הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פיתוח, אפיון והערכה של מערכות נוזל יוני מבוססות CAGE להעברה דרך העור

1.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68658

⸱

26 בספטמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1LEO Foundation Center for Cutaneous Drug Delivery, Department of Pharmacy, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה דן בסטנדרטיזציה להכנת מערכות נוזל יוני מבוססות CAGE כדי להבטיח שחזור ולייעל את זרימת העבודה הכוללת במעבדות מדעיות שונות.

תקציר

נוזלים יוניים זכו לאחרונה להכרה יוצאת דופן בשל יישומיהם באספקת תרופות, במיוחד הפוטנציאל שלהם לאפשר חדירת תרופות עוריות ולשפר את חדירת התרופות. בנוסף לשיפור חדירות המחסום, לנוזלים יוניים יש תכונות המסה מצוינות, המתמודדות עם האתגר של המסת תרופות מסיסות בצורה גרועה. בשל האסימטריה הגדולה בין הקטיונים האורגניים לאניונים, מלחים פונקציונליים אלה נשארים נוזליים בטמפרטורת החדר. מנקודת מבט יישומית, נוזלים יוניים מספקים גישה מבטיחה וניתנת לכוונון גבוה לשרת תחומים טיפוליים מרובים. נוזל יוני תואם ביולוגית המורכב מכולין וחומצה גרנית (CAGE), ביחס יונים סטויכיומטרי של 1:2, טומן בחובו פוטנציאל עצום לאספקה דרך העור של מגוון רחב של מרכיבים פרמצבטיים פעילים, כולל מולקולות קטנות, פפטידים, חלבונים וחומצות גרעין. יש לכך השפעה מינימלית על תפקוד מחסום העור. כאן, אנו חולקים את השיטות שלנו להכנה, אפיון והערכה של CAGE. תוצאות מייצגות מוצגות עבור אפיון CAGE באמצעות ספקטרוסקופיה NMR, קלורימטריית סריקה דיפרנציאלית, טיטרציה של קרל-פישר לניתוח תכולת מים ומחקרי אינטראקציה של מחסום ex vivo על עור חזיר.

מבוא

העור הוא האיבר הגדול והחיוני ביותר בגוף, המשמש כמחסום מגן מפני חומרים מזיקים תוך מניעת איבוד מים1. יחד עם זאת, מריחת תרופות על העור ודרכו מציעה מגוון רחב של יתרונות. בהשוואה להזרקות ולמתן דרך הפה, מתן עורי מגביר את היענות המטופלים ומונע חילוף חומרים במעבר ראשון בכבד2. במיוחד עבור מצבי עור, פורמולציות הניתנות בעור מצטיינות במתן אפקט מקומי, ומפחיתות את החשיפה המערכתית3. עם זאת, האופי הכמעט אטום של העור מאתגר באופן משמעותי את הלידה העורית המוצלחת4. עור האדם מורכב משלוש שכבות שונות: האפידרמיס, הדרמיס וההיפודרמיס4. האפידרמיס היא השכבה החיצונית של העור וניתן לחלק אותה לתת-שכבות שונות, כאשר שכבת הקרנית היא השכבה החיצונית ביותר, המורכבת בעיקר מקרטינוציטים. שכבת הקרנית משמשת כמחסום חדירה בולט לרוב המולקולות, ומעכבת את הובלתן לשכבות עמוקות יותר של העור5. פונקציית מחסום זו נובעת מנוכחותם של קורנוציטים המוטבעים בסידור שומנים צפוף, המורכב בעיקר מפוספוליפידים, סטרולים וסרמידים, המכונה לעתים קרובות מבנה הלבניםוהטיט 6. כדי להתגבר על מחסום עור זה, משפרי חדירה כימיים (CPEs) נפרסו כדי לספק מקרומולקולות, מכיוון שהם משבשים את מבנה שכבת הקרנית על ידי אינטראקציה עם השומנים והחלבונים הקיימים בה7.

נוזלים יוניים (ILs) הופיעו כ-CPEs של הדור הבא8. אלה מורכבים מקטיונים אורגניים מגושמים ואניונים, המסודרים בצורה אסימטרית ומתואמים על ידי אינטראקציות יוניות חלשות ולא כיווניות9. בשל הכוחות הבין-מולקולריים החלשים הללו, ILs קיימים כנוזלים מתחת ל-100 מעלות צלזיוס, ואינם מסוגלים לארוז למבנה גבישי מוגדר היטב10. ILs ניתנים לכוונון גבוה, מכיוון שיעילותם תלויה מאוד בבחירת הקטיונים או האניונים והיחס הסטויכיומטרי בין יונים אלה. לפיכך, יש להם יכולת מסיסות וייצוב גבוהה לתרופות בעלות הידרופוביות מגוונת11. ILs משרתים את התכונות הייחודיות של שומנים ופולימרים על ידי מתן שחרור מושהה ואנקפסולציה של מקרומולקולות, בהתאמה12.

ל-ILs תואמים ביולוגית המבוססים על כולין וחומצה גרנית (CAGE), הקיימים ביחס טוחנת סטויכיומטרי של 1:2, יש יישומים משמעותיים באספקה טרנסדרמית של תרכובות הידרופיליות והידרופוביות כאחד. דווח כי CAGE משפר משמעותית את האספקה הטרנסדרמית של חלבונים (אינסולין13) וחומצות גרעין (siRNA14). CAGE מוכן על ידי תגובת מטתזת מלח בין כולין ביקרבונט לחומצה גרנית, עם CO2 כתוצר לוואי15. תגובת מטתזת מלח מציעה היווצרות של תרכובות חדשות באמצעות חילופי יונים בתנאים מתונים בצורה ישירה, מהירה וסלקטיבית ביותר. באופן כללי, חסרים זרימות עבודה קלות למעקב לפיתוח והערכה של CAGE IL. לפיכך, כאן אנו מספקים זרימת עבודה אחת כזו, המפרטת כל שלב בהכנת CAGE כדי לאפשר לחוקרים מרקעים שונים להיכנס למרחב מחקר זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בהתאם להנחיית האיחוד האירופי 2010/63 ואושרו על ידי מינהל הווטרינריה והמזון הדני (רישיון מס. DK-13-oth-931833).

1. הכנת כלוב על ידי תגובת מטתזת מלח

  1. התגבשות מחדש של חומצה גרנית (טוהר 85%, מול משקל 168.23 גרם/מול)
    1. קח בקבוק תחתון עגול בנפח 500 מ"ל ומדוד את משקלו.
    2. שוקלים 40.0 גרם חומצה גרנית בבקבוק. זה מתאים ל-0.2 מול של חומצה גרנית.
    3. לגבש מחדש חומצה גרנית בחומצה גרנית של 70:30% (w/w): אצטון: הוסף (40 גרם*0.85*0.30)/(0.70*0.784 גרם/מ"ל) = 18.42 מ"ל אצטון לבקבוק התחתון העגול.
    4. קח של 5 ליטר והכין כ -0.5 ליטר קרח יבש ואתנול.
    5. מניחים את הבקבוק התחתון העגול בתערובת הקרה היבשה של קרח-אתנול מבלי להסתחרר כדי לאפשר קירור חיצוני. לשפוך אצטון וזיהומים מהחומצה הגרנית המוצקה/התגבשה מחדש כאשר ההתגבשות הגיעה לשיווי משקל (המקביל לנפח האצטון הנוסף, בדרך כלל תוך 0.5-2 שעות). חזור על שלב זה 5-6 פעמים כדי להבטיח טוהר מספק.
    6. הסר את האצטון שנותר על ידי אידוי סיבובי בוואקום ב-40 סל"ד למשך 20 דקות לפחות או עד שהבקבוק התחתון העגול כבר לא מרגיש קר כשנוגעים בו (לאצטון לחץ אדים של 240 מבר ב-20 מעלות צלזיוס).
    7. שקלו ושימו לב למסת הבקבוק והחומצה הגרנית שהתגבשה מחדש. חשב את התשואה על סמך משקל הבקבוק הריק הראשוני. טווח התשואה הצפוי הוא 60-80%.
  2. תגובת מטתזת מלח
    1. עבור יחס מולרי של 2:1 של חומצה גרנית: כולין חשב את מספר השומות של כולין, תוך התחשבות בתפוקת ההתגבשות מחדש של החומצה הגרנית. לדוגמא, עם תפוקה של 70% יש להוסיף 0.07 מול כולין (0.2*70/100=0.14, 0.14/2=0.07).
    2. לכולין ביקרבונט יש טוהר של 80% ומשקל מולקולרי של 165.19 גרם/מול. בהתאם לכך, הוסף 14.45 גרם (0.07*165.19 = 11.56 גרם; 100/80*11.56 גרם = 14.45 גרם) של כולין ביקרבונט טיפתי כדי למנוע זליגה.
    3. מערבבים את הדגימה למשך הלילה במהירות של 300 סל"ד (או מתאים) בטמפרטורת החדר (18 ± 3 שעות) או עד להפסקת אידוי CO2 .
    4. יבש את הדגימה על ידי אידוי סיבובי ב-60 מעלות צלזיוס, 30 מבר למשך 40 דקות. ראשית, העלו את הטמפרטורה, ואז הפחיתו לאט את הלחץ כדי למנוע קצף.
    5. Aliquot CAGE לבקבוקוני זכוכית בנפחים המתאימים ליישום המיועד (למשל, 2 מ"ל של CAGE בבקבוקוני זכוכית של 4 מ"ל).
    6. יבש את הבקבוקונים בוואקום בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.

2. אפיון כלוב

  1. ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR)
    1. ממיסים את הכלוב לריכוז של 25 מ"ג/מ"ל בדימתיל סולפוקסיד דוטראט (d-DMSO), מה שמבטיח נפח סופי של לפחות 500 מיקרוליטר
      הערה: ממיסים דוטרים חיוניים בתמ"ג כדי למנוע הפרעות מאטומי מימן בממס.
    2. מעבירים 500 מיקרוליטר מהתמיסה המוכנה לצינור NMR נקי ויבש (בדרך כלל בקוטר 5 מ"מ, תלוי במכשיר). אטום את הצינור במכסה כדי למנוע אידוי וזיהום.
      הערה: הימנע מהכנסת בועות אוויר, מכיוון שהן עלולות להשפיע על הומוגניות השדה המגנטי.
    3. השתמש בספקטרומטר NMR (למשל 400 מגה-הרץ) עם הפרמטרים הבאים:
      -מספר סריקות: 8-16 עבור 1H NMR; 1,000-5,000 עבור 13C NMR (תלוי בריכוז ויחס האות לרעש (S/N) הרצוי.
      -עיכוב הרפיה (D1): 1-2 שניות למשך 1שעות ו-13צלזיוס NMR.
    4. לעבד נתונים באמצעות תוכנה מתאימה.
      1. התאם לצורות שיא מיטביות באמצעות תיקון פאזה וקו בסיס.
        הערה: פעולה זו מתבצעת בדרך כלל בתוכנת NMR בכרטיסייה עיבוד או תיקון (בהתאם לתוכנה שבה נעשה שימוש), שם זמינים כלים אוטומטיים להתאמת פאזה ותיקון בסיסי.
      2. השתמש בשיא הממס השיורי (d-DMSO) כהפניה: ~ כ-2.50 עמודים לדקה למשך שעה אחת, ~ כ-39.52 עמודים לדקה עבור 13תמ"ג צלזיוס. ראה Fulmer et al.15להפניות לטומאה.
    5. שלב פסגות והקצה אותן לפרוטונים במבנה (ראה איור 1).
  2. תכולת המים כפי שנקבעה על ידי טיטרציה של קארל פישר
    1. ממיסים 300 מ"ג כלוב ב-300 מיקרוליטר מתנול. יש להעמיס למזרק של 1 מ"ל ולשקול לפני ואחרי ההזרקה.
    2. קבע את תכולת המים באמצעות טיטרטור קולומטרי של קארל פישר לפי הוראות היצרן.
      1. הזרקו את הדגימה לתא הטיטרציה דרך המחיצה באמצעות מזרק, הזינו את משקל המזרק הריק ולחצו על Enter. התוצאה תופיע כ-% w/w.
      2. התאם את תכולת המים של מתנול כדי לקבל את תכולת המים בפועל בכלוב (בדרך כלל 1-2% w/w). (דגימת W =דגימת W + מדלל * (מדגם m + מדלל m) - (מדלל W * מדלל m) /מדגם m).
  3. יציבות תרמית של CAGE על ידי קלורימטריית סריקה דיפרנציאלית (DSC)
    1. יש להניח 3-5 מ"ג מכל דגימה בתבניות Tzero מאלומיניום ולאטום במכסה הרמטי.
    2. נתח את הדגימות באמצעות DSC בטווח הטמפרטורות שבין 80 מעלות צלזיוס ל- 80 מעלות צלזיוס עם תקופה איזותרמית של 10 דקות לפני הקירור עד - 80 מעלות צלזיוס.
    3. השתמש בקצב חימום/קירור קבוע של 5 מעלות צלזיוס לדקה וטיהור חנקן של 50 מ"ל לדקה.
    4. עבד את הנתונים באמצעות תוכנה מתאימה.

3. הערכה מחוץ לגוף של אינטראקציה עם מחסום העור

  1. עיבוד דרמטום של עור חזיר
    1. חותכים פוליסטירן מורחב (EPS) כך שיתאים ללהב הדרמטום ועוטפים אותו בנייר דבק. השתמש בעור שנאסף מאזור החלציים של חזירים באמצעות אזמל. כאן, עור הושג מנקבות בנות 3.5 חודשים מגזע דני או מחזירי יורקשייר (30-40 ק"ג).
    2. הסר את רקמת השריר והשומן. כדי להקל על הדרמטום של הרקמה, חשוב להקפיד על צד שטוח ואחיד בסיסי.
    3. הסר כמה שיותר שיער מהעור באמצעות גוזם שיער.
    4. שטפו את העור עם מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS, pH 7.4) להסרת דם ושיער רופף.
    5. חותכים את העור לחתיכות קטנות יותר (5 ס"מ על 15 ס"מ) בעזרת סכין כך שיתאימו לגושי ה- EPS.
    6. חבר את העור לגוש ה- EPS בעזרת מחטים.
    7. הגדר את הדרמטום לעובי של 0.5 מ"מ וחתך את העור.
    8. אחסן את העור הדרמטומי בין שתי שכבות של סרט השתלה ואחסן בטמפרטורה של -70 מעלות צלזיוס.
  2. איבוד מים דרך האפידרמיס (TEWL)
    1. הכן PBS (pH 7.4) על ידי המסת טבליה אחת ב -200 מ"ל מים טהורים במיוחד. דגה למשך 20 דקות באמבט קולי.
    2. הפעל את אמבט המים המחובר לתאי הדיפוזיה של פרנץ. הוסף כ -12 מ"ל PBS נטול גז וחרוז מגנטי לכל תא. הפעל את הערבוב המגנטי (למשל ב-600 סל"ד) כדי להבטיח פיזור אחיד בתווך הקולטן מבלי ליצור מערבולת. שימו לב שלא כל הגדרות התא של פרנץ מאפשרות שליטה מדויקת במהירות הערבוב. כוונן את מקור החימום כך שיגיע לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במדיום הקולטן.
    3. חותכים את העור הדרמטומי לחתיכות בקוטר של כ-3 ס"מ (או גודל מתאים) בעזרת אזמל ומרכיבים בזהירות את העור הדרמטומי על תאי דיפוזיה של פרנץ באמצעות מהדקים וטבעות איטום, כאשר שכבת הקרנית פונה כלפי מעלה.
    4. לאחר מכן, מלאו את תאי הקולטנים לחלוטין ב-PBS באמצעות פיפטת פסטר מזכוכית, וודאו שהם מלאים עד לסימון המציין את הנפח הידוע של מדיום הקולטן. הסר בועות אוויר על ידי היפוך בזהירות של התאים. יש להרטיב למשך 30 דקות.
    5. הפעל את מכשיר TEWL והתאזן למשך 20 דקות עד להתייצבות בהתאם להנחיות היצרן.
    6. הנח את בדיקת TEWL על כל תא פרנץ ולחץ על התחל בתוכנה. החזק אותו עד להצגת קריאה.
    7. הוסף 300 מיקרוליטר של דגימה על גבי העור (במשולש, n=3) וחסום על ידי הנחת סרט השתלה על גבי תא פרנץ. דגירה למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (טמפרטורת קולטן בינונית).
    8. הסר את הדגימה על ידי ניגוב הרקמה במגבונים נטולי מוך. השאירו למשך 30 דקות.
    9. מדוד TEWL עבור כל תא כדי לבחון את השפעת הדגימות על מחסום העור. חשב ערכי TEWL ביחס לערכי טרום חשיפה והתאם ביחס לבקרת PBS (TEWL יחסי = (TEWL post-TEWL-pre/TEWLpre)/(TEWL(PBS)post-TEWL(PBS)pre/TEWL(PBS)pre))*100.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ספקטרום NMR
מטרת טכניקה זו היא לאשר את היווצרותו המוצלחת של CAGE על ידי ניתוח הסביבות הכימיות של אטומי מימן ופחמן באמצעות ספקטרוסקופיה של 1H ו-13C. הספקטרום המתקבל מספק תזוזות כימיות אופייניות, דפוסי פיצול וערכי אינטגרציה המשקפים את המבנה המולקולרי וההרכב של ה-IL המסונתז. ספקטרום התמ"ג של הפרוטונים באיור 1 מאשר את היחס המולרי של 2:1 בין חומצה גרנית לכולין. זה ניכר מערכי האינטגרציה, כאשר השיא המתאים לחומצה גרנית (9) שימש כהתייחסות לכיול. כתוצאה מכך, ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שיטת ההכנה של CAGE המתוארת בעבודה זו אומצה מהספרות15. עם זאת, חשוב להכיר בכך שתהליך הסינתזה רגיש לגורמים חיצוניים שונים, שיכולים להשפיע על תכונות המוצר הסופי. לכן, לאחר ההכנה, יש לאפיין את מערכת הכלוב באמצעות טכניקות כגון ספקטרוסקופיה של תמ"ג כדי לאשר את היווצרות הכלוב.

כפי שמוצג באיור 1, ספקטרום הפרוטונים של CAGE ממחיש את התזוזות הכימיות של הפרוטונים עבור כל מולקולה. הקצאות שיא מפורטות הן עבור ספקטרום

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק קרן LEO מס. LF15007 ו-LF-FE-23-700013.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות NMR בקוטר 5 מ"מסיגמא אולדריץ'41121705
אצטוןVWR23L064039
מחבתות אלומיניום TzeroTA אינסטרומנטס90,16,83,901
מכשיר Aqua Fluxמערכות ביוקס
ברוקר אבנס III NMRברוקרמכשיר לספקטרוסקופיית NMR
ביקרבונט כוליןסיגמא אולדריץ'C7519
דרמטומהביומט זימר
קלורימטר סריקה דיפרנציאליתTA אינסטרומנטס
אתנולVWR23J314009
פוליסטירן מורחבקלקר
תאי דיפוזיה פרנץPermeGear
חומצה גרניתסיגמא אולדריץ'427764
סרט השתלהפאראפילם
קרל פישר טיטרטורמטלר טולדו30252662
מתנולVWR85681.32
PBSפישר סיינטיפיק10388739
תוכנת ניתוח אוניברסלי TA לשנת 2000TA אינסטרומנטסתוכנה לניתוח נתוני DSC
תוכנת טופספיןברוקרתוכנה לניתוח נתוני NMR

מקורות

  1. Dąbrowska, A. K., et al. The relationship between skin function, barrier properties, and body-dependent factors. Skin Res Technol. 24 (2), 165-174 (2018).
  2. Date, A. A., Naik, B., Nagarsenker, M. S. Novel drug delivery systems: Potential in improving topical delivery of antiacne agents. Skin Pharmacol Physiol. 19 (1), 2-16 (2005).
  3. Phatale, V., Vaiphei, K. K., Jha, S., Patil, D., Agrawal, M., Alexander, A. Overcoming skin barriers through advanced transdermal drug delivery approaches. J Control Release. 351, 361-380 (2022).
  4. Kasting, G. B., Smith, R. L., Cooper, E. R. Effect of lipid solubility and molecular size on percutaneous absorption. Skin Pharmacokinet. 1, 138-153 (1987).
  5. Wickett, R. R., Visscher, M. O. Structure and function of the epidermal barrier. Am J Infect Control. 34 (10), S98-S110 (2006).
  6. Elias, P. M. Epidermal barrier function: intercellular lamellar lipid structures, origin, composition and metabolism. J Control Release. 15 (3), 199-208 (1991).
  7. Moser, K., Kriwet, K., Naik, A., Kalia, Y. N., Guy, R. H. Passive skin penetration enhancement and its quantification in vitro. Eur J Pharm Biopharm. 52 (2), 103-112 (2001).
  8. Lu, Y., Qi, J., Wu, W. Ionic liquids-based drug delivery: A perspective. Pharm Res. 39 (10), 2329-2334 (2022).
  9. Welton, T. Room-temperature ionic liquids. Solvents for synthesis and catalysis. Chem Rev. 99 (8), 2071-2084 (1999).
  10. Lei, Z., Chen, B., Koo, Y. M., MacFarlane, D. R. Introduction: Ionic liquids. Chem Rev. 117 (10), 6633-6635 (2017).
  11. Huang, W., et al. Ionic liquids: Green and tailor-made solvents in drug delivery. Drug Discov Today. 25 (5), 901-908 (2020).
  12. Mitragotri, S. Choline geranate (CAGE): A multifaceted ionic liquid for drug delivery. J. Control. Release. 376, 593-600 (2024).
  13. Banerjee, A., Ibsen, K., Iwao, Y., Zakrewsky, M., Mitragotri, S. Transdermal protein delivery using choline and geranate (CAGE) deep eutectic solvent. Adv Healthc Mater. 6 (15), 1601411(2017).
  14. Edwardson, T. G., Mori, T., Hilvert, D. Rational engineering of a designed protein cage for siRNA delivery. J Am Chem Soc. 140 (33), 10439-10442 (2018).
  15. Fulmer, G. R., et al. NMR chemical shifts of trace impurities: common laboratory solvents, organics, and gases in deuterated solvents relevant to the organometallic chemist. Organometallics. 29 (9), 2176-2179 (2010).
  16. Zakrewsky, M., et al. Ionic liquids as a class of materials for transdermal delivery and pathogen neutralization. Proc Natl Acad Sci. U.S.A. 111 (37), 13313-13318 (2014).
  17. Torres, A. M., Price, W. S. Common problems and artifacts encountered in solution-state NMR experiments. Concepts Magn Reson. A. 45 (2), e21387(2016).
  18. Takeda, J., Iwao, Y., Karashima, M., Yamamoto, K., Ikeda, Y. Structural evaluation of the choline and geranic acid/water complex by SAXS and NMR analyses. ACS Biomater Sci Eng. 7 (2), 595-604 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

נוזל יוני CAGEחדירות תרופותמחסום העורספקטרוסקופיית NMRקלורימטריה סורקת דיפרנציאליתטיטרציית קארל-פישרעור ex vivoמסיסות תרופות
פיתוח, אפיון והערכה של מערכות נוזל יוני מבוססות CAGE להעברה דרך העור
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.