Method Article

ייצור מבוסס מיקרוביוריאקטורים של תאי סטרומל מזנכימיים התלויים בעיגון, המוכנים לתסמונת מצוקה נשימתית חריפה

DOI:

10.3791/68650

⸱

December 12th, 2025

 ,  ,  , 
1Harvard-MIT Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 2Departments of Materials Science & Engineering and Biomedical Engineering, Cornell University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתואר פרוטוקול לייצור מיקרו-נשא-מיקרוביוריאקטור של תאים התלויים בעיגון כטיפולים פוטנציאליים מבוססי תאים. בהתמקדות במקרה שימוש של תסמונת מצוקה נשימתית חריפה, מוצגים תפוקת תאים דומה וביטוי גנים חיובי ביחס לתנאי תהליך מבוססי בקבוקון. פרוטוקול זה ניתן להרחבה לתאים תלויי עיגון אחרים ולסימני יעד.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפול מבוסס תאים הוא גישה טיפולית מתפתחת למגוון מצבים בריאותיים. עם זאת, ייצור כמויות מספקות של תאים איכותיים נותר אתגר מדעי וטכני פעיל. המוצר הסופי של התא אינו ניתן לעיקור; לכן, שיקולי סטריליות ואיכות לפי עיצוב הם קריטיים. בתאים התלויים בעיגון, התרחבות מבוססת בקבוק עדיין משמשת בקנה מידה של פיתוח ותעשייתי, מה שדורש טביעות רגל פיזיות גדולות, מגביל שליטה בסביבה הביוכימית (pH,CO2 ו-O2, גרדיאנטים דיפוזיונליים של חומרים מזינים ומטבוליטים), ומספק רמזים פיזיקליים שיכולים להשפיע על איכות התא הסופית. אתגרים אלו הניעו את אימוץ גישות ייצור מבוססות ביוריאקטורים, אך גישות כאלה בדרך כלל מתבצעות בקנה מידה נפחי שמציבים אתגרים ועלולים להיות יקרים למחקר חקרני או לפיתוח תהליכים. דווח כי ייצור טיפול בתאי מיקרוביוריאקטור-מיקרו-נשא מספק שליטה ביוכימית במהלך תרבית במקרה ניסוי של סוג מקור התא - תאי סטרומל מזנכימליים. להערכה ראשונית של איכות התאים במבחנה, נלקחה בחשבון תסמונת מצוקה נשימתית חריפה כמקרה שימוש פוטנציאלי. הגישה המודגמת כאן מאפשרת פיתוח תהליכים מהיר בקנה מידה על הספסל בזכות הנפח הקטן (2 מ"ל) והשליטה הביוכימית ההדוקה במיקרוביוריאקטור. כדי להשיג זאת עבור סוג תא תלוי עיגון, כמו תאי סטרומל מזנכימליים, נדרשו שינויים משמעותיים בתהליך המיקרוביוריאקטור, והשתמשו בפלטפורמת מיקרו-נשא ג'לטין שנוצרה בתוך הבית באמצעות תהליך מיקרופלואידי. כאן מוצגים פרטים נוספים על השיטה והפרמטרים של התהליך ששימשו לתרבות תאים התלויים בעיגון במיקרוביוריאקטור, במטרה לאפשר לחוקרים אחרים להתאים שיטות אלו למקרי השימוש שלהם ולסוגי מקורות התאים שלהם.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש בתאים חיים כמוצר טיפולי הפך לאחרונה לאפשרות טיפול מבטיחה למספר אתגרים בריאותיים. לדוגמה, תאי T של קולטני אנטיגן כימרי (CAR) הביאו הפוגה מתמשכת לאנשים עם מה שמכונה סרטן נוזלי — לוקמיה, לימפומה ומיאלומה נפוצה — שהיו עמידים לכל הטיפולים הזמיניםקודם לכן 1. בשנים האחרונות, אושר מוצר תאי גזע/סטרומל מזנכימלי (MSC) (ריונסיל) לטיפול בילדים הסובלים ממחלת השתל נגד המארח החריפה העמידה לסטרואידים (SR-aGvHD), מצב עם תמותה >-50%2. אך הרחבה לצרכים קליניים אחרים שלא נענו דורשת פיתוח אינטנסיבי הן של הטיפול והן של האמצעים לפיתוח וייצור המוצר.

אחד הצרכים הקליניים הבלתי מסופקים ניתן למצוא אצל אנשים הסובלים מתסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS). ARDS נדון כאן כדי לספק מקרה שימוש ספציפי להמחשת השיטה, התוצאות והדיון על הרחבות אפשריות למטרות מחלות אחרות. ה-ARDS קריטי (התקדמות בשעות עד ימים), נפוץ (>-200,000 מקרים בשנה בארה"ב) וקטלני (27%-46% תמותה, תלוי בחומרת ההופעה), זכה לתשומת לב מחודשת ונרחבת במהלך מגפת הקורונה כמנגנון המוות הטיפוסי של חולים שנדבקו ב-SARS-CoV-2 3,4. ARDS מאופיין בחדירות מוגברת של כלי דם ריאתיים, המובילה לבצקת בין-תכליתית, הצפות אלוואולריות וחדירת רכיבים תאיים, כולל נויטרופילים ותאי דם אדומים, לתא האלוואולרי5. בשלב ההפרשה הראשוני של ARDS, דלקת מולדת המתווכת על ידי תאי חיסון מונעת את התוצאות הפתוגניות הללו על ידי פגיעה בשלמות מחסומי האנדותל והאפיתל וקידום גיוס והפעלה של תאי החיסון באמצעות הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים; פתרון מוצלח של התגובה הדלקתית, תיקון שלמות המחסום והימנעות מפיברוזיס מופרז הם קריטיים להישרדות3. בעוד שטיפולים אנטי-ויראליים כמו רמדסיביר הראו פוטנציאל במאבק ב-ARDS המתווך על ידי SARS-CoV-2, לסיבות אחרות אין כיום התערבויות פרמקולוגיות מאושרות שמפחיתות תמותה5.

MSCs עשויים להציע גישה מבטיחה לטיפול ב-ARDS, בהתחשב בטרופיזם הריאתי הספציפי שלהם בהזרקה מערכתית וביכולתם להפריש אותות פרקריניים אימונומודולטוריים למיקרו-סביבה הסובבת 6,7. מחקרים מכניים העלו מעורבות בביטוי של גורמים פרקריניים כמו אינטרלוקין-10 (IL-10)8, אינדולאמין 2,3-דיאוקסיגנאז 1 (IDO1)9, פרוסטגלנדין E2 (PGE2)10, ואחרים, בהנעת עוצמה טיפולית משוערת של MSC לאינדיקציות מרובות, כולל פגיעה ריאתית חריפה (ALI)/ARDS11; לכן, רמות הביטוי של מוצרי גנים אלו מייצגות תכונות איכות קריטיות (pCQAs) פוטנציאליות שעשויות לנבא יעילות קלינית, ולספק קריטריונים לשחרור ניתנים למוצר התא הסופי במהלך הייצור. עם זאת, ייצור כמויות מספקות של תאים כדי להגיע למינון טיפולי יעיל הוא אתגר; ריונציל, למשל, מיועד למינון של 2 x 106 תאים/ק"ג של מסת מטופל, ניתנת פעמיים בשבוע במשך 4שבועות 12. עבור מטופל במשקל 80 ק"ג, זה שווה > 1.2 מיליארד MSCs לטיפול יחיד, מה שמחייב טביעת רגל פיזית גדולה לאחסון שטח פנים מספק למצב הצמיחה הדו-ממדי הזה. בהינתן שמוצר תאים חיים זה אינו ניתן לחטא לפני מתן המטופל מבלי לפגוע בפוטנציאל הטיפולי של התאים, ניצול הנחיות שיטות ייצור טובות קיימות לייצור בצורה סטרילית הוא חיוני, מה שמוסיף למורכבות הלוגיסטית של ייצור התאים ולעלות המוצרים13.

בנוסף, מחקרים קודמים הראו ראיות לכך שייצור MSC טיפוסי בבקבוקי תרבית רקמה (TCPS) תורם להופעת הטרוגניות פנוטיפית תוך-אוכלוסיית. בחלק מהשימושים הסופיים, זה הופך את מאמצי בקרת האיכות בין קבוצות לאתגר במחקר ובתרגום קליני 14,15,16,17. ישנה השערה כי השליטה הביוכימית המוגבלת הזמינה בבקבוקי TCPS, כולל גרדיאנטים דיפוזיונליים של גזים, חומרים מזינים ותוצרי פסולת מטבולית, ויסות pH לקוי ועוד, תורמים לאתגרים אלה.

נושאים אלו מניעים את אימוץ תרבית מבוססת ביוריאקטור כדי לנצל את הוויסות הביוכימי המעולה וצפיפות התאים הזמינים בפורמט צמיחה תלת-ממדי מבוקרעם ערבוב דינמי. עם זאת, עיבוד או ייצור מבוססי ביוריאקטור מגיע עם אתגרים משלו: כסוג תא תלוי עיגון, MSCs זקוקים לסוג כלשהו של תת-שכבת שעליה יגדלו בביוריאקטור, מה שמחייב הוספת מיקרו-נשאיים. בנוסף, רבים מהביוריאקטורים הזמינים מסחרית פועלים בקני מידה של נפח שדורשים משאבים כבדים (> 3 ליטר של מדיום גידול) למחקר חקרני הנדרש לזיהוי ושיפור פרמטרי תהליך לא ידועים המשפיעים על ביטוי מדדים מדידים של איכות התא. תכונות אלו מתוארות כתכונות קריטיות פוטנציאליות או pCQAs19.

Krupczak ואחרים דיווחו בעבר על גישת מיקרו-נשא-מיקרוביוריאקטור שיצרה MSCs עם ביטוי pCQA משופר ל-ARDS, הוגבלה להערכות in vitro 20. גישה זו שילבה שימוש בפלטפורמת מיקרו-נשא ג'לטין מתמוססת שיוצרה פנימית עם פלטפורמת מיקרוביוריאקטור מסחרית, המיקרוביוריאקטור Mobius Breez21. מיקרוביוריאקטור זה עושה שימוש בתאי כור חד-פעמיים בנפח 2 מ"ל ומשלב תכונות רבות מבוקשות לשיפור בקרה ביוכימית, כולל ויסות טמפרטורה, pH,CO2 ו-O2 במערכת דינמית מעורבבת ומזינה בפרפוזיה סגורה, אך לא תוכנן עם תאים תלויי עיגון כמו MSCs. למעשה, הערוצים המיקרופלואידיים הסטנדרטיים המשמשים להזרקת תכולת הכור קטנים מדי כדי לאפשר מעבר של מיקרו-נשאיים, מה שמחייב התאמה משמעותית לייצור מוצלח של MSCs בפלטפורמה זו.

כאן מתואר ומאויר פרוטוקול מפורט למטרת התאמת המיקרוביוריאקטור הזה לתרבות התלויה בעיגון של MSCs. פרמטרי התהליך שדווחו כאן זוהו במטרה להנחות פיתוח תהליכים וייצור של MSCs להערכת יעילות טיפולית פרה-קלינית, במבחנה, עבור ARDS. עם זאת, עקרונית, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם ליישומים אחרים של משתמשי קצה, מצבים דלקתיים או איממונומודולטוריים אחרים, וסוגי תאים תלויי עיגון שיכולים להרוויח משליטה ביוכימית מוגברת בקנה מידה רחב. איור 1 מציג את הפרוטוקול המתואר בסרטון המצורף, ואיור 2, איור 3 ואיור 4 ממחישים תוצאות מרכזיות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הקמה והכנת מיקרוביוריאקטור

  1. הכנת המספר הנדרש של מוצרי מיקרוביוריאקטור
    1. ודא שארון הבטיחות הביולוגית (BSC) פועל וסטרילי. הסר את שקית נייר האלומיניום שמכסה את החומר החדש על ידי ניקוב החלק העליון של השקית והשארת שקית האלומיניום עד לסיום הניסוי (כדי לתעד פרטים של פריט# במקרה של פגם). פתח את אריזת השלפוחית החיצונית וזרוק את חבילת ההידרציה שבתוכה. השליכו את אריזת השלפוחית החיצונית.
    2. רסס את אריזת השלפוחיות הפנימית עם 70% אתנול והכניס אותו ל-BSC. פתח את אריזת השלפוחיות הפנימית והשליך.
    3. באמצעות מזרק סטרילי, הסר את הבוכנה וחבר את הפיה למסנן סטרילי של 0.22 מיקרון. שפוך 50 מ"ל מים אולטרה-טהורים לא מחוטאים לתוך קנה המזרק. בעת החזקת המזרק מעל צינור סטרילי של 50 מ"ל, הכנס מחדש את הבוכנה למזרק והזריק את המים המסוננים לצינור האיסוף הממתין.
    4. הסר את מכסה הפלסטיק השקוף שמחובר לבקבוק LL במתקן הבקבוקים. באמצעות מזרק סטרילי חדש בנפח 50 מ"ל, הסר את הבוכנה וחבר את הפיה לבקבוק LL. שפוך את המים המסוננים לסטריל אל חבית המזרק והזריק אותם לבקבוק LL.
      הערה: פתחי החיבור ללא מחט עלולים להיתקע במהלך תהליך העיקור של היצרן, ולכן ייתכן שתצטרכו לחבר ולנתק את המזרק מספר פעמים כדי לשבור את האטימה של הבקבוק ולהזריק בהצלחה את התכולה. חלופה נוספת היא להשתמש בריתוך צינורות כדי לחבר בקבוק מקור לצינור הריתוך בצורה סטרילית לבקבוק המתאים.
    5. באותו הליך, למלא בקבוק L ב-25 מ"ל של DMEM דל גלוקוז ללא תוספת FBS, בקבוק R ב-25 מ"ל PBS סטרילי, ובבקבוק RR ב-8 מ"ל של תמיסת שטיפה נגד הדבקה. השתמש במזרק סטרילי חדש לכל נוזל.
    6. חזור על ההליך הזה עבור כמה שיותר צרכנים שנדרשים בניסוי.
  2. בצע בדיקת POD עצמית בכל POD המשמש לניסוי זה.
    הערה: הבדיקה העצמית אמורה להסתיים ללא בעיות; אם רכיב במבחן העצמי נכשל, טפלו בכישלון לפני שממשיכים.
  3. הוציאו את הקלטות לבדיקה עצמית לשקיות האחסון המוגנות באור.
  4. התקן את החומר המתכל לביוריאקטור כפי שמתואר להלן.
    1. הסר את הסרט הירוק מהשסתומים של החומר המתכל והתקן אותו במקומו ב-POD. התקן מחדש את המהדקים וודא שלא נשמע גז/אוויר שורק כשהוא יוצא.
    2. חבר את קו חיישן הלחץ של מתקן הבקבוק הלבן, קו לחץ האוויר האדום, וקו הוואקום הכחול בין הצרכנים לתחנת הבסיס/POD. ודא שפתח ההזרקה הצדדי סגור עם מהדק לבן.
    3. עקבו אחרי שלבי התוכנה כדי להתחיל ניסוי חדש. אלה מגיעים לשיא עם תכונת ההפעלה האוטומטית והכיול, שלוקחת ~4-5 שעות ויכולה לפעול במהלך הלילה.
  5. תייגו כל מדף בקבוקים עם מיקום ה-POD שלו כדי שיהיה קל להבחין לאיזה POD להחזיר את המזון לאחר שהוסר מהביוריאקטור. השתמש בסרט צבעוני כדי לציין את המיקום: Pod0 = אדום, Pod1 = כתום, Pod2 = צהוב, Pod3 = ירוק. כתוב את שם הניסוי ואת התאריך על הקלטת.
  6. תשאיר את הצרכנים לכייל כל הלילה. ודא שהמדיה יכולה להיכנס לכור ולצאת לקו הפסולת.
  7. אם מתכננים להשתמש בתאים המאוחסנים בחנקן נוזלי, הפשיר וצלח אותם כך שיהיה להם > 24 שעות להתאושש מאחסון קריו לפני ההזרקה.

2. כיול מחדש והכנת מיקרו-נשאים

  1. ודא ששלבי האוטופריימינג והכיול הושלמו בהצלחה.
    1. אם הכיול לא הושלם בהצלחה, יש לזהות ולתקן כל בעיה שורשית ואז לנסות כיוול מחדש. בעיות נפוצות כוללות הזנחת הסרת מהדק הבקבוקים הלבן, הזנחת הסרת הסרט הירוק מהחומר המתכל לפני הכנסתו ל-POD, ונפח מדיה לא מספק בבקבוק המדיה.
  2. ודא שחיישני החמצן המומסים יציבים.
    1. כמעט 10% מהצרכנים יראו סטייה של חיישן בחיישן ה-DO לאחר הכיול. בצע את הפעולה המתקנת המועדפת, שהיא להריץ מחדש את הכיול המלא. אם יש צורך, בצע אחד מהבאים.
      1. ודא שאין אוויר בקלטת, ואז הסר את הסימון של תיבת Display plots כדי להראות בקרים, ואז לחץ על כיול אוטומטי DO ו-pH.
        1. אם היה אוויר בכור כאשר נדרש כיול מחדש, חזרו לעמוד הראשון בלוח המחוונים של MBS על ידי לחיצה על החץ הכחול השמאלי בפינה השמאלית העליונה של החלון עבור ה-POD הספציפי. לחץ על הכפתור כדי להפעיל מבצעים ידניים. בדוק את תיבת Waste Tube ready והזן W בתיבת הזנת הטקסט כדי לבחור את בקבוק הפסולת. לחץ על כפתור ה-Out-wash , ואז לחץ על כן בחלון הקופץ. זה יפנה את תאי הכור וימלא אותם מחדש במדיה מבקבוק מקור המדיה.
  3. הכינו את המספר הנכון של מיקרו-נושאים בצינורות חרוטיים של 15 מ"ל, אחד לכל מצב.
    הערה: מספר המיקרוקרייר, שטח הפנים המצטבר וצפיפות הזריעה של התאים תלויים ביישום שלך. לפרוטוקול זה, מומלץ להזריק מספר מוחלט של מיקרו-נשאים שמביאים ל-75ס"מ רבוע של שטח גידול המיקרו-נשאים הזמין להשוואה לבקבוק T75.
  4. לאפשר למיקרו-נשאים לשקוע בצינור; שאיבת כמה שיותר סופרנטנט מבלי להסיר מיקרו-נשאים כדי לפנות מקום לתאים ולמדיה טרייה.

3. הזרקת תאים ומיקרו-נשאים

  1. ודא שהפריים האוטומטי והכיול הושלמו בהצלחה.
  2. לחץ דרך חלון התוכנה כאילו הכור מחוסן לפי זרימת העבודה הסטנדרטית של תא התלייה.
  3. הזן הערה בחלון הקופץ המציין שלא בוצעה הזרקת תאים בשלב זה.
  4. הפעל מבצעים ידניים כדי לעצור את ערבוב הכור ולהוסיף קליפס C לבן לקווי מתקן הבקבוקים.
  5. הסר כל פריט מתכל והעבר ל-BSC. הסר את המדיה המשומשת מבקבוקי הזרע והפסולת והזריקה.
    1. ודאו להסיר את כל הפסולת מבקבוק הפרפוזיה הגדול וגם מהצינור הקטן בנפח 1.5 מ"ל שבתוך בקבוק הפרפוזיה אם אתם מתכננים לאסוף מדיה מותאמת בכל שלב במחקר.
  6. הסר את מדיום הגידול שאינו עם סרום מבקבוק L והשליך. שטוף את בקבוק L עם ~20 מ"ל של PBS סטרילי וזרק. הוסף 25 מ"ל של מדיום גדילה עם תוספת סרום לבקבוק ה-L.
  7. החזר את הצרכנים ל-PODs שלהם. שים בקבוקי מקור מדיה על הקרח למשך שארית תקופת הניסוי. רענן את הקרח מדי יום.
    הערה: ניתן להוסיף קרח רטוב עם שקיות מקפיא כדי להאריך את משך בקרת הטמפרטורה.
  8. שטוף את הכורים עם PBS ושטוף את הקווים.
    1. לחץ על כפתור שטיפת הבקבוקים , הפעל את כפתור הרדיו עבור בקבוק L, בחר פלט לפסולת, ואז לחץ על Start Flush MSCserum.
      הערה: זה ישטוף את המדיה החדשה של hMSC דרך הקו כדי להבטיח שלא ייכנס עוד מדיה שאינה ממוסיפה FBS לכור.
    2. לחץ שוב על כפתור שטיפת הבקבוקים , בחר את כפתור הרדיו ל-Bottle RR, והתחל לשטוף מים. זה ישטוף את תמיסת השטיפה נגד הדבקה דרך הקו ויבטיח שהוא מוכן לכניסה לכור.
    3. בחלון תוכן הבקבוק, ציין בתוכנה ש-MSCserum נמצא בבקבוק R, שמכיל למעשה PBS.
    4. עבור לתפעול ידני ובצע שלושה מחזורי שטיפה-הוצאה על בקבוק הפסולת.
  9. הוסיפו תמיסת שטיפה נגד היצמדות לכור.
    1. חזור לחלון תכולת הבקבוק וציין ש-MSCserum נמצא ב-Bottle RR, שבפועל מכיל תמיסת שטיפה נגד היצמדות.
    2. עבור לתפעול ידני ובצע מחזור שטיפה אחד על בקבוק הפסולת.
      הערה: שטיפת PBS לשעבר נועדה למנוע מכל רכיב ב-DMEM להפריע לשטיפת האנטי-היצבות; כעת, הכור אמור להיות מלא בתמיסת שטיפה נגד היצמדות עם PBS זעירים.
  10. לאחר 30 דקות עם תמיסת אנטי-היצמדות, שטוף את המזון עם PBS.
    1. בחלון תוכן הבקבוק, ציין בתוכנה ש-MSCserum נמצא בבקבוק R, שמכיל למעשה PBS.
    2. עבור לתפעול ידני ובצע שלושה מחזורי שטיפה-הוצאה על בקבוק הפסולת.
    3. חזור לחלון תכולת הבקבוק וציין בתוכנה ש-MSCserum נמצא בבקבוק L, שמכיל מדיה hMSC.
  11. רוקן את הכור כדי להמתין להזרקת התא והמיקרו-נשאי. בפאנל התפעול הידני, לחץ על Renoculate והשאיר את המערכת בשלב שבו לוח המחוונים מציין לחסן את הכור.
    הערה: כאן, המונח 'חיסון' מתייחס פשוט להזרקה של התאים המיועדים להתרחבות במיקרוביוריאקטור.
  12. הוסף את הנגדים הנוספים כדי למודול את מהירות הערבוב בקו עם נגד R0 ברירת המחדל.
  13. הרם תאים מהבקבוק וסופר אותם על המוסיטומטר. בצע את כל הפעולות הפתוחות ב-BSC כדי להבטיח סטריליות.
    1. שואף את המדיום, ואז שטוף עם 5-10 מ"ל של PBS מחומם מראש. שאפו את ה-PBS והוסיפו 5 מ"ל טריפסין + EDTA לבקבוק.
    2. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות או עד שכל התאים התרוממו לעין מפני הבקבוק.
    3. הוסף 10 מ"ל של מדיום hMSC מחומם מראש כדי לנטרל את פעילות הטריפסין. שואב את תכולת הנוזל והנח אותו בצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל.
    4. צנטריפוגה את התאים ב-300 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט ותחזירו את כדור התא בנפח מתאים של מדיה hMSC לספירה. לבקבוק T75 מתמזג לחלוטין, נפח מתאים הוא בדרך כלל 2-4 מ"ל, מה שיניב ריכוז תאים של ~1-2E6 תאים למילילטר.
    5. מערבבים דגימה מהתאים שהוחזרו עם צבע חיוניות Trypan Blue בחלק שווה והעמיסו את התערובת להמוסיטומטר לספירה. ספרו את התאים לפי הוראות היצרן.
  14. חשב את נפח תמיסת התאים הנדרש כדי להגיע ל-150,000 תאים ופיפטה את הכמות הזו לצינור הקוניקל הממתין של 15 מ"ל המכיל מיקרו-נשאים לכל מצב. העלה את הווליום בצינור ל-2.2 עד 2.5 מ"ל עם מדיה hMSC טרייה וחמימה.
    הערה: הנפח בכל קונוס של 15 מ"ל צריך להיות מעט גדול מ-2 מ"ל, כך שההזרקה תוביל למצב כור מלא מעט מדי כדי למנוע בועות, שיואזנו בשלב מאוחר יותר.
  15. הוסף את נפח התאים המתאים לבקרת הבקבוקון T75.
  16. לעבוד עם אחד או שניים של מוצרי צריכה בכל פעם, להוציא את הצרכים מה-POD ולהכניס אותם ל-BSC.
  17. למשוך תאים ומיקרו-נשאים במזרק של 5 מ"ל באמצעות מחטים ירוקות קהות של 4 אינץ'. הזריק את התאים והמיקרו-נשאים לכור.
  18. החזירו את החומר הצרכן לתחנת הבסיס וחזרו על התהליך עד שכל החומרים הצרכוניים מוזרקים.
  19. לחץ דרך חלונות התוכנה כדי לציין שהחיסון בוצע. כאשר התוכנה חוזרת לדף הבית הרגיל, הסר את הקלמפ הלבן מקווי הפלט המתכלים.
  20. היכנסו למבצעים ידניים ומבצעים פונקציית Eject Excess עם פורט יציאה מוגדר ל-P לפרפוזיה. הפעל מצב מיקס סטטי, תוך שימוש ב-1680 שניות דלוק ו-120 שניות כבוי. שמור על תדר המיקס על 5 הרץ למיקסר סטטי.
  21. כבה את מדידת ההתייחסות לצפיפות אופטית.
    1. פתח את לקוח ה-MBS ולחץ על התחברות. הכנס את הפקודה הבאה המופיעה במרכאות: "dmem_write 0,1,2,3 F_measure_ODref_skip 1"
    2. לחץ על שלח, המתין לאישור שהפקודה נשלחה בהצלחה, וסגור את לקוח ה-MBS.
  22. אחרי 24 שעות, כבה את מצב המיקס הסטטי והפעל מחדש את המיקס הרגיל. הורד את תדר המיקס ל-1.5 הרץ.

4. הפעלת מיקרוביוריאקטור

  1. עקוב אחרי המיקרוביוריאקטור מדי יום כדי לוודא שאין בעיות שיפריעו לניסוי. ודא שבקבוקי מקור המדיה שומרים על >5 מ"ל מדיה כדי לפרפיוז מוצלח של הכור ללא בעיות.
  2. החלף את דליי הקרח לפי הצורך כדי לשמור על שליטה בטמפרטורה של בקבוק מקור המדיה. שמור את הכיסוי המגן לאור מעל חזית המיקרוביוריאקטור כדי למנוע התדרדרות מבוססת אור של רכיבי מדיה נדיפים.
  3. ודא שלא יוכנסו בועות לכור. אל תשכחו להחליף מדי פעם את המדיה בבקרת הפלאסק של TCPS.

5. קציר מיקרוביוריאקטורים

  1. ודאו שה-BSC סטרילי ומוכן לפעולה.
    1. חממו את התגובות הנדרשות הבאות בחרוז או באמבט מים לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס: ~25 מ"ל מדיום חם hMSC, 10 מ"ל PBS חמים, ו-1.5 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל פרונאז הנדרש לקציר.
  2. הכינו את מתקן הבקבוקים לקציר.
    1. הפעל מצב הפעלה ידנית לכל POD בתוכנה.
    2. מהדקים את קווי הקלט הצרכוניים באמצעות קלאפ C לבן לאורך החלק השקוף של הקו.
    3. הסר את הצרכנים ל-BSC. הסר את תכולת בקבוק הפסולת והשליך.
    4. שטוף את בקבוק הפסולת עם ~20 מ"ל PBS וזרוק. בדוק את הנפח שנותר בבקבוק המדיה ומלא במדיה hMSC טרייה (קרה) במידת הצורך.
      הערה: כאן, נדרש > 4 מ"ל מדיה להשלמת שלושת מחזורי השטיפה-השטיפה הנדרשים לקציר.
    5. ריפד את בקבוק הפסולת ב-~5 מ"ל של מדיום hMSC קר כדי לרכך את הנוזל שנקצר.
  3. קצור את התאים מהמיקרוביוריאקטור.
    1. באמצעות מזרק של 1 מ"ל, יש למשוך 200 מיקרוליטר של 10 מ"ג/מ"ל פרונאז למזרק ו~300-400 מיקרוליטר אוויר.
    2. הברג את פקק צינור ההזרקה של פתח הצד וריסס את מחבר השסתומים ללא מחט ב-70% אתנול. הסר את הסרט, אבטח את קו ההזרקה בצד הקשור ופתח את הקשר. שחרר את מהדק הטיפה הלבן.
    3. חבר את המזרק של 1 מ"ל והזריק בעדינות את הפרונאז לכור. רדוף אחרי הנוזל לאורך קו ההזרקה עם אוויר כדי לוודא שכל תכולת הנוזל תגיע לכור.
    4. תחבר מחדש את מהדק הטירפול ותסגור מחדש את כבל ההזרקה בצד. החזר את החומר ל-POD שלו, חבר מחדש את כל הקווים, הסר את ה-C-clamp הלבן, וממשיך לערבב.
    5. ודא שבקבוק הפסולת ובקבוק מקור המדיה מוחזקים על קרח. הפעל טיימר של 5 דקות ותן ל-Pronase לעכל את המיקרו-נשאים בתוך הכור.
    6. אחרי 5 דקות, בדוק אם המיקרו-נשאים התדרדרו על ידי אימות שהם כבר לא נראים לעין בכור. אם המיקרו-נשאים עדיין נראים לעין, אפשר דקה נוספת לעיכול. אם אין מיקרו-נשאים גלויים, המשיכו.
    7. קצור את התאים. הפעל מצב הפעלה ידנית, הגדר את # המחזורים ל-3, ופתח יציאה ל-W לבזבוז, ולחץ על 'הוצאת שטיפה'.
    8. לאחר סיום מחזורי השטיפה בהוצאה, הוציאו את החומר הצרכן חזרה ל-BSC ושלבו את תכולת בקבוק הפסולת באמצעות מזרק בנפח 10 או 20 מ"ל.
    9. שפוך את תכולת בקבוק הפסולת לצינור צנטריפוגה קוני בנפח 15 מ"ל. צנטריפוגה את התאים בעוצמה של 300 x g למשך 5 דקות, שאפו את הסופרנאנט, והערכו את גודל כדור התא.
    10. החזירו את כדור התא ל-1-5 מ"ל של מדיום גדילה או PBS וספרו את התאים על המוציטומטר. חזור על השלב הזה עבור כל הצרכנים.
  4. קצור את המצב של הבקבוק לפי פרוטוקולי תרבית התאים הרגילים שלך. פרוטוקול טיפוסי ל-MSCs מתואר בגרסה 3.13.

6. ניתוח התאים מתנאי המיקרוביוריאקטור ותנאי הבקבוק ליישום במורד הזרם

הערה: השיטות האנליטיות ששימשו להפקת התוצאות המוצגות מוצגות בקצרה להלן ומתוארות בפירוט נוסף ב-Krupczak, Farruggio, ו-Van Vliet (2024)20.

  1. בקרה סביבתית: השתמש בממשק משתמש גרפי המסופק על ידי המיקרוביוריאקטור כדי לגשת ולהציג נתונים מכל אחד מהחיישנים המשולבים של הצריכה במהלך תקופת הגידול. הנתונים הללו מסופקים בתוכנת Breez Explorer שמותקנת במחשב הנייד שמצורף למיקרוביוריאקטור.
  2. תפוקת תאים: קצור MSCs כפי שתואר לעיל והפך את התאים ל-300 x גרם למשך 5 דקות. הסר בזהירות את הסופרנטנט ותלווה מחדש את כדור התא בנפח מתאים של מדיום PBS או hMSC (1-2 מ"ל). קחו דוגמית מתערובת התאים המושפעת וערבבו עם כמות שווה של צבע Trypan Blue. מיקרופיפטה של תערובת הדגימה המוצבעת לשבב המוציטומטר ומדידת מספר התאים והכדאיות באמצעות המוציטומטר אוטומטי או ידני.
  3. בדוק את ביטוי הגנים באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית דו-שלבית, כפי שמתואר להלן.
    1. טיהור RNA: השתמש בערכת RNeasy Mini לבידוד וטיהור RNA מכל דגימה בהתאם להוראות היצרן. בקיצור, לעבור את התאים, להעביר את תכולת התאים לצינור סיבוב טיהור, ולשטוף את הדגימות עם כל בופר כדי להסיר רכיבים תאיים מיותרים, חומצות גרעין וחלבונים שעלולים להפריע ל-PCR הבא.
    2. המרת cDNA: השתמש בערכת שעתוק הפוך בקיבולת גבוהה ובמחזור תרמי להמרת ה-RNA המטוהר ל-DNA משלים (cDNA) בהתאם להוראות היצרן. בקיצור, הפשיר את רכיבי הערכה וצור תערובת ראשית על ידי שילוב רכיבים בנפחים המתאימים למספר הדגימות שלך. טעינו חלקים שווים של RNA מטוהר ותערובת מאסטר מוכנה (10 מיקרוליטר כל אחד) לכל באר של לוח PCR, תוך שמירה על זהירות במעקב אחר מיקומי זהות הדגימה. עקבו אחרי פרוטוקול היצרן במחזור התרמי כדי להשלים את תגובת השעתוק ההפוכה.
    3. qPCR: באמצעות פריימרים ספציפיים לרצף עם אקסונים שמאומתים כדי להימנע מדימר פריימר, טעינו פלטת qPCR עם 384 בארות עם פריימר קדמי, פריימר הפוך, תבנית cDNA, מים ללא נוקליאז ותערובת מאסטר בנפחים מתאימים (בדרך כלל, 1 מיקרוליטר, 1 מיקרוליטר, 1 מיקרוליטר, 7 מיקרוליטר, 10 מיקרוליטר, בהתאמה) באמצעות מספר בארות שכפול טכניות לכל גן ודגימה. חלק את התכולה על פני מספר לוחות במידת הצורך כדי ללכוד את כל מטרות הגנים. ודאו שכל הדגימות עבור מטרה גנטית מסוימת נטענות על אותה פלטה כדי למנוע שונות בין צלחת בתוצאות, ושלכל פלטה יש גן ניקיון מתאים ובקרות ללא תבניות. למדוד עוצמת פלואורסצנציה במכונת qPCR מתאימה ולהשתמש בשיטת ΔΔCt לכימות יחסי לחישוב ביטוי גנים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המיקרוביוריאקטור אפשר ניטור וויסות של גורמים סביבתיים במשך כ-10 ימים בתרבית. גורמים סביבתיים, כולל pH (איור 2A), טמפרטורה (איור 2B), חמצן מומס (איור 2C) ופחמן דו-חמצני (איור 2D), נמדדו במדויק ונשמרו בתנאי המיקרוביוריאקטור, אך לא בתנאי בקבוק, במהלך תקופת הגידול. הנתונים באיור 2A-D מציגים תוצא...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה מתוארת שיטה להרחבה, פריימינג וקטיף תאים באמצעות גישת מיקרו-נשא-מיקרוביוריאקטור. תהליך זה מאפשר לתאים התלויים בעיגון כמו MSCs להגדיל את מספר התאים תחת שליטה ביוכימית מעולה של פלטפורמת ביוריאקטור (יחסית לבקבוקי TCPS קונבנציונליים) בקנה מידה על הספסל, המתאימים להתפתחות תהליכים מהירה. יתרה מזאת, הוכח כי ייצור מיקרו-נשא-מיקרוביוריאקטור של MSCs יוצר פנוטיפ תאים מוקדם שעשוי להציג עוצמה טיפולית מוגברת לטיפול ב-ARDS.

גישות מבוססות ביוריאקטור מציעות יתרונות...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים חושפים הסכם שיתוף פעולה עם יצרנית המיקרוביוריאקטורים, MilliporeSigma.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למתקן Genomics Core (Weill Cornell Medicine) על הייעוץ בניתוח qPCR ופתרון תקלות. אנו מודים בתודה על עזרתם של אוון גייטס ואריק שיואה (MilliporeSigma) בתמיכה הטכנית למיקרוביוריאקטור.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
תמיסת שטיפה נגד היצמדותטכנולוגיות תאי גזע7010
ארון בטיחות ביולוגית
מיקרוביוריאקטור בריזמיליפורסיגמא
צנטריפוגה
צינור קוני, 15 מ"ל
צינור קוני, 50 מ"ל
Dulbecco's Modified Eagle בינוני, עם רמת סוכר נמוכהגיבקו11885084
אתנול
סרום בקר עובריגיבקוA5670701
המוציטומטר
קלטת מעבדה
מיקרו-נושאים
צינור מיקרוצנטריפוגה, 1.5 מ"ל
מיקרוסקופ
מחט, קהה, 4 אינץ', 18 גייג'אמזוןB0D663ZR6D
תמלח מפוספט עם בופרקורנינג21-040-CM
פרונאז, מ-Streptomyces griseusמיליפורסיגמא10165921001
פיפטה סרולוגית, 10 מ"לVWR75816-100
מים טרייליים ללא יוניים
מסנן מזרק, 0.22 אממ, סטריליסלטריט סיינטי פרודקטס229762
מזרק, 1 מ"לBD309628
מזרק, 20 מ"לBD302830
מזרק, 5 מ"לBD309646
מזרק, 50 מ"לBD309653
בקבוק פוליסטירן לתרבות רקמה, T75תרמו פישר סיינטיפיק130190
טרייפן בלוסיגמה אלדריץ'T8154-100ML

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sin, W. X., et al. A high-density microfluidic bioreactor for the automated manufacturing of CAR T cells. Nat Biomed Eng. 8 (12), 1571-1591 (2024).
  2. US Food and Drug Administration. FDA Approves First Mesenchymal Stromal Cell Therapy to Treat Steroid-refractory Acute Graft-versus-host Disease. , (2024).
  3. Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. Acute Respiratory Distress Syndrome. N Engl J Med. 377 (6), 562-572 (2017).
  4. Torres Acosta, M. A., Singer, B. D. Pathogenesis of COVID-19-induced ARDS: implications for an ageing population. Eur Respir J. 56 (3), 200249(2020).
  5. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 18(2019).
  6. Kidd, S., et al. Direct evidence of mesenchymal stem cell tropism for tumor and wounding microenvironments using in vivo bioluminescent imaging. Stem Cells. 27 (10), 2614-2623 (2009).
  7. Gnecchi, M., et al. Evidence supporting paracrine hypothesis for Akt-modified mesenchymal stem cell-mediated cardiac protection and functional improvement. FASEB J. 20 (6), 661-669 (2006).
  8. Doron, G., Temenoff, J. S. Culture Substrates for Improved Manufacture of Mesenchymal Stromal Cell Therapies. Adv Healthc Mater. 10 (15), e2100016(2021).
  9. Noronha, N. C., et al. Priming approaches to improve the efficacy of mesenchymal stromal cell-based therapies. Stem Cell Res Ther. 10 (1), 131(2019).
  10. Hezam, K., et al. Superior protective effects of PGE2 priming mesenchymal stem cells against LPS-induced acute lung injury (ALI) through macrophage immunomodulation. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 48(2023).
  11. Zhang, X., et al. Mesenchymal stromal cells alleviate acute respiratory distress syndrome through the cholinergic anti-inflammatory pathway. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 307(2022).
  12. Full Prescribing Information - Ryoncil. , https://www.ryoncil.com/pdfs/prescribing-information.pdf (2024).
  13. Kumar, A., Starly, B. Large scale industrialized cell expansion: producing the critical raw material for biofabrication processes. Biofabrication. 7 (4), 044103(2015).
  14. Rennerfeldt, D. A., Raminhos, J. S., Leff, S. M., Manning, P., Van Vliet, K. J. Emergent heterogeneity in putative mesenchymal stem cell colonies: Single-cell time lapsed analysis. PLoS One. 14 (4), e0213452(2019).
  15. Mets, T., Verdonk, G. In Vitro Aging of Human Bone Marrow Derived Stromal Cells. Mech Ageing Dev. 16, 81-89 (1981).
  16. Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (14), 7841-7845 (2001).
  17. Tremain, N., et al. MicroSAGE Analysis of 2,353 Expressed Genes in a Single Cell-Derived Colony of Undifferentiated Human Mesenchymal Stem Cells Reveals mRNAs of Multiple Lineages. Stem Cells. 19 (5), 408-418 (2001).
  18. Klein, S. G., et al. A prevalent neglect of environmental control in mammalian cell culture calls for best practices. Nat Biomed Eng. 5 (8), 787-792 (2021).
  19. Bellani, C. F., et al. Scale-Up Technologies for the Manufacture of Adherent Cells. Front Nutr. 7, 575146(2020).
  20. Krupczak, B., Farruggio, C., Van Vliet, K. J. Manufacturing mesenchymal stromal cells in a microcarrier-microbioreactor platform can enhance cell yield and quality attributes: case study for acute respiratory distress syndrome. J Transl Med. 22 (1), 614(2024).
  21. Ng, E. X., et al. Dissolvable Gelatin-Based Microcarriers Generated through Droplet Microfluidics for Expansion and Culture of Mesenchymal Stromal Cells. Biotechnol J. 16 (3), e2000048(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microbioreactor ProductionMesenchymal Stromal CellsAnchorage Dependent CellsCell Therapy ManufacturingGelatin MicrocarriersAcute Respiratory DistressEnvironmental MonitoringCell HarvestingCell Quality ControlBiochemical Environment Control

Related Articles