שיפור רווחת הגרביל באמצעות אימון חיזוק חיובי בסביבות מחקר

סיכום

אימון קליקר משמש כטכניקת חיזוק חיובית לגרבילים במעבדה. שיטה זו שואפת להפחית מתח ולשפר את יעילות הטיפול באמצעות חיזוק חיובי, ובכך לתרום לרווחתם של חיות הניסוי.

תקציר

שיפור רווחת חיות המעבדה על ידי מזעור הלחץ וקידום טיפול מותאם למינים הוא יעד מרכזי של המחקר הביו-רפואי העכשווי ברחבי העולם. אימון קליקר, צורה מוכרת של אימון חיזוק חיובי, משתמש בצליל קליק כמחזק מותנה כדי לגשר בין ההתנהגות הרצויה לתגמול, ומאפשר לבעלי חיים ללמוד מהר יותר ועם מתח מופחת. קבוצת המחקר שלנו הדגימה בעבר שאימון קליקר מתפקד כצורה של העשרה קוגניטיבית בעכברים וחולדות. במחקר הנוכחי, התאמנו בהצלחה את גישת האימון הזו לגרבילים מונגוליים (Meriones unguiculatus), והתאימנו את הפרוטוקול למאפייני ההתנהגות הספציפיים למין של הגרבילים. קבוצה של 43 גרבילים מולדים (27 נקבות ו-16 זכרים) עברו פרוטוקול אימון קליקר סטנדרטי של 10 ימים, שבמהלכו הם למדו להתקרב מרצונם ולתקשר עם ידו של הנסיין בתמורה לתגמול מזון. לאחר תקופת האימון, בעלי החיים עברו הערכות התנהגותיות, כולל מבחן שדה פתוח ומבחן אינטראקציה אנושי סטנדרטי, כדי להעריך את השפעות האימון על התנהגות חקרנית ואינטראקציה בין בני אדם לחיה. הממצאים שלנו מראים כי היישום של אימון קליקר בגרבילים הוא מהיר, יעיל ונסבל היטב. בעלי חיים מאומנים, במיוחד נקבות, הראו אינטראקציה רצונית מוגברת עם ידו של הנסיין והתנהגויות דמויות חרדה מופחתות. תוצאות אלה מצביעות על כך שפרוטוקולי אימון קליקרים מותאמים למינים יכולים להקל על פיתוח אמון בין הנסיין לבעלי החיים, ובסופו של דבר להפחית את הלחץ ולשפר הן את רווחת בעלי החיים והן את אמינות תוצאות הניסוי.

מבוא

עידון השימוש בבעלי חיים במחקר ביו-רפואי להפחתת מתח ושיפור הרווחה הוא יעד בינלאומי מוכר ^1,2,3. בשנת 2022, הנציבות האירופית דיווחה כי מתוך 838,539 בעלי החיים ששימשו באיחוד האירופי (Alures), 3,440 היו גרבילים⁴. בגרמניה, כ-1.46 מיליון בעלי חוליות וצפלופודים שימשו בניסויים בבעלי חיים בשנת 2023 תחת סעיף 7 (2) לחוק רווחת בעלי חיים (TierSchG)⁵. בשילוב עם בעלי חיים שנהרגו למטרות מדעיות, המספר הכולל של חיות מעבדה ששימשו בגרמניה בשנת 2023 הגיע לכ-2.1 מיליון⁶. מספרים אלה מדגישים את הרלוונטיות של שימוש בגרבילים במחקר ביו-רפואי, ומדגישים את הצורך בשיפורים מתמשכים בפרוטוקולים לרווחת בעלי חיים.

הצרכים ההתנהגותיים של חיות מעבדה והחשיבות של אסטרטגיות ניהול התומכות ברווחה ספציפית למינים הוכרו באופן נרחב כחיוניים לפרקטיקה אתית ומדעית⁷. אינטראקציות בין בני אדם לבעלי חיים בגידול מוגבלות לעתים קרובות למשימה החיונית של העברת בעלי חיים מכלובים מלוכלכים לכלובים נקיים, מבלי לטפח קשר בין המטפל לבעל החיים. היעדר אינטראקציה חברתית זה יכול להוביל ללחץ, המשפיע לרעה על התנהגות ופיזיולוגיה של בעלי חיים, ובסופו של דבר משפיע על תוצאות הניסוי⁸. טיפול לא נכון הוא מקור ידוע לשונות בנתוני המחקר⁹. לדוגמה, הרמת עכברים בזנב מגבירה חרדה ולחץ, בעוד ששיטות מנהרה או יד פתוחה מקדמות גישה רצונית ומפחיתות התנהגות דמוית חרדה^10,11. טיפול משמש אפילו כגורם לחץ חריף מתוקנן במחקרים על יונקים קטנים בשל השפעותיו העקביות על סמנים פיזיולוגיים כמו רמות גלוקוקורטיקואידים¹². ממצאים אלה מדגישים את ההשפעה המשמעותית של אינטראקציות אנושיות קצרות ואת הצורך בטכניקות טיפול מעודנות^{במתח נמוך 13}.

עידון מבוסס אימון זכה להכרה הולכת וגוברת כשיטה יעילה לשיפור רווחת בעלי החיים ואיכות המחקר^10,14. אחת משיטות האימון היעילות ביותר המשמשות במחקר בבעלי חיים היא אימון קליקר, שלעתים קרובות משולב עם תגמולי מזון^15,16. במהלך העשורים האחרונים פורסמו 34 מחקרים על אימון קליקרים, המשקפים את העניין המדעי הגובר בגישת אימון זו¹⁷. מחקרים מראים שכלבים (47%) וסוסים (30%) הם חיות המעבדה המאומנות ביותר, ואחריהם חתולים, בקר, דגים, עזים וקופים (כל אחד 3%)¹⁷. בעלי חיים מאולפים יכולים להשתתף מרצונם בהליכים, להפחית מתח ולמזער את הצורך בריסון פיזי¹⁸.

פרוטוקולי חיזוק חיובי יושמו גם על יונקים קטנים. מחקרים אחרונים מדווחים על אילוף מוצלח בארנבים להליכי גידול, וגרבילים למחקר התנהגותי^19,20. בכמה עבודות קודמות, הראינו שעכברים שאומנו בקליקר הפגינו מגע מוגבר עם נסיינים ופחות מדדים התנהגותיים הקשורים ללחץ, כגון מתן שתן, עשיית צרכים, קולות והתנהגות צפה 21,22,23. זה עולה בקנה אחד עם ממצאים מתחום הווטרינריה, שם הוכח שאילוף של יונקים קטנים - כגון ארנבות, מכרסמים וחמוסים - מפחית את תגובות הפחד ומקל על הטיפול באמצעות טכניקות חיזוק חיוביות²⁴. יש לציין כי ראינו גם הבדל ספציפי למין בביצועי האימון: עכברים נקבות הראו מוטיבציה גבוהה יותר ותדירות תגובה גבוהה יותר מאשר זכרים במהלך האימונים. זה מצביע על כך שעכברים נקבות עשויות לעסוק ביתר קלות במשימות אימון מרצון בתנאים סטנדרטיים²¹.

בעוד שגישות האילוף הקיימות לגרבילים מבטיחות, קשורות בדרך כלל לפרדיגמות התנהגותיות ספציפיות ואינן מיועדות לשימוש כללי בשגרת הגידול היומיומית²⁵. פרוטוקול סטנדרטי ישים לגרבילים מונגוליים (Meriones unguiculatus) - ללא תלות במערך ניסוי מסוים - עדיין לא נקבע. כדי להתמודד עם פער זה, המחקר הנוכחי נועד לפתח ולתקף פרוטוקול אימון קליקר פשוט המותאם למאפיינים הספציפיים למין של גרבילים. הפרוטוקול מתמקד בהפחתת מתח באמצעות טיפול עדין ומעורבות מרצון עם הנסיין. אנו משערים שגישה זו תשפר את רווחת בעלי החיים, תבסס קווי בסיס התנהגותיים עקביים יותר ותגדיל את האמינות של תוצאות הניסוי. בשל הפשטות והגמישות שלו, ניתן ליישם אותו בקלות במגוון רחב של הגדרות מעבדה.

כדי להעריך את היעילות והישימות של פרוטוקול ההכשרה המוצע, ניסחנו את התחזיות הספציפיות הבאות הניתנות לבדיקה:
גרבילים מאומנים יבצעו באופן אמין את התנהגות המטרה - ישיבה מרצון על ידו של הנסיין - תוך תקופת אימון של 10 ימים.
בעלי חיים מאומנים יציגו אינטראקציה רצונית מוגברת עם הנסיין במבחן סטנדרטי, בהשוואה לקבוצת ביקורת לא מאומנת.
בעלי חיים מאולפים יציגו אינדיקטורים התנהגותיים התואמים להפחתת התנהגות דמוית חרדה, במיוחד על ידי בילוי זמן רב יותר באזור המרכזי של מבחן שדה פתוח.
נקבות גרבילים עשויות להראות תגובות התנהגותיות חזקות יותר לאימונים מאשר זכרים, מה שעשוי לשקף הבדלים בין המינים בהסתגלות לאינטראקציה אנושית.
תחזיות אלה הנחו את עיצוב ההערכות ההתנהגותיות והודיעו על קריטריוני ההערכה של הפרוטוקול.

פרוטוקול

הטיפול בגרבילים והליכי הניסוי נערכו בהתאם להנחיות האירופיות, הלאומיות והמוסדיות לטיפול בבעלי חיים. מאושר על ידי רישיון הרשות המקומית G 21-1-100. הפרוטוקול כולל 10 ימי אימונים (שני עד שישי), עם הפסקות בסופי שבוע (שבת וראשון). ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות לצרכים ספציפיים. כל החומרים הנדרשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת בעלי חיים

1. להשיג את המספר הנדרש של בעלי חיים ממתקן הגידול המוסדי. שמור על בעלי חיים במחזור אור/חושך של 12 שעות במערכת דיור פתוחה.
2. לגמול צאצאים בגיל 5 שבועות. סמן את החיות לאחר הגמילה ושכן בקבוצות חד מיניות של 2-3 פרטים בכלוב.
3. מאחור ומאכלסים את כל הגרבילים בכלובים מסוג 4 (590 x 380 x 200 מ"מ; 1.815 מ^"ר). ציידו כל כלוב בשלוש מנהרות לפחות ולעסו עצים להעשרה. לספק מזון ומים אד ליביטום (ראה טבלת חומרים).
4. הקצה באופן אקראי בעלי חיים לקבוצות מאומנות (נקבות: n=27; זכרים: n=16) ולא מאומנים (נקבות: n=16; זכרים: n=5) כדי למזער את הטיית הבחירה ולהבטיח תנאי בסיס דומים בין הטיפולים. הרגילו בעלי חיים הן לתגמול המזון והן לידו של הנסיין בסביבת כלוב הרבייה, כמתואר בשלב 2.2. של הפרוטוקול. בתחילת האימון, החיות (נקבות וזכרים) היו בנות 8 שבועות בערך.

2. הרגלת בעלי חיים

הערה: אם לא הועברו גרבילים, ניתן להפחית את זמן ההתרגלות. הסקירה הגרפית של הפרוטוקול מתוארת באיור 1. בבעלי חיים שגודלו בבית, ניתן לקצר באופן דרסטי את תקופת ההתרגלות של הצעירים אם חיות ההורים מורגלות היטב וההרגלה הידנית נמשכת לפחות פעם בשבוע מרגע שהגורים הופכים לניידים. שלב הכנה זה נועד להפחית את הניאופוביה ולבסס עמותה חיובית לטיפול במזון, מה שמבטיח מעבר חלק לאימונים מבוססי קליקר.

איור 1: סקירה כללית של פרוטוקול הרגלה ואילוף עבור בעלי חיים ממקור חיצוני ופנימי: איור זה מתאר את ציר הזמן ואת השלבים הפרוצדורליים העיקריים של פרוטוקול ההרגלה והאילוף המשמש עבור גרבילים ממקור חיצוני וגרבילים שגודלו בבית. הפרוטוקול כולל טיפול ראשוני, הרגלת מזון, הכנסת קליקר ואילוף קליקרים, מותאם על סמך המקור והחשיפה המוקדמת של בעלי החיים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

1. שבוע 1: הרגלה לבעלי חיים ממקור חיצוני
   1. עם ההגעה, מאכלסים את הגרבילים בקבוצות חד מיניות של 2-3 בעלי חיים בכלוב. הוסף חומר קינון ומצעים מקופסת ההובלה, יחד עם כמות קטנה של כדורי מזון מוכרים כדי לתמוך בהתאקלמות.
   2. ספק לכל כלוב לפחות 3-4 מנהרות (למשל, צינורות קרטון או מקלטי פלסטיק) ומלא את המצע לעומק של כ-8-10 ס"מ כדי לאפשר התנהגות חפירה אופיינית למין.
   3. הימנע מהרמת גרבילים בזנב, מכיוון שהדבר עלול לגרום ללחץ וסיכון לפציעה בזנב²⁶. במקום זאת, השתמשו בטיפול מכוסה כדי להעביר בעדינות את החיות בעת הצורך (ראו איור 2A).
   4. התחל הרגלה מבוססת מזון מיד על ידי פיזור ~ 5 גרם גרעיני דלעת או חמניות לתוך המצע (ראה טבלת חומרים). זה מעודד חפירה ומכיר לבעלי החיים את התגמול.
   5. למחרת, הכניסו יד אחת המכילה ~10 זרעי פרס לכלוב למשך 2-3 דקות. אם בעלי החיים לא לוקחים את הזרעים ישירות, הניחו ~5 גרם זרעים לתוך המצעים.
   6. חזור על הליך זה פעם ביום עד שבעלי החיים לוקחים אוכל מהיד. זה בדרך כלל לוקח כשבוע. אם הצלחתם מוקדם יותר, המשיכו לאימון קליקים (ראו שלב 3).
   7. במהלך ההתרגלות, העריכו את העדפות המזון על ידי הצעת סוגי זרעים שונים ביד וספירת הזרעים הנותרים לאחר 2-3 דקות.
      הערה: ספקו מזון במנות קטנות אך ורק כפרס לחיזוק ההתנהגות הרצויה. ודא שתגמול המזון תואם את ההנחיות התזונתיות לחיות מעבדה. בעוד שפרוטוקול זה משתמש בגרעיני דלעת וחמניות, ניתן להשתמש בתגמולים מתאימים אחרים אם הם עומדים בדרישות ההיגיינה של המתקן. פינוקים זמינים מסחרית המיועדים לחיות מעבדה מקובלים גם הם.
2. שבוע 1: הרגלה לבעלי חיים שגודלו בבית
   1. התחל להתרגל לתגמול המזון ישירות בכלוב הרבייה על ידי הנחת ~5 גרם גרעיני דלעת או חמניות לתוך המצע, כמתואר בשלב 2.1.3. יש להתחיל שלב זה עם הזוג הרבייה לפני הלידה כדי לבסס היכרות עם התגמול.
   2. לאחר שבעלי החיים המקננים צורכים באופן אמין זרעים מהמצעים, הציעו את התגמול מידו של הנסיין בהתאם להליך המתואר בשלב 2.1.4. אפשרו לבעלי חיים לחקור ולקחת את הפרס מרצונם במשך 2-3 דקות מדי יום.
   3. לאחר שהנקבה יולדת, השעו את ההרגלה הידנית למשך שבוע לפחות. במהלך תקופה זו, המשיכו לספק תגמולי מזון ישירות למצעי הכלוב 1-5 פעמים בשבוע כדי לשמור על החשיפה.
   4. המשיכו בהרגלה ידנית לאחר שהגורים הופכים לניידים (בערך יום 18-21 לאחר הלידה). אפשרו לבעלי החיים לחקור את היד עם פרס למשך 2-3 דקות לכל מפגש. זה תומך בהיכרות מוקדמת של הצאצאים עם הקשר האילוף.
   5. בגיל 5 שבועות, גמלו את הצעירים ושיכנו אותם בקבוצות חד מיניות של 2-3 בעלי חיים בכלוב. המשיכו את ההרגלה על ידי הכנסת תגמול המזון למצעי הכלוב החדשים ביום ההעברה.
   6. ביום שלאחר הגמילה, הציגו מחדש משלוחי מזון ידניים כמתואר לעיל (שלבים 2.1.4 ו-2.1.5).
   7. חזור על הליך זה פעם ביום עד שבעלי החיים לוקחים אוכל מהיד.
   8. ברגע שבני נוער לוקחים את הפרס באופן עקבי מהיד, המשיכו בפרוטוקול האימון (ראו שלב 3). זה בדרך כלל לוקח כשבוע. אם הצלחתם מוקדם יותר, המשיכו לאימון קליקים (ראו שלב 3).

איור 2: טיפול והרגלה של גרביל באמצעות חיזוק חיובי. (A) טיפול מכוסה בגרביל: גרביל נגרף בעדינות בשתי הידיים בצורה מכוסה כדי למזער את הלחץ. (B) תחילת האימון: ידו של הנסיין מונחת על רצפת הכלוב עם תגמולי מזון בכף היד. הגרביל מקבל פרס, ולחיצה משמשת לציון ההתנהגות. (C) הגרביל יושב מרצונו על ידו של הנסיין, מה שמעיד על אימון מוצלח. תגמול המזון מונח באופן גלוי על כף היד. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

3. אימון קליקר

הערה: התחל להתאמן רק אם הגרביל מקבל מזון מידו של הנסיין. אם לא, האריכו את שלב ההתרגלות למזון מעבר למשך הזמן המתואר בשלב 2.1. או 2.2.

1. סקירת הדרכה
   1. ערכו אימון אחד לכל גרביל ביום, כל אימון שנמשך 4 דקות. בצעו את האילוף ישירות בכלוב הביתי של בעל החיים כדי להפחית מתח ולשמור על סביבה מוכרת. אין צורך להסיר את כל פריטי ההעשרה אלא לוודא שלפחות צינור או מנהרה אחת נשארים בכלוב, ושיש מספיק מקום ליד הנסיין על רצפת הכלוב.
      הערה: באופן אידיאלי, ההדרכה צריכה להתבצע בחדר שקט ייעודי. אם זה לא אפשרי, ניתן להשתמש בארון מוגן רעש בתוך מתקן בעלי החיים, בתנאי שהוא מפחית ביעילות את החשיפה לרעש סביבתי והפרעות.
   2. כדי למנוע מרמזים שמיעתיים להפוך למשתנים מבלבלים, הימנע בקפדנות מתקשורת מילולית או צלילים קוליים במהלך האימונים. הגבילו כל אינטראקציה קולית עם בעלי החיים לתקופות מחוץ להקשר האילוף.
   3. השתמש בחזרה על התנהגות המטרה (למשל, ישיבה מרצון על ידו של הנסיין) כאינדיקטור מעשי להרגלה ולמידה מוצלחת במהלך האימון. שקול אימון מוצלח כאשר התנהגות זו נצפית לפחות 5 פעמים בכל מפגש במשך שלושה ימים רצופים (ראה שלב 3.4.4).
2. הכנה לאימונים
   1. הכן את כל החומרים הנדרשים: חותכים גרעיני חמניות לשניים או גרעיני דלעת לשליש כתגמולים. ספק לוחץ רגל, אפליקציית טיימר המשתמשת ברמזי צבע (ללא צליל), או כל טיימר שקט אחר (דיגיטלי או אנלוגי), וכלוב משני נקי (ראה טבלת חומרים).
   2. העבירו את הכלוב הביתי לאזור שקט ונטול הסחות דעת שבו תתקיים ההדרכה כדי למזער את גורמי הלחץ הסביבתיים. הימנע מרעשים פתאומיים או חזקים כגון דיבור, טריקת דלת או קולות ציוד במהלך הפגישה, מכיוון שגרבילים רגישים מאוד לגירויים שמיעתיים.
   3. הסר את כל פריטי ההעשרה למעט מנהרה אחת. ודא שהמנהרה שנותרה אינה חוסמת את הגישה לאזור האימונים. ודא שיש מספיק מקום להכיל יד.
   4. העבירו כל בעל חיים לכלוב המשני הנקי, כולל כמות קטנה של מצעי כלוב ביתי והעשרה להפחתת מתח במהלך ההפרדה.
   5. הנח את הקליק של כף הרגל (מכשיר מכני המפיק צליל נקישה כאשר לוחצים עליו עם כף הרגל; ראה טבלת חומרים) מתחת לשולחן או למשטח האימון. זה מאפשר למאלף לסמן את ההתנהגות הרצויה מבלי להשתמש בידיים, מה שמבטיח תזמון עקבי תוך שמירה על שתי הידיים זמינות לאינטראקציה עם בעל החיים.
3. יום אימון 1-5: מבוא לקליקר
   1. הפעל את הטיימר: הקש על התחל באפליקציה או לחץ על הכפתור בטיימר השקט.
   2. עמדו או שבו מול הכלוב. מניחים חמש חתיכות מהזרע שנבחר בכף היד ומניחים את היד שטוחה על המצע בפינה אחת של הכלוב.
   3. לחצו על הרגע שבו הגרביל לוקח זרע מהיד (איור 2B). אם נלקחים מספר זרעים ברצף, לחץ אחרי כל אחד מהם. השתמש בצליל הקליק כדי לשייך את תגמול המזון להתנהגות של האכלה מהיד.
   4. סיים את האימון כאשר בעל החיים מבצע את ההתנהגות הרצויה פי 5 או כאשר הטיימר מגיע לאפס (לאחר 4 דקות).
   5. החל מהיום השלישי, בהתאם להתנהגות הגרביל, התחילו להציע את הזרעים אחד בכל פעם. החזיקו את היד ממש מעל רצפת הכלוב כדי לעודד את החיה להתמתח או ליצור מגע קצר עם כפות הרגליים הקדמיות שלה (איור 2C). זה עוזר לעצב את ההתנהגות בהדרגה ומכין את החיה לשלב האילוף הבא (ראה שלב 3.4).
4. יום אימונים 6-10
   הערה: טיפ אימון אופציונלי: אם גרביל לא שש לטפס על היד, חלק את המשימה לצעדים קטנים יותר ובוני ביטחון. ראשית, חזקו את ההתנהגות של נגיעה ביד לפני שאתם מצפים מהחיה לטפס. השתמש באסטרטגיית עיצוב זו כדי להפחית מתח ולתמוך בבעלי חיים שזקוקים לזמן רב יותר להתרגל לטיפול.
   1. הצע רק זרע אחד בכל פעם. החזק את היד מוגבהת מעט מעל המצע כדי לעודד את הגרביל לטפס במלואו על היד כדי לגשת לתגמול. שלב זה מתבסס על תהליך העיצוב הקודם ומייצג את המעבר להתנהגות היעד הסופית.
   2. ברגע שהגרביל מטפס בעקביות על היד, לחץ כדי לחזק את ההתנהגות. התחילו להציע את הזרע באמצעות היד השנייה שלכם (ראו איור 3). שמור על יד האימון מעל רצפת הכלוב כך שהגרביל חייב לטפס עליה במלואו. השתמשו ביד אחת כדי להחזיק את הזרע בין האגודל לאצבע המורה (איור 3A), או השתמשו ביד אחת כדי להציג את הפרס מעל כף היד השנייה, שעליה מעודדים את החיה לטפס (איור 3B).
   3. העריכו את הצלחת האימון כאשר הגרביל יושב מרצונו על ידו של הנסיין פי 5 בכל מפגש ומקבל את התגמול מכף היד או מהיד השנייה.
   4. סיימו את האימון לאחר משך מקסימלי של 3 שבועות (5 ימים בשבוע) או כאשר יעד האימון מודגם באופן עקבי במשך תקופה של 3 ימים רצופים.
      הערה: למרות שהפרוטוקול מגדיר שלב אימון מובנה של עד 3 שבועות, ניתן להמשיך במפגשי חיזוק מעבר לתקופה זו במידת הצורך, במיוחד כאשר צפוי עיכוב בין סיום האימון לתחילת הליכי הניסוי. חיזוק חיובי מתמשך יכול לעזור לשמור על ההתנהגות הנלמדת ולהבטיח אמינות לאורך זמן. אנו ממליצים להמשיך בחיזוק פעם בשבוע לאחר סיום מוצלח של שלב האימון. עם זאת, כדי להבטיח עקביות והשוואה בין בעלי חיים, יש לתעד נקודת קצה ברורה של אימון - המוגדרת על ידי ביצועים יציבים וחוזרים של התנהגות היעד - לפני המעבר למשימות ניסוי.

איור 3: דוגמאות למיקום היד במהלך מתן התגמול. (A) התגמול מוחזק בין האגודל לאצבע המורה של אותה היד, בזמן שהחיה יושבת על כף היד. (B) הפרס מוחזק עם האצבע השנייה והאצבע המורה, בעוד החיה יושבת על כף היד השנייה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

4. ביצוע מבחני התנהגות לאחר אימון (יום 10+)

1. מבחן אינטראקציה
   הערה: משתנים תלויים: המשתנה התלוי העיקרי הוא משך האינטראקציה הרצונית בין החיה לידו של הנסיין במהלך הדקה השנייה של הניסוי. אינטראקציה מוגדרת כמגע פיזי ישיר, כגון רחרוח, טיפוס או נגיעה ביד עם הכפות הקדמיות¹⁰. ניקוד התנהגותי מבוסס על הקלטות וידאו וניתן לבצע אותו באופן ידני או באמצעות תוכנת ניתוח התנהגות.
   1. מקם מצלמה המותקנת על חצובה מעל השולחן שבו תתבצע בדיקת האינטראקציה.
   2. אם בעלי החיים שוכנים בקבוצות, העבירו את בעלי החיים לכלוב משני נקי המכיל קומץ מצעים מהכלוב הביתי.
   3. הסר את כל המנהרות או המקלטים מהכלוב הביתי והנח אותם בכלוב הנקי. השאירו רק את המצעים בכלוב הבדיקה (=כלוב ביתי). הנח את כלוב הבית, המכיל כעת רק מצעים, מתחת למצלמה.
   4. השתמש בטיפול מכוסה כדי להחזיר בעדינות את חיית הניסוי לכלוב הביתי.
   5. התחל להקליט. הישארו דוממים מול הכלוב למשך דקה אחת. לאחר דקה אחת, הניחו יד אחת עם כפפה בתוך הכלוב ליד הקצה הקדמי למשך דקה נוספת.
   6. החלף כפפות בין בעלי חיים ממינים שונים.
2. בדיקת שדה פתוח
   הערה: משתנים תלויים: המשתנים הנמדדים כוללים את המרחק הכולל שנסע, זמן שהייה באזור המרכז לעומת הפריפריה, מספר כניסות למרכז ואירועי גידול. אינדיקטורים אלה משקפים פעילות תנועתית כללית והתנהגות דמוית חרדה. הגדלת זמן המרכז מתפרשת בדרך כלל כחרדה מופחתת. ההתנהגות מתועדת על ידי וידאו ומנותחת באמצעות תוכנת מעקב אוטומטית (ראה טבלת חומרים).
   1. הצב מצלמה מעל זירת השטח הפתוח (100 ס"מ על 100 ס"מ על 40 ס"מ).
   2. התחל להקליט וידאו, ולאחר מכן הנח בעדינות את החיה במרכז הזירה באמצעות טיפול מכוסה. הקלט התנהגות למשך 7 דקות.
   3. לאחר הבדיקה, החזירו את החיה לכלוב הביתי שלה. נקה את קופסת השדה הפתוח והקירות עם 70% אתנול אחרי כל בעל חיים. המתן עד שהאתנול יתאדה לחלוטין לפני שתכניס את החיה הבאה לזירה.

5. ניתוח סטטיסטי

1. בעוד שסמיות מלאה של הנסיין לא הייתה אפשרית במהלך האימונים בשל אופי האינטראקציה הישירה עם בעלי החיים, בצע ניתוח נתונים התנהגותיים בצורה עיוורת כדי להפחית את הטיית הצופה.
2. הן עבור האינטראקציה והן עבור בדיקות השטח הפתוח, הקלט את כל המפגשים בווידאו. אסוף משתנים תלויים באופן ידני על ידי משקיפים מיומנים (בדיקת אינטראקציה) או באופן אוטומטי באמצעות תוכנת ניתוח התנהגות (ראה טבלת חומרים) להקלטות שדה פתוח (זמן שהייה באזור המרכז).
3. לפני ניתוח סטטיסטי, בדוק את כל הנתונים להתפלגות נורמלית באמצעות מבחן שפירו-וילק. זהה חריגים ואל תכלול באמצעות שיטת רגרסיה חזקה והסרת חריגים (ROUT) עם שיעור גילוי שגוי (Q) המוגדר ל- 10%. כדי לנתח את ההשפעות של אימון ומין על תוצאות התנהגותיות, ערכו ANOVA דו-כיווני חוזר למבחן האינטראקציה, ו-ANOVA דו-כיווני מעורב כדי להעריך את הזמן שהושקע במרכז מבחן השדה הפתוח.
4. סווג את מבחן האינטראקציה ואת הזמן המצטבר שהושקע באזור המרכזי של השדה הפתוח כמשתנים התלויים העיקריים. בצע השוואות פוסט הוק באמצעות מבחן ההבדל המשמעותי הכנה (HSD) של Tukey. ערך p של < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנה סטטיסטית (ראה טבלת חומרים).

תוצאות

כל הגרבילים המאומנים למדו את המשימה שהוטלה עליהם תוך 10 ימים, מה שמדגים את ההיתכנות של אימון קליקר במין זה. איור 4 מציג את הצלחת האימון של גרבילים נקבות (n=27) וזכרים (n=16) מהיום הראשון עד היום העשירי. ניתוח הביצועים של ANOVA במדידות חוזרות ביום האימון 1 לעומת היום ה-10 בגרבילים זכרים ונקבות לא הראה השפעה משמעותית על אינטראקציה בין זמן ומין (F_{(1, 41)} = 0.003; p = 0.955), מה שמצביע על כך שהשיפור לאורך זמן היה דומה עבור שני המינים. נצפתה השפעה מובהקת ביותר של זמן (F_{(1, 41}) = 38.83, p < 0.0001), מה שמראה כי גרבילים משני המינים צייתו באופן מלא לפרוטוקול האימון עד היום העשירי.

העובדה שגרבילים מאומנים עמדו במשימה שהוטלה עליהם תוך 10 ימים מאמתת את היעילות של מתודולוגיית אילוף קליקרים במין זה. שיעור הצלחה זה מתיישב עם עקרונות בסיסיים של התניה אופרנטית, שבה הקליק מתפקד כמחזק משני המגשר על הפער בין ההתנהגות הרצויה לתגמול העיקרי (זרעי חמניות/דלעת). הקליקר משמש כגשר בין ההתנהגות לתגמול, ומאפשר למאמן לסמן את הרגע המדויק שבו מתרחשת ההתנהגות הרצויה בתזמון מדויק. זה עוזר ליצור קשר ברור ומיידי בין המעשה לבין תוצאותיו החיוביות.

בדיקות התנהגותיות נערכו לאחר השלמת פרוטוקול האימון, במיוחד לאחר יום ההכשרה העשירי. ניתוח ANOVA מעורב דו-כיווני הראה שגרבילים מאומנים הגבירו את האינטראקציה הרצונית עם ידו של הנסיין (איור 5A). זוהתה השפעה משמעותית של אימון (F _{(1, 60)} = 22.89; p < 0.0001), כאשר בעלי חיים מאומנים היו מעורבים בתדירות גבוהה יותר עם הנסיין. ניתוח פוסט הוק חשף את ההבדלים הספציפיים באימון בין נשים (p < 0.0001, n = 27) וזכרים (p = 0.049, n = 16). השפעת המין לא נצפתה (F_{(1, 60)} = 0.621, p = 0.434), מה שמצביע על כך שגרבילים זכרים ונקבות ביצעו ביצועים דומים בסך הכל. הניתוח לא גילה אינטראקציה משמעותית בין מין לאימון (F_{(1, 60)} = 0.078, p = 0.781).

האינטראקציה הרצונית המוגברת של הגרבילים מצביעה על כך שאימון קליקר הפחית ביעילות את תגובות הפחד המולדות באמצעות חיזוק חיובי. זה עשוי לעזור למזער את הלחץ במהלך הטיפול וההליכים הניסיוניים, ולשפר הן את רווחת בעלי החיים והן את איכות הנתונים.

הערכה של התנהגות דמוית חרדה לאחר האימון בוצעה באמצעות מבחן השדה הפתוח. איור 5B ממחיש את משך הזמן המצטבר שהושקע באזור המרכז. לא נצפתה אינטראקציה בין מין לאימון במשך המצטבר באזור המרכזי של מבחן השדה הפתוח (F_{(1, 60)} = 0.101, p = 0.751). בנוסף, לא נמצאה השפעה עיקרית משמעותית של יחסי מין (F_{(1, 60)} = 0.001, p = 0.969. נצפתה השפעה עיקרית משמעותית ביותר של אימון (F_{(1, 60)} = 17.26, p < 0.0001; מבחן HSD Tukey: p = 0.003 ו- p = 0.052 בנקבות ובזכרים, בהתאמה), מה שמצביע על כך שגרבילים מאומנים בילו זמן רב יותר במרכז בהשוואה לגרבילים לא מאומנים. תוצאות אלה משקפות תגובות התנהגותיות שנמדדו לאחר שהחיות השלימו את תקופת האימון בת 10 הימים.

ה-OFT מנצל את הקונפליקט הטבעי של התקרבות-הימנעות שמכרסמים חווים בעת חקר סביבות חדשות²⁷. גרבילים עשויים לאזן את הדחף המולד שלהם לחקור עם הנטייה הטבעית שלהם להימנע ממרחבים פתוחים שעלולים להיות מסוכנים. לכן, העובדה שגרבילים מאומנים בילו זמן רב יותר באזור המרכז מעורר החרדה מצביעה על כך שאימון הקליק שיפר את הנכונות ההתנהגותית הכללית שלהם לחקור, מה שעשוי להצביע על שיפור ברווחה הכללית.

איור 4: אימות אימון קליקר. הצלחת אימון ביום 1 לעומת יום 10 לנבדקים גברים ונשים: הצלחת האימון הוערכה בגרבילים נקבות (פסים לבנים, n = 27) וזכרים (פסים אפורים, n = 16) ביום 1 וביום 10 של פרוטוקול האימון. ANOVA במדידות חוזרות דו-כיווניות חשף השפעה עיקרית משמעותית של יום האימונים (p < 0.0001). השוואות מרובות באמצעות מבחן HSD של טוקי הראו עלייה משמעותית בהצלחת האימון מהיום הראשון עד היום העשירי הן בנשים (p < 0.0001, n = 27) והן בגברים (p < 0.0001, n = 16). הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: הערכה התנהגותית. (A) מבחן אינטראקציה: משך האינטראקציה עם היד של הנסיין (ב-s) נמדד בגרבילים מאומנים (פסים אפורים) ולא מאומנים (פסים לבנים) נקבות וזכרים לאחר שהחיות השלימו את תקופת האימון של 10 ימים. ה-ANOVA המעורב הדו-כיווני חשף השפעה עיקרית משמעותית של אימון (p < 0.05) ואפקט אינטראקציה משמעותי (p < 0.05). ניתוח פוסט הוק באמצעות מבחן HSD של טוקי הראה כי עכברים מאומנים קיימו אינטראקציה ארוכה יותר עם ידו של הנסיין בהשוואה לעכברים לא מאומנים (נקבות: p < 0.0001, זכרים: p = 0.0497). הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. נקבות מאומנות: n= 27; נקבות לא מאומנות: n = 16; זכרים מאומנים: n = 16; זכרים לא מאומנים: n = 5. (ב) מבחן בשטח פתוח: המבחן נערך לאחר השלמת פרוטוקול האימון, במיוחד לאחר יום האימון ה-10. משך הזמן המצטבר שהושקע באזור המרכזי נמדד בגרבילים מאומנים (פסים אפורים) ולא מאומנים (פסים לבנים). ANOVA מעורב דו-כיווני בוצע כדי לנתח את השפעות האימון על חקר אזור המרכז. השוואות מרובות באמצעות מבחן HSD של טוקי גילו כי נקבות מאומנות בילו זמן רב יותר באזור המרכז בהשוואה לנקבות לא מאומנות (p = 0.003). הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. נקבות מאומנות: n= 27; נקבות לא מאומנות: n = 16; זכרים מאומנים: n = 16; זכרים לא מאומנים: n = 5. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

הממצאים מראים את היעילות של הפרוטוקול המוצע להרגלת גרבילים לאינטראקציה אנושית בסביבות ניסוי. היכולת של כל בעלי החיים המאולפים להשלים את המשימה הרצויה תוך 10 ימים מדגישה את היעילות של שיטה זו.

שלב קריטי אחד בפרוטוקול הוא ההתרגלות ההדרגתית לידו של הנסיין, מה שמבטיח שהגרבילים יקשרו אינטראקציה אנושית עם גירוי חיובי. השימוש בתגמולים ספציפיים למין מייעל עוד יותר את תהליך האימון. שינויים, כגון התאמת משך האימונים או שינוי סוג התגמול, יכולים להתאים עוד יותר את הפרוטוקול להבדלים אינדיבידואליים בין גרבילים ולייעל אותו לדרישות הספציפיות של הניסוי.

אנו מתמקדים בהבדלים הבולטים הספציפיים למינים בהתנהגות ובדינמיקת הלמידה בין עכברים לגרבילים מונגוליים. יש לקחת בחשבון הבדלים כאלה בעת תכנון פרוטוקולי הדרכה. לדוגמה, עכברים נוטים להיות ניאופוביים ורגישים יותר ללחץ, ולעתים קרובות דורשים יותר זמן להתרגל לסביבות חדשות ולאינטראקציה אנושית²⁸. לעומת זאת, גרבילים מפגינים דחף חקר וסקרנות חברתית גבוהים יותר, מה שיכול להקל על מעורבות מהירה יותר במשימות אימון²⁹. במחקר הנוכחי, גרבילים ניגשו בקלות לידו של הנסיין ולמדו לקשר את הקליק לתגמול בפחות מפגשים ממה שדווח בדרך כלל עבור עכברים^21,22. עם זאת, גרבילים הראו גם שונות אישית גדולה יותר, במיוחד אצל זכרים, מה שעשוי לשקף מתח ספציפי למין או גורמי מוטיבציה שפחות בולטים במודלים של עכברים. הבחנות אלה מדגישות את החשיבות של אסטרטגיות אילוף מותאמות למינים ומצביעות על כך שגרבילים עשויים להפיק תועלת ממפגשים קצרים יותר וממוקדי תגמול עם דגש רב יותר על אינטראקציה רצונית, בעוד שעכברים עשויים לדרוש דה-רגישות הדרגתית יותר וחזרה עקבית. הבנת ההבדלים ההתנהגותיים והקוגניטיביים הללו חיונית לחידוד פרוטוקולי האימון ולמקסום יעילותם בין מינים.

גרבילים מונגוליים יכולים להפיק תועלת משמעותית מאימון קליקר לא ספציפי או כללי, המתמקד באינטראקציה חיובית בין אדם לבעלי חיים והתניה התנהגותית בסיסית במקום הכנה למערך ניסוי מסוים. אימון כללי כזה משפר את סובלנות הטיפול, מפחית את רמות הלחץ הבסיסי ומקדם גורמי בסיס התנהגותיים צפויים יותר בעלי ערך במגוון רחב של הקשרים ניסיוניים³⁰. אימון לא ספציפי מקדם גמישות התנהגותית ואינטראקציה רצונית עקבית עם הנסיין, מה שהופך את בעלי החיים ליותר מסתגלים לסביבות, הגדרות או פרדיגמות בדיקה שונות 16,31,32. זה מועיל במיוחד במחקרים ארוכי טווח או ניסויים רב-שלביים, שבהם בעלי חיים נחשפים למגוון הליכים. במחקר הנוכחי, למרות שהאימון לא היה קשור ישירות לפרוטוקול בדיקה יחיד, גרבילים הראו אינטראקציה משופרת עם הנסיין והתנהגות מופחתת הקשורה ללחץ, מה שתמך ברעיון שהרגלה כללית באמצעות חיזוק חיובי יכולה לשפר את החוסן הניסיוני הכולל ואת רווחת בעלי החיים.

בנוסף לאינטראקציה מוגברת עם הנסיין, חיות מאומנות בילו זמן רב יותר באופן משמעותי באזור המרכזי של מבחן השדה הפתוח. דפוס התנהגות זה מתפרש בדרך כלל כהפחתה בהתנהגות דמוית חרדה אצל מכרסמים, במיוחד בתגובה לסביבות חדשות או מעט מרתיעות³³. ממצאים אלה מצביעים על כך שאימון קליקר עשוי לתרום לירידה במדדים התנהגותיים של חרדה, ובכך לשפר את יכולתם של בעלי החיים להתמודד עם הליכי ניסוי. זה תומך במסקנה הרחבה יותר שפרוטוקולי הרגלה מבוססי חיזוק חיובי יכולים לשפר את עמידות הלחץ והיציבות ההתנהגותית בגרבילים במעבדה. מעבר להפחתת מתח, לאימון קליקר יש השלכות רחבות יותר על תוצאות הניסוי³⁴. גרבילים מאומנים הפגינו סובלנות רבה יותר לטיפול, מה שממזער שינויים פיזיולוגיים הנגרמים על ידי לחץ שעלולים לבלבל את תוצאות המחקר. ממצאים דומים דווחו במינים אחרים, כולל ארנבות מעבדה ועכברים, שבהם בעלי חיים שאומנו בקליקר הפגינו אינטראקציה מוגברת עם הנסיינים ופחות התנהגויות הקשורות לחרדה ודיכאון, כגון ירידה במתן שתן, עשיית צרכים, קולות והתנהגות צפה^19,21.

תוצאות אלה מדגישות את הפוטנציאל של אימון קליקרים לשפר הן את רווחת בעלי החיים והן את העקביות של נתונים התנהגותיים על ידי הפחתת השונות בתגובות הקשורות ללחץ. חשוב להבהיר שמטרת הפרוטוקול הזה היא לא להתנות בעלי חיים לקשר בין הליכים מרתיעים מטבעם - כמו לקיחת דם - לגירויים חיוביים כמו הקליקר. במקום זאת, המטרה היא להפחית את הלחץ הבסיסי, להרגיל בעלי חיים לאינטראקציה אנושית ולקדם השתתפות מרצון במשימות ניטרליות או מאתגרות קלות. בעוד שכמה מחקרים חקרו את השימוש בחיזוק חיובי כדי להכין בעלי חיים^{להליכים} פולשניים יותר, זה דורש תהליך דה-סנסיטיזציה מובנה בקפידה והוא מעבר לתחום הפרוטוקול הנוכחי. יישום שגוי של רמזי קליקר בהקשרים הקשורים לאי נוחות אכן עלול לגרום לאסוציאציות שליליות לא מכוונות. עם זאת, כאשר מיושמים נכון, טכניקות חיזוק חיוביות יכולות לעזור לבעלי חיים להתמודד עם הליכים שעלולים להיות מרתיעים על ידי שיפור יכולת החיזוי ומתן מידה מסוימת של שליטה³⁶. יש צורך במחקרים נוספים כדי לקבוע אם ניתן לאמן גרבילים באופן אמין להקשרים כאלה, כפי שהוכח בהצלחה במינים אחרים כמו כלבים ופרימטים לא אנושיים^37,38.

למרות הצלחתה, לשיטה יש מגבלות. חלק מהגרבילים דרשו תקופות התרגלות ארוכות יותר, מה שמעיד על שונות אינדיבידואלית במהירות הלמידה. בנוסף, המספר הנמוך יחסית של גרבילים זכרים לא מאומנים מגביל את הכוח הסטטיסטי של הניתוח, ומקשה על הסקת מסקנות חזקות. הגדלת גודל המדגם בקבוצה זו תשפר ככל הנראה את המהימנות והפרשנות של התוצאות. מחקרים נוספים צריכים לחקור הבדלים פוטנציאליים בין המינים בתגובות לחץ ובמנגנוני למידה.

ההשלכות הרחבות יותר של מחקר זה חורגות מעבר להפחתת מתח. יישום פרוטוקולי אימון מובנים כחלק מגידול סטנדרטי עשוי להפחית את השונות הנגרמת על ידי תגובות פיזיולוגיות הנגרמות על ידי לחץ ולשפר את האמינות של תוצאות הניסוי^39,40. זה רלוונטי במיוחד בדיסציפלינות כמו מדעי המוח או מחקר מטבולי, שבהם לחץ הוא גורם מבלבל קריטי. דיווח קפדני וסטנדרטיזציה של נהלי ההכשרה חיוניים כדי למנוע השפעות העשרה לא מכוונות.

בהמשך, מחקר עתידי צריך לבחון לוחות זמנים חלופיים לחיזוק, אוטומציה של נהלי אילוף והשפעות ארוכות טווח על פני מינים. עם תמיכה מדעית גוברת, אימון קליקים מייצג אסטרטגיית חידוד רבת ערך שיכולה לשפר הן את איכות הנתונים והן את רווחת בעלי החיים. סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הדרכה וטיפול במעבדות יכולה לסייע בשיפור יכולת השחזור ולתמוך באימוץ רחב יותר של פרקטיקות הומאניות ויעילות במחקר ביו-רפואי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כלובים	Zoonlab GmbH	3010006	590 x 380 x 200 מ"מ; 1.815 m2
מצלמה	Sony	HDR-CX240E	מקליט מצלמת וידאו דיגיטלית HD כדורי
מזון	Ssniff	V1644-000	Art. Nr. Clicker-Blau
רגל קליקר		https://www.hundeschulen.com
GraphPad פריזמה	GraphPad תוכנה, בע"מ		https://www.graphpad.com/features גרסה 10 לחלונות
שדה פתוח תיבת	Noldus	MXO1S-M001	אופל 100 x 100 x 40 ס"מ
זרעי דלעת	REWE	8820911	REWE Bio
Pylon צופה	בסלר	https://www.baslerweb.com/de-de/software/pylon/
חמניות	Seeberger	4744292
חצובה	Manfrotto	GT- mkbfra4gtxp bh	מנהרות Befree GT
	Plexx	14179	152 x 76 x 3 מ"מ