פענוח התנהגות טבעית מהטמעה נוירו-אתולוגית

Summary

פרוטוקול זה נותן מסגרת משולבת המבוססת על שיטות נוירו-אתולוגיות חישוביות מתקדמות להבנת קידוד מוח בהקשרים נטורליסטיים.

Abstract

בעלי חיים מתקשרים עם סביבתם הטבעית באמצעות פעילות מוחית עשירה ודינמית. הבנת האופן שבו דינמיקה של אוכלוסייה עצבית מקודדת התנהגות נטורליסטית נותרה אתגר בסיסי במדעי המוח של המערכות. ההתקדמות האחרונה בניתוח התנהגות מבוסס למידה עמוקה והדמיה פלואורסצנטית מיניאטורית פתחו אפיקים חדשים לחקירת האופן שבו המוח מקודד התנהגות טבעית. כאן, מחקר זה מציג מסגרת ניסויית וחישובית משולבת המשלבת את אטלס ההתנהגות החברתית (SBeA), מיקרוסקופיה דו-פוטונית מיניאטורית (mTPM) והטמעות עקביות של הקלטות בממדים גבוהים באמצעות משתני עזר (CEBRA) כדי לפענח התנהגויות מורכבות מדינמיקת המוח. מחקר זה משתמש באינטראקציות חברתיות נטורליסטיות בין עכברים הנעים בחופשיות כמערכת מודל, המאפשרת הערות התנהגותיות ברזולוציה גבוהה לצד הדמיה עצבית בו זמנית. מסגרת זו כוללת הערכת תנוחות התנהגותיות מדויקות, מעקב אחר עכבר כפול מסונכרן, יישור הטמעה עצבית ופענוח תכונות התנהגותיות ישירות ממרכיבים עיקריים עצביים. מחקר זה מדגים כי גישה זו משיגה דיוק פענוח של 3. ± 1.5 פיקסלים ליציבה ודיוק של 89 ± 6% לפענוח מוטיבים על פני בעלי חיים, מה שמדגיש את החוסן ויכולת ההכללה שלו. שיטה זו מספקת כלי רב עוצמה לחקר האופן שבו פעילות מוחית משקפת מצבים התנהגותיים מובנים, והיא מניחה את היסודות למחקרים עתידיים של עקרונות קידוד עצבי נטורליסטי.

Introduction

מסגרת זו נועדה ללכוד ולפענח נתוני התנהגות והדמיה מוחית מבעלי חיים הנעים בחופשיות במסגרות ניסוי נטורליסטיות. הוא מורכב משלושה מרכיבים עיקריים: שיטות הערכת תנוחות וסיווג התנהגות מבוססות למידה עמוקה, SBeA¹, טכניקות הדמיה פלואורסצנטיות מיניאטוריות mTPM², ואלגוריתם הטמעה נוירו-אתולוגי מבוסס למידה ניגודית, CEBRA³. מחקרים אחרונים הדגישו את המורכבות של תהליכים נוירו-אתולוגיים בבעלי חיים הנעים בחופשיות, העולה על זו שנצפתה בפרדיגמות ניסוי קבועות ראש ^4,5. עם זאת, מגבלות טכניות ושונות עיכבו את היישום הנרחב של גישות אלה לחקירות רחבות יותר של התנהגות טבעית. פרוטוקול זה מציג מסגרת יציבה ומשולבת המבטיחה נגישות לנתונים התנהגותיים ועצביים שנאספו בהקשרים נטורליסטיים עבור מגוון רחב של מעבדות מחקר.

בהתחשב בכך שבעלי חיים נעים בחופשיות בסביבות טבעיות, מסגרת זו משלבת הערכת תנוחות מבוססת למידה עמוקה כדי להשיג מעקב מדויק אחר תנוחות ^6,7. שיטות מעקב מסורתיות מבוססות עיבוד תמונה אינן מספיקות ללכידת תנועות בקנה מידה עדין, כגון דינמיקת גפיים וכפות, בהשוואה לגישות מבוססות למידה עמוקה⁸. ההתנהגויות המגוונות והמורכבות המוצגות על ידי בעלי חיים הנעים בחופשיות מציבות אתגרים לשיטות סיווג התנהגות מפוקחות⁹, שכן קטגוריות התנהגות מוגדרות מראש לרוב אינן מקיפות את כל טווח הפנוטיפים ההתנהגותיים הטבעיים¹⁰. כתוצאה מכך, שיטות סיווג מבוססות למידה ללא פיקוח מתאימות יותר לניתוח התנהגות במסגרות נטורליסטיות¹. הם יכולים לפרק באופן מקיף התנהגות רציפה למוטיבים תת-שניות בדידים בהתאם לדמיון המבני המהותי שלהם, ואז ההגדרות העקביות שלהם ניתנות באמצעות אשכולות מונעי נתונים.

הדמיית מוח בבעלי חיים הנעים בחופשיות דורשת לכידת השונות הנרחבת של פעילות נוירון בודד ^4,5. רישומים אלקטרופיזיולוגיים בבעלי חיים הנעים בחופשיות מוגבלים ביכולתם לזהות נוירונים^{עם פעילות} תת-סף בעיקר. בנוסף, מיקרוסקופיה של פוטון בודד סובלת מרזולוציה וניגודיות נמוכים, מה שמקשה על שמירה על זהויות נוירונים עקביות לאורך מפגשי הדמיה¹². mTPM מציע רזולוציה וניגודיות מעולים בהשוואה למיקרוסקופיה של פוטון יחיד, מה שהופך אותו לכלי יעיל יותר לחקירת הקידוד העצבי של התנהגויות טבעיות 2,13,14,15.

ביסוס מיפוי חזק בין התנהגות לנתונים עצביים מחייב שיטות המסוגלות לחשוף את מבנה המידע המשותף שלהם¹⁶. טכניקות הפחתת מימדים קונבנציונליות, כגון ניתוח רכיבים עיקריים (PCA)¹⁷, הטמעת שכן סטוכסטי מבוזר t (t-SNE)¹⁸, וקירוב והקרנה של סעפת אחידה (UMAP)¹⁹, אינן יכולות להטמיע ביעילות נתונים התנהגותיים ועצביים בתוך מרחב תכונות משותף. לעומת זאת, גישות הטמעה מבוססות למידה עמוקה, כגון CEBRA, מאפשרות שילוב של אופני נתונים מרובים הן במסגרות מפוקחות והן בפיקוח עצמי, ויוצרות ייצוגים סמויים באיכות גבוהה³. בעוד ששיטות חלופיות שונות צצו בשנים האחרונות 20,21,22, מסגרת מוצעת זו נותנת עדיפות ליישומים מעשיים על ידי שילוב שיטות מבוססות היטב הזמינות מסחרית או נתמכות על ידי הדרכות מקיפות .

בהשוואה למחקרים אחרונים ^4,5, מסגרת זו מציעה שלוש התקדמות מרכזית. ראשית, זה מבטל הטיה אנושית בסיווג התנהגות. מחקרים קודמים הסתמכו על תיוג התנהגות ידני, שהוא עתיר עבודה ונוטה לחוסר עקביות, במיוחד כאשר המפרשים חווים עייפות 23,24,25. לעומת זאת, מסגרת זו משתמשת בסיווג התנהגות לא מפוקח, המשמר את המבנה הטבעי של דפוסי התנהגות על ידי פירוק אובייקטיבי וקיבוץ מוטיבים התנהגותיים לפני הקצאת הגדרות^26,27. שנית, השימוש ב-mTPM מאפשר ללכוד דינמיקה עצבית מורכבת יותר ברמת הנוירון היחיד. יתרון מתודולוגי זה מרחיב את הישימות של מסגרת זו לפענוח התנהגויות טבעיות מורכבות מאוכלוסיות עצביות מגוונות, כולל אלה המעורבות בקידוד תת-סף²⁸. שלישית, מסגרת זו משלבת נתונים התנהגותיים ועצביים במרחב ייצוגי מאוחד, במקום להשתמש ב-UMAP כדי להטמיע כל אופן בנפרד או להשתמש במכונות וקטוריות תומכות כדי לכפות מיפוי נוקשה בין פעילות עצבית להתנהגות תוך התעלמות מהדינמיקה הפנימית שלהן ^4,5. גישת הטמעה משותפת זו מבטיחה ייצוג מקיף ומשמעותי יותר מבחינה ביולוגית של הקשר בין התנהגות לפעילות המוח.

מסגרת זו מתאימה היטב לפרויקטים מחקריים הכוללים רישום ופענוח של נתונים התנהגותיים ועצביים מבעלי חיים הנעים בחופשיות בתנאי ניסוי נטורליסטיים. בעוד שהיישום הנוכחי מותאם למחקרי עכברים, התאמתו למודלים אחרים של בעלי חיים עשויה לדרוש פיתוח נוסף. מכיוון שרכיבי החומרה המשמשים במסגרת זו זמינים מסחרית, מצד אחד, העלות הכוללת עשויה להיות גבוהה יחסית. מצד שני, זמינות מסחרית זו מפחיתה משמעותית את הזמן המושקע בפתרון בעיות לוגיסטיות ומבטיחה השגת תוצאות יציבות ואמינות בצורה יעילה.

פרוטוקול זה נועד להיות ניתן לשחזור ונגיש למעבדות מדעי המוח המצוידות בהדמיה של בעלי חיים קטנים ומעקב אחר התנהגות. המערכת השלמה משלבת התקן mTPM זמין מסחרית עם מערך רכישה התנהגותי מרובה זוויות. הקלטות עצביות טיפוסיות נרכשות ב-4.84 הרץ ברזולוציה של 512 ×-512 פיקסלים, ונתוני התנהגות נלכדים ב-30 פריימים לשנייה. סנכרון נתונים מושג באמצעות יישור דופק TTL במהלך עיבוד מקדים. ניתן לבצע אימון ופענוח בתחנת עבודה סטנדרטית עם GPU (למשל, NVIDIA RTX 3090 או שווה ערך), והצינור המלא דורש כ-100 GB של אחסון לכל ניסוי. בעוד שהיישום הנוכחי מותאם לעכברים הנעים בחופשיות, העיצוב המודולרי של זרימת העבודה מאפשר הסתגלות למינים אחרים על ידי התאמת כיול מעקב ופרמטרים של הדמיה על סמך גודל החיה וניידותה. פרטים מעשיים אלה תומכים ביכולת ההסתגלות והשחזור של הפרוטוקול במגוון הגדרות ניסוי.

Protocol

הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים במכון שנזן לטכנולוגיה מתקדמת, האקדמיה הסינית למדעים, אישרה את כל הליכי הגידול והניסוי.

1. הקמת פלטפורמה

הערה: הפלטפורמה מורכבת משני רכיבים עיקריים: התקן mTPM והתקן התנהגות תלת-ממד (איור 1A). מכשיר ה-mTPM מאפשר סנכרון בזמן אמת של הדמיית mTPM עם נתונים התנהגותיים, ובכך מאפשר רכישה יעילה, יציבה ורציפה של נתונים באיכות גבוהה מבעלי חיים הנעים בחופשיות. מכשיר ההתנהגות התלת-ממדית מצויד בארבע מצלמות כדי ללכוד את הסצנה המלאה של התנהגות בעלי חיים ומודול כיול אוטומטי לשחזור תנוחות תלת מימד של בעלי חיים. שני המכשירים נדרשים לשלב מודולי סנכרון בגרסאות המתאימות להם.

1. חיבור מכשיר
   1. הסר את המעטפת החיצונית של התקן ההתנהגות התלת-ממדית. הנח את החלקים הנותרים של התקן ההתנהגות התלת-ממדית, כולל ארבע מצלמות ומודול כיול אוטומטי, בתוך תא ההקלטה ההתנהגותי של מכשיר ה-mTPM.
   2. חבר את כבל האפיק הטורי האוניברסלי (USB) של מודול הסנכרון של התקן ההתנהגות התלת-ממדית לתחנת העבודה של התקן ההתנהגות התלת-ממדית.
   3. חבר את מודול הסנכרון של התקן ה-mTPM לבקר של התקן ה-mTPM באמצעות כבל SubMiniature גרסה A (SMA) אחד.
   4. חבר את יציאת הפלט Transistor-Transistor Logic (TTL) של מודול הסנכרון של התקן ההתנהגות התלת-ממדית ליציאת כניסת TTL של מודול הסנכרון של התקן ה-mTPM באמצעות כבל המרה SMA-Bayonet Neill-Concelman (BNC) אחד.
2. הקלטת חותמת זמן של מסגרות mTPM
   1. הפעל כל ספק כוח של התקן mTPM.
   2. הפעל את תוכנת ההקלטה mTPM ואת תוכנת הסנכרון mTPM.
   3. הגדר את נתיבי השמירה של מסגרות mTPM וחותמות זמן של סינכרון.
      הערה: אל תשתמש באותיות שאינן באנגלית ובתווים מיוחדים כדי לתת שמות לנתיבים.
   4. הגדר את מספר מסגרות ההקלטה של תוכנת ההקלטה mTPM. מספר הפריימים המומלץ הוא 6000, וזה מספיק כדי לסיים את שלב ניפוי הבאגים בסנכרון.
   5. בחר כל ערוץ של תוכנת הסינכרון mTPM.
   6. התחל את ההקלטה של mTPM באמצעות תוכנת ההקלטה mTPM. לפני תחילת ההקלטה, כבה את כל האורות בתוך החדר כדי להגן על ה-mTPM מפני שריפת יתר של אור. תוכנת הסינכרון mTPM תופעל באופן אוטומטי כאשר המשתמש יתחיל את ההקלטה.
   7. בדוק אם חותמות הזמן של מסגרת mTPM נלכדות על-ידי תוכנת הסינכרון של mTPM.
      הערה: מסגרת ה-mTPMAMPS המוצגת בתוכנת הסנכרון mTPM היא פעימות TTL חדות. כל מסגרת הדמיה מפעילה דופק TTL חד, שהוא 4.84 הרץ כברירת מחדל. אם אין דופק מוצג בלוח התוכנה, ישנן 2 בעיות רגילות. הראשון הוא שמנהל ההתקן של הבקר של מכשיר ה- mTPM אינו תומך בלכידת חותמת זמן. שיפור גרסת מנהל ההתקן שלו כדי לתמוך בלכידת חותמת זמן יכול לפתור את הבעיה הראשונה. השני הוא החיבור הגרוע של כבל ה- SMA. ודא שמחברי ה-SMA מהודקים היטב. לפני בדיקת חותמות הזמן, חזור ל-1.1.2 ולאחר מכן נסה צעד אחר צעד.
   8. המתן עד שההקלטה תיפסק. בדוק אם קובץ .tif של מסגרות mTPM, קובץ .tdms אחד וקובץ .tdms_index אחד של חותמות הזמן נשמרים.
3. הקלטת חותמת זמן של ארבע מצלמות של התקן ההתנהגות התלת-ממדית
   1. הגדר את נתיב השמירה של הסרטונים וחותמות הזמן של אופן הפעולה בסקריפט סנכרון המצלמה המותאם אישית.
      הערה: קוד סנכרון המצלמה המותאם אישית נמצא https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/camera_code/mul_camera_save_video_event.py.
   2. הפעל את תוכנת הסינכרון mTPM. הגדר את נתיבי השמירה של חותמות זמן של סינכרון mTPM.
   3. התחל את ההקלטה של תוכנת הסנכרון mTPM. הפעל את סקריפט סנכרון המצלמה המותאם אישית.
   4. בדוק אם חותמות הזמן של אופן הפעולה נלכדות על-ידי תוכנת הסינכרון של mTPM.
      הערה: חותמות הזמן של ההתנהגות המוצגות בתוכנת הסנכרון mTPM הן פעימות TTL חדות. חותמת זמן אחת של התנהגות נשלחת לתוכנת הסנכרון mTPM עבור כל 30 פריימים של הקלטת מסגרת וידאו של התנהגות. חותמות הזמן של אופן הפעולה יישמרו גם בתחנת העבודה של התקן ההתנהגות התלת-ממדית.
   5. בדוק אם נשמרים ארבעה קובצי .avi של סרטוני וידאו של התנהגות, קובץ .txt אחד של חותמות זמן של התנהגות בהתקן התנהגות תלת-ממדית, וקובץ .tdms אחד וקובץ .tdms_index אחד של חותמות הזמן של התנהגות בתחנת העבודה mTPM.
4. כיול המצלמה של התקן אופן הפעולה התלת-ממדי
   1. התאם את זווית הצילום של ארבע מצלמות. ארבע המצלמות צריכות לכסות באופן מקיף את כל בסיס השדה הפתוח תוך הרחבת שדה הראייה שלהן לפחות 20 ס"מ מעל הגבול הרחוק ביותר של השדה הפתוח כדי להבטיח שמקרים של התרוממות העכבר נלכדים במלואם.
   2. שים את מודול הכיול במרכז אזורי הצילום. הפעל את תוכנת כיול המצלמה. לפני הפעלת תוכנת כיול המצלמה, כבה את כל האורות.
      הערה: ארבע מצלמות יצלמו את המסגרות של לוח הסימון הנע המוצג על ידי מסך הכיול. כיול המצלמה מבוסס על שיטת הכיול של ז'אנג²⁹.
   3. לאחר הפעלת תוכנת כיול המצלמה, יישמר קובץ .mat אחד, המכיל את מטריצת הקרנת המצלמה לשחזור תנוחות תלת מימד של בעלי חיים. מכיוון שיצירת האינדקס של נתוני ההתנהגות בשלב סנכרון המערכת מסתמכת על קובץ ה-.mat של הכיול, ודא ששלב כיול המצלמה הסתיים לפני שלב הסנכרון של המערכת כולה.
5. סנכרון של המערכת כולה
   הערה: לפני שלב זה, ודא שתוכנת הסינכרון mTPM יכולה לקבל חותמות זמן ממסגרות mTPM ומהתקן התנהגות תלת-ממדית בנפרד.
   1. הפעל כל ספק כוח של התקן mTPM והתקן התנהגות תלת-ממדית.
   2. הפעל את תוכנת ההקלטה mTPM, תוכנת הסנכרון mTPM ותסריט סנכרון המצלמה המותאם אישית.
   3. הגדר את הנתיב והפרמטרים שלהם בהתייחס לשלב 1.3.1. התחל את ההקלטה של mTPM באמצעות תוכנת ההקלטה mTPM.
   4. הפעל את סקריפט סנכרון המצלמה המותאם אישית. ודא שתחילת ההקלטה של מסגרות mTPM מקדימה את הפעלת קובץ ה- Script של הקלטת אופן הפעולה כך שתוכנת הסינכרון של mTPM תוכל לקבל את חותמות הזמן מהתקן ההתנהגות התלת-ממדית. הגדר את שעת הסיום של הקלטת מסגרות mTPM לארוכה יותר מזמן הקלטת אופן הפעולה כך שתוכנת הסינכרון של mTPM תוכל ללכוד את חותמות הזמן של אופן הפעולה ללא אובדן.
      הערה: ההמלצה על זמן ההקלטה של מסגרות mTPM ארוכה מ-5 דקות מהקלטת אופן הפעולה. לדוגמה, אם המשתמש מעוניין לתעד התנהגות של 15 דקות, יש להגדיר את מספר מסגרות ה- mTPM ל- 4.84 x (15+5) x 60 = 5808 מסגרות.
   5. המתן להפסקת ההקלטה. לאחר ההקלטה, יש קובץ .tif מסגרת mTPM אחד, שני קבצי .tdms לסנכרון mTPM, שני קבצי .tdms_index, ארבעה קבצי .avi וידאו של התנהגות וקובץ .txt חותמת זמן אחד של התנהגות.
   6. הפעל את קוד הסנכרון המותאם אישית כדי ליישר את מסגרת ה- mTPM ואת סרטוני ההתנהגות. קוד הסנכרון המותאם אישית נמצא https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step1_align_tpm_data.m.
      1. לפני הפעלת קובץ Script זה, ארגן את הקבצים באופן ידני באופן הבא:
         ----\נתיב שורש # הנתיב לשמירת כל הנתונים
         --------\behavior_all # הנתיב לשמירת נתוני התנהגות
         ------------\A-B-C-D-E-caliParas.mat # קובץ כיול מצלמה
         ------------\A-B-C-D-E-camera-1.avi # סרטון התנהגות ממצלמה 1
         ------------\A-B-C-D-E-camera-2.avi # סרטון התנהגות ממצלמה 2
         ------------\A-B-C-D-E-camera-3.avi # סרטון התנהגות ממצלמה 3
         ------------\A-B-C-D-E-camera-4.avi # סרטון התנהגות ממצלמה 4
         ------------\A-B-C-D-E-event.txt # חותמת זמן התנהגות מהתקן התנהגות תלת-ממדית
         ----\tpm_suite2p # הנתיב לשמירת נתוני mTPM
         --------\sep # הנתיב לשמירת מסגרות וחותמות זמן של mTPM
         ------------\A-B-C-D-E-אירוע # הנתיב לביצוע יישור חותמת זמן
         ----------------\beh.tdms # קובץ ה- .tdms של ערוץ ההתנהגות
         ----------------\beh.tdms_index #The התנהגות ערוץ .tdms_index קובץ
         ----------------\tpm.tdms # קובץ ה- .tdms של ערוץ mTPM
         ----------------\tpm.tdms_index # קובץ .tdms_index ערוץ mTPM
         ------------\A-B-C-D-E-tpm # הנתיב לשמירת מסגרות mTPM
         ----------------\F.tif # מסגרות ה-mTPM של כל הקלטה
         --------\process # הנתיב לחילוץ עקבות עצביים
         ------------\C # הנתיב של כל עכבר
         ----------------\F.tif # מסגרות ה-mTPM של כל עכבר
         A עד G הן הגדרות של שדות שם, כאשר
         A פירושו קבוצות ניסוי, למשל, חופשיות,
         B פירושו רצף הסרטונים, למשל, seg1,
         C פירושו זהות של בעלי חיים, למשל, 1tpmss,
         D פירושו שותפי האינטראקציה, לדוגמה, 1wt,
         E פירושו תאריך הניסוי, למשל, 20220226, ו-
         F פירושו נתח מסגרת ההקלטה של mTPM (5000 פריימים לכל נתח), לדוגמה, חברתי 1.
         הערה: קצב הפריימים של מערכת המעקב ההתנהגותי התלת-ממדי הוא 30 הרץ, בעוד זה של ה-mTPM הוא 4.84 הרץ. מכיוון שדיוק הסנכרון המרבי הניתן להשגה מוגבל על ידי קצב הפריימים הנמוך ביותר (4.84 הרץ), הרזולוציה הזמנית של הסנכרון היא כ-206 אלפיות השנייה. חותמות זמן התנהגותיות משמשות כהפניה, וכל מסגרת mTPM מיושרת לנקודת הזמן ההתנהגותית הקרובה ביותר. מרווחים בין מסגרות mTPM עוקבות ביחס לציר הזמן ההתנהגותי מופנים באמצעות גישה מדורגת.

2. רישום נתונים נוירו-אתולוגיים

הערה: תהליך רישום הנתונים הנוירו-אתולוגיים מורכב מארבעה שלבים עיקריים (איור 1B).

1. הרכבה mTPM
   הערה: מכיוון שהפרטים של הרכבה על mTPM כלולים במדריך של ה-mTPM, רק השלבים העיקריים מוצגים כאן.
   1. הכן את חלון הגולגולת.
      הערה: הכנת חלון הגולגולת כוללת בעיקר הזרקת הנגיף, השתלת זכוכית הכיסוי וקיבוע לוחית המתכת. מכיוון שאתרי ההדמיה שונים במחקרים שונים, פרטי הכנת החלון הגולגולתי שונים. במקרה זה, הכנת חלון הגולגולת מתבצעת על ידי שירות מיקור חוץ. אזור המוח ההדמיה בנתוני הדוגמה הוא קליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית (S1).
   2. קבע את מסנן העכבר למיקרומניפולטור mTPM. קבע את ראש העכבר למסנן דרך לוחית המתכת.
   3. מצא את הקרינה באמצעות mTPM. כבה את כל האורות לפני הפעלת הדמיית ה-mTPM. קבע את ה-mTPM למחזיק לפני השלבים הבאים.
      1. יש להוסיף טיפה אחת של ג'ל עיניים Carbomer לחלק העליון של חלון הגולגולת. הזז את העכבר דרך פלטפורמת התנועה כאשר חלון הגולגולת מיושר מתחת לאובייקט mTPM.
      2. הזז את המיקרומניפולטור אנכית כדי למצוא את מישור ההדמיה. הזז את המיקרומניפולטור במישור כדי למרכז את מישור ההדמיה.
   4. קבע את הבסיס העליון ל-mTPM. הדביקו את הבסיס התחתון לבסיס העליון ולחלון הגולגולת.
      1. כדי להבטיח יציבות מבנית, מלא את הפער בין שני הבסיסים לתושבת לוחית המתכת המחוברת לראש העכבר וחבר אותו עם דבק מבני אקרילי בעל ביצועים גבוהים. רפאו את הדבק למשך 30 דקות לפני הערכת יציבות הקשר על ידי בדיקה עדינה של הבסיס בפינצטה. במידת הצורך מורחים דבק נוסף עד להשגת קיבוע בטוח.
         הערה: חיוני למנוע כל הידבקות ישירה בין הבסיס ל-mTPM עצמו. הבסיסים העליונים והתחתונים הם מסגרות אלומיניום קטנות. הבסיס העליון מיוצר בהתאמה אישית כדי להתאים היטב לקווי המתאר התחתונים של בית ה-mTPM. בסיסים תחתונים עם אפשרויות גובה מרובות משמשים לגישור על הפער בין הבסיס העליון לחלון הגולגולת. לכל הבסיסים התחתונים יש מידות מישוריות זהות לבסיס העליון כדי להבטיח תאימות מכנית, שונות אך ורק בגובה כדי להתאים למרחקים משתנים בין הגולגולת לבסיס העליון.
   5. יש להוסיף טיפה אחת של ג'ל עיניים Carbomer בתוך תא הבסיס. בדוק את הקרינה העצבית באמצעות mTPM. אם הקרינה העצבית אינה נראית בבירור, הסר את הדבק באמצעות מקדחה גולגולתית, המאפשרת הפרדת הבסיס, ולאחר מכן חוזרים על ההליך הנ"ל עד להשגת בהירות הקרינה.
   6. אבטח את רדיד האלומיניום עם סרט בין סיב ה-mTPM לחלון הגולגולת.
      הערה: שלב זה נועד לשמור על מיגון אור תקין לאורך כל תהליך ההקלטה. השימוש בנייר אלומיניום ובסרט דבק צומצם כדי להפחית את המשקל הכולל.
   7. הדליקו את תאורת החדר ובדקו את הבהירות של מסגרות mTPM.
2. הכנסת העכבר לשדה פתוח
   הערה: שלב זה כולל הצבת העכבר בשדה הפתוח תוך הקפדה על איזון משקל תקין עבור הסיב וה-mTPM.
   1. נפחו לפחות 10 בלוני הליום וקשרו אותם בנפרד בחוט כותנה. נתק את לוחית המתכת ממסנן העכבר.
   2. החזק את העכבר בזנבו ביד אחת. תמכו בסיב mTPM באמצעות היד השנייה.
   3. מקם בעדינות את העכבר בשדה הפתוח. תלו את בלוני ההליום באמצעות חוטי כותנה לסיבים. התאם את מספר הבלונים עד שהעכבר יוכל לנוע בחופשיות ולחקור את השדה הפתוח ללא אילוץ.
      הערה: המספר האופטימלי של בלונים נקבע כאשר העכבר נשאר מקורקע, כאשר גפיו הקדמיות אינן מורמות על ידי ציפה כלפי מעלה, תוך איזון מספיק של משקל ה-mTPM כדי לאפשר לבעל החיים לשמור על תנוחת ראש טבעית ולעמוד זקוף באופן ספונטני. יש לקשור את חוט הכותנה בגובה מעל השדה הפתוח כדי להבטיח אורך סיבים מספיק לתנועה בלתי מוגבלת של העכבר. חוט הכותנה נקשר בגובה הסיב האופטי, שהיה מיושר בערך עם הקצה העליון של תא השדה הפתוח. בדוגמה הנתונה, לאחר השלמת שלב זה, עכבר לא מטופל מוכנס לשדה הפתוח כדי לאפשר אינטראקציה חברתית חופשית.
   4. סגור את הדלת של מארז ה-mTPM כדי למזער הפרעות חיצוניות.
3. הפעלת הקלטת mTPM.
   1. הפעל את תוכנת ההקלטה mTPM ואת תוכנת הסנכרון mTPM. הגדר את הנתיב והפרמטרים שלהם המתייחסים לשלב הקמת הפלטפורמה.
   2. התחל את ההקלטה של mTPM באמצעות תוכנת ההקלטה mTPM. ודא את נוכחותם של סמני זמן המתאימים לכל מסגרת של שני פוטונים בתוך תוכנת הסנכרון.
   3. העריכו אם הניגודיות של תמונות שני הפוטונים נותרה ללא השפעה ואשרו שתנועת העכבר אינה פוגעת ביציבות הפריימים המוקלטים. אם מתגלות בעיות כלשהן, חזור על הליך הסנכרון ועל תהליך ההרכבה של mTPM עד שהדמיית שני הפוטונים תייצר מסגרות ברורות עם סמני זמן מיושרים במדויק.
4. הפעלת הקלטת התנהגות
   1. הפעל את סקריפט סנכרון המצלמה המותאם אישית.
      הערה: קוד סנכרון המצלמה המותאם אישית נמצא https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/camera_code/mul_camera_save_video_event.py.
   2. הגדר את הנתיב והפרמטרים המתייחסים לשלב הקמת הפלטפורמה.
   3. התחל את הקלטת ההתנהגות באמצעות סקריפט סנכרון המצלמה המותאם אישית. ודא את נוכחותם של סמני זמן המתאימים לכל 30 מסגרות התנהגות בתוכנת הסינכרון mTPM.
   4. בדוק אם ארבעת זרמי הווידאו מהמצלמות מסונכרנים כהלכה, ובדוק את פרמטרי לכידת הווידאו של מערכת המעקב ההתנהגותית התלת מימדית.
      הערה: בהגדרה לעיל, המצלמות משתמשות ברזולוציית מסגרת של 640 × 480 פיקסלים, קצב פריימים של 30 פריימים לשנייה, מסגרות RGB וחשיפה אוטומטית. החשיפה האוטומטית מאפשרת למצלמה להתאים את הבהירות באופן דינמי בהתאם לתנאי תאורת הסביבה. מכיוון שזמן החשיפה משפיע ישירות על קצב הפריימים הניתן להשגה, במיוחד בתנאי תאורה חלשה שבהם נדרשות חשיפות ארוכות יותר, קצב הפריימים עשוי לרדת. כדי להבטיח רכישת מסגרת יציבה ב-30 הרץ, חשוב לשלוט בתאורת הרקע כדי למזער את זמן החשיפה. הגדרות הרווח והשילוב של המצלמה נשמרות בערכי ברירת המחדל שלהן לאורך כל ההקלטה.
   5. ההקלטה ההתנהגותית תיפסק אוטומטית ברגע שתגיע למשך הזמן שהוגדר מראש. לאחר השלמת ההקלטה ההתנהגותית, כבה ידנית את ההקלטה והסנכרון של mTPM. על ידי ביצוע שלבים אלה, הושלם ניסוי יחיד של רכישת נתונים עצביים והתנהגותיים בו זמנית.

3. עיבוד מקדים של נתונים נוירו-אתולוגיים

הערה: אם כל השלבים הקודמים הושלמו בהצלחה, יש להשיג שלוש קטגוריות של קבצי נתונים: מסגרות הדמיה של שני פוטונים (.tif), ארבע הקלטות וידאו התנהגותיות (.avi) יחד עם כיול מצלמה file ( .mat), ושני סנכרון חותמת זמן files ( .tdms) עבור עיבוד מקדים של נתונים עוקבים (איור 1C). יש לשנות את שמם של נתונים אלה באופן ידני ולהכניס אותם לתיקיות המתייחסות לשלב 1.5.7.

1. עיבוד מקדים של נתוני mTPM
   1. חלץ מסלולי אותות עצביים ממסגרות mTPM דרך suite2p³⁰. שמור את הפרמטרים של suite2p בערכי ברירת המחדל שלהם כדי להבטיח שחזור. התאם רק את קצב הפריימים כך שיתאים להגדרות רכישת mTPM.
      הערה: מכיוון שהשלבים הבאים כוללים עיבוד אותות ובקרת איכות, אין צורך לכוונן בהרחבה את הפרמטרים של suite2p בשלב זה. יש חשיבות רבה יותר לשמירה על עקביות בין מערכי נתונים.
   2. הפעל את הקוד המותאם אישית כדי ליישר את חותמות הזמן בין מסגרות ה- mTPM לסרטוני ההתנהגות.
      הערה: קובץ Script זה מיישר חותמות זמן של אירועים התנהגותיים עם זמני הרכישה המתאימים של mTPM. הוא מייצר ושומר מיפויי אינדקס עבור כל הקלטה, ומאפשר ניתוח מסונכרן של התנהגות ונתונים עצביים. קוד מותאם אישית זה נמצא https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step1_align_tpm_data.m.
   3. הפעל את הקוד המותאם אישית כדי להמיר את פורמט הנתונים מהפלט suite2p.
      הערה: סקריפט זה מחלץ ומארגן מחדש נתוני mTPM עבור בעלי חיים בודדים על ידי זיהוי ומיפוי מדדי מסגרת רלוונטיים. הוא בוחר את עקבות הפעילות העצבית המתאימים ובונה אותם מחדש לפורמט נתונים סטנדרטי, המאפשר ניתוח יעיל במורד הזרם של הקלטות מפולחות. קוד מותאם אישית זה נמצא https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step2_separate_tpm_data.m.
   4. הפעל את הקוד המותאם אישית כדי לדגום מחדש אותות עצביים כדי ליישר קו עם מסגרות התנהגות.
      הערה: סקריפט זה מבצע דגימה מחדש זמנית של נתוני mTPM כדי ליישר עקבות פעילות עצבית עם חותמות זמן התנהגותיות. הוא טוען נתונים עצביים ומדדי סנכרון שפולחו בעבר, מחלץ עקבות שנדגמו מחדש בהתאם ושומר את הפלט בפורמט סטנדרטי להמשך עיבוד אותות. שיטת הדגימה מחדש הזמנית היא אינטרפולציה מדורגת. קוד מותאם אישית זה נמצא https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step3_resample_tpm_data.m.
   5. הפעל את הקוד המותאם אישית כדי לחדד מסלולים עצביים.
      1. מכיוון שאינטרפולציה צעדית יכולה להציג חפצי צלצול ורעש בתדר גבוה, תכנן מסנן מעביר-נמוכים שווה ערך עם תדר פס-מעבר של 2 הרץ ותדר פס-עצירה של 2.2 הרץ כדי להפחית את החפצים הללו. סדר המסנן הוא 61.
      2. לאחר מכן, השתמש בשיטת הפחתת הרעשים של Weijian Zong כדי לחדד עקבות סידן mTPM שנדגמו מחדש¹³. הוא מעריך קווי בסיס מקומיים באמצעות קריטריוני אחוזון ושונות מקומית ומחשב את אותות ה-ΔF/F. ΔF/F הוא מדד חסר מימד המייצג את השינוי היחסי בעוצמת הקרינה על פני קו הבסיס, המשמש בדרך כלל לכימות פעילות עצבית בהדמיית סידן. מכיוון שגם המונה (ΔF) וגם המכנה (F) נמצאים ביחידות פלואורסצנטיות שרירותיות, לערך ΔF/F המתקבל אין יחידה פיזיקלית והוא מבוטא כיחס או אחוז. תאים עם אותות שטוחים או רוויים במיוחד אינם נכללים על סמך סף טווח האותות. עקבות הפעילות העצבית האיכותיות המתקבלות נשמרות לניתוח במורד הזרם ( איור 2A, איור 3A ואיור 4A).
         הערה: הקוד המותאם אישית זמין בכתובת https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step4_filter_tpm_data.m.
2. עיבוד מקדים של נתוני התנהגות
   1. חלץ תנוחות התנהגותיות מהקלטות וידאו באמצעות מעקב תנוחות נגד סחיפה (ADPT)⁷.
      הערה: ADPT מטפל בבעיה של סחיפה נקודתית תכופה שנצפתה בשיטות מבוססות רשת עצבית קונבולוציוניות כגון DeepLabCut⁶ ו-SLEAP²². ADPT מתאים במיוחד לתרחישים הכוללים מכשירי הקלטה עצביים, כגון הדמיית mTPM בבעלי חיים הנעים בחופשיות, מכיוון שהוא מפחית ביעילות את הסחיפה הנקודתית הנגרמת על ידי תנועת הסיבים. המאגר של ADPT נמצא https://github.com/tangguoling/ADPT.
      1. בהתחשב בכך שהמערך הניסויי כולל שני עכברים, כאשר ה-mTPM משמש כמזהה לאחד מהם, אמן שני מודלים עצמאיים של ADPT של עכבר יחיד כדי להעריך את התנוחות של כל עכבר בנפרד.
      2. עבור כל דגם, הוסף הערות ידניות ל-16 נקודות מפתח 1,10,15,31 - כולל האף, האוזן השמאלית, האוזן הימנית, הצוואר, הגפיים הקדמיות השמאלית והימנית, הגפיים האחוריות השמאליות והימניות, הכפות הקדמיות השמאליות והימניות, הכפות האחוריות השמאליות והימניות, הגב, בסיס הזנב, הזנב האמצעי וקצה הזנב - עבור כ-600 פריימים, עם 150 פריימים המסומנים ידנית לכל תצוגת מצלמה למשך סרטון של 15 דקות.
      3. תרגול מודלים של ADPT באמצעות פרמטרי ברירת מחדל. הפרטים של פרמטרי האימון והחיזוי נמצאים ב-https://github.com/tangguoling/ADPT/blob/main/code/config.yaml ו-https://github.com/tangguoling/ADPT/blob/main/code/config_predict.yaml.
   2. שחזור תנוחות תלת מימד של בעלי חיים. לאחר האימון, החל את שני המודלים באופן עצמאי כדי לחזות את התנוחות של כל עכבר מכל אחד מהסרטונים שצולמו על ידי מצלמות שונות. מזג את הנתונים המתקבלים לקובץ טבלה יחיד להמשך עיבוד.
   3. בצע שחזור תלת מימדי של מסלולי ההתנהגות באמצעות טריאנגולציה בשילוב עם קובץ כיול המצלמה³². לאחר השחזור, השיגו את מסלולי התנועה של העכבר הנבדק (זה הנושא את ה-mTPM, איור 2B, איור 3B, איור 4B) ועכבר האובייקט (האינטראקציה הספציפית, איור 2C, איור 3C, איור 4C) לניתוח עוקב.
   4. במחקרי אינטראקציה חברתית, מרחקים בין-אישיים משמשים כאינדיקטורים קריטיים לדינמיקה חברתית³³. חשב את מרחקי הגוף היחסיים בין שני העכברים באמצעות מרחקים אוקלידיים זוגיים בין נקודות גוף מתאימות, וספק מדדים כמותיים לניתוח התנהגות חברתית נוסף ( איור 2D, איור 3D, איור 4D).
   5. לפרק ולסווג מוטיבים של התנהגות.
      הערה: אף על פי שהשלבים הקודמים מניבים מסלולי תנוחה עדינים, הם עדיין לא אומרים לנו מה החיה עושה. התנהגות מתייחסת לאופן שבו בעל חיים נע לאורך תקופה מסוימת, והקצאת התנהגות כרוכה במתן תווית משמעותית לכל תקופה כזו הניתנת לפירוש אנושי. הדרך הרגילה היא להשתמש בביאורים אנושיים.
      1. מכיוון שהקלטות התנהגותיות לרוב ארוכות מדי לתיוג ידני בשלמותן, השתמש בשיטות למידת מכונה.
         הערה: למידה בפיקוח מקפידה על כללי תיוג מוגדרים מראש: ביאורים אנושיים מקצים תוויות לפלחי התנהגות נבחרים, המשמשים לאחר מכן לאימון מודלים של למידת מכונה או בינה מלאכותית לחיזוי תוויות על פני מערך הנתונים המלא. בעוד שגישה זו משפרת את היעילות של סיווג ההתנהגות, היא נותרת מוגבלת על ידי הקבוצה המוגבלת של תוויות הניתנות לפירוש אנושי, מגבלה משמעותית במיוחד כאשר עוסקים בהתנהגויות מורכבות ונטורליסטיות. כדי ללכוד את השונות העשירה של התנהגויות נטורליסטיות, פותחו שיטות סיווג התנהגות לא מפוקחות. גישות אלו מזהות קווי דמיון מהותיים בין מוטיבים התנהגותיים לאורך זמן ומקבצים אותם בתוך מרחבי תכונות נמוכים, מה שמאפשר פרשנות אנושית יעילה ובלתי משוחדת. בעיקרו של דבר, סיווג מפוקח מסתמך על תוויות אנושיות מוגדרות מראש כדי להנחות זיהוי התנהגות, בעוד שסיווג לא מפוקח חושף מבנים התנהגותיים סמויים ללא תיוג מוקדם, ומציע גמישות רבה יותר בלכידת דינמיקה נטורליסטית מורכבת.
      2. במסגרת ההתנהגות הנטורליסטית, זהו את המוטיבים ההתנהגותיים של שני העכברים באמצעות אטלס התנהגות (BeA)¹⁰ ואטלס התנהגות חברתית (SBeA)¹ ( איור 2E, איור 3E, איור 4E), שתיהן שיטות אשכולות לא מפוקחות המיועדות לפילוח התנהגותי. שיטות אלה מפרקות ומאגדות התנהגות של בעלי חיים למוטיבים תת-שניות המבוססים על הדינמיקה והמבנים ההיררכיים הפנימיים שלהן³⁴, ולאחר מכן מקשרות אותן לקטגוריות התנהגות מוגדרות.
   6. חלץ מוטיבים התנהגותיים של עכברים בודדים באמצעות BeA.
      1. כדי להפחית רעש, החל מסנן חציוני עם חלון זמן של 500 אלפיות השנייה. בצע יישור גוף באמצעות נקודות המפתח של בסיס הגב והזנב כדי להקל על פירוק של תנועות לא תנועתיות, בעוד שהגפה הקדמית הימנית, הגפה הקדמית השמאלית, הגפה האחורית הימנית והגפה האחורית השמאלית משמשות לנורמליזציה של גודל הגוף.
      2. לפירוק התנהגות, השתמש ב-39 קואורדינטות גוף מיושרות, כולל: אף (x, y, z), אוזן שמאל (x, y, z), אוזן ימין (x, y, z), צוואר (x, y, z), גפה קדמית שמאלית (x, y, z), גפה קדמית ימנית (x, y, z), גפה אחורית שמאלית (x, y, z), גפה אחורית ימנית (x, y, z), כפה קדמית שמאלית (x, y, Z), כפה קדמית ימנית (x, y, z), כפה אחורית שמאלית (x, y, z), כפה אחורית ימנית (x, y, z), גב (z) ובסיס זנב (x, z).
      3. הגדר את מדד ההפחתה הזמנית ל-5, עם רזולוציית אשכולות של 3. השתמש באשכולות ספקטרליים לאתחול, תוך שימוש בקרנל גאוס עם סיגמא רוחב פס של 30. הגדר את אורכי הפילוח המינימליים והמקסימליים ל-500 אלפיות השנייה ו-2000 אלפיות השנייה, בהתאמה.
      4. להטמעת מוטיב התנהגות, החל UMAP עם 30 השכנים הקרובים ביותר ומרחק מינימלי של 0.05. אשכול את המוטיבים באמצעות אשכולות היררכיים באמצעות הקישור של וורד והמרחק הזוגי האוקלידי כדי לשפר את יציבות הסיווג. המאגר של BeA נמצא בכתובת
      5. זהה מוטיבים התנהגותיים חברתיים באמצעות SBeA. הגדר את פרמטרי האתחול עבור SBeA כך שיהיו עקביים עם אלה המשמשים ב-BeA, עם השינויים הבאים: גודל חלון המסנן החציוני מוגדר ל-1000 אלפיות השנייה, אורך הפילוח המינימלי גדל ל-2000 אלפיות השנייה, ואורך הפילוח המרבי מורחב ל-5000 אלפיות השנייה לפירוק התנהגות חברתית.
      6. להטמעת מוטיבים יש להחיל גרעין גאוס עם סיגמא רוחב פס של 2. המספר הסופי של אשכולות התנהגות חברתית נע בין 16 (גבול תחתון) ל-280 (גבול עליון). בדוגמאות המוצגות, רק 16 האשכולות הגדולים ביותר משמשים למטרות הדגמה. המאגר של SBeA נמצא https://github.com/YNCris/SBeA_release/blob/main/README_SBeA_mapper.md.

4. מיפוי נתונים נוירו-אתולוגיים

1. הכן מערכי נתונים של מיפוי. בעקבות ההכנות הנ"ל, שבעה מערכי נתונים זמינים למיפוי נוירו-אתולוגי, כולל פעילויות עצביות, תנוחות נושא, תנוחות אובייקט, מרחקי גוף, מוטיבים של התנהגות סובייקט, מוטיבים של התנהגות אובייקטים ומוטיבים של התנהגות חברתית. ארגן קבצים אלה באופן ידני באופן הבא:
   נתיב נתונים # הנתיב לשמירת כל הנתונים
   ----\A-B-C-D-E-neu.mat # פעילויות עצביות
   ----\A-B-C-D-E-pose-tpm.mat # תנוחות נושא
   ----\A-B-C-D-E-pose-free.mat # תנוחות אובייקט
   ----\A-B-C-D-E-rel_dist.mat # מרחקי גוף
   ----\A-B-C-D-E-mov-tpm.mat # מוטיבים של התנהגות הנושא
   ----\A-B-C-D-E-mov-free.mat # מוטיבים של התנהגות אובייקט
   ----\A-B-C-D-E-sbea.mat # מוטיבים של התנהגות חברתית
   ההגדרות של השדות A, B, C, D ו- E זהות ל- 1.5.7. נתוני ההדגמה לשעתוק נמצאים https://doi.org/10.6084/m9.figshare.29606795.v1.
2. צור את ההטמעות של המיפוי באמצעות CEBRA.
   הערה: בהתחשב בכך ש-CEBRA משלבת גישות מונעות השערות ומונחות גילוי לבניית הטמעות, היא מתאימה היטב לחשיפת ייצוגים עצביים הקשורים למשתני עזר שונים (איור 5A).
   1. כדי להבטיח השוואה שיטתית של הטמעות על פני שיטות שונות, תקנן את הפרמטרים של דגמי CEBRA. ארכיטקטורת המודל משתמשת ב-10 הקיזוזים, עם גודל אצווה של 1024, קצב למידה של 0.0001 ופרמטר טמפרטורה של 1.
   2. הגדר את ממד הפלט ל-3, ובצע הדרכה למקסימום 15,000 איטרציות. השתמש במרחק הקוסינוס כמדד הדמיון, בעוד שהמשתנה המותנה מוגדר כדלתא הזמן עם היסט זמן של 10. השתמש בנתוני הפעילות העצבית כקלט, ובמשתני עזר כתוויות ליצירת הטמעות מפרקים.
3. להטמעה עצמית של פעילויות עצביות, החל את אותם פרמטרים של CEBRA, אך השתמש רק בנתוני פעילות עצבית כקלט.

Results

חקר ההתנהגות הטבעית מציג מורכבות רבה יותר בהשוואה לניסויים מבוססי ניסויים. ראשית, בתנאים טבעיים, גם לפעילות העצבית וגם להתנהגות אין קו בסיס קבוע. פעילויות אלה חוזרות על עצמן, כלומר הן מושפעות ממצבים קודמים, ולכן, יישור הופעתן של התנהגויות ספציפיות להשוואה של פעילות עצבית אינו מצליח לנתק את ההשפעות של מצבים נוירו-אתולוגיים קודמים. שנית, קידוד עצבי בהתנהגות טבעית מתרחש בעיקר ברמת האוכלוסייה ^4,5. השונות שנצפתה בתאי עצב בודדים היא משמעותית מספיק כדי להיחשב כרעש. כדי לאמת זאת, חלק זה ערך ניתוח מתאם בין פעילות עצבית לתנוחות התנהגותיות טבעיות (איור 2F, איור 3F, איור 4F). מטריצות מקדם המתאם שהתקבלו לא גילו התאמה ספציפית לנוירונים עם עקבות הפוזה. באופן ספציפי, מקדמי המתאם בין אותות עצביים ותנוחות נבדק, תנוחות אובייקט או מרחקים בין-גופיים נפלו כולם בטווח של -0.3 עד +0.3, הנחשבים בדרך כלל כמתאמים חלשים¹⁵ (איור 2G, איור 3G, איור 4G). ממצאים אלה מצביעים על כך שבתנאים נטורליסטיים, מידע הקשור לתנוחה אינו מקודד באופן ספציפי לנוירונים.

בהתחשב בגורמים אלה, מסגרת זו מציעה גישה אובייקטיבית ללכידה ומיפוי של נתונים נוירו-אתולוגיים ברמת האוכלוסייה העצבית. הדמיית mTPM מבטיחה שהשונות של נוירונים בודדים נשמרת ככל האפשר. בנוסף, השימוש בהערכת תנוחות מבוססת למידה עמוקה על ידי ADPT ושיטות פירוק התנהגות לא מפוקחות, כגון BeA ו-SBeA, מייצר משתני עזר עשירים, המאפשרים ל-CEBRA לפרש ביעילות את השונות בתוך אוכלוסיות עצביות.

דוגמאות אלה מדגימות כי הטמעות ה-CEBRA המשותפות קיימות בכל משתני העזר, כולל תנוחות נושא, תנוחות אובייקט, מרחקי גוף, מוטיבים של התנהגות סובייקט, מוטיבים של התנהגות אובייקטים ומוטיבים של התנהגות חברתית (איור 5A). על מנת לאמת את העקביות של מוטיבים התנהגותיים והטמעות עצביות על פני מפגשים או נבדקים, נעשה שימוש בניתוח Procrustes³⁵ על פני שלושה זוגות עכברים (איור 5B). בהתחשב בכך שהטמעות CEBRA מפוזרות על כדור יחידה, רק פרמטר הסיבוב בניתוח Procrustes הופעל. מכיוון שהטמעות CEBRA בהתנהגות טבעית חסרות קו בסיס ברור, חלק זה ביצע תחילה דגימת יישור מונחית תווית על ההטמעות ליישור, והבטיח נקודות עיגון עקביות לפני החלת ניתוח Procrustes. מבחינה ויזואלית, הטמעות CEBRA אלה מציגות מידה של עקביות מהותית, כאשר מרחק הגוף והמוטיבים החברתיים מראים את היישור הגבוה ביותר. זה מתאים לכימות של ה-RMSE לפני ואחרי יישור Procrustes (איור 5C). לאחר מכן, דיוק פענוח ההטמעה מושווה עבור תנוחות (איור 5D) ומוטיבים (איור 5E). בעוד שהייצוגים שלהם שונים, כל אחד מהם ניתן לפענוח בדיוק גבוה. למרות שפענוח RMSE של מרחק הגוף גבוה משמעותית מתנוחות הנושא והאובייקט, הוא לא יותר מדיוק המעקב של ADPT⁷.

כדי לחקור את המקורות של הטמעות מונעות השערות אלה, נוצרה הטמעה מאורגנת עצמית של פעילות עצבית באמצעות CEBRA (איור 5A, עמודה ימנית). צורת ההטבעה העצבית מורכבת יותר משאר הטמעות המפרקים, ומשלבת דפוסים מהטמעות מפרקים שונות. בנוסף, הדמיון בין הטמעות עצביות והטמעות מפרקים הושוו באמצעות טרנספורמציית Procrustes, ולאחר מכן הושוו קווי הדמיון שלהם בקוסינוס (איור 5F). הדמיון הקוסינוסי נגזר לדקה בין ההטבעות המיושרות על פני נקודות זמן מתאימות.

הטמעת התנוחה המשותפת של נבדק S1 נבחרה כבסיס להשוואות דמיון בהתבסס על התפקיד המבוסס היטב של S1 בקידוד תשומות סומטוסנסוריות מאורגנות עצמית³⁶. הטמעה זו משמשת כנקודת ייחוס בעלת משמעות ביולוגית להערכת האופן שבו משתנים אחרים - כגון מוטיבים הקשורים לאובייקטים - מיוצגים באותו מרחב עצבי. השוואות כאלה מאפשרות לנו להעריך את החוזק היחסי של קידוד לממדים התנהגותיים שונים ביחס לקו בסיס סומטוסנסורי הקשור לעצמו.

כאשר משווים את הדמיון הקוסינוסי של הטמעות עצביות עם נושא S1 מציב הטמעת מפרקים כקו הבסיס, מחקר זה מוצא כי הטמעות המפרקים עבור מוטיבים של אובייקטים נמוכות משמעותית. זה מצביע על כך שבמהלך 15 הדקות של אינטראקציה חברתית חופשית בדוגמה זו, הפעילויות העצביות S1 של העכבר הנבדק מקודדות בעיקר הן את התנהגותו והן את האינטראקציות החברתיות המתמשכות. בעוד שניתוח זה משמש כמקרה הדגמה, ניתן ליישם את אותה מסגרת מתודולוגית בקלות על חקירות פרטניות יותר, למשל, על ידי השוואת מבני הטמעה על פני תקופות זמן שונות כדי לחשוף שינויים דינמיים בקידוד עצבי.

איור 1: נוהל לאיסוף נתונים נוירו-אתולוגיים. (A) אינטגרציה של מכשירים. (ב) פעולת רישום הנתונים. (C) חילוץ אותות עצביים, הערכת תנוחות דו-ממדיות ושחזור מסלול גוף תלת-ממדי לאחר ההקלטה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: נתונים מעובדים מראש של עכבר 1 להמשך ניתוח. (A) פעילויות עצביות. (ב) תנוחות הנבדק. (C) תנוחת חפץ. (D) מרחק גוף. (ה) מוטיבים של התנהגות. מלמעלה למטה הם מוטיבים של נושא, אובייקט והתנהגות חברתית. (F) מטריצות מקדם המתאם בין פעילות עצבית לתנוחות. משמאל: מקדמי המתאם בין פעילות עצבית לתנוחות הנבדק. מרכז: מקדמי המתאם בין פעילות עצבית לתנוחות אובייקט. מימין: מקדמי המתאם בין פעילות עצבית למרחק הגוף. מקדמי המתאם הם בין כל עקבות נוירון וכל ממד תנוחה. (ז) ההתפלגות של מקדמי המתאם של F. מדדי הנוירונים ממוינים לפי מקדמי המתאם בין פעילות עצבית לתנוחות הנבדק. קיצורים: N & S = פעילות עצבית ותנוחות נושא, N & O = פעילות עצבית ותנוחות אובייקט, N & B = פעילות עצבית ומרחקי גוף, CC = מקדמי מתאם. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: נתונים מעובדים מראש של עכבר 2 להמשך ניתוח. (A) פעילויות עצביות. (ב) תנוחות הנבדק. (C) תנוחת חפץ. (D) מרחק גוף. (ה) מוטיבים של התנהגות. מלמעלה למטה הם מוטיבים של נושא, אובייקט והתנהגות חברתית. (F) מטריצות מקדם המתאם בין פעילות עצבית לתנוחות. משמאל: מקדמי המתאם בין פעילות עצבית לתנוחות הנבדק. מרכז: מקדמי המתאם בין פעילות עצבית לתנוחות אובייקט. מימין: מקדמי המתאם בין פעילות עצבית למרחק הגוף. מקדמי המתאם הם בין כל עקבות נוירון וכל ממד תנוחה. (ז) ההתפלגות של מקדמי המתאם של F. מדדי הנוירונים ממוינים לפי מקדמי המתאם בין פעילות עצבית לתנוחות הנבדק. קיצורים: N & S = פעילות עצבית ותנוחות נושא, N & O = פעילות עצבית ותנוחות אובייקט, N & B = פעילות עצבית ומרחקי גוף, CC = מקדמי מתאם. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: נתונים מעובדים מראש של עכבר 3 להמשך ניתוח. (A) פעילויות עצביות. (ב) תנוחות הנבדק. (C) תנוחת חפץ. (D) מרחק גוף. (ה) מוטיבים של התנהגות. מלמעלה למטה הם מוטיבים של נושא, אובייקט והתנהגות חברתית. (F) מטריצות מקדם המתאם בין פעילות עצבית לתנוחות. משמאל: מקדמי המתאם בין פעילות עצבית לתנוחות הנבדק. מרכז: מקדמי המתאם בין פעילות עצבית לתנוחות אובייקט. מימין: מקדמי המתאם בין פעילות עצבית למרחק הגוף. מקדמי המתאם הם בין כל עקבות נוירון וכל ממד תנוחה. (ז) ההתפלגות של מקדמי המתאם של F. מדדי הנוירונים ממוינים לפי מקדמי המתאם בין פעילות עצבית לתנוחות הנבדק. קיצורים: N & S = פעילות עצבית ותנוחות נושא, N & O = פעילות עצבית ותנוחות אובייקט, N & B = פעילות עצבית ומרחקי גוף, CC = מקדמי מתאם. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ניתוח הטמעות CEBRA של נתונים נוירו-אתולוגיים. (A) הטמעות CEBRA. משמאל לימין הם ההטמעה המשותפת של הפעילות העצבית S1 ותנוחות הנושא, ההטמעה המשותפת של הפעילות העצבית S1 ותנוחות האובייקט, ההטמעה המשותפת של הפעילות העצבית S1 ומרחקי הגוף בין שני בעלי חיים, ההטמעה המשותפת של הפעילות העצבית S1 ומוטיבים של התנהגות הנושא, ההטמעה המשותפת של פעילות עצבית S1 ומוטיבים של התנהגות אובייקטים, ההטמעה המשותפת של פעילות עצבית S1 ומוטיבים של התנהגות חברתית, וההטמעה העצבית של S1. (B) ניתוח Procrustes מיישר את ההטבעות לעיל. העיגולים האפורים מייצגים את זוג העכברים 1, המשמש כהטמעת הייחוס. סימני הפלוס הירוקים מייצגים זוג עכברים 2, והצלבים הכתומים מייצגים זוג עכברים 3, שניהם מיושרים לזוג עכבר 1. (C) שורש השגיאה הריבועית הממוצעת (RMSE) לפני (משמאל) ואחרי (מימין) יישור Procrustes (מבחן t מזווג, n=3, ממוצע ±-SEM). (D) ה-RMSE של שחזור תנוחות מהטמעות CEBRA (ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של Tukey, n=3, ממוצע ±-SEM). (E) הדיוק של שחזור מוטיבים מהטמעות CEBRA (ANOVA חד כיווני ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של Tukey, n=3, ממוצע ± SEM). (F) הדמיון הקוסינוסי בין הטמעות מפרקים להטמעה עצבית של S1 (ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של דנט, n=45, ממוצע ±-SEM). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

לא.	בעיה שנצפתה	סיבה סבירה	פתרונות אפשריים
1	אין חותמות זמן התנהגותיות	(1) כבלי SMA או BNC פגומים	(1) החלף כבלי SMA ו-BNC
		(2) חסר מנהל התקן USB-to-TTL	(2) התקן את מנהל ההתקן הפורה PL2303 USB
		(3) בחירת יציאת COM שגויה	(3) אמת את מספר יציאת ה-COM במנהל ההתקנים ועדכן אותו הן בסקריפט של תוכנת mTPM והן בסקריפט מצלמת ההתנהגות.
2	אין פלואורסצנטיות גלויה במהלך הרכבת mTPM	(1) חוסר ביטוי ויראלי	(1) השתמש בעכבר אחר
		(2) שדה ראייה שגוי	(2) התאם מחדש את שדה הראייה
		(3) כוח לייזר לא מספיק	(3) הגדל בהדרגה את עוצמת הלייזר
		(4) ג'ל קרבומר מיובש	(4) יש למרוח מחדש ג'ל קרבומר טרי
3	הדמיית mTPM מציגה מסך לבן לחלוטין	(1) דליפת אור	(1) עטפו מחדש את רדיד האלומיניום למיגון נכון
		(2) כוח לייזר לא מספיק	(2) הגדל בהדרגה את עוצמת הלייזר
		(3) סיבים מנותקים מראש ה-mTPM	(3) הכנס מחדש את הסיב לתוך ה-mTPM והדק את בורג הקיבוע
4	השמטת פריימים בסרטון התנהגותי	(1) תאורת סביבה נמוכה	(1) הגדל את תאורת הרקע
		(2) יציאת USB שגויה	(2) השתמש ביציאות USB 3.0 לפחות
		(3) ביצועי מחשב לא מספיקים	(3) השתמש במכשיר עם Intel i7-9700K ואילך, זיכרון RAM דו-ערוצי ואחסון SSD.
5	אין תנועה בעכברים המותקנים ב-mTPM	(1) שימוש חוזר באותו עכבר	(1) הימנע משימוש חוזר בעכברים תוך 3 ימים
		(2) שימוש מופרז בנייר אלומיניום	(2) השתמש בנייר כסף מינימלי הדרוש למיגון אור
		(3) מספר או נפח לא מספיק של בלוני הליום	(3) התאם את מספר הבלונים וניפוחם כדי לתמוך בסיבי ה-mTPM תוך מתן יציבה ותנועה טבעית של עכברים.
6	הערכת תנוחה דו-ממדית לא מדויקת	(1) מספר לא מספיק של מסגרות עם תוויות ידניות	(1) הוסף ביאורים ל-200 פריימים לפחות באופן הדרגתי
		(2) מודל ADPT לא מאומן	(2) הגדל את תקופות האימון בקובץ config.yaml של ADPT
7	שחזור תנוחות תלת מימד חריגות	(1) כיול לא תקין של המצלמה	(1) שפר את הכיול, הניגודיות וזווית ההטיה
		(2) קלט תנוחה דו-ממדית לא מדויק	(2) הגדל את מספר מסגרות לוח הסימון שנלכדו
			(3) פתור תחילה את בעיות התנוחה הדו-ממדית (ראה בעיה 6)
8	חוסר התאמה בין נתונים עצביים והתנהגותיים	(1) רצף שגוי של אתחול תוכנה	(1) התחל תמיד הקלטת mTPM לפני מצלמת התנהגות
		(2) מסגרות התנהגות שהושמטו	(2) לטפל בבעיות של נפילת מסגרת (ראה בעיה 4)
			(3) ודא שיש מספיק שטח דיסק זמין
9	גלישת זיכרון במהלך עיבוד BeA/SBeA	(1) משך הקלטה מוגזם	(1) פצל את ההקלטות למקטעים קצרים יותר (5-60 דקות), ולאחר מכן הפעל את BeA/SBeA
		(2) זיכרון RAM מוגבל של המערכת	(2) הגדל את מקדם ההפחתה הזמני (למשל, מ-5 ל-10) ב-BeA
			(3) שדרג זיכרון RAM ל-64 GB לפחות
10	CEBRA לא מצליח לפעול ב-GPU	(1) חוסר התאמה בין CUDA למנהל ההתקן של המעבד הגרפי	(1) אל תעקוב ישירות אחר המדריך להתקנת CUDA 11.3
		(2) גרסת PyTorch לא תואמת	(2) בדוק את דגם ה-GPU ואת גרסת מנהל ההתקן שלך (nvidia-smi)
			(3) התקן את גרסאות CUDA ו-PyTorch הנכונות בהתאם ולאחר מכן התקן את CEBRA באמצעות pip

טבלה 1: רשימת פתרון בעיות. להלן רשימה של 10 בעיות לא טריוויאליות שנתקלו בהן בעבר ופתרונות אפשריים.

Discussion

מסגרת הקלטה ופענוח נוירו-אתולוגית זו בנויה על מכשירים זמינים מסחרית, מה שמבטיח שניתן יהיה לטפל ברוב בעיות פתרון הבעיות על ידי החברות המתאימות. למרות זאת, מחקר זה מספק רשימה של בעיות שנתקלים בהן לעתים קרובות כדי להקל על הפניה ולייעל את פתרון הבעיות (טבלה 1). נגישות זו הופכת את המסגרת לידידותית יותר למשתמש עבור מצטרפים חדשים. בנוסף, המסגרת גמישה ביותר, עם סנכרון בין הקלטות עצביות והתנהגותיות המסתמכות על אותות TTL סטנדרטיים. כתוצאה מכך, זה פשוט לשלב מכשירי הקלטה פיזיולוגיים אחרים במסגרת במידת הצורך. הליכי הניתוח הבאים הם גם כלליים מספיק כדי לתמוך במערכות הקלטה עצביות והתנהגותיות מותאמות אישית לחלוטין.

העלות הכרוכה במסגרת זו, המבוססת על מכשירים ממוסחרים, גבוהה יחסית (~500,000 דולר), ובכך מטילה נטל כספי נוסף על המעבדה. בעוד שכלי קוד פתוח עדכניים כמו MINI2P¹³ ו-Anipose³⁷ יכולים לסייע בהפחתת עלויות החומרים, ניסיון זה מצביע על כך שההוצאות הכוללות יישארו דומות כאשר מביאים בחשבון את עלויות משאבי האנוש הכרוכות בניפוי באגים. מגבלה נוספת של מסגרת זו טמונה ביכולת הפרשנות של הטמעות CEBRA. כשיטה המבוססת על רשתות עצביות מלאכותיות, היא מאתגרת מטבעה לפרשנות. בעוד שדוגמה זו מספקת גישה פשוטה להסבר ההטמעות, יהיה צורך לפתח שיטות נוספות על בסיס כל מקרה לגופו עבור פרויקטים שונים. פתרון פוטנציאלי אחד לפרשנות נוספת של הטמעות CEBRA הוא יישום מערכות דינמיות³⁸. בנוסף, ניתן לפלח התנהגות טבעית לשלבים נפרדים, כגון אינטראקציות כאשר שני העכברים רחוקים או קרובים. שאלות מדעיות שונות עשויות לדרוש פיתוח של זרימות עבודה מותאמות אישית לניתוח נתונים.

בעוד שמערכת המצלמות הנוכחית mTPM + 3D נפרסת בזירה בשטח פתוח, היישום שלה אינו מוגבל להקשר התנהגותי ספציפי זה. האילוצים העיקריים נובעים מהקשירה הפיזית של מערכת ההדמיה, המגבילה את מידת הניידות של בעלי החיים, ושדה הראייה של מצלמת התלת מימד, המגביל את הנפח הניתן למעקב. ניתן לטפל בגורמים אלה באיטרציות עתידיות על ידי שילוב מודולי הדמיה אלחוטיים³⁹ או מערכי מצלמות מלכודת⁴⁰ כדי לאפשר פרדיגמות התנהגותיות מורכבות ונטורליסטיות יותר. יש לציין שגם מערכת ה-mTPM וגם מערך מצלמות התלת מימד מסוגלים לקלוט נתונים רציפים של 24 שעות^10,41, מה שהופך את הצינור כולו למתאים היטב למחקרי הקלטה התנהגותיים ועצביים בקנה מידה ארוך.

מחקר זה מאמץ גישה מונעת נתונים לחלוטין כדי לחקור את הקידוד העצבי של התנהגות ספונטנית, ולכן נמנע במכוון מהקצאת תוויות סמנטיות מוגדרות מראש למוטיבים התנהגותיים מקובצים. החלטה זו מושרשת במטרה לשמר את יכולת ההכללה של מסגרת מיפוי ההתנהגות העצבית, ולאפשר לה לפעול ללא תלות בקטגוריות התנהגותיות המוטלות על ידי הנסיין. קוראים המתעניינים ביכולת הפרשנות הביולוגית והסיווג המפוקח של מוטיבים התנהגותיים עשויים להתייחס לעבודות קודמות ^1,10, כמו גם למחקר שנערך לאחרונה⁴², שהשווה באופן שיטתי אשכולות מוטיבים לא מפוקחים עם התנהגויות מתויגות ידנית תוך שימוש באותה מסגרת אטלס התנהגות בסיסית. מחקרים אלה מספקים גם הדמיות נרחבות, כולל רצפי תנוחות תלת מימדיות, מסלולים והטמעות ברמת המוטיב, הזמינים דרך מאגרים ציבוריים. יחד, משאבים אלה מציעים תובנות משלימות לגבי המבנה הסמנטי של ההתנהגות תוך תמיכה בגישת הפענוח העצבי הגמישה והניתנת להכללה שאומצה כאן.

צינור עיבוד נתונים זה תוכנן מתוך מחשבה על מודולריות וגמישות, המאפשרים התאמה להגדרות ניסוי מגוונות ולהעדפות המשתמש. כל מרכיב עיקרי בצנרת, החל מהערכת תנוחות תלת מימדיות, אשכולות מוטיבים התנהגותיים ללא פיקוח, עיבוד מקדים של אותות עצביים ועד להטמעה נוירו-אתולוגית משותפת, מיושם כמודול עצמאי עם ממשקי קלט ופלט מוגדרים בבירור. ארכיטקטורה זו מאפשרת למשתמשים להחליף כלים או אלגוריתמים חלופיים בכל שלב (למשל, מסגרות שונות להערכת תנוחות ^6,22, אלגוריתמי אשכולות התנהגות^43,44 או מפענחים עצביים^45,46) מבלי לשבש את זרימת העבודה הכוללת. בעוד שרכיבים אלה נועדו להיות בעלי יכולת פעולה הדדית, מחקר זה לא בדק באופן ממצה את כל השילובים האפשריים של שיטות חלופיות, וייתכן שמשתמשים יצטרכו לבצע כוונון נוסף כדי להבטיח תאימות ביישומים הספציפיים שלהם. מודולריות כזו מאפשרת הן יכולת שחזור והן יכולת הרחבה, ומאפשרת להתאים את המסגרת למינים, לשיטות רישום או לפרדיגמות התנהגותיות מעבר לאלה המוצגות כאן. כדי לתמוך בשימוש קהילתי רחב יותר, מחקר זה מספק סקירה סכמטית וטבלת סיכום (איור 1, טבלת חומרים).

הגדרות הפרמטרים המשמשות עבור SBeA ו-CEBRA בצנרת זו מבוססות על שילוב של ערכי ברירת מחדל וכוונון אמפירי ספציפי להקשר ניסיוני זה, עכברים הנעים בחופשיות תחת אינטראקציה חברתית טבעית. פרמטרים אלה אומתו כדי לשחזר את כל התוצאות שהוצגו במחקר זה מבלי לדרוש התאמה נוספת. בעוד שמשתמשים עשויים לרצות לכוונן פרמטרים מסוימים כדי להתאים להגדרות הקלטה שונות או למשימות התנהגותיות, שינויים כאלה אינם נחוצים לשכפול צינור זה. למשתמשים העובדים בהקשרים אחרים, מומלץ לעיין בתיעוד ובספרות המקוריים עבור SBeA ו-CEBRA, שם ניתנים טווחי פרמטרים והדרכה ספציפית למשימה. מימוש זה משמש כתצורת ייחוס חזקה הניתנת ליישום או התאמה ישירה לפי הצורך.

ההתקדמות העיקרית של מסגרת זו טמונה ביישומה על בעלי חיים הנעים בחופשיות. ניתן להתאים מחקרים קודמים שנערכו עם בעלי חיים מקובעי ראש לתנאי תנועה חופשית במסגרת זו. לדוגמה, משימות כגון משימת Go/No-Go⁴⁷ ו-Two-Alternative Forced Choice⁴⁸ ניתנות לשינוי ולשילוב במסגרת זו בהתבסס על פרדיגמות התנהגות טבעיות. גישה זו מבטלת חפצים הנגרמים על ידי הגבלת ראש, ומאפשרת לחקור את הקשר בין משימה למצבי התנהגות טבעיים. מסגרת זו מספקת לבעלי חיים אוטונומיה רבה יותר בקבלת החלטות. הוא גם תומך במחקרי חוט השדרה בהקשרים נטורליסטיים, בשילוב שיטת הקלטת חוט השדרה mTPM⁴⁹. בנוסף, זה מקל על חקר התנהגות קבוצתית חופשית, תופעה שאינה אפשרית בהגדרות קבועות ראש. זרימת העבודה של ניתוח הנתונים מאפשרת לפרש את פעילות האוכלוסייה העצבית על פני משתנים מרובים, תוך שימוש בהטמעות כדי לחשוף את המורכבות של תפקוד המוח מאחורי אוכלוסיות עצביות.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מערכת הקלטת התנהגות תלת מימדית	BayONE סיינטיפיק	BA-3D-עכבר	מודול סנכרון משולב
בלון	אליאקספרס	כתובת אתר: https://tinyurl.com/3uex669s	כל בלון קל מספיק כדי לעוף כשהוא מלא בהליום. הבלונים הם בלוני נייר כסף כדוריים, בקוטר של כ-45 ס"מ, וכוללים שסתומים אטומים מעצמם. כתובת ה- URL מספקת דוגמה לבלונים.
ג'ל עיניים קרבומר	וידיסיק	ג'ל עיניים סיכה על בסיס Carbomer 980	10 גרם
חוט כותנה	אליאקספרס	כתובת אתר: https://tinyurl.com/ywu7u754	עבה וקל, קוטר 1-2 מ"מ. כתובת האתר מספקת דוגמה לחוט הכותנה.
מקדחה גולגולתית	RWD	78001	מקדחה של 0.8, 1.4 ו-2.1 מ"מ
מודול מצלמה מותאם אישית ניתן להגדרה	אינטל	RealSense D435	/
דבק מבני אקרילי בעל ביצועים גבוהים	הוטיאן	1320	490 מ"ל
עכבר להדמיה	התעלות מעל הוויווסקופ	כתובת אתר: https://en.tv-scope.com/	העכבר הזכר עם רקע C57BL/6J (בן 10 שבועות) שוכן בעכבר אחד לכל כלוב מתחת ל-12  h מחזור אור-חושך ב-22– 25&דק; ° C עם 40%– 70% לחות והורשה גישה למים ולמזון אד ליביטום. נגיפי AAV9-CaMKII-GCaMP6s הוזרקו לקליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית שלו (AP, − 0.60 מ"מ; ML, ומינוס; 2.40 מ"מ; DV, 2.00 מ"מ). במחקר שלנו, העכברים הוכנו על ידי TRANSCEND VIVOSCOPE כחלק משירות הכנת בעלי החיים המקצועי שלהם. שירות זה כולל הזרקת וירוסים, השתלת חלונות גולגולת והתקנת לוחות בסיס המותאמים במיוחד למערכת המיקרוסקופיה המיניאטורית הדו-פוטונית שלהם.
עכבר לאינטראקציה	בייוואן לאק	כתובת אתר: https://lac.bayonesci.com/	העכברים הזכרים עם רקע C57BL/6J (בני 10 שבועות) שוכנו ב-5 עכברים לכלוב מתחת ל-12  h מחזור אור-חושך ב-22– 25&דק; ° C עם 40– 70% לחות והורשו לגשת למים ולמזון אד ליביטום. כל הליכי הגידול והניסויים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים במכון שנזן לטכנולוגיה מתקדמת, האקדמיה הסינית למדעים.
מערכת הקלטה עצבית mTPM	התעלות מעל הוויווסקופ	סופרנובה-600	ה-SUPERNOVA-600 היא מערכת הדמיה דו-פוטונית זעירה משולבת במלואה עבור מכרסמים הנעים בחופשיות, כולל כל הרכיבים האופטיים וההקלטה החיוניים, אך לא כולל התקני גירוי חיצוניים. הוא צריך להכיל את מודול הסנכרון המשולב.