בקבוק משמעותיים בפיתוח תרופות. ייצור rAAV בתפוקה גבוהה ובקנה מידה קטן ללא הליכי טיהור עתירי עבודה וגוזלי זמן מציע אסטרטגיה חלופית רבת ערך להאצת מחקר פרה-קליני וסינון טיפולי בשלב מוקדם. גישה זו מאפשרת יצירה מהירה של גרסאות rAAV מגוונות או מבנים טיפוליים באיכות מספקת להערכה ראשונית במבחנה וב-vivo . פרוטוקול זה מציג שתי שיטות הנבדלות לפי סוג התא וקנה המידה של הייצור: ייצור בקנה מידה מיקרו וייצור rAAV בקנה מידה זעיר. ייצור בקנה מידה מיקרו מתבצע בפורמט של 6 בארות באמצעות תאי כליה עוברית אנושית (HEK) 293T (מיקרו-6-באר), בעוד שייצור בקנה מידה זעיר משתמש בתאי תרחיף בצלחות של 24 בארות (mini-HT24). וקטורים הנוצרים בשיטות אלה עוברים ניתוחים במורד הזרם כדי לייעל את תנאי התרבות של התאים ו/או משמשים להערכת הפעילות הביולוגית של טרנסגנים. קריאות אנליטיות מרכזיות כוללות טיטרציה של גנום וקטורי (vg/mL), קביעת טיטר קפסיד (vp/mL), ניתוח כתמים מערביים ומבחני התמרת תאים. בנוסף, וקטורים המיוצרים בקנה מידה זעיר ומטוהרים למחצה באמצעות שרפי זיקה מושווים לתכשירים בקנה מידה בינוני המטוהרים באמצעות שיפועי צפיפות צזיום כלוריד. השיטות היעילות המתוארות כאן מדגימות פוטנציאל משמעותי לחידוד פרמטרים של תרבית תאים, זיהוי מועמדים מובילים במהלך הקרנות (כלומר, קלטות טרנסגנים אופטימליות או קפסידים AAV מעולים), ושיפור ביטוי הטרנסגנים. ביחד, זרימות העבודה המוצגות תומכות בהקמת פלטפורמה חזקה ויעילה לפיתוח איטרטיבי בצנרת הריפוי הגנטי שניתן ליישם בקלות בכל מעבדת מחקר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח תרופות הוא תהליך מורכב ועתיר משאבים הדורש שילוב נתונים באיכות גבוהה משלבים שונים, כולל זיהוי מטרות, אימות פרה-קליני וניסויים קליניים1. בתגובה לדרישות הגוברות ללוחות זמנים מהירים יותר ולהפחתת עלויות2, תעשיית התרופות אימצה יותר ויותר בדיקות בקנה מידה קטן בתפוקה גבוהה (HT) בשילוב עם בינה מלאכותית מתקדמת (AI) כאבן פינה של אסטרטגיות פיתוח מודרניות 3,4,5. מבחני HT מאפשרים סינון והערכה מהירים של מספר רב של מועמדים לתרופות או משתני בדיקה בשבריר מהזמן והעלות בהשוואה לשיטות מסורתיות 5,6.

ביישומי ריפוי גנטי, במיוחד אלה המשתמשים בווקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו-(AAV), העלות הגבוהה של סחורות ולוחות הזמנים הארוכים של הייצור מציבים אתגרים משמעותיים7. תהליך הפיתוח מתחיל בייצור חומר הפלסמיד הנדרש לטרנספקציה, ואחריו צמיחת תאים לצפיפות גבוהה המספיקה לייצור וקטור ויראלי. לאחר הטרנספקציה, נדרשת תקופת דגירה של יומיים עד חמישה ימים לפני הקטיף, והתהליך מסתיים בטיהור ואפיון אצווה 8,9. באופן קולקטיבי, זרימת עבודה זו יכולה להימשך עד חודש והיא מוגבלת בדרך כלל למספר מוגבל של תכשירים שיכולים לפעול במקביל בעת שימוש בעמודות זיקה או אולטרה-צנטריפוגה שיפוע 9,10,11,12.

מתוך הכרה בצורך בפרוטוקולי ייצור AAV קטנים, מיני-או מיקרו-סקאלה, התחום אימץ מספר גישות לייצור AAV רקומביננטי (rAAV) במערכי מעבדה קטנים. גישות אלו כוללות בדרך כלל שימוש במספר צלחות של 15 ס"מ לתאים דבקים13,14 או 50-2000 מ"ל15 צלוחיות שייק לתרביות תרחיף. בעבר נעשה שימוש בשיטות טיהור AAV, כגון אולטרה-צנטריפוגה שיפוע (למשל, יודיקסנול16, צזיום כלוריד (CsCl)17, או שיפועי סוכרוז18). שיטה זולה ובלתי תלויה בסרוטיפ זו התאימה מאוד לייצור rAAV בקנה מידה מעבדתי, אך אופייה עתיר העבודה ויכולת האולטרה-צנטריפוגה המוגבלת שלה הופכים אותה לפחות תורמת ליישומים בעלי תפוקה גבוהה19,20.

הביקוש המתמשך לתפוקה גבוהה יותר הוביל לבחינת גישות חלופיות להפחתת ייצור rAAV. באמצעות תאים דבקים, נחקרו פורמטים כגון 6 בארות 13,21,22, 96 בארות23 ואפילו 384 בארות24. לאחרונה אומצו תאי תרחיף בהתחשב ביכולת ההרחבה המשופרת שלהם ובעוצמה הניתנת להשוואה, או אפילו עדיפה של תכשירים וקטוריים8.

עם זאת, ייצור תפוקה גבוהה של rAAV בתאי תרחיף עם נפחי תרבית נמוכים מ-15 מ"ל נותר תחום מיוחד, עם פרוטוקולים מוגבלים שפורסמו 7,25,26. רוב המחקרים מתמקדים בנפחים גדולים יותר כדי להשיג תשואות מספיקות עבור יישומים במורד הזרם 8,9,27, אך כמו עם תאים נצמדים, פורמטים בקנה מידה זעיר מציעים הפחתה משמעותית בצריכת המשאבים ובזמן העיבוד, ובכך עונים על צורך קריטי בתחום. חשוב לציין, פרוטוקולים בקנה מידה זעיר ומיקרו משתמשים לעתים קרובות ב"ליזטים גולמיים", או קציר תרבית תאים לא מטוהרים המכילים חלקיקים וקטוריים, לאפיון וניתוח במורד הזרם.

מחקר זה מתאר שני פרוטוקולים המשתמשים הן בתאי יצרן דבקים והן בתרחיף (איור 1). ליזטים גולמיים של rAAV המיוצרים מתאי HEK293T דבקים משמשים ישירות ליישומים הבאים, כגון התמרה של תאי מטרה. לעומת זאת, rAAVs הנוצרים בתאי תרחיף עוברים עיבוד נוסף באמצעות טיהור זיקה ושרף בתפוקה גבוהה. שיטות אלו פותחו במיוחד כדי לשפר את התפוקה, להעריך את איכות הווקטור ולנטר ביטוי טרנסגנים, כל זאת תוך מזעור הצריכה של ריאגנטים וחומרים יקרים. התוצאות המוצגות כאן מראות שגם ליזטים גולמיים (מתאים דבקים) וגם חומר מטוהר זיקה (מתאי השעיה) מתאימים, בהתאם להיקף היישום. יתר על כן, rAAV שהושג באמצעות שרפי זיקה הושווה ישירות לעמיתיהם שטוהרו באמצעות אולטרה-צנטריפוגה מסורתית של צזיום כלוריד במונחים של תפוקה, טוהר ויעילות התמרה בתרבויות עצביות שמקורן בבני אדם.

אימוץ בדיקות בקנה מידה קטן בתפוקה גבוהה בפיתוח תרופות לטיפול גנטי מייצג התקדמות הכרחית, מאיצה חדשנות ומגשרת על הפער בין תגליות מדעיות למציאות טיפולית. שיטות אלו לא רק מפחיתות עלויות ולוחות זמנים, אלא גם מאפשרות בדיקה מקבילה של מצבים רבים, ובסופו של דבר תורמות לפיתוח יעיל של טיפולים טרנספורמטיביים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ייצור מיקרו-6 בארות של וקטורי rAAV בתאים דבקים

הערה: ייצור המיקרו-6 בארות של rAAV הוא גרסה מותאמת מפרוטוקול שפורסם בעבר על ידי Fakhiri et al.21.

  1. זריעה וטרנספקציה של תאי HEK293T
    1. הפשירו בקבוקון של HEK293T תאים28 באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    2. העבירו תאים ל-30 מ"ל של מצע תרבית תאים דבק בצלוחיות T175 ושמרו במדיום הנשר השונה (DMEM) של Dulbecco + 10% סרום עגל עוברי (FCS), ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
    3. פיצול HEK293T כל 2-3 ימים: שאפו מדיום תרבית תאים והוסיפו בזהירות 10 מ"ל של מי מלח חוצץ פוספט (PBS) כדי לשטוף את התאים.
      הערה: רק מעברי תאים מתחת למעבר מספר 15 שימשו בפרוטוקול זה כדי להבטיח את שלמות ובריאות התאים, מה שמשפיע ישירות על ייצור rAAV.
    4. הוסף לתאים 2 מ"ל של 0.025% חומצה טריפסין/אתילנדיאמין-טטראצטית (EDTA) ודגירה למשך 2 דקות ב-37 מעלות צלזיוס (או עד שהתאים מתנתקים).
    5. עצור את התגובה על ידי הוספת 20 מ"ל של מדיום טרי והשעיית התאים במדיום באמצעות פיפטה של 25 מ"ל. בהתאם למפגש, ניתן לדלל תאים 1:10 או 1:20 ב-24 מ"ל של מדיום גלוקוז גבוה DMEM. כדי להשיג צפיפות תאים מספקת לטרנספקציה, זרע 7 × 106 HEK293T תאים בבקבוק T175.
    6. לאחר 72 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, קצרו את התאים על ידי טריפסיניזציה (כמתואר בשלב 1.1.3-1.1.5), השעו מחדש ב-20 מ"ל של מדיום וספרו את התאים.
      הערה: ניתן לספור תאים בשיטות שונות, בהתאם לדיוק, לתפוקה ולציוד הזמין. בעיקר, נעשה שימוש בשתי גישות: ספירה ידנית (תא נויבאואר) ומוני תאים אוטומטיים. פרוטוקול זה משתמש במנתח תאים אוטומטי לחלוטין מבוסס תמונה כדי למדוד פרמטרים קריטיים של תאים כגון כדאיות, צפיפות תאים וקצב צבירה.
    7. תאי זרע בצפיפות של 0.5 × 106 תאים / באר בצלחת של 6 בארות. כדי להפיץ תאים באופן שווה, יש לנער בעדינות את הצלחת ולהניח אותה בחממת CO2 .
    8. לאחר 24 שעות, התאים מגיעים למפגש של 60-70% וניתן לעבור אותם משולש.
    9. עבור כל באר, מערבבים 90 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום עם סך של 2.6 מיקרוגרם DNA פלסמיד, כולל pTransgene, pRep/Cap ו-pHelper ביחס מולארי של 1:1:1.
    10. בשפופרת שנייה, הוסף 5 מיקרוליטר של פוליאתילנימין (PEI) ל-90 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום ממש לפני הטרנספקציה.
    11. לאחר שילוב שתי התמיסות, מערבלים את התערובת ודוגרים בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 דקות.
    12. הוסף את תערובת הטרנספקציה טיפתית לכל באר. נענע בעדינות את הצלחות לפני שמחזירים אותן לחממה.
      הערה: ניתן לבצע שינוי בינוני לאחר טרנספקציה, אך הוא לא יושם כפרקטיקה סטנדרטית, מכיוון שהתאים שמרו על כדאיות טובה לאורך כל הניסוי.
  2. קציר וליזה של תאים
    1. 72 שעות לאחר הטרנספקציה, שאפו בזהירות את מדיום התא מהלוח/ים.
    2. נתק תאים על ידי הוספת 500 מיקרוליטר PBS לכל באר, ופיפטה בזהירות למעלה ולמטה.
    3. העבירו את מתלה התא לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
    4. מדוד את הכדאיות והצפיפות של התאים באופן ידני או אוטומטי על-ידי ביצוע הוראות היצרן.
    5. העבר 50 מיקרוליטר מהמתלה לצלחת תחתונה של 96 U כדי לקבוע את יעילות הטרנספקציה על ידי כימות אוכלוסיות חיוביות לדיווח באמצעות ציטומטריית זרימה.
      הערה: תמיד מומלץ לבצע בקרת טרנספקציה במקביל, כלומר, טרנספקציה של 1-2 בארות עם טרנסגן הנושא חלבון פלואורסצנטי (למשל, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), mCherry וכו') כדי לפקח על יעילות הטרנספקציה בצלחת. בארות עם תאים שאינם מתמרים משמשות כבקרה שלילית.
    6. צנטריפוגה את תרחיף התאים הנותר ב-800 × גרם למשך 10 דקות ב-RT לתאי גלולה, המכילים את החלק העיקרי של הווקטורים המיוצרים.
    7. השליכו תאים סופרנטנטים והשעו מחדש ב-100 מיקרוליטר של PBS. ניתן לאחסן את מתלה התא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: כדי להשיג ליזאט גולמי מהתאים שנקטפו, השתמש באחת משתי הגישות המתוארות להלן.
    8. בגישה הראשונה, ניתן לעבור תאים לחמישה מחזורי הקפאה-הפשרה, כל אחד 5 דקות, באמצעות אמבט מים מחומם מראש של 37 מעלות צלזיוס וחנקן נוזלי. מערבולת קצרה את הדגימות בין המחזורים למשך 2-3 שניות.
    9. האפשרות השנייה והמשמשת בעיקר בפרוטוקול זה היא סוניקציה. כאן, העבירו את מתלה התא לצלחות או צינורות תגובת שרשרת פולימראז (PCR) בעלי קירות דקים והניחו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בסוניקטור אמבט מים.
      1. דגימות סוניקט למשך 3 דקות בסך הכל במרווחים של 30 שניות הפעלה-כיבוי במשרעת (עוצמה) של 25%.
    10. לאחר סוניקציה, גלולה את התאים באמצעות צנטריפוגה שולחנית (16,100 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס) כדי להסיר פסולת תאים ולקבל תרחיף וקטורי נטול תאים.
    11. העבירו סופרנטנטים לצינורות של 1.5 מ"ל ופיפטה 10 מיקרוליטר מכל דגימה לתוך צלחת 96 בארות בעלת קשירה נמוכה לניתוח טיפות דיגיטליות (dd)PCR או דיגיטלי (d)PCR.
    12. אחסן את הצינורות וצלחות 96 בארות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
  3. התמרה של תאי HEK293A באמצעות ליזטים גולמיים
    הערה: ייתכן שתאי HEK293A לא יתאימו לכל הסרוטיפים של AAV. כדי לזהות קו תאים מתאים, אנא עיין במאגרי מידע כגון SPIRIT29 (ראה טבלת חומרים לקישור למסד הנתונים של SPIRIT) או מאמרי מחקר מקוריים רלוונטיים30,31.
    1. זרע HEK293A תאים בשלוש צלחות של 96 בארות יום אחד לפני ההתמרה בצפיפות של 1.5 × 106 תאים לצלחת.
    2. למחרת, ערבבו 10 מיקרוליטר של הווקטורים המיוצרים עם נפחים שונים של PBS כדי ליצור דילולים של 1:2, 1:10 ו-1:100.
    3. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, התמרו את התאים בלוחות של 96 בארות בטריפליקטים טכניים.
    4. דגירה של תאים עם ה-rAAVs ללא החלפה בינונית למשך 72 שעות. לאחר מכן, בצע את הניסויים במורד הזרם בהתאם לטרנסגן המתבטא, כגון מדידות רמת חלבון, ניתוח ציטומטריית זרימה לביטוי חלבון פלואורסצנטי, ניתוחי נוקדאון/נוקאאוט וכו'.
    5. עבור ציטומטריית זרימה סטנדרטית כפי שמבוצעת בפרוטוקול זה, שאפו את המדיום ונתקו את התאים על ידי הוספת 25 מיקרוליטר של 0.025% טריפסין/EDTA.
    6. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
    7. עצור את התגובה על ידי הוספת 175 מיקרוליטר של 1% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS לכל באר.
    8. השתמש ב-100 מיקרוליטר של תרחיף התא לניתוח ציטומטריית זרימה.

2. ייצור Mini-HT24 של וקטורי rAAV בתאי תרחיף

הערה: במערך ה-mini-HT24, בניגוד לייצור המיקרו-6-בארות שתואר קודם לכן, תכשירים מטוהרים של וקטורי rAAV נוצרים באמצעות תאי השעיה. תרביות תרחיף מניבות כמויות גבוהות יותר של rAAV בשל צפיפות התאים המוגברת שניתן להשיג באותו נפח תרבית. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בפורמט באר בעומק 24. ליזטים של תאים גולמיים מטוהרים בתפוקה גבוהה באמצעות שרפים בעלי זיקה AAVX במטרה לייצר מוצרים נקיים יותר הנדרשים ליישומים מסוימים שבהם ליזטים גולמיים אינם מתאימים (ראה סעיף דיון).

  1. טיפוח והעברה משולשת של תאי השעיה בלוחות באר בעומק 24
    1. הפשירו בקבוקון של תאי ייצור נגיפיים (VPC) באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. תאי מעבר פחות מ-30 פעמים כדי להבטיח את האיכות העקבית של הווקטורים המיוצרים.
    2. העבירו תאים ל-30 מ"ל של מצע תרבית מתלה בבקבוק ניעור ותרבו אותם במשך 2-3 ימים בתנאי תרבית תחזוקה: 37 מעלות צלזיוס, 8% CO2, 95% לחות ו-140 סל"ד (רדיוס פלטפורמת טלטול 25 מ"מ).
    3. קבע צפיפות תאים בת קיימא לאחר 2-3 ימים (ראה הערה בשלב 1.1.6). המשך בתת-תרבות והרחבה עד להשגת המספר הרצוי של תאים ברי קיימא הנדרשים לייצור AAV.
      הערה: תאי תת-תרבית בצפיפות בת קיימא של > 4 × 106 תאים/מ"ל ו-< 6 ×-106 תאים/מ"ל או על פי הוראות היצרן בהתבסס על קו התאים הבודד בו נעשה שימוש. זרע בצפיפות בת קיימא של 6 × 105 תאים/מ"ל למשך 3 ימים, מפוצל או 3 × 105 תאים/מ"ל למשך 4 ימים. מפוצל לפי הוראות היצרן.
    4. זרע 3 × 106 תאים/מ"ל ב-2.5 מ"ל מכל באר של צלחת הבאר בעומק 24 וכסה את הצלחת במכסה קרום סטרילי.
    5. הכן את תערובת הטרנספקציה המשולשת עבור כל מבנה rAAV באופן הבא:
      1. הכן תערובת DNA של פלסמידי הייצור (pHelper, pRep/Capsid, pTransgene) ביחס מולארי של 1:1:1 במסה סופית של 600 ננוגרם DNA לכל 1 × 106 תאים ברי קיימא.
      2. הכן את התערובת במדיום תרבית השעיה בנפח סופי של 2.5% מנפח התרבות שיש להעביר.
      3. הכן את PEI-Mix במדיום תרבית מתלה בנפח סופי של 2.5% מנפח התרבות שיש להעביר. השתמש במסה סופית של 1 ננוגרם PEI לכל 1 ננוגרם DNA.
      4. שלב גם את ה-DNA-Mix וגם את PEI-Mix על ידי העברת כל הנפח של ה-PEI-Mix הבודד ל-DNA-Mix המתאים, וכתוצאה מכך נפח תערובת טרנספקציה של 5% מנפח התרבית.
      5. מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים.
        הערה: אין לערבב את תערובת הטרנספקציה לאחר זמן הדגירה כדי למנוע הפרעה של קומפלקסים PEI-DNA שנוצרו במהלך הדגירה32.
      6. דגירה ב- RT למשך 10 דקות.
    6. הוסף את תערובות הטרנספקציה טיפה לבארות המתאימות תוך ניעור צלחת הבאר העמוקה בזהירות.
    7. אטמו את הצלחת באמצעות סרט זהורית נושם סטרילי וכסו אותה בנוסף במכסה הממברנה המתאים כדי למזער את האידוי.
    8. וודאו שהצלחת מונחת על מגש שייקר מתאים לבאר עמוקה וקבעו אותה היטב.
    9. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 8% CO2, 95% לחות ו-225 סל"ד למשך 72 שעות.
      הערה: פורמטים שונים של לוחות באר עמוקים דורשים הערכה פרטנית של מהירות הטלטול כדי לאפשר חילופי גז ותרבות יעילים של תאים בתרחיף הומוגני מבלי שהתאים ישקעו לקרקעית לאורך זמן. זה דורש בדיקה ראשונית התלויה בציוד המעבדה הבודד ובהגדרה, כמו גם בקווי התאים המשמשים לייצור. שקול במיוחד רדיוס טלטול, פורמט צלחת וצורת תחתית טובה כדי לשמור על מתלה התאים הומוגני וכדי למנוע שקיעה של תאים לתחתית.
  2. קציר וליזה
    1. קצור תאים על ידי העברת נפח התרבית המלא של כל באר לצינורות 5 מ"ל המסומנים בנפרד, וצנטריפוגה ב-800 × גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    2. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-550 מיקרוליטר של PBS של Dulbecco (D)PBS והעבירו את המתלה לצינור מכסה בורג של 1.8-2.0 מ"ל כדי למנוע אירוסולים וטיפות בעת פתיחת הצינורות.
      הערה: ניתן לאחסן כדורים גם בשלב זה כדי להמשיך בתהליך הטיהור מאוחר יותר. אחסן את הכדורים התלויים של Dulbecco עם חוצץ פוספט (DPBS) בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס והקפד לקחת זאת בחשבון במהלך שלבי מחזור ההקפאה-הפשרה.
    3. הכן ליזטים על ידי הנחת הצינורות בחנקן נוזלי למשך כ-2 דקות, ולאחר מכן הפשרתם באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. חזור על מחזור זה פי 3-5.
    4. צנטריפוגה ליזאטית למשך 5 דקות ב-1000 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס. מכסים את דליי הצנטריפוגה במכסים אטומים לתרסיס.
    5. הסר בזהירות צינורות מהצנטריפוגה.
      הערה: ליזטים צריכים להיות שקופים וללא פסולת או עכירות גלויה כדי למנוע סתימת השרף המשמש בתהליך הטיהור. הימנע מטלטול או הפרעה לכדורים. חזור על שלב הצנטריפוגה למקרה שהסופרנטנטים אינם ברורים. שקול מהירות צנטריפוגה גבוהה יותר או משך זמן ארוך יותר במקרה של דגימות מרוכזות מאוד או דגימות עם כמויות גדולות של פסולת.
  3. טיהור rAAV בתפוקה גבוהה מבוסס שרף זיקה
    1. בכוס, הכינו את מאגר ה-Elution על ידי הוספת 720 מ"ג חומצת לימון ל-50 מ"ל מים טהורים במיוחד כדי להגיע לריכוז סופי של 75 מ"מ חומצת לימון.
    2. מערבבים את המאגר עד שהאבקה נמסה לחלוטין.
      הערה: ודא שנפח הבאר מספיק כדי להכיל את נפחי החיץ וקצות הפיפטות מבלי לשפוך או להסתכן בזיהום צולב של בארות שכנות.
    3. התאם את ה-pH ל-3.0 על ידי הוספה טיפתית של 1 M חומצה הידרוכלורית (HCl) תוך ערבוב מתמיד של המאגר ומדידה עם אלקטרודת pH.
    4. הפעל סינון סטרילי על המאגר באמצעות גודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר.
    5. הכן עמודים של צלחת באר עמוקה 96 בנפח באר של 2-2.2 מ"ל לטיהור על פי התוכנית המתוארת בטבלה 1.
      הערה: הדגימות כאן טוהרו באמצעות מערך פיפטה אלקטרוני רב ערוצי. התהליך תואם למערכות אוטומטיות לטיפול בנוזלים וניתן להגדיל אותו לתפוקת דגימה גבוהה יותר.
    6. הפעל את הטיהור בארון בטיחות ביולוגית ב-RT באמצעות פרמטרים המוצגים בתוכנית הטיהור (ראה טבלה 1) או בצע אופטימיזציה של פרמטרים בהתאם לדרישות האישיות, בהתאם לנפח השרף או הדגימה, הטיטר הצפוי וכו'.
    7. לאחר השטיפה, הוסף 1/4 נפח פליטה של מאגר נטרול לכל דגימה.
    8. מערבבים על ידי פיפטינג 80% מהנפח פי 10 למעלה ולמטה.
    9. הכן את לוחות הדיאליזה על ידי הסרת קלטות הממברנה והוספת 1600 מיקרוליטר של מאגר דיאליזה לכל באר.
      הערה: הקפד לא לבוא במגע של הממברנות עם נוזל לפני ביצוע הדיאליזה, מכיוון שייבוש מחדש עלול לפגוע בשלמות הממברנה ובתפקודה.
    10. העבר את נפח הדגימה המלא (מקסימום 300 מיקרוליטר) לקלטת דיאליזה עם פורמט נפח מתאים וגודל נקבוביות הממברנה (≥-20,000 חיתוך משקל מולקולרי (MWCO)). ודא שהממברנות עמוסות בצורה הומוגנית ואין בועות אוויר.
    11. הניחו את הקלטות בבארות העמוסות של צלחת הדיאליזה ואטמו את הצלחת בנייר כסף.
    12. העבירו את לוחית הדיאליזה למשטח טלטול ודגרו ב-300 סל"ד, 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    13. החלף את מאגר הדיאליזה וחזור על הדגירה ב-300 סל"ד, 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    14. חזור על החלפת מאגר ודגירה פי 3 בסך הכל.
    15. העבר את הנפח המלא של הדגימות הדיאליזה לצינורות אחסון מסומנים ואחסן אותם ב-4 מעלות צלזיוס אם הם משמשים לאחר מכן לאפיון או לניסויים אחרים.
    16. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. הימנע ממחזורי הפשרה בהקפאה מכיוון שהדבר יכול להשפיע על עוצמת ה-AAVs, והכן מינויים בנפח קטן במידת הצורך.
  4. טיטרציה של טיטר גנומי rAAV מליזטים גולמיים וטיהור מבוסס שרף באמצעות PCR דיגיטלי (dPCR)
    1. כדי לקבוע את הטיטר הגנומי של הליזטים הגולמיים, כלומר, גנומים נגיפיים למ"ל (vg/mL), הפשירו את דגימות הווקטור שנאספו ב-RT ולאחר מכן פיפטה 10 מיקרוליטר לתוך צינור.
      הערה: קיימות מספר שיטות לקביעת טיטר הגנום הנגיפי (vg/mL) של תכשיר וקטורי, כאשר כימות מוחלט מסתמך בדרך כלל על שתי גישות עיקריות: השיטה המבוססת על טיפות או תחליב (ddPCR), והשיטה המבוססת על מיקרו-פלטות, המיוצגת על ידי PCR דיגיטלי (dPCR)33,34. בנוסף לשיטות דיגיטליות אלה, ניתן להשיג כימות מוחלט גם באמצעות PCR כמותי (qPCR). בעוד ש-qPCR היא באופן מסורתי שיטת כימות יחסית, ניתן להתאים אותה לכימות מוחלט על ידי שימוש בעקומה סטנדרטית של פלסמיד. זה כרוך בפלסמיד המכיל את רצף המטרה בריכוז ידוע, המשמש כהתייחסות לאקסטרפולציה של טיטר הגנום הנגיפי21,33. למרות ש-qPCR מהיר יותר וזול יותר מ-ddPCR או dPCR, הוא פחות מדויק ומסתמך במידה רבה על הדיוק של תקן הפלסמיד16. ללא קשר לשיטת הכמות, יש לטפל בדגימות מראש כדי לשחרר את הגנום הנגיפי מהחלקיקים. פרוטוקול זה עוקב אחר שיטה שתוארה בעבר על ידי Dobnik, D. et al35.
    2. טפל בדגימות rAAV עם נוקלאז ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לפרק DNA פלסמיד חופשי מתהליך הטרנספקציה.
      הערה: אופציונלי, בהתאם לאנזים המשמש: מחממים דגימות ל-95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לנטרל את האנזים ולייז את הקפסיד של הווקטור.
    3. לאחר הקירור ל-RT, הוסף פרוטאינאז K למשך 15 דקות כדי לעכל שברי קפסיד.
    4. לנטרול פרוטאינאז K, יש לחמם שוב את הדגימות ל-95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    5. הכן את תערובות המאסטר ddPCR או dPCR על ידי ביצוע הוראות היצרן.
    6. השתמש בבדיקות DNA מסומנות מכיוון שהן מספקות אות ספציפי יותר מאשר צבעים משולבים. תכנן בדיקות שייקשרו "באופן מרכזי" בגנום הנגיפי, כלומר בטרנסגן (ראה הערה), ולא במקדם או בזנב הפוליA, ובחר פלואורופור כמו hexachloro-6-carboxyfluorescein (HEX) או 6-carboxyfluorescein (FAM) התואם למערכת ה-PCR המתאימה.
      הערה: לאחרונה, נעשה שימוש ב-multiplex ddPCR או dPCR, תוך שימוש בערכות פריימר/בדיקה המכוונות לאזורים שונים של הגנום הנגיפי, כדי לשפר את הדיוק של קביעת הטיטר36,37. גישה זו מאפשרת לכמת גנומים שלמים על ידי יישום נוסחאות המתוארות במחקרים המוזכרים או שימוש בפתרונות תוכנה משולבים.
    7. בצע דילול סדרתי פי 10 של הדגימות שעובדו לאחר מכן ב-ddH2O באמצעות לוחות 96 בארות נמוכים הקשורים ל-DNA. לבסוף, העבירו 5.5 מיקרוליטר (עבור ddPCR) או 2 מיקרוליטר (עבור dPCR) של התבנית (דילולים 10,4- ו-10,5) לצלחת ddPCR עם 96 בארות, שכבר מכילה את ddPCR/dPCR Master Mix כולל פריימר/בדיקות. התאם את טווח הדילול בהתבסס על יעילות הייצור של מבנים בודדים כדי להבטיח שהמדידות נופלות בטווח הזיהוי הליניארי.
      הערה: מכיוון שכימות dPCR/ddPCR הוא שיטה רגישה ביותר, יש צורך ב-10דילולים של 4 ו-105 של הדגימות.
    8. בצע את השלבים המתוארים להלן עבור ddPCR.
      1. עבור PCR amplification, עקוב אחר הוראות היצרן לאופטימיזציה של תנאי הבדיקה, כולל התאמות לחישול והגברה זמני בהתבסס על ערכות הפריימר/בדיקה המשמשות. פרוטוקול הרכיבה הסטנדרטי ששימש במחקר זה היה כדלקמן: דנטורציה ראשונית ב-9 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (עלייה ב-°C/s); 35 מחזורי דנטורציה ב-9 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות והגברה ב-6 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות; ואחריו שלב התארכות אחרון ב-9 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (עלייה ב-°C/s).
      2. לאחר הגברת PCR של מטרות הגנום הנגיפי rAAV, העבירו את הצלחת לקורא הטיפות ופעל לפי הוראות היצרן כדי למדוד את עוצמת הקרינה בכל באר. קורא הטיפות מאפשר כימות מוחלט של מספרי עותקי הגנום הנגיפי בתגובת מיקרוליטר.
    9. בצעו את השלבים המתוארים להלן עבור dPCR.
      1. כמתואר לכימות מבוסס ddPCR, עקוב אחר הוראות היצרן לאופטימיזציה של תנאי הבדיקה.
      2. כנקודת התחלה, עקוב אחר הפרופיל התרמי שנקבע מראש במכשיר ה-dPCR, הכולל שלב דנטורציה ראשוני ב-9 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואחריו 40 מחזורי דנטורציה ב-9 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות וחישול/הארכה ב-5 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
        הערה: פרוטוקול זה בוצע באמצעות המומלצים amp קצבי התגובה ונפחי התגובה שצוינו על ידי היצרן.
    10. נתח נתוני ddPCR ו-dPCR באמצעות פתרונות תוכנה שונים, המסופקים בדרך כלל על ידי יצרן המכשיר (למשל, QX manager ו-QIAcuity Software Suite 1.2, בהתאמה). עבור שתי השיטות, בחר רק דילול מדגם עם יחס הולם של מחיצות/טיפות חיוביות לשליליות לכימות.
      הערה: לקביעת טיטר חלקיקי rAV (VP/ML; vp = חלקיקים ויראליים) מליזטים גולמיים וחומר מטוהר שרף AAVX, ניתן להשתמש בבדיקת אימונוסורבנט מקושרת לאנזים (ELISA)., ערכות ELISA סטנדרטיות שונות זמינות מסחרית לכימות AAV זמינות (הערכות המשמשות בעבודה זו מפורטות בטבלת החומרים). בצע את הבדיקה בהתאם למדריכי היצרן. ודא שערכת ELISA המשמשת תואמת לסרוטיפ AAV המיוצר.
  5. ניתוח יחס VP מ-rAAVs מטוהרים
    הערה: כדי לקבוע את יחס חלבון הקפסיד הנגיפי (VP) של כל דגימה מהבארות הבודדות של מערך 24 הבארות העמוקות, ניתן לבצע כתם מערבי סטנדרטי או פרוטוקולים אוטומטיים מבוססי נימים.
    1. כדי לזהות חלבוני קפסיד AAV2 VP1, VP2 ו-VP3, השתמש בנוגדנים חד-שבטיים ראשוניים נגד AAV VP1/VP2/VP3. ודא שהנוגדן העיקרי עובד עם הסרוטיפ או גרסת הקפסיד המתאימה.
    2. השתמש בפקדים חיוביים מתאימים, כגון VP1, VP2 ו-VP3 רקומביננטיים או תקן ייחוס AAV.
    3. הכן את הבקרה החיובית ביחס מולקולרי של 1:1:10 (VP1:VP2:VP3) כדי לחקות את יחס ה-VP הצפוי. זה משמש גם כהתייחסות לכימות יחס VP באמצעות שילוב אזור אותות.
    4. בחר ערכה נימית עם טווח מתאים המקיף את חלבוני הקפסיד שיש לזהות, כולל הקטן ביותר (VP3 עם ~ 60 kDa) והגדול ביותר (VP1 עם ~ 82 kDa). זה יכול להשתנות בהתאם לסרוטיפ ולוריאנט הקפסיד בו נעשה שימוש.
    5. הכן את הריאגנטים והסולם הביוטיניל המסופקים בערכה בהתאם להוראות היצרן.
    6. הכן סדרת דילול של הדגימות (על סמך הטיטר הגנומי החל מ-1 ×10 12 vg/mL עד 1 × 1010 vg/mL או 1:2 דילולים החל מהדגימה הלא מדוללת עד 1:64) במאגר הדילול המסופק של הערכה כדי להבטיח טווח זיהוי טוב עבור כל דגימה.
    7. יש לדלל את הנוגדנים הראשוניים במאגר דילול הנוגדנים המסופק בהתאם להוראות היצרן או בהתאם לבדיקות קודמות. התחילו ב-1:100.
    8. השתמש בערכת זיהוי מתאימה בהתאם למקור הנוגדן העיקרי.
    9. טען את הצלחת על פי התוכנית המסופקת עם הערכה.
    10. הקפד למלא עמודים ריקים במים או מאגר דילול דגימה גם כדי לא לפגוע בנימי המכשיר על ידי התייבשות.
    11. מכסים את הצלחת בנייר כסף וצנטריפוגה בחום של 1200 × גרם, 5 דקות, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    12. העבירו את הצלחת והנימים למכשיר והשתמשו בתנאים סטנדרטיים שנקבעו מראש לריצה.
    13. נתח את הריצה באמצעות תוכנת ניתוח נתונים, כגון Compass (גרסה 6.3.0)38.
      הערה: כדי לנתח את שלמות החלקיקים, חד-פיזור וטוהר מומלצת מיקרוסקופ אלקטרונים להעברת צביעה שלילית (ns-TEM). ניתן לבצע ניתוח TEM כפי שמתואר על ידי שטיינינגר ואחרים. al25. עם זאת, שיטות אחרות, כגון פוטומטריית מסה39, SEC-MALS40 וצביעה רסיס41 יכולות גם לספק קריאות משלימות להערכת איכות תכשירי rAAV.
  6. התמרה עם חלקיקים נגיפיים מטוהרים
    הערה: כדי להמיר תאים עם וקטורים נגיפיים מטוהרים, יש לקבוע ריבוי זיהום (MOI). MOI מוגדר כמספר הגנומים המכילים חלקיקים שנוספו לכל תא. חשוב לציין שזהו ערך תיאורטי; המספר האמיתי של גנום rAAV המועבר לתא תלוי ביכולתו של הקפסיד להמיר בהצלחה את תאי המטרה. לכן, ה-MOI האופטימלי חייב להיקבע תמיד בניסוי. בחלק זה, המטרה הייתה להשוות בין שני מלאי וקטור ויראלי, שיוצרו בשיטות טיהור שונות (אולטרה-צנטריפוגה של צזיום כלוריד ושרף זיקה AAVX). לשם כך, תרביות עצביות משותפות שמקורן בבני אדם הומרו עם שני התכשירים, ויעילות ההתמרה הוערכה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
    1. צפו צלחת תחתונה אופטית שחורה של 96 בארות ב-PLO של 0.1% (Poly-L-Ornithine) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס או דגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך ≥ שעה.
    2. ביום הזריעה יש לשאוב את מגיב הציפוי PLO ולצפות אותו במטריצת ממברנת הבסיס של גורם גידול מופחת ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ≥1 שעה.
    3. תרבית נוירונים מוטוריים עם אסטרוציטים ביחס של 1:6 או לפי המלצת הספקים.
    4. ביומיים במבחנה (DIV), התמיר את התרבות המשותפת ב-MOI של 50,000.
    5. הפשרה נגיפית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    6. הכן אמצעי התמרה (וקטורים ויראליים ב-MOI הרצוי המבוססים על גנומים ויראליים לתא + מדיה של תרבית תאים בנפחים מתאימים כדי להחליף 50% ממצע התרבית לבאר).
    7. בצע החלפת מדיה של 50% עם מדיית התמרה.
    8. ב-5 DIV, בצע חילופי מדיה מלאים עם תקשורת תרבות רגילה.
    9. שמור על תאים עם החלפת אמצעי תרבית קבועים כל 2-3 ימים או לפי המלצת הספק.
    10. עקוב אחר רמות הביטוי באמצעות מיקרוסקופ הדמיה חי המצויד בעירור נכון לטרנסגן מדווח. עבור נוירונים שמקורם בבני אדם, ביטוי המישור נצפה בין 10-14 ימים לאחר ההתמרה (ראה איור 4A).
צעדמאגר/חומרנפח באר [μL]נפח עבודה [μL]מחזוריםקצב זרימה
[מיקרוליטר לדקה]
1. שיווי משקלשיווי משקל/
שטיפה I מאגר		11009502500
2. טוען/
לכידת		מדגם Supernatant5505004
3. שטיפה Iשיווי משקל/
שטיפה I מאגר		11009502
4. וושינגטון 2מאגר Wash II11009502
5. הרחקהמאגר סילוק70 μL (קצות שרף 20 μL)
250 μL (קצות שרף μL 80)		60 μL (קצות שרף μL 20)
240 μL (קצות שרף μL 80)		4
6. נטרולמאגר נטרולהוסף 1/4 מנפח Elution ישירות לכל דגימה
→ דגימה מגולגלת של 70 μL הוסף 17.5 μL
250 מיקרוליטר דגימה מגולגלת → הוסף 62.5 מיקרוליטר		--

טבלה 1: פרמטרי פריסת לוחות וטיהור לטיהור שרף זיקה של rAAVs.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנים האחרונות, הביקוש לייצור וקטור AAV בקנה מידה מעבדתי גדל משמעותית, מה שהוביל להקמת ארגוני מחקר חוזיים רבים המציעים זאת כשירות42. בהתחשב בעלויות הגבוהות ובלוחות הזמנים המאוחרים הקשורים לעתים קרובות למיקור חוץ, ייצור rAAV פנימי נותר אופציה אטרקטיבית. בפרט, פרוטוקולים בעלי תפוקה גבוהה הממזערים את צריכת החומרים ושעות העבודה תוך שילוב שלבי טיהור מועילים מאוד בצנרת פיתוח התרופות.

פרוטוקול זה מתאר שתי הגדרות תפוקה גבוהה עבור ייצור rAAV: גישת מיקרו-6-בארות המשתמשת בתאים דבקים ופרוטוקול mini-HT24 עבור תאי תרחיף (ראה סקירה כללית באיור 1). מערך המיקרו-6 בארות משתמש בתאי HEK293T דבקים כדי לייצר rAAV בפורמט של 6 בארות. חומר זה שימש להערכת ההשפעות של שני ריאגנטים טרנספקטיביים של PEI ונתרן כלורי (NaCl) הזמינים מסחרית על ייצור rAAV2 (איור 2A). כאן, פרמטרים שונים נוטרו בו זמנית: (i) כדאיות התא המפיק ויעילות הטרנספקציה באמצעות טרנסגן GFP (איור 2B ואיור משלים 1), ו-(iii) אחוז התאים החיוביים ל-GFP (GFP+) לאחר התמרה עם ליזטים גולמיים (איור 2C). ניסוי ההתמרה שימש כקריאה עקיפה זולה ומהירה של טיטרים וקטוריים ופונקציות. מעניין לציין כי יחסים נמוכים יותר של מגיב טרנספקציה ל-DNA היו מספיקים כדי לקדם ייצור וקטורי יעיל (איור 2B) תוך שמירה על כדאיות תאים טובה. יתר על כן, תוספת של 150 מ"מ NaCl נראתה מועילה, במיוחד בעת שימוש במגיב PEIpro. ביצוע ניסוי זה בקנה מידה מיקרו הציע מספר יתרונות: (i) זרימת עבודה מהירה, עם זריעת תאים, טרנספקציה וקצירת וקטור שהושלמו תוך שבוע אחד; (ii) תאימות למבחנים אנליטיים סטנדרטיים במורד הזרם; ו-(iii) תחולה רחבה על כל הסרוטיפים של AAV.

עבור יישומים הדורשים כמויות גדולות יותר של וקטורי rAAV, כגון ניסויים in vivo או מחקרים קינטיים במבחנה (שבהם מיושם מגוון גבוה יותר או רחב יותר של MOIs), יש צורך בהגדלה. כדי להקים פרוטוקול מיני-HT24 המספק חומר מספיק לטיהור בתפוקה גבוהה, נעשה שימוש בתאי מתלה. בהשוואה לתאים דבקים, תרביות מתלים מציעות מדרגיות טובה יותר וחסכוניות יותר במקום, מכיוון שהן אינן מוגבלות על ידי שטח הפנים. מכיוון שתאי תרחיף גדלים בחופשיות במדיום, הם יכולים לתפוס את כל נפח התרבית, מה שהופך את ההגדלה בתלת מימד לפשוטה יותר. זה מאפשר להשיג צפיפות תאים גבוהה יותר בהשוואה לתרביות שכבה. בנוסף, מערכות מתלים קלות יותר לתחזוקה ולעיבוד מכיוון שאין צורך בשלבי ניתוק במהלך המעבר או הקציר. האחידות של ייצור rAAV בפורמט של 24 בארות הוערכה על ידי ניתוח שלושה פרמטרים מרכזיים על פני הלוח (איור 3): (A) טיטר חלקיקים (vp/mL); (B) יחס VP בקפסיד; (C) טיטר גנומי (vg/mL) ו-(D) יחס ריק למלא.

בעוד שנצפתה שונות מסוימת בין פרמטרים אלה, היא נותרה במידה רבה בטווח כפול, שנמצא בטווח טעות המדידה. ביטוי חלבון VP הוערך גם באמצעות ניתוח אוטומטי של כתמים מערביים (איור 3E). לבסוף, מוצגת השוואה של סך התפוקות המתקבלות מייצור מיקרו-6 בארות, מיני-HT24 וייצור בקנה מידה בינוני (בקבוק ניעור) כדי להנחות את בחירת קנה המידה המתאים על סמך דרישות הניסוי והצרכים האנליטיים במורד הזרם (איור 3F).

היבט קריטי של כל פרוטוקול טיהור AAV הוא הערכת טוהר ועוצמת הווקטור. כאן, וקטורים מטוהרים בשרף הושוו זה לצד זה עם אלה שטוהרו בשיטת אולטרה-צנטריפוגה (UC) מבוססת צזיום כלוריד (CsCl) דו-שלבית (איור 4). עוצמה דומה בין שני התכשירים נצפתה במיקרוסקופיה פלואורסצנטית, כפי שהודגם על ידי התמרה מוצלחת של נוירונים מוטוריים ואסטרוציטים (איור 4A). ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים לא גילה הבדלים משמעותיים בצורת החלקיקים או במצב הצבירה. עם זאת, הייתה מגמה קלה המצביעה על כך שטיהור CsCl הניב באופן עקבי יותר תכשירים נקיים יותר (איור 4B).

figure-results-1
איור 1: סקירה כללית של גישות ייצור והכנה של rAAV. איור זה ממחיש שיטות ייצור rAAV, החל מצלוחיות טלטול בקנה מידה בינוני ועד תרביות תרחיף מיני-HT24 ותרביות דבקות מיקרו-6. גישות אלו מאפשרות יצירת rAAV בקני מידה שונים, תוך שימוש באסטרטגיות שונות של ליזיס תאים וטיהור וקטורים. האפיון הסופי של rAAVs כולל בדרך כלל qPCR/dPCR לכימות גנום ויראלי (vg/mL), ELISA לקביעת טיטר קפסיד (vp/mL) ומבחני התמרת תאים להערכת פעילות ביולוגית. נוצר ב-BioRender. אוהלנד, פ '(2025) https://BioRender.com/x3sfbdd. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: אופטימיזציה של פרוטוקול טרנספקציה עבור ייצור מיקרו-6 בארות rAAV. (א) סקירה סכמטית של הניסוי עם פרמטרים שנבדקו וקריאות אנליטיות. (B) תאים HEK293T נזרעו בצלחות של 6 בארות בצפיפות של 0.5 ×-106 תאים/באר 24 שעות לפני הטרנספקציה. נבדקו כמויות DNA שונות, סוגי PEI (Pro או Max), יחסים וריכוזי NaCl. (C) אחוז התאים החיוביים ל-GFP (GFP+) HEK293A 72 שעות לאחר ההתמרה עם נפחים שווים של ליזטים מפאנל A (10 מיקרוליטר כל אחד). לשם הפשטות, מוצג רק מצב ה-DNA שהביא לתפוקות הווקטוריות הגבוהות ביותר (2650 ננוגרם). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: אפיון אנליטי של rAAV המיוצר במערך mini-HT24 והשוואת טיטר על פני קני מידה שונים. (A) ניתוח ELISA של טיטר קפסיד rAAV מטוהר בכל באר. הערכים מיוצגים כוריאציות מעל טיטר החלקיקים הממוצע של הצלחת לאחר הטיהור. הטיטר הצפוי תלוי בקפסיד ה-AAV המשומש ובטרנסגן הארוז. טיטר החלקיקים עבור וקטורים שונים של AAV נע בין נמוך 1011 לגבוה 1012 VP/mL. (B) ניתוח יחס VP על ידי WES של rAAV מטוהר מהבארות שצוינו. AAV2 רקומביננטי VP1, VP2 ו-VP3 שימשו כבקרות חיוביות ביחס מולארי של 1:1:10. (C) ניתוח dPCR של rAAV מטוהר מכל באר. הערכים מוצגים כווריאציות מעל הטיטר הגנומי הממוצע של הצלחת לאחר הטיהור. הטיטר הצפוי תלוי בקפסיד ה-AAV המשומש ובטרנסגן הארוז. הטיטר הגנומי עבור וקטורים שונים של AAV נע בין נמוך 1010 (rAAV2) לגבוה 1011 vg/mL (rAAV9, לא מוצג כאן). (D) יחס ריק למלא (E/F) של הבארות המצויינות, בהתבסס על תוצאות גנומיות ותוצאות טיטר חלקיקים מלוחות A ו-C. הערכים מנורמלים לממוצע הצלחת. ממוצע E/F בפורמט mini-HT24 עבור rAAV2 המוצג הוא 10.6% ±-3.0% לאחר טיהור שרף זיקה AAVX. (E) ניתוח כתם מערבי נימי של חלבוני VP בדגימות rAAV2 מטוהרות מכל באר. (F) השוואה של סך תפוקות הגנום הנגיפי בהתחשב בנפח הדגימה הסופי והריכוז של כל שיטה. הנתונים מוצגים כהפרש קיפול ממוצע על פני הפורמט הקטן ביותר (מיקרו-6-באר), עם פסי שגיאה המציינים סטיית תקן (SD) משכפולים ביולוגיים. לייצור תפוקה גבוהה של 24 בארות עמוקות עם טיהור שרף זיקה AAVX, SD = ±0.176 (n = 24); לסוניקציה של מיקרו-6 בארות; SD = ±0.349 (n = 6); ולייצור סטנדרטי בקנה מידה בינוני עם טיהור שיפוע CsCl, SD = ±134.70 (n = 2). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: השוואה של עוצמה וטוהר בין rAAV מטוהר שרף בתפוקה גבוהה (HT) לבין דגימות סטנדרטיות מטוהרות CsCl. (A) נוירונים מוטוריים ואסטרוציטים שמקורם בבני אדם הומרו עם אותו מבנה rAAV המבטא מדווח פלואורסצנטי mRuby3 תחת מקדם הסינפסין האנושי כמדווח ב-MOI של 50,000. תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי צולמו במיקרוסקופ הדמיה חי שבעה ימים לאחר התמרה (DPT). rAAVs טוהרו בשיטת שיפוע CsCl הסטנדרטית (למעלה) או בגישה המבוססת על קצה שרף זיקה HT AAVX (למטה). דגימות מטוהרות CsCl נחשפו למחזור הקפאה-הפשרה נוסף לפני ביצוע הטרנסדוקציה והושוו ל-rAAVs מטוהרים בשרף. (ב) ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM) של גרסאות מבוססות rAAV2-serotype מטוהרות באמצעות שיפוע CsCl (למעלה) ושיטות קצה שרף HT (למטה). ניתן להשוות שתי קבוצות של דגימות מטוהרות בשרף HT של rAAV2 ללא דיאליזה (למטה משמאל) ועם דיאליזה (למטה מימין). יחס ריק למלא (E/F) נקבעו באמצעות TEM כדי להיות > 90% מלאים עבור דגימות מטוהרות באולטרה-צנטריפוגה בשיפוע CsCl <ו-40% מלאים עבור דגימות מטוהרות בשרף זיקה AAX. סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. לוח B מציג תמונות מייצגות של קבוצות מטוהרות בשיטות שצוינו. שימו לב שתמונות אלה אינן שייכות לאותם תכשירים המשמשים לניסויי התמרה המוצגים בפאנל A. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: טרנספקציה של תאי HEK293T לייצור rAAV2-GFP באמצעות מערך המיקרו-6 בארות. כמויות DNA שונות, ריכוזי NaCl (במ"מ), תוצרי PEI ויחסי PEI-ל-DNA שימשו לטרנספקציה (כמתואר באיור 2). התמונות צולמו 72 שעות לאחר הטרנספקציה תוך שימוש באותו זמן חשיפה (320 אלפיות השנייה). תמונות מיקרוסקופיה מייצגות של שדה בהיר ופלואורסצנטי מוצגות באיור זה. הגדלה: פי 10. סרגל קנה המידה אינו מוצג; התמונה מיועדת להמחשה ולהערכה איכותית בלבד. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נייר פרוטוקול זה מתאר שיטות יעילות לייצור rAAV בהגדרות בקנה מידה קטן בתפוקה גבוהה תוך שימוש בתאי דבק ותרחיף כאחד. מתודולוגיות אלו נותנות מענה לביקוש הגובר לתהליכי ייצור rAAV ניתנים להרחבה וגמישים התומכים במחקר פרה-קליני תוך מזעור זמן, עלות וצריכת משאבים.

הן מערכות תאי הדבקה והן מערכות תאי מתלה מציעות יתרונות ואתגרים מובהקים לייצור rAAV בקנה מידה קטן. מערכות תאים דבקות, כגון תאים HEK293T28 הגדלים בפורמטים של לוחות מרובי בארות, מתאימות במיוחד לתכנון וקטורי בשלב מוקדם ולמחקרים השוואתיים. התאימות שלהם לפרוטוקולי תרבות וטרנספקציה מבוססים מאפשרת יישום פשוט ברוב המעבדות. לדוגמה, Grosse et al. השתמש בייצור בקנה מידה קטן בצלחות של 6 בארות כדי לחקור את פונקציונליות AAP, חלבון חיוני להרכבת הקפסיד הנגיפי22. Drittanti et al. ייצרו וקטורים של rAAV בלוחות של 96 בארות כדי להעריך את הקינטיקה של שכפול rAAV ולבדוק את ההשפעות של עוזרי אדנו-וירוס שונים על ייצור rAAV23. יש לציין כי במחקר האחרון, תוארה בדיקת שכפול באמצעות תאי HeLa מיוחדים המבטאים AAV Rep ו-Cap כדי להגביר עוד יותר את האות. לאחרונה, Quan et al. יישמו פרוטוקול ייצור בעל תפוקה גבוהה של 384 בארות בהקשר של מסך siRNA, ודיווחו על טיטרים יחסיים24. עם זאת, בהתחשב בכמות החומר המוגבלת, עדיין לא ברור כמה בדיקות וקריאות ניתן לבצע, או האם ניתן להשיג מספיק MOIs בניסויי התמרת תאים מעבר למדידת חלבונים פלואורסצנטיים, מה שעלול להשפיע על יכולת השחזור.

בעבודה זו, נעשה שימוש בייצור מבוסס באר מיקרו-6 בתאי HEK293T דבקים כדי לייעל את תנאי התרבית עבור rAAV2 (איור 1 ואיור 2). בהתאם למחקרים קודמים ודוחות טכניים43,44, יחסי PEI ל-DNA נמוכים יותר ותוספת NaCl במהלך טרנספקציה השפיעו לטובה על ייצור rAAV. זה בא לידי ביטוי בעקיפין ביעילות ההתמרה של הווקטורים המיוצרים בתאי HEK293A. ההבדלים הבולטים שנצפו עם יחסי PEI:DNA נמוכים יותר יוחסו בעיקר ללחץ תאי, כפי שמעיד על כדאיות תאים נמוכה, במיוחד עם PEIpro. למרות שההשפעות היו פחות ניכרות בתנאי PEImax, תמונות מיקרוסקופיה חשפו אזורים נטולי תאים בשכבה התאית, מה שמעיד על מתח או ניתוק תאים (איור משלים 1).

חשוב לציין, ממצאים אלה לא היו ישימים ישירות לייצור וקטור בתרביות תרחיף, והדגישו כי תנאי ניסוי המשפרים את ייצור rAAV בתאי HEK293T דבקים עשויים לא תמיד להיות מתורגמים לתאי תרחיף, גם כאשר סוג התא הבסיסי נשאר זהה. ניתן לייחס את הפער הזה להבדלים ברמות הטרנסקריפטומיות והפרוטאומיות בין שתי המערכות הללו45. כתוצאה מכך, התאמה קרובה יותר לתהליכי ייצור קליניים עשויה לחייב שימוש בתרביות תרחיף בשלבי הפיתוח המוקדמים. בהתבסס על תצפיות אלו ועל היתרון של השגת צפיפות תאים גבוהה יותר בתרחיף, אומצה מערכת בארות בעומק 24 לייצור rAAV בתרביות תרחיף בקנה מידה זעיר (mini-HT24). מערכת זו עברה אימות נרחב, והדגימה טיטרים עקביים של vg/mL ו-vp/mL על פני הצלחת, יחד עם ביטוי ויחסים אחידים של חלבון VP (איור 3A-E). ואכן, צפיפות התאים הגבוהה יותר שהושגה במערך המיני-HT24 (3 ×10 6 תאים/מ"ל) בהשוואה לפורמט המיקרו-6 בארות (5 × 105 תאים לבאר) הביאה לטיטר rAAV גבוה יותר, כפי שמוצג באיור 3F. זה מדגיש יתרון מרכזי של מערכות מבוססות מתלים, שאינן מוגבלות על ידי שטח הפנים של כלי הגידול. עם זאת, הטמעת מערכות כאלה דורשת ציוד מיוחד שאולי לא יהיה זמין בכל המעבדות. לבסוף, מומלץ לאמת עוד יותר מולקולות עופרת שזוהו או תנאי תרבות מעולים ממערכת המיני-HT24 באמצעות מערכות מיני-ביו-ריאקטור כגון AMBR15 או AMBR250, שכן מערכות אלו הוכחו כמחקות יותר את תנאי הייצור בביו-ריאקטורים גדולים46,47.

לבחירת רמת הטיהור יש תפקיד מכריע בקביעת ההתאמה של תכשירי rAAV ליישומים ספציפיים במורד הזרם. ליזטים גולמיים, שמקורם הן בתרביות דבקות (מיקרו-6-באר) והן מתרביות תרחיף (mini-HT24), מספקות אפשרות מהירה וחסכונית במשאבים לבדיקות סינון ראשוניות. ליזטים אלה מכילים תערובת של חלקיקים ויראליים, פסולת תאית ורכיבי מדיה, מה שמקובל עבור יישומים כגון טיטר גנומי/חלקיקים וקטורי, סינון יעילות התמרה וניתוח כתמים מערביים. ישים במיוחד במחקרים העוסקים בשאלות ביולוגיות בסיסיות (כפי שהודגם לעיל בחקירת פונקציונליות AAP), אופטימיזציה של מצב תרבית תאים וסינון ובחירת מועמדים פרה-קליניים. עם זאת, נוכחות של זיהומים עשויה לדרוש דילולים גבוהים יותר, וכתוצאה מכך רגישויות נמוכות יותר לבדיקה. בנוסף, זיהומים עלולים להשפיע לרעה על הכדאיות של סוגי תאים רגישים, כגון תאים ראשוניים.

בניגוד לליזטים גולמיים, תכשירים מטוהרים בשרף זיקה AAVX, המשמשים אך ורק בפרוטוקול מבוסס השעיה, משיגים רמת טוהר גבוהה יותר על ידי בידוד סלקטיבי של קפסידים שלמים. זה מתגבר על המגבלות של ליזטים של תאים גולמיים, מה שהופך את התכשירים הללו למתאימים יותר ליישומים כגון מחקרי in vivo , כמו גם ניתוחים מפורטים במבחנה של קינטיקה של ביטוי טרנסגנים, וקריאות פונקציונליות מדויקות, שלעתים קרובות דורשות כמויות גדולות יותר של חומר (ראה השוואת תשואה באיור 3F). עבור יישומי מבחנה , תפוקות של וקטורי rAAV המיוצרים בהגדרת mini-HT24 היו בדרך כלל מספיקות לרוב הקריאות, תלוי במספר התאים וב-MOIs הנדרשים. לעומת זאת, יישומי in vivo דורשים בדרך כלל ייצור בקנה מידה של בקבוק שייק או גדול יותר, תלוי במינון, מסלול המתן ודגם החיה. למרות העלות והזמן המוגברים הנדרשים לטיהור, העקביות והאמינות של החומר המתקבל מצדיקים לעתים קרובות את ההשקעה במקרי שימוש קריטיים. יש לציין כי התוצאות המוצגות באיור 4 מדגימות כי וקטורים rAAV מטוהרים בשיטות שרף זיקה מתפקדים באופן דומה לאלה שטוהרו באמצעות אולטרה-צנטריפוגה מסורתית של צזיום כלוריד (CsCl). זה עולה בקנה אחד עם תצפיות קודמות שלקפסידים ריקים אין השפעה על התמרה או אפילו עשויים לשפר אותה, תלוי במיני ה-AAV הקיימים48. עם זאת, חשוב לציין כי רק MOI אחד ונקודת זמן אחת שימשו בניסוי זה, ויש לקבוע תנאים אופטימליים בנפרד עבור כל סוג תא. בעוד שטיהור CsCl מניב בדרך כלל רקע נקי יותר, AAVs מטוהרים בקצה שרף HT מראים שונות גדולה יותר בטוהר (ראה תמונות TEM באיור 4). באופן קולקטיבי, ממצאים אלה תומכים עוד יותר באימוץ תהליכי עבודה בעלי תפוקה גבוהה בקנה מידה קטן.

השימוש בטיפים מלאי שרף זיקה בקנה מידה קטן בטיהור בתפוקה גבוהה מספק פתרון מעשי לבדיקת rAAV מהירה, אך מספר היבטים טכניים דורשים תשומת לב כדי להבטיח תוצאות אמינות. בשל נפח מיטת השרף המוגבל, טיפים אלה מועדים במיוחד לסתימה, במיוחד בעת עיבוד ליזטים גולמיים. לפיכך, הבהרת ליזטים על ידי צנטריפוגה במהירות גבוהה חיונית להסרת פסולת סלולרית לפני הטעינה, שכן הבהרה לא מספקת עלולה להפחית את קצב הזרימה ולפגוע בתפוקה. עבור הגדרת ה-mini-HT24, מומלץ לבצע אופטימיזציה של פרוטוקולי טרנספקציה ולשמור על נפח עבודה מרבי של 2.5-3 מ"ל לבאר. כאשר עובדים עם סרוטיפים או ספריות קפסיד שונות, מומלץ לבדוק סוגי שרף זיקה שונים, שכן יעילות הכריכה וההתאוששות עשויים להשתנות בהתאם למבנה הקפסיד49. מערכת הפיפטינג האלקטרונית הרב-ערוצית הנישא ביד מאפשרת שילוב קל של זרימת עבודה זו במעבדות קטנות, ומציעה גמישות ללא צורך באוטומציה. עם זאת, טיפול ידני יכול להציג שונות והבדלים בין אצווה לאצווה. לעקביות רבה יותר, פלטפורמות אוטומטיות לטיפול בנוזלים עשויות להועיל. יש להקדיש תשומת לב קפדנית כדי למנוע זיהום צולב במהלך הוספת דגימה וחוצץ, והשימוש בפורמטים מתאימים של צלחות עם נפח באר מתאים חיוני למניעת הצפה. על ידי התייחסות לשיקולים אלה, כולל הבהרת דגימות, אופטימיזציה של פרוטוקולים, בחירת שרף ופיפטינג זהיר, חוקרים יכולים למזער בעיות טכניות ולשפר את החוסן והשחזור של זרימות עבודה לטיהור זיקה בקנה מידה קטן בתפוקה גבוהה.

לסיכום, השילוב של שיטות ייצור rAAV בקנה מידה קטן עם אסטרטגיות טיהור ספציפיות ליישום מספק פלטפורמה רב-תכליתית לקידום מחקר ריפוי גנטי. פרוטוקולים אלה נותנים מענה לביקוש הגובר לתהליכי עבודה חסכוניים ויעילים תוך שמירה על הגמישות לעמוד בדרישות ניסיוניות מגוונות. על ידי איזון הפשרות בין טוהר, מדרגיות וצריכת משאבים, חוקרים יכולים להאיץ את הפיתוח הפרה-קליני ולהקל על המעבר ליישומים קליניים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ג'וליה פחירי מודה בהכרת תודה על תמיכתה באמצעות מלגת פוסט-דוקטורט של רוש. נתוני מיקרוסקופ אלקטרונים נרכשו במתקן Roche cryo-EM Nautilus. אנו מודים למוריץ קלאסן ולובומיר קובאצ'יק על תרומתם לתפעול ותמיכה במתקן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.9% תמיסת מלח ללא חומצהב. בראון, מלסונגן, גרמניה7647-14-5מאגר Wash II
1 מ 'חומצה הידרוכלוצירמרק מיליפור, ברלינגטון, מסצ'וסטס, ארה"ב1099700050התאמת pH של מאגרים
מאגר 10x DNase Iתרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, ארה"בAM8170GddPCR/dPCR
1M Tris-HCl, pH 9.0תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, ארה"בJ60707. אי-פימאגר נטרול
מיקרו-פלטות באר בעומק 24Enzyscreen, Heemstede, הולנדCR1424clציוד לתרבות מתלים
בקבוק פוליקרבונט ארלנמאייר 250 מ"ל עם מכסה אוורורקורנינג, ניו יורק, ניו יורק, ארה"ב431144ציוד לתרבות מתלים
66 - 440 kDa הפרדה 8x25 מחסניות נימיותBioTechne, מיניאפוליס, מינסוטה, ארה"בSM-W008ערכת כתם מערבי אוטומטית
96 באר 2.2 מ"ל פוליפרופילן DeepWell תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, ארה"בAB0661לוחית עיבוד ואחסון לדוגמא
צלחת תחתונה שחורה/שקופה 96 באר, משטח TCתרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, ארה"ב165305מבחני התמרה
AAV2 VP1, חלבון רקומביננטיPROGEN , היידלברג גרמניה640823מגיב ווס
AAV2 VP2, חלבון רקומביננטיPROGEN , היידלברג גרמניה640824מגיב ווס
AAV2 VP3, חלבון רקומביננטיPROGEN , היידלברג גרמניה640825מגיב ווס
AAV2 אקספרס אליסהPROGEN , היידלברג גרמניהPRAAV2XPמשמש לדגימות מטוהרות של שרף HT.
מודול זיהוי נגד עכבר עבור WesBioTechne, מיניאפוליס, מינסוטה, ארה"בDM-002ערכת כתם מערבי אוטומטית
פריימר קדימה ספציפי לבדיקה/תבניתמנהגמנהגddPCR/dPCR
בדיקה ספציפית לבדיקה/תבניתמנהגמנהגddPCR/dPCR
פריימר הפוך ספציפי לבדיקה/תבניתמנהגמנהגddPCR/dPCR
BalanCD HEK293 - נוזלFUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC INC, סנטה אנה, CA, ארצות הבריתNC1192689מדיום לתרבית תאי השעיה
סרום בקר אלבומין חוות דעת על SERVA Electrophoresis , היידלברג, גרמניהcBovine סרום אלבומיןתוסף למדיום תאים דבק
סרט זהורית נושם, סטרילי VWR International LLC, רדנור, פנסילבניה, ארה"ב391-1262ציוד לתרבות מתלים
C1000 תרמו-ציקלרמעבדות ביו-ראד, הרקולס, ארה"ב1851096ddPCR
ערכת ELISA של CaptureSelec AAVX Ligand Leakageתרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, ארה"ב8113522000אליסה
מנתח Cedex HiRes Roche Holding AG, באזל, שוויץ5650216001מונה תאים
מיקרופלטה לתרבית תאים, 96 בארגריינר ביו-וואן, Kremsmü nster, אוסטריה655162ציוד תרבית תאים אדהרנטי
חומצת לימוןSigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית5949-29-1מגיב טיהור; זהירות
מצלמת TEM מבוססת CMOS TVIPS XF416 Tietz Video and Image Processing Systems GmbH, Gilching, גרמניהXF416 מערכת עיבוד וידאו ותמונה
תוכנת מצפן (גרסה 6.3.0)BioTechne, מיניאפוליס, מינסוטה, ארה"בתוכנת WES
Costar 6-well Clear TC צלחות מרובות מטופלותקורנינג, ניו יורק, ניו יורק, ארה"ב    3516ציוד תרבית תאים אדהרנטי
שמן מחולל טיפות ddPCR מעבדות ביו-ראד, הרקולס, ארה"ב#1864110מגיב ddPCR
שמן קורא טיפות ddPCR מעבדות ביו-ראד, הרקולס, ארה"ב#1863004מגיב ddPCR
ddPCR Supermix לבדיקות (ללא dUTP) מעבדות ביו-ראד, הרקולס, ארה"ב#1863023מגיב ddPCR
DMEM, גלוקוז גבוהתרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, ארה"ב11960044מדיום לתרבית תאים נדבקים
DMEM, גלוקוז נמוךתרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, ארה"ב11885084מדיום לתרבית תאים נדבקים
DNA נמוך קושר 96 לוחות בארEppendorf, Hamburg, גרמניה30129504ddPCR/dPCR
צינורות קשירה נמוכים של DNAEppendorf, Hamburg, גרמניה30108051ddPCR/dPCR
DPBSתרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, ארה"ב14190094מאגר כביסה
רשתות EM (T600H-Cu 698 ליטר / אינץ' רשת דקה; EMS)מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית, האטפילד, פנסילבניה, ארה"בFFTH600-Cu-ULניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים
מערכת הדמיה EVO M5000תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, ארה"בAMF5000מיקרוסקופ הדמיה חי לבדיקות התמרה
EZ מארז סטנדרטי 3BioTechne, מיניאפוליס, מינסוטה, ארה"בנ.ב. ST03EZ-8ערכת כתם מערבי אוטומטית
צינורות צנטריפוגה חרוטיים פלקון 15 מ"לפישר סיינטיפיק, שוורטה, גרמניה11507411עיבוד מדגם
צינורות צנטריפוגה חרוטיים Falcon 50 מ"לפישר סיינטיפיק, שוורטה, גרמניה10203001עיבוד מדגם
Geltrex ללא LDEV גורם גדילה מופחת מטריצת ממברנה בסיסיתתרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, ארה"ב  A1413201ציפוי צלחת תרבות
תוסף GlutaMAX (L-אלניל-L-גלוטמין)תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, ארה"ב35050061תוסף למדיום תאים דבק
HEK293Aתרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, ארה"ב₪1,0000מבחני התמרה (שימוש מחקרי בלבד)
HEK293TATCC, מנסס, וירג'יניה, ארה"בCRL-3216תרבית תאים אדהרנטית, המשמשת לייצור rAAV (שימוש מחקרי בלבד)
תמיסת HEPES, 1MMerck, Darmstadt, גרמניה#H0887תוסף למדיום תאים דבק
HL-Salt Active Nuclease, SAN (25 U/µ L)ArcticZymes Technologies, Tromsø, נורבגיה70910-202ddPCR/dPCR
מכונת כביסה HydroSpeed MicroplateTecan, Mä nnedorf, שוויץ30190101אליסה
ערכת אסטרוציטים iCell, 01434FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc., מדיסון, ויסקונסין, ארה"ב₪1092מבחני התמרה
ערכת נוירונים מוטוריים iCell, 01279FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc., מדיסון, ויסקונסין, ארה"ב₪1051מבחני התמרה
אינסופי 200 פרוTecan, Mä nnedorf, שוויץ30213617אליסה
JEM-1400Plus הוא מיקרוסקופ אלקטרונים שידורJEOL Ltd., Akishima, טוקיו, יפןJEM-1400Plusמיקרוסקופ אלקטרונים שידור
כיסוי כריך באידוי נמוך עם סיכותEnzyscreen, Heemstede, הולנדCR1224cציוד לתרבות מתלים
קורא מיקרופלייט  ספקטרמקס i3התקנים מולקולריים, סן חוזה, קליפורניה, ארה"בi3xאליסה
עכבר anit-AAV2 VP1 / VP2 / VP3 נוגדן חד שבטיPROGEN , היידלברג גרמניה690058מגיב ווס
מים ללא נוקלאז'ים Roche Diagnostics GmbH, מנהיים, גרמניה3036430103ddPCR/dPCR
Opti-MEM, סרום מופחת בינוני תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, ארה"ב#31985070מדיום להיווצרות קומפלקס PEI-DNA
PBS תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, ארה"ב#10010023מאגר כביסה
PEI-MAX, פוליאתילן, מלאי 1 מ"ג/מ"לפוליסיינס אירופה,  Hirschberg an der Bergstraß e, גרמניה24765 או 24765מגיב טרנספקציה
פייפרוPolyplus, Illkirch-Graffenstaden, צרפת101000033/10 מ"למגיב טרנספקציה
צלחת מיקרודיאליזה פירס, 96 באר, 0.3 מ"ל, 20K MWCOתרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, ארה"בא50472ציוד טיהור
פולוקסמר 188Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארצות הבריתP5556-100 מ"למגיב תרבית תאים; זהירות
תמיסת פולי-L-אורניתין (0.01%)סיגמא-אולדריץ'א-004-ממבחני התמרה
תמיסת פרוטאינאז K (20 מ"ג/מ"ל)תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, ארה"ב25530049ddPCR/dPCR
חלבוןפשוט " ווס"BioTechne, מיניאפוליס, מינסוטה, ארה"ב004-600מכשיר לכתם מערבי אוטטי
מערכת QIAcuity Eight PlatformQiagen, Hilden, גרמניה911052dPCR
QIAcuity Nanoplate 8.5k 96 בארותQiagen, Hilden, גרמניה250021ddPCR/dPCR
ערכת QIAcuity Probe PCRQiagen, Hilden, גרמניה250101, 250102 או 250103ddPCR/dPCR
חבילת תוכנה QIAcuity 1.2Qiagen, Hilden, גרמניהתוכנת dPCR
מנהל QX מעבדות ביו-ראד, הרקולס, ארה"בתוכנת ddPCR
קורא טיפות QX200מעבדות ביו-ראד, הרקולס, ארה"ב1864003ddPCR
צינור מיקרו מכסה בורג, 1.5 מ"ל, ביצועי PCR נבדקוSarstedt, Nü mbrecht, גרמניה72.703.416ציוד לתרבות מתלים
פקק בורג, DNA LoBind, 5.0 מ"לEppendorf, Hamburg, גרמניה30122348ציוד לתרבות מתלים
חממת שייקרInfors AG, Bottmingen, שוויץמולטיטרוןציוד לתרבות מתלים
נתרן פירובט (100 מ"מ)תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, ארה"ב11360070מדיום לתרבית תאים נדבקים
מערכת צופר מיקרופלייט סוניקטורQSonica, ניוטאון, קונטיקט, ארה"בQ700MPXCסוניקטור המשמש לייצור ליזאט גולמי
רוחקישור למאגר SPIRIT: https://spirit.cladiac.com/aav.html 
Steriflip-GP צינור צנטריפוגה סטרילי יחידת מסנן עליוןמרק מיליפור, ברלינגטון, מסצ'וסטס, ארה"בSCGP00525ציוד להכנת חיץ
T-175, בקבוק תרבית תאים, 550 מ"ל, 175 ס"מ&2;גריינר ביו-וואן, Kremsmü nster, אוסטריה660175ציוד תרבית תאים אדהרנטי
טריפסין/EDTA 0.025%תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, ארה"בR001100מגיב תרבית תאים
תאי ייצור וירוסים 2.0 (VPC2.0)תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, ארה"בA49784 או A51218ייצור rAAV
J63596. K2לדלל 1:10 לפתרון עבודה PBST

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Singh, N. Drug discovery and development: Introduction to the general public and patient groups. Front. Drug Discov. 3, 1201419(2023).
  2. Thakur, G., Mink, S., Bak, H., Tustian, A. D. Improving process efficiency to reduce cost-of-goods per dose in manufacturing of recombinant AAVs. Cell Gene Ther. Insights. 10 (3), 479-499 (2024).
  3. Reid, C. A., Hörer, M., Mandegar, M. A. Advancing AAV production with high-throughput screening and transcriptomics. Cell Gene Ther. Insights. 10 (6), 821-840 (2024).
  4. Matsunaga, R., Tsumoto, K. Accelerating antibody discovery and optimization with high-throughput experimentation and machine learning. J. Biomed. Sci. 32 (1), 46(2025).
  5. Pereira, D. A., Williams, J. A. Origin and evolution of high-throughput screening. Br. J. Pharmacol. 152 (1), 53-61 (2007).
  6. Aldewachi, H., Al-Zidan, R. N., Conner, M. T., Salman, M. M. High-throughput screening platforms in the discovery of novel drugs for neurodegenerative diseases. Bioengineering. 8 (2), 30(2021).
  7. Liu, H., et al. Producing high-quantity and high-quality recombinant adeno-associated virus by low-cis triple transfection. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 32 (2), 101230(2024).
  8. Blessing, D., et al. Scalable production of AAV vectors in orbitally shaken HEK293 cells. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 13, 14-26 (2019).
  9. Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol. Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
  10. Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications. Hum. Gene Ther. Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
  11. Fakhiri, J., Nickl, M., Grimm, D. CRISPR gene editing, methods and protocols. Methods Mol. Biol. 1961, 111-126 (2019).
  12. Strobel, B., et al. Standardized, scalable, and timely flexible adeno-associated virus vector production using frozen high-density HEK-293 cell stocks and CELLdiscs. Hum. Gene Ther. Methods. 30 (1), 23-33 (2019).
  13. Rumachik, N. G., et al. Methods matter: Standard production platforms for recombinant AAV produce chemically and functionally distinct vectors. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 18, 98-118 (2020).
  14. Merten, O. W. AAV vector production: State of the art developments and remaining challenges. Cell Gene Ther. Insights. 2 (5), 521-551 (2016).
  15. Trivedi, P. D., et al. Comparison of highly pure rAAV9 vector stocks produced in suspension by PEI transfection or HSV infection reveals striking quantitative and qualitative differences. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 24, 154-170 (2022).
  16. Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther. 6 (6), 973-985 (1999).
  17. Wada, M., et al. Large-scale purification of functional AAV particles packaging the full genome using short-term ultracentrifugation with a zonal rotor. Gene Ther. 30 (7-8), 641-648 (2023).
  18. Kronenberg, S., Böttcher, B., von der Lieth, C. W., Bleker, S., Kleinschmidt, J. A. A conformational change in the adeno-associated virus type 2 capsid leads to the exposure of hidden VP1 N termini. J. Virol. 79 (9), 5296-5303 (2005).
  19. Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications. Hum. Gene Ther. Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
  20. Shiraishi, Y., Adachi, T., Cacicedo, J. M., Ido, Y. Development of a high-yield, high-quality purification process for adeno-associated virus vectors that can be used in vivo without ultracentrifugation: Application to a lung endothelial cell-targeted adeno-associated virus. FASEB J. 36 (12), e22653(2022).
  21. Fakhiri, J., Nickl, M., Grimm, D. CRISPR gene editing, methods and protocols. Methods Mol. Biol. 1961, 111-126 (2019).
  22. Grosse, S., et al. Relevance of assembly-activating protein for adeno-associated virus vector production and capsid protein stability in mammalian and insect cells. J. Virol. 91 (20), (2017).
  23. Drittanti, L., Rivet, C., Manceau, P., Danos, O., Vega, M. High throughput production, screening and analysis of adeno-associated viral vectors. Gene Ther. 7 (11), 924-929 (2000).
  24. Quan, D. N., Shiloach, J. rAAV production and titration at the microscale for high-throughput screening. Hum. Gene Ther. 33 (1-2), 94-102 (2022).
  25. Steininger, T., et al. Improved recombinant adeno-associated viral vector production via molecular evolution of the viral Rep protein. Int. J. Mol. Sci. 26 (3), 1319(2025).
  26. Fisher, K., et al. Polo-like kinase inhibitors increase AAV production by halting cell cycle progression. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 33 (1), 101412(2025).
  27. Chen, K., et al. Advanced biomanufacturing and evaluation of adeno-associated virus. J. Biol. Eng. 18 (1), 15(2024).
  28. DuBridge, R. B., et al. Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system. Mol. Cell. Biol. 7 (1), 379-387 (1987).
  29. Börner, K., et al. Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening. Mol. Ther. 28 (4), 1016-1032 (2020).
  30. Weinmann, J., et al. Identification of broadly applicable adeno-associated virus vectors by systematic comparison of commonly used capsid variants in vitro. Hum. Gene Ther. 33 (21-22), 1197-1212 (2022).
  31. Westhaus, A., et al. High-throughput in vitro, ex vivo, and in vivo screen of adeno-associated virus vectors based on physical and functional transduction. Hum. Gene Ther. 31 (9-10), 575-589 (2020).
  32. Yang, S., Shi, H., Chu, X., Zhou, X., Sun, P. A rapid and efficient polyethylenimine-based transfection method to prepare lentiviral or retroviral vectors:useful for making iPS cells and transduction of primary cells. Biotechnol. Lett. 38 (9), 1631-1641 (2016).
  33. Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. Adeno-associated virus vectors, design and delivery. Methods Mol. Biol. 1950, 51-83 (2019).
  34. Wang, G., et al. Assessment of key factors impacting variability in AAV vector genome titration by digital PCR. Int. J. Mol. Sci. 25 (10), 5149(2024).
  35. Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Front. Microbiol. 10, 1570(2019).
  36. Duong, T., Firmo, M., Li, C. T., Gu, B., Wang, P. Three-dimensional linkage analysis with digital PCR for genome integrity and identity of recombinant adeno-associated virus. Sci. Rep. 15 (1), 2154(2025).
  37. Tereshko, L., et al. A novel method for quantitation of AAV genome integrity using duplex digital PCR. PLOS ONE. 18 (12), e0293277(2023).
  38. Sormunen, A., et al. Comparison of automated and traditional Western blotting methods. Methods Protoc. 6 (2), 43(2023).
  39. Hiemenz, C., et al. Characterization of virus particles and submicron-sized particulate impurities in recombinant adeno-associated virus drug product. J. Pharm. Sci. 112 (8), 2190-2202 (2023).
  40. McIntosh, N. L., et al. Comprehensive characterization and quantification of adeno associated vectors by size exclusion chromatography and multi angle light scattering. Sci. Rep. 11 (1), 3012(2021).
  41. Su, Q., Sena-Esteves, M., Gao, G. Analysis of recombinant adeno-associated virus (rAAV) purity using silver-stained SDS-PAGE. Cold Spring Harb. Protoc. (8), pdb.prot095679(2020).
  42. Capra, E., Gennari, A., Loche, A., Temps, C. Viral-vector therapies at scale: Today's challenges and future opportunities . , McKinsey & Company. https://www.mckinsey.com/industries/life-sciences/our-insights/viral-vector-therapies-at-scale-todays-challenges-and-future-opportunities (2022).
  43. Huang, X., et al. AAV2 production with optimized N/P ratio and PEI-mediated transfection results in low toxicity and high titer for in vitro and in vivo applications. J. Virol. Methods. 193 (2), 270-277 (2013).
  44. Development of a novel cell culture medium for AAV production with multiple HEK293 lineages and process optimization. , Merck. https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/technical-documents/technical-article/pharmaceutical-and-biopharmaceutical-manufacturing/gene-therapy-manufacturing/development-of-novel-cell-culture-medium-aav-production (2025).
  45. Malm, M., et al. Evolution from adherent to suspension: Systems biology of HEK293 cell line development. Sci. Rep. 10 (1), 18996(2020).
  46. Warr, S. R. C. Animal cell biotechnology, methods and protocols. Methods Mol. Biol. 2095, 43-67 (2019).
  47. Manahan, M., et al. Scale-down model qualification of ambr 250 high-throughput mini-bioreactor system for two commercial-scale mAb processes. Biotechnol. Prog. 35 (6), e2870(2019).
  48. Wang, Q., et al. Syngeneic AAV pseudo-particles potentiate gene transduction of AAV vectors. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 4, 149-158 (2017).
  49. Florea, M., et al. High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 28, 146-159 (2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Recombinant AAVHigh Throughput ProductionGene TherapyAAV Vector ProductionMicroscale AAVMiniscale AAVHEK 293T CellsCell Transduction AssayVector Genome TitrationWestern Blot

מאמרים קשורים