חקר אינטראקציות חלבון-גליקן: התקדמות בתהודה מגנטית גרעינית

אינטראקציות חלבון-גליקן הן בסיסיות למגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כולל זיהוי תא-תא, אפנון תגובה חיסונית ואינטראקציות פתוגן-מארח ^1,2. אינטראקציות מולקולריות אלו הן מאוד ספציפיות ודינמיות וממלאות תפקידים מכריעים במנגנונים פיזיולוגיים ופתולוגיים כאחד ^3,4,5. דוגמה קלאסית לאינטראקציות כאלה מתרחשת עם לקטינים, חלבונים המזהים ונקשרים באופן ספציפי לגליקנים. Cyanovirin-N (CVN), למשל, נחקר רבות כמודל ניסיוני בגלל יכולתו לקיים אינטראקציה בזיקה גבוהה עם אוליגוסכרידים גבוהים של מנוז ^5,6,7.

בנוסף לקטינים, חלבונים מגליקוזיליים רבים, כגון אינטגרינים, ממלאים גם תפקידים חיוניים בזיהוי ובאיתות תאי. אינטגרינים הם קולטנים טרנסממברניים שעוברים לעתים קרובות גליקוזילציה של יחידות המשנה שלהם, ומשפיעים על יציבותם וזיקתם לליגנדים, כולל גליקנים 5,8,9,10. עם זאת, האפיון המבני של אינטראקציות אלה נותר מאתגר בשל ההטרוגניות והגמישות הפנימית של גליקנים, מה שמסבך את הגישות המסורתיות של ביולוגיה מבנית. בהקשר זה, פיתוח מתודולוגיות מתקדמות המסוגלות ללכוד את האינטראקציות הללו בתמיסה הוא בעל ערך רב לתחום זה, במיוחד עבור גליקוביולוגיה^11,12.

ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR) התגלתה ככלי רב עוצמה לחקירת אינטראקציות חלבון-ליגנד ברמה האטומית. בניגוד לטכניקות אחרות, כגון קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ומיקרוסקופ אלקטרונים קריו, NMR מאפשר לחקור אינטראקציות ביומולקולריות בתנאים כמעט פיזיולוגיים, ומספק תובנות הן לגבי המבנה והן לגבי הדינמיקה. גמישות זו מאפשרת לחוקרים לווסת פרמטרים סביבתיים כגון pH (בדרך כלל בין 4.0-8.0), חוזק יוני (למשל, 0-500 מ"מ NaCl) וטמפרטורה (בדרך כלל 273-330 K), ובכך להתאים את התנאים לספציפיות של קומפלקסים של חלבון-גליקן. בנוסף, NMR מועיל במיוחד לניתוח אינטראקציות חולפות וחלשות, האופייניות לרוב לאירועי זיהוי חלבון-גליקן^13,14.

מספר טכניקות NMR שימשו כדי לחקור אינטראקציות חלבון-גליקן, תוך שימוש בגישות מבוססות חלבון וליגנד. מנקודת המבט של החלבון, טיטרציה של קוהרנטיות קוונטית יחידה הטרו-גרעינית (HSQC) נמצאת בשימוש נרחב למיפוי אתרי קשירה על ידי ניטור הפרעות בשינוי כימי עם הוספת ליגנד. ניסויי פיזור הרפיה מאפשרים לזהות תהליכי קונפורמציה וחילופי כימיקלים המתרחשים בסולם הזמן של מיקרו עד אלפית השנייה, ומספקים תובנות לגבי ההיבטים הדינמיים של זיהוי גליקן^15,16. טכניקות מבוססות חלבון אלו דורשות בדרך כלל ריכוזי דגימה בטווח של 50 מיקרומטר עד 2 מ"מ, תלוי ביציבות החלבון וביעילות התיוג^17,18.

טכניקות NMR מבוססות ליגנד מציעות מידע משלים על ידי התמקדות בשינויים בגליקן במהלך הקשירה. הפרש העברת רוויה (STD-NMR) שימושי במיוחד לזיהוי אפיטופים של גליקן המעורבים בזיהוי, מכיוון שהוא מרווה באופן סלקטיבי את אותות ה-NMR של אזורי ליגנד במגע הדוק עם החלבון^19,20. ליגנדי מים שנצפו באמצעות ספקטרוסקופיה שיפוע (WaterLOGSY)^21,22 וספקטרוסקופיה של אפקט אוברהאוזר גרעיני מועבר (Tr-NOESY) מספקים אמצעים נוספים להערכת קשירת ליגנד ושינויים קונפורמטיביים במהלך אינטראקציות²³. יתר על כן, ניסויי הרפיה של Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) מסייעים בזיהוי אינטראקציות חלשות וחולפות שקשה לזהות בשיטות קונבנציונליות²⁴. ניסויים מבוססי ליגנד מבוצעים לרוב בריכוזי חלבון של 10-50 מיקרומטר ועשויים לדרוש אופטימיזציה של זמני ערבוב ופרמטרי רוויה²⁵. יש לציין כי שיטות אלו יכולות להיות מוגבלות על ידי המסיסות הנמוכה של גליקנים או יחס האות לרעש הגרוע בעבודה עם ליגנדים קטנים.

יחד, שיטות NMR אלו מספקות מסגרת מקיפה להבהרת התכונות המבניות והדינמיות של אינטראקציות חלבון-גליקן. עם ההתקדמות המתמשכת באסטרטגיות רגישות ותיוג איזוטופי, טכניקה זו הופכת חיונית יותר ויותר בגליקוביולוגיה, ומציעה נקודות מבט חדשות על מנגנוני זיהוי מולקולרי עם יישומים פוטנציאליים בפיתוח תרופות וגילוי סמנים ביולוגיים. עם זאת, הצלחתן של גישות אלו תלויה בגורמים כמו הומוגניות מדגם, מורכבות גליקן ונוכחות של אזורים גמישים או לא מסודרים שעלולים להרחיב אותות NMR או לעכב את הפרשנות²⁶. תמ"ג היא שיטה רבת עוצמה לחקר אירועים חולפים, המהווה אתגר מרכזי בביולוגיה מבנית.

CVN מזהה שאריות מנוזיל המקושרות ל-α(1,2) הקיימות באוליגוסכרידים בעלי מנוז גבוה עם זיקות ננו-מולריות, 27,28,29. עם זאת, הוא מזהה בצורה גרועה את ה-D-מנוז החד-סוכר. בעבודה הנוכחית, חקרנו את האינטראקציה של CVN עם D-mannose כדרך להמחיש כיצד NMR חזק בהבנת אינטראקציות חולפות.

הערה: בצע את כל השלבים הכרוכים בתרביות חיידקים ותכשירי חיץ בהתאם לפרוטוקולי בטיחות ביולוגית מוסדיים. השתמש בציוד מגן אישי (PPE) ובעת טיפול בתרביות פתוחות או כימיקלים, עבוד בארון בטיחות ביולוגית או במכסה אדים כימי במידת הצורך.

1. ביטוי של ציאנובירין-N

1. הפוך תאי E. coli BL21 עם פלסמיד המקודד את גן ה-CVN המוחדר לווקטור pET26a.
2. לטפח את התאים ב-1 ליטר של סופר מרק (32 גרם טריפטון, 20 גרם תמצית שמרים, 5 גרם NaCl לליטר), בתוספת קנמיצין (50 מיקרוגרם/מ"ל), 0.5% (משקל/נפח) גלוקוז ו-1.6 מ"מ MgSO₄. דגירה תחת תסיסה מתמשכת ב-~250 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס.
3. לייצור ^{של 15}CVN עם תווית N, גדל את התאים במדיום מינימלי M9 מותאם תוך שימוש ^ב-15NH₄Cl כמקור החנקן היחיד.
   1. הכן 1 ליטר של מדיום מינימלי M9 על ידי ערבוב של 200 מ"ל של תמיסת מלחים סטרילית 5x M9 המכילה 64 גרם/ליטר של Na₂HPO₄, 15 גרם/ליטר של KH₂PO₄, 2.5 גרם/ליטר של NaCl, 5 גרם/ליטר של NH₄Cl.
   2. הוסף 2 מ"ל של 1 M MgSO₄ (0.22 מיקרומטר מעוקר מסנן), 0.1 מ"ל של 1 M CaCl₂ (0.22 מיקרומטר מעוקר מסנן), ו-4 גרם גלוקוז (ריכוז סופי 0.4%, מומס במים מזוקקים סטריליים ו-0.22 מיקרומטר מעוקר בפילטר).
   3. הביאו את הנפח הסופי ל-1 ליטר עם מים מזוקקים סטריליים.
      הערה: ניתן להוסיף תוספי מזון כגון חומצות אמינו או ויטמינים לפי הצורך.
4. עקוב אחר התרבית עד שהיא מגיעה לצפיפות אופטית (OD₆₀₀) של כ-1.2. לאחר מכן, הוסף איזופרופיל-בטא-D-תיוגלקטופירנוזיד (IPTG) לריכוז סופי של 1.0 מ"מ כדי לגרום לביטוי חלבון.
5. דגירה למשך 20 שעות לאחר האינדוקציה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
6. קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 7,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
7. בודד את השבר הפריפלזמי באופן הבא:
   1. השעו מחדש את כדורי התא ב-0.4 נפחים של 30 מ"מ Tris-HCl buffer (pH 8.0) המכילים 20% סוכרוז ו-1 מ"מ EDTA ודגרו בטמפרטורת החדר עם ניעור למשך 10 דקות.
   2. צנטריפוגה בטמפרטורה של 10,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   3. השעו מחדש את הכדורים המתקבלים ב-0.4 נפחים של מים מזוקקים קרים כקרח ודגרו על קרח עם ניעור למשך 10 דקות.
   4. שוב צנטריפוגה ב-10,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   5. אסוף את הסופרנטנט, המתאים לשבר הפריפלזמי, למיצוי חלבון.
      הערה: כל המאגרים חייבים להכיל קוקטייל מעכב פרוטאז כדי למנוע פירוק חלבון.

2. ניסויי תמ"ג

הערה: כל הניסויים נרכשו ב-14.1 T באמצעות בדיקה לגילוי תהודה משולשת ^{של 1}H/¹⁵N/¹³C (ראה טבלת חומרים) ב-298K.

1. ניסויים מבוססי ליגנד
   1. הכנת מדגם
      1. הכן שתי דגימות: אחת המכילה CVN ואחת ללא CVN (בקרת ליגנד בלבד). כל דגימה מכילה 600 מיקרוליטר של 80 מיקרומטר CVN במאגר נתרן פוספט (pH 7.4) המכיל 50 מ"מ NaCl.
      2. הוסף D-מנוז לריכוז סופי של 4 מ"מ.
      3. הוסף 5% (v/v) D₂O לכל דגימה.
      4. העבירו את הדגימה לצינור NMR בקוטר 5 מ"מ.
      5. השתמש בעודף טוחנת פי 50 של הליגנד ביחס לחלבון.
         הערה: עודף ליגנד בטווח של פי 10 עד פי 1000 מומלץ בדרך כלל, כאשר עודפים נמוכים יותר עדיפים לחלבונים קטנים.
   2. רכישה ספקטרלית למשימת D-מנוז
      1. רכוש ספקטרום 2D TOCSY ו-2D ^{1 H-13}C HMBC באמצעות רצפי פולסים סטנדרטיים:
         TOCSY: ספקטרוסקופיה רגישה לפאזה (TOCSY) עם פיסול עירור לדיכוי מים (DIPSI2ESGPPH).
         HMBC דו-ממדי: ^{1 H-13}C מתאם מרובה קשרים הטרו-גרעיני עם בחירת שיפוע ורכישה לא מנותקת (HMBCGPNDQF).
         הערה: ניסויים אלה בוצעו לצורך הקצאת D-מנוז אך אינם מוצגים, מכיוון שהקצאת הסטה כימית אינה במסגרת מחקר זה.
   3. מיפוי קשירת ליגנד באמצעות הפרעת הזזה כימית (CSP) של הליגנד
      1. להכנת הדגימה ורכישתה של ספקטרום ¹H-¹³C HSQC, הכינו תמיסה של 4 מ"מ של D-מנוז במאגר נתרן פוספט (pH 7.4), עם 50 מ"מ NaCl ו-5% D₂O. חלקו את התמיסה לשתי דגימות: אחת עם 80 מיקרומטר CVN ואחת ללא CVN (התייחסות ליגנד בלבד).
         הערה: ספקטרום זה ישמש לקביעת ה-CSP של D-מנוז בעת אינטראקציה עם CVN.
      2. להגדרה של ^פרמטרירכישה של 1 ^H-13C HSQC, השתמש ברצף הדופק הסטנדרטי HSQCETGPSI (בחירת שיפוע ורגישות ^{משופרת 1 H-13}C HSQC). הגדר את הפרמטרים הבאים לרכישה:
         תחום זמן (TD): 1024 × 128 נקודות מורכבות (מידות ¹H × ¹³C)
         רוחב ספקטרלי (SW): 10.0171 עמודים לדקה (6009.615 הרץ) עבור ¹H, 80 עמודים לדקה (12069.106 הרץ) עבור ¹³C
         תדרי ספק: 4.7 עמודים לדקה עבור ¹H, 75 עמודים לדקה עבור ¹³C
         - מספר סריקות: 448.
      3. חשב את ה- CSP באמצעות המשוואה הבאה:
         
         כאשר ומייצגים את הבדלי ההסטה הכימית בין D-מנוז בנוכחות CVN (איור 1A, מסומן באדום) לבין D-מנוז חופשי (איור 1B).
   4. מיפוי קשירת ליגנד דרך הפרש העברת הרוויה (STD)
      1. צור מערך נתונים חדש והגדר פרמטרים עבור ניסויי STD-NMR. ניתן ליישם שתי אסטרטגיות ניסיוניות: (i) הקרנה של תדרי רוויה שונים כדי לייעל את יחס האות לרעש; (ii) קביעת תדירות הרוויה ושינוי זמן הרוויה כדי להעריך את ההצטברות.
      2. הגדר ניסויי תמ"ג 1D ¹H באמצעות רצף הדופק zgpr. כוונו את הספקטרומטר ל-¹H, בצעו שימינג ומדדו פולס קשה של 90° (למשל, ~10 μs בהנחתה של -10.6 dB, שווה ערך ל-~11.482 W).
      3. מרכז את תדר המוביל ¹H בכ-4.7 עמודים לדקה, המתאים לאות המים.
      4. בחר את רצף הדופק STDDIFFESGP.3 והגדר את פרמטרי הרכישה באופן הבא:
         הגדר את הרוחב הספקטרלי בהתאם לדרישות המדגם.
         הגדר את עיכוב הסריקה (d1) ל-4 שניות.
         הגדר את זמן הרוויה (d20) על סמך הניסוי הרצוי.
         טען את FQ2LIST המכיל את תדר הרוויה מחוץ לתהודה (-40 עמודים לדקה) ואת תדרי התהודה כדי להרוות את אות החלבון בלבד.
         הערה: תדרי תהודה חייבים להתאים לפרוטונים חלבונים וחייבים להיות במרחק של לפחות 1000 הרץ מכל אות ליגנד כדי למנוע רוויה ישירה.
      5. בדוק את תדרי הרוויה הבאים בתהודה כדי לקבוע תנאים אופטימליים: -0.59 עמודים לדקה, 0.73 עמודים לדקה ו-8.1 עמודים לדקה (ראה איור 2A).
         הערה: 0.73 עמודים לדקה נבחר כתדר רוויה בתהודה, מכיוון שהוא סיפק את יחס האות לרעש הטוב ביותר. באמצעות תדר זה, גורם ההגברה של STD (A_STD) כומת כפונקציה של זמן הרוויה. לשם כך, ספקטרום STD נרכש בזמנים שונים של רוויה (0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 ו-4 שניות) כדי לבנות את עקומת הצטברות מחלות המין (איור 2B). ערכי A_STD המתאימים תווו לאחר מכן כפונקציה של זמן הרוויה (איור 2C), מה שמאפשר להעריך את היעילות של העברת הרוויה, שהיא פרופורציונלית לזמן ולקרבה של מימן הליגנד לחלבון. גורם_STD מוגדר כ:
         
         I_STD הוא ההבדל בעוצמת האות בין ספקטרום התהודה המופעל והכבוי, I₀ הוא עוצמת האות בספקטרום התהודה הלא-תהודה, [L]_T הוא ריכוז הליגנד הכולל, ו-[P] הוא ריכוז החלבון. נורמליזציה זו לוקחת בחשבון את השפעות הריכוז ומאפשרת השוואה בין תנאי ניסוי שונים. STD מסתמך על דיפוזיה של ספין ונפילה מולקולרית איטית כדי להעביר ביעילות רוויה מהחלבון לליגנד הקשור. חלבונים גדולים יותר (נפילה איטית) מאפשרים רוויה והתפשטות יעילה יותר של מגנטיזציה בתוך החלבון 19,30,31,32.
      6. הגדר את מספר הסריקות (ns) ל-64 וממוצע הניסוי l4 (לולאה 4) פעמים.
      7. חשב את המספר הכולל של סריקות כ: סה"כ סריקות = ns × l4. השתמש ב-32,768 נקודות מורכבות בממד הישיר (TD) עם רוחב ספקטרלי (SW) של 10.0171 עמודים לדקה (6,009.615 הרץ).
      8. הגדר את ההשהיה הבין-סריקה (d1) ל-4 שניות ואת זמן הרכישה (AQ) ל-2.7262976 שניות. עיכוב הרפיה כולל שווה ל-d1 + AQ.
      9. הגדר את דופק הרוויה באופן הבא: משך 50 אלפיות השנייה; צורה גאוס (עמ' 42); נשלט באמצעות תוכנית מעוצבת 9 (SP9).
      10. השתמש בגרסת רצף דופק STD הכוללת מסנן T₁ρ כדי לדכא אותות חלבון שיוריים. הגדר את זמן נעילת הסיבוב (d29) בהתבסס על המשקל המולקולרי של החלבון. עבור חלבונים גדולים יותר, השתמש בזמני נעילת ספין קטנים יותר (~20 אלפיות השנייה) ועבור חלבונים קטנים יותר, גדולים יותר (> 40 אלפיות השנייה).
          הערה: כל ספקטרום STD נרכש ב-599.93 מגה-הרץ (BF1). התאמה של d29 היא קריטית כדי למזער את הרקע של החלבון תוך שמירה על שלמות אות הליגנד. בצע אופטימיזציה של פרמטר זה באופן אמפירי במידת הצורך.
   5. מיפוי קשירת ליגנד באמצעות ¹H-R₂
      1. בחר את תוכנית הדופק CPMG_ESGP2D מהספרייה הסטנדרטית של Bruker. רצף זה מבוסס על ניסוי Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG), המשלב פיסול עירור לדיכוי מים³³.
      2. הגדר את הניסוי כרכישה דו-ממדית.
         הערה: זהו ניסוי פסאודו-דו-ממדי שבו רק הממד הישיר משמש למידע על הסטה כימית.
      3. הגדר את פרמטרי הרכישה באופן הבא:
         תחום זמן (TD): 32,768 נקודות מרוכבות בממד הישיר ¹H.
         (ט"ד1): 2 נקודות.
         רוחב ספקטרלי (SW): 7.9932 עמודים לדקה (4,795.396 הרץ).
         עיכוב בין-סריקה (d1): 4 שניות.
         תדר מוביל (o1): 4.7 עמודים לדקה (ממורכז באות מים).
         מספר סריקות (ns): 8.
         מספר סריקות דמה (ds): 4.
         עיכוב CPMG (d20): ≤1 אלפיות השנייה (כלומר, קצר מ-1⁄3 J_HH).
         מספר ממוצעים (TDav): 200.
      4. הפעל את הניסוי במשך 200 מחזורים של 8 סריקות כל אחד, וכתוצאה מכך הצטברות כוללת של 1,600 סריקות. התאם את רשימת המונה המשתנה (vclist) בהתאם לזמן הכולל הרצוי של מחזור CPMG (T_CPMG). כאן, נבחרו 2 מחזורים עבור T_CPMG=8 ms ו-200 מחזורים נבחרו עבור T_CPMG=800 ms.
      5. הפעל שני ניסויים ^{של 1}H-CPMG, אחד עבור הדגימה המכילה את החלבון (4 מ"מ D-מנוז ו-80 מיקרומטר CVN) והשני עבור D-מנוז חופשי (4 מ"מ D-מאנוז).
      6. שרטט את ספקטרום ^ה-1H עבור כל T_CPMGבאמצעות הפקודה efp (כפל אקספוננציאלי ואחריו התמרת פורייה ותיקון פאזה) או sinm (כפל סינוס מוסט ב-90°, SSB=2) ואחריו fp (התמרת פורייה ותיקון פאזה). התאם את פונקציית החלון בהתאם לאסטרטגיית העיבוד הטובה ביותר.
         הערה: בניסוי זה נעשה שימוש ב-sinm ו-fp. הסדרה הראשונה תהיה הספקטרום עם_{T CPMG} של 8 אלפיות השנייה (הראשונה ב-vclist),^והסדרה השנייה תהיה 800 אלפיות השנייה (שנייה ב-vclist). ספקטרום ^{ה-H המעובד}1 משורטט באיור 3.
      7. חשב את מנת ה-CPMG (Q) באמצעות משוואה 3.
         ​
2. ניסויים מבוססי חלבון
   1. הכנת מדגם
      1. הכן 600 מיקרוליטר של דגימה המכילה 436 מיקרומטר באופן אחיד ¹⁵CVN עם תווית N במאגר נתרן פוספט (pH 7.4) בתוספת 50 מ"מ NaCl ו-5% תחמוצת דאוטריום (D₂O). טיטרט D-מנוז לתוך הדגימה לריכוז סופי של 60 מ"מ. עבור הטיטרציה, השתמש בצינור NMR 5 מ"מ.
   2. הקצאת תהודה (שלב אימות אופציונלי)
      1. אשר את הקצאת ה-CVN החופשי בתמיסה באמצעות ערכי הסטה כימית שדווחו בעבר³⁴. רכוש את ספקטרום התהודה המשולש הבא: HNCO, HNCA, HNCACB ו-CBCACONH 35,36,37.
         הערה: ניסויים אלה משמשים רק לאימות ההקצאה ואינם מוצגים, מכיוון שהקצאת משמרת כימית אינה המטרה העיקרית של פרוטוקול זה.
   3. מיפוי הקישור של D-מנוז על CVN על ידי הפרעה כימית של החלבון
      1. רכוש ^{1 H-15}N ספקטרום HSQC של ¹⁵CVN עם תווית N ב-298 K. בצע טיטרציה על ידי הוספת D-מנוז כדי להגיע לריכוזים הסופיים הבאים: 0, 1, 2, 5, 10, 20, 40 ו-60 מ"מ.
      2. הגדר את ניסוי ^{1 H-15}N Fast-HSQC באמצעות רצף הפולסים הרגיש לפאזה של FHSQCF3GPPH מספריית הסטנדרטים של Bruker. השתמש בפרמטרים הבאים:
         תחום זמן (TD): 1024 × 140 נקודות מרוכבות בממדים ¹H ^ו-15N.
         רוחב ספקטרלי (SW): 16.0274 עמודים לדקה (9615.385 הרץ) בממד ¹H ו-34 עמודים לדקה (2067.119 הרץ) בממד ¹⁵N.
         תדר ספק: 4.7 עמודים לדקה (^{שעה אחת}) ו-119 עמודים לדקה (¹⁵N).
         מספר סריקות: 128.
      3. חשב את הפרעת ההיסט הכימי (Δδ) באמצעות המשוואה הבאה:
         
         היכן והם הבדלי ההסטה הכימית בין ה-CVN בנוכחות ובהיעדר D-מנוז (איור 4A).
         הערה: פקטור 10 מסביר את ההבדל ברוחב הספקטרלי בין מידות הפרוטון והחנקן.
      4. חשב את קבוע הדיסוציאציה (K_D) על ידי התוויית ערכי CSP עבור כל שארית כפונקציה של ריכוז D-מאנוז. התאם את הנתונים המתקבלים לאיזותרמית קשירה של אתר יחיד באמצעות המשוואה הבאה (5).
         משוואה 5
         כאשר [P_T] הוא ריכוז החלבון המשמש בטיטרציה (CVN), [P_T] הוא ריכוז הליגנד (D-mannose), ו-CSPmax הוא ה-CSP בריכוז הרוויה של הליגנד ו-CSPmin בהיעדר הליגנד.
   4. מיפוי הקישור של D-מנוז ל-CVN באמצעות מיקום ¹⁵N-R₂ של החלבון.
      1. מדוד את ^{ערכי 15}N-R₂ של השאריות הבודדות של CVN בהיעדר ונוכחות של 60 מ"מ D-מנוז. בצע את כל הניסויים ב-298 K.
      2. הגדר את ניסוי ¹⁵N-R₂ באמצעות רצף הדופק המבוסס על CPMG רגיש לפאזה HSQCT2ETF3GPSI3D מהספרייה הסטנדרטית של Bruker. השתמש בפרמטרים הבאים:
         תחום זמן (TD): 1024 × 128 נקודות מרוכבות בממדים ¹H ^ו-15N, עם 8 נקודות בממד הפסאודו.
         רוחב ספקטרלי (SW): 16.0274 עמודים לדקה (¹H; 9615.385 הרץ) ו-34 עמודים לדקה (¹⁵N; 2067.119 הרץ).
         תדר ספק: 4.7 עמודים לדקה (^{שעה אחת}) ו-119 עמודים לדקה (¹⁵N).
         מספר סריקות: 32. (v) רשימת מונים משתנים: 1, 8, 2, 6, 3, 5, 4 ו-7, המתאימים לעיכובים בהרפיה (_{T relax}) של 16.96, 135.68, 33.92, 101.76, 50.88, 84.96, 67.84 ו-118.72 אלפיות השנייה, בהתאמה.
      3. עבד את הספקטרום הפסאודו-תלת-ממדי כסדרה של ספקטרום הרפיית מתאם ¹H/¹⁵N דמוי HSQC באמצעות NMRPipe³⁸, בעקבות מדריך התוכנה (ראה טבלת חומרים לקישור למדריך).
      4. ייבא את הספקטרום המעובד לפלטפורמת ניתוח NMR מתאימה (למשל, CCPNMR³⁹). בחר את כל הספקטרום והחל את הכלי "עקוב אחר שינויי עוצמה". שרטט את העוצמה של כל שיא צולב כפונקציה של T_הרפיה והתאם את הדעיכה לפונקציה חד-מעריכית כדי לחלץ ¹⁵ערכי_{N-R 2} עבור כל שאריות.
      5. חשב את השגיאה הניסיונית מיחס האות לרעש של הספקטרום דמוי HSQC ב-67.84 אלפיות השנייה. עבדו אזור בספקטרום המכיל רעש בלבד והמירו אותו לקובץ טקסט בעזרת הפקודה הבאה:
         pipe2txt.tcl ./PROCs/ft/R2_67_84.ft2 > noise67_84.txt"
      6. קבע את סטיית התקן של אזור הרעש באמצעות תוכנה סטטיסטית (למשל, Origin(Pro), גרסה 2021). הגדר ערך זה כעוצמת הרעש I_רעש.
      7. חשב את שגיאת הניסוי עבור כל שאריות באמצעות המשוואה הבאה:
         
         הערה: חשוב להשתמש בשגיאת הניסוי ולא בשגיאת ההתאמה. שגיאת הניסוי מגדירה את גבולות הפרשנות כאשר משווים את ¹⁵N-R₂ בהיעדר ונוכחות של D-מאנוז.

איור 1: הפרעה בהסטה כימית של D-מנוז בנוכחות CVN. (A) ¹ספקטרום ^H-13C-HSQC של D-מנוז בנוכחות CVN. (B) ¹ספקטרום ^H-13C-HSQC של D-מנוז חופשי. התוויות בספקטרום מציגות כל אחת מהקצאות ההסטה הכימית ואת התצורה האנומרית המתאימה (α או β). התוויות באדום הן אלה שהוקצו לקונפורמציה המאוגדת, ואלה בשחור הן אלה שהוקצו לקונפורמציה החופשית. (C) סופרפוזיציה של ספקטרום ^{1 H-13}C-HSQC בנוכחות (ירוק) ובהיעדר (כחול) של CVN. (D) המבנה הכימי של α ו-β-D-mannose המדגיש את ה-CSP הנצפה, שחושב לפי משוואה (1). ערכי CSP מתוארים מתחת לעיגולים הירוקים. העיגול האדום מייצג את המימן β-אנומרי שנעלם בנוכחות CVN. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ספקטרום הפרש העברת רוויה (STD) של D-מנוז בנוכחות CVN. (A) מחלות מין הנרכשות בתדרי רוויה שונים: -0.59, 0.73 ו-8.1 ppm. (B) STD נרכש בזמני רוויה שונים: 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 ו-4 שניות. (C) מקדם הגברה STD (A_STD) מחושב לפי משוואה 2 כפונקציה של זמן הרוויה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ¹H-R₂ של D-מנוז בנוכחות ובהיעדר CVN. (A) ייצוג של ספקטרום D-mannose ¹H-CPMG הצפוי עבור קלסר ולא-מקשר שנרכש עם זמני הרפיה R₂ של 8 ו-800 אלפיות השנייה בהיעדר (למטה) ונוכחות (למעלה) של CVN. Q חושב לפי משוואה 3. בהיעדר אינטראקציה (Q ≈ 1), עוצמות האות נשארות דומות בשני זמני ההרפיה של הליגנד עם או בלי החלבון. עם הקישור (Q < 1), עוצמות האות יורדות עם הגדלת ההרפיה עבור הדגימה המכילה את החלבון. (B) ייצוג סכמטי של חילופי הכימיקלים בין מצבים חופשיים וקשורים של D-מאנוז. בהתאם לערכים היחסיים של הפרש ההיסט הכימי (Δω) וקבוע שער החליפין (k_ex = k_on + k_off), המערכת נופלת למשטרי חילופין איטיים, בינוניים או מהירים. (ג)¹ספקטרום H NMR של D-מנוז חופשי ו-D-מנוז בנוכחות CVN, המראה הבדלים בעוצמות האות בזמני הרפיה של 8 אלפיות השנייה ו-800 אלפיות השנייה. גורמי ה-Q המחושבים עבור מימנים ספציפיים (H_6β, H_3β, H_5α, H_4β) מוצגים, כאשר ערכי Q נמוכים יותר מצביעים על אינטראקציות חזקות יותר עם CVN ומזהים את אזורי הסוכר המעורבים בקשירה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ניתוח הפרעות הזזה כימית (CSP) החושף שאריות CVN המעורבות בקשירת D-מאנוז. (A) תרשימי עמודות המציגות את CSPs של אמיד עמודת השדרה (^{15 N-1}H) של CVN בעת טיטרציה עם D-מנוז בריכוזים של 10 מ"מ (למעלה) ו-60 מ"מ (למטה). הקווים האופקיים מציינים את ה-CSP הממוצע בתוספת סטיית תקן אחת או שתיים (av + sd, av + 2 sd), ששימשו כסף לזיהוי שאריות מופרעות משמעותית. (B) מיפוי של שאריות מופרעות באופן משמעותי על המבנה של CVN המורכב עם הדו-סוכר Manα1-2Manα (מזהה PDB: 1IIY⁴⁰). שאריות עם CSPs מעל סף av + 2 sd מודגשות באדום, ואלה שבין av + sd ל- av + 2 sd מוצגות בכחול. מולקולות Manα1-2Manα הדו-סוכריות מוצגות בכתום כדי לציין את מיקום הקישור שלהן. (C) עקומות קשירה נבחרות המייצגות CSPs כפונקציה של ריכוז D-מאנוז. הנתונים הותאמו על פי משוואה 5 כמודל קשירה של אתר יחיד כדי להעריך את K_D, וחשפו מגוון של זיקות, כאשר D44 מציג את האינטראקציה החזקה ביותר (K_D = 1.1 ± 0.35 mM) ו-E41 החלש ביותר (K_D = 35 ± 29 mM). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ניתוח של ¹⁵N-R2 עבור CVN חופשי וקשור ל-D-מאנוז. (א, ב) שיעורי הרפיה רוחבית (¹⁵N-R₂) נמדדו עבור כל שארית של CVN במצבים החופשיים (A) ו-(B) הקשורים ל-D-mannose. (C) הפרש בערכי R₂ (ΔR₂ = R₂^bound− R₂^חופשי) משורטט לכל שאריות. הקווים הכחולים והאדומים מייצגים סטיית תקן אחת ושתי סטיות תקן מהממוצע (av ± sd ו-av ± 2 sd), בהתאמה. שאריות עם ערכי ΔR₂ משמעותיים מסומנות. (D) מיפוי של ערכי ΔR₂ עבור המבנה של CVN מורכב עם הדו-סוכר Manα1-2Manα (מזהה PDB: 1IIY⁴⁰). שאריות עם ΔR₂ מעל או מתחת av± 2 sd מוצגות באדום; אלה שבין Av± SD ל-Av± 2 SD מוצגים בכחול. מולקולות D-מנוז מוצגות בכתום כדי לציין את מיקום הקישור שלהן. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

בעבודה הנוכחית הצגנו ניסויי NMR כדי לחקור אינטראקציות חלבון-גליקן. זיהוי מולקולרי של חלבון-גליקן עומד בבסיס תהליכים ביולוגיים רבים הכוללים את המטריצה החוץ-תאית (ECM), כולל ויסות הידבקות תאים, נדידה, התפשטות וצורות שונות אחרות של תקשורת תאית.

כאן, בחרנו לעבוד עם החד-סוכר D-מנוז, המתואר כקלסר חלש. המטרה הייתה לתאר שיטות למדידת אינטראקציות חולפות ולהדגיש את חשיבותן בהבהרת מנגנוני קשירה. שלוש גישות NMR שונות מבוססות ליגנד שימשו כדי לאפיין את אתרי האינטראקציה של הליגנד.

השיטה הראשונה כללה הערכת הפרעות השינוי הכימי (CSPs) של D-מנוז בנוכחות CVN. למטרה זו, רשמנו ספקטרום H-13C-HSQC של דגימה המכילה פי 50 עודף של D-מנוז ביחס ל-CVN (איור 1A) ושל D-מנוז חופשי בתנאי חיץ זהים (איור 1B). שינויים בהסטה כימית נצפו עבור שתי התצורות האנומריות (איור 1C). יש לציין כי התגלו הפרעות גדולות יותר עבור β-D-mannose, מה שמרמז על קשירה מועדפת ל-CVN.

עבור רוב המימנים של D-מנוז, נצפו שתי פסגות נפרדות בספקטרום בנוכחות CVN, המתאימות למצבים החופשיים (כחולים) והקשורים (ירוקים) (איור 1C). התנהגות זו אופיינית למשטר חילופין איטי (איור 3B), מה שמצביע על כך שהפרש ההסטה הכימית בין המצבים החופשיים והקשורים עבור כל פרוטון (Δω, ב-Hz) עולה על שער החליפין (kₑₓ = kמופעל + kכבוי). רק מימן אחד (H5β) הפגין משטר חילופי מהיר. בנוסף, לא נצפה CSP עבור הפרוטון האנומרי של α-D-mannose. לעומת זאת, לא זוהה שיא הצלב המתאים לפרוטון האנומרי של β-D-mannose, מה שעשוי לשקף חילופי ביניים עקב קשירה. המימנים המעורבים בקישור של שתי הצורות האנומריות מסוכמים באיור 1D.

הניסוי השני המבוסס על ליגנד שערכנו היה תמ"ג הפרש העברת רוויה (STD), שמתאים היטב לליגנדים שמחליפים בין המצבים הקשורים לחופשיים בסקאלה של מיקרו-שנייה. משטר חילופי זה מאפשר לבצע ניסויים עם עודף גדול של ליגנד ביחס לחלבון. במקרה שלנו, השתמשנו ב-4 מ"מ D-מנוז ו-80 מיקרומטר CVN, המקבילים לעודף טוחנת פי 50.

תוצאות STD השלימו את נתוני CSP-mannose. גרעיני המימן שהציגו את ערכיה-A STD הגבוהים ביותר היו קשורים ל-β-D-mannose (איור 2C), בהסכמה עם ניתוח CSP, שהראה הפרעות בולטות ב-H2β, H3β, H4β ו-H6β (איור 1D). מחלת מין משקפת את היעילות של העברת מגנטיזציה מהחלבון הרווי (CVN) לליגנד (D-mannose), בתיווך אינטראקציות דו-קוטביות בין הספינים הגרעיניים ¹H של שתי המולקולות. מכיוון שהעברה זו תלויה בקרבה המרחבית, צפויים ערכיA STD גבוהים יותר עבור פרוטוני D-מנוז הנמצאים במגע הדוק עם אתר הקישור של CVN.

דרך נוספת למפות את אתרי האינטראקציה על ליגנד היא על ידי הערכת שיעורי ההרפיה הרוחבית (1H-R2) של אטומי המימן שלו (איור 3B). 1הרפייתH-R 2 מתרחשת בעיקר באמצעות אינטראקציות דו-קוטביות עם גרעיני 1H שכנים באמצעות מסלולי הרפיה מרובים. עם קשירת ליגנד לחלבון, מוצגים מסלולי הרפיה חדשים בשל קרבתם של מימן חלבוני לאלו של הליגנד. מסלולים נוספים אלה מגבירים את יעילות ההרפיה, וכתוצאה מכך ערכי 1H-R2 מוגברים. גורם נוסף התורם לערכי 1H-R 2 גבוהים יותר הוא הגידול בזמן המתאם הסיבובי לכאורה (τc) בעת הכריכה. כאשר ליגנד קטן ומתגלגל במהירות מקיים אינטראקציה עם חלבון גדול יותר, ה-τc האפקטיבי שלו עולה (משוואה 7), מה שגם מקדם הרפיה רוחבית יעילה יותר, מה שמוביל לערכי 1H-R 2 גבוהים יותר שנצפו.

(משוואה 7)

היכן הוא זמן המתאם הסיבובי לכאורה והיכן ומתאים לזמן המתאם של הקומפלקס והליגנד, בהתאמה. בדרך כלל, , וכתוצאה מכך , כך שהליגנד מתנהג כמולקולה גדולה יותר עם ערכי 1H-R2 גבוהים. זמן המתאם לכאורה מושפע מהשברים המולאריים החופשיים הקשורים f וה-f של הליגנד. ככל שחסםf גדל, עולה, מה שמוביל להרפיה משופרת של 1H-R 2.

גורם תורם נוסף לעלייה ב-1H-R2 עם הקישור הוא התרומה מחילופי כימיקלים בין המצבים החופשיים והקשורים (Rex), מה שמעלה עוד יותר את קצב ההרפיה הרוחבית לכאורה, (משוואה 8).

Rex תלוי במשטר חילופי הכימיקלים להפעלה/כיבוי, כדלקמן (משוואות 9, 10 ו-11):

(משוואה 10)

(משוואה 11)

שער החליפין הוא kex = kon + koff, כאשר Δω הוא הפרש ההסטה הכימית בין המצב הקשור למצב החופשי של הליגנד (rad.s-1), ו-ρF ו-ρ B הן האוכלוסיות של המצבים החופשיים והקשורים של הליגנד, בהתאמה (איור 3B).

בתוצאות המיפוי של 1H-R2 (איור 3C), לא ראינו הבדלים משמעותיים בין פרוטוני הליגנד. רוב הפסגות נותרו ללא שינוי, כאשר R2 מנה (Q) קרובה ל-1, למעט Hβ4. הסבר אפשרי ל-Q ~1 הוא זיקת הקישור הנמוכה (כלומר, ρB קטן), בשילוב עם העובדה שפרוטוני הליגנד נמצאים במשטר החלפה איטי (איור 1A, איור 3A). בתנאים אלה, התרומה של חילופי כימיקלים Rex ל היא מינימלית, מכיוון ש-Rex במשטר ההחלפה האיטית אינו תלוי במונח מסדר שני, כגון Δω2 (משוואה 9).

השילוב של שלוש שיטות ה-NMR הללו הוא בעל ערך למיפוי אינטראקציות ליגנד-חלבון, מכיוון שהוא מספק מידע משלים באמצעות מנגנונים פיזיקליים מובחנים. CSP מזהה שינויים בסביבה הכימית המקומית, הבאים לידי ביטוי בהפרעות בהסטה כימית. מדידות 1H-R2 מבוססות CPMG מדווחות על ההשפעה של חופש הסיבוב של הליגנד והחלפה בין המצבים החופשיים והקשורים על הרפיה רוחבית. ה-STD מספק מידע על אינטראקציות דו-קוטביות ישירות בין הליגנד לחלבון, וכתוצאה מכך העברת מגנטיזציה מהחלבון הרווי לליגנד. הפרשנות המשולבת של שלוש הגישות הללו מציעה הבנה מקיפה יותר של אופי האינטראקציה.

עד כה מיפינו את התנהגות הקישור של הליגנד (D-mannose). לאחר מכן, נערכו ניסויי NMR מבוססי חלבון כדי למפות את אתר הקישור של D-מנוז ב-CVN. הגישה האינפורמטיבית הראשונה הייתה רכישת סדרה של ספקטרום HSQC 1 H-15N עם ריכוזים שונים של D-מאנוז. הפרעות ההיסט הכימי של 1H ו-15N (CSPs, משוואה (4)) הנגרמות על ידי הוספת ליגנד (D-mannose) רגישות מאוד לשינויים עדינים בסביבה הכימית. ההפרעה הגדולה ביותר התרחשה בריכוזים של D-מנוז עד 10 מ"מ (איור 4A, למעלה); עם זאת, שאריות מסוימות, במיוחד Gly2, הראו שינוי משמעותי ב-CSP עד 60 מ"מ D-מנוז (איור 4B, למטה).

כדי להבין את התנהגות הקישור של D-מנוז ב-CVN, ניתחנו את ה-CSPs המשמעותיים ביותר במבנה של CVN המורכב עם הדו-סוכר Manα1-2Manα40 (איור 4B). נצפה כי β הגדילים המורכבים משאריות I40, E41, N42, V43, D44 ו-G45 תואמים את אתר הקישור Manα1-2Manα בעל הזיקה הגבוהה שתואר קודם לכן. CSPs משמעותיים, כולל שאריות L1, G2, E10 ו-R24, זוהו גם ליד אתר הקישור בעל הזיקה הנמוכה. מעניין שאף אחד מאתרי הקישור הידועים של Manα1-2Manα לא הוגדר במלואו על ידי CSPs שנצפו. פירוש אפשרי אחד הוא ש-D-מאנוז, שהוא קטן יותר מ-Manα1-2Manα או אוליגוסכריד בעל מאנוז גבוה, אינו גדול מספיק כדי לתפוס את מלוא היקף אתר הקשירה. כתוצאה מכך, קשירתו מתרחשת בזיקה נמוכה יותר.

פרשנות זו מציעה כי D-מנוז נקשר באופן מועדף לשאריות בגדיל β (40-44) בתוך אתר הקישור בעל הזיקה הגבוהה ולשאריות L1, G2, E10 ו-R24 בתוך אתר הזיקה הנמוכה, אם כי רק באופן ארעי. אינטראקציה חולפת זו מפריעה גם לשאריות כגון H90 ו-W49, הממוקמות בממשק בין תחומי הזיקה הנמוכה (שאריות 1-39) והזיקה הגבוהה (שאריות 40-90) של CVN. תצפיות אלה מצביעות על כך שקשירת D-מנוז עשויה לגרום להפרעות בשאריות המרוחקות מאתרי הקישור המוגדרים היטב, בין אם על ידי קידום שינויים מבניים אלוסטריים או על ידי יצירת מתחמי מפגש חולפים.

האפשרות האחרונה מדגישה יתרון מרכזי של חקר אינטראקציות עם ליגנדים בעלי זיקה נמוכה. ספקטרוסקופיה של NMR מתאימה במיוחד לזיהוי אינטראקציות חולפות וזיקה נמוכה כאלה, מכיוון שהיא יכולה ללכוד הפרעות עדינות בשינוי כימי והשפעות העברת רוויה גם כאשר אוכלוסיית המצב הקשור נמוכה. תכונות אלו מאפשרות זיהוי של מתחמי מפגש ואירועי קשירה חלשים שאולי לא יהיו נגישים באמצעות טכניקות הדורשות היווצרות קומפלקס הדוקה או יציבה. בהקשר זה, NMR מספק תובנות מבניות ודינמיות חשובות המשתרעות מעבר לאתר הקישור המיידי41,42.

ניתחנו גם את האיזותרמיות המקשרות על ידי התוויית ה-CSPs של שאריות בודדות כפונקציה של ריכוז D-מנוז (איור 4C). יש לציין כי שאריות בתוך β הגדילים (40-44), היוצרות את אתר הקישור בעל הזיקה הגבוהה, הראוKD ממוצע של כ-7 מ"מ. ביניהם, שאריות D44 הראו זיקה גבוהה במיוחד, עם KD של 1.1 ± 0.35 מ"מ, מה שמעיד על תפקידו המשמעותי בקשירת ליגנד. זיקת הקישור שנצפתה עבור D-מנוז נמוכה בערך פי 5000 מזו שדווחה עבור הדו-סוכר Manα1-2Manα, שיש לו KD של 139 ננומטר באתר הזיקה הגבוהה ו-1.47 מיקרומטר באתר הזיקה הנמוכה40.

גישה נוספת ששימשה למיפוי אתר הקישור של D-mannose ב-CVN הייתה מדידה של 15שיעורי הרפיה של N-R2 בהיעדר (איור 5A) ונוכחות (איור 5B) של הליגנד. כדי להדגיש את השפעות הכריכה, חישבנו ערכי ΔR2 (איור 5C), המוגדרים כ - , ושקלנו את התפשטות השגיאה הניסויית משני התנאים. ניתוח זה מדגיש את החשיבות של הערכת אי הוודאות במדידה בעת פירוש נתוני NMR דינמיים.

שינויים ב-15N-R2 עם הוספת ליגנד יכולים להתרחש מכמה סיבות. עלייה ב-R2 עשויה לנבוע מ-τc הגבוה יותר של הקומפלקס או מתרומות קונפורמציה וחילופי כימיקלים (Rex) הנובעות משיווי המשקל עם הליגנד. לעומת זאת, ניתן להבחין גם בירידה ב-R2 . במקרים שבהם קשירת ליגנד עוקבת אחר מנגנון בחירה קונפורמציונלי, Rex יורד לעתים קרובות עם הוספת ליגנד, מה שמשקף דינמיקת חילופין מופחתת.

לכן, ניתן להשתמש בערכי ΔR2 חיוביים ושליליים החורגים משגיאת הניסוי המתפשטת כדי לזהות אזורים המעורבים בקשירת ליגנד.

ריכוז הליגנד הוא גורם קריטי נוסף בפירוש נתונים אלה. בריכוזים רוויים, הקישור נוטה לדכא תרומות קונפורמציה וחילופי כימיקלים, מה שמוביל להפחתה ב-Rex וכתוצאה מכך לערכי R2 קטנים יותר. בתנאים אלה, ספקי שירותי אינטרנט מגיעים בדרך כלל לערכים המרביים שלהם. לעומת זאת, בריכוזים תת-רוויים, יש שיווי משקל משמעותי של ליגנד, וכתוצאה מכך Rex מוגבר ומגיע לערכי ביניים של CSPs. יש לקחת בחשבון השפעות תלויות ריכוז אלה בעת ניתוח נתוני ΔR2 ו-CSP.

כדי להבין עוד יותר את התנהגות הקישור של D-מנוז ל-CVN, ניתחנו את השאריות המציגות את השינויים המשמעותיים ביותר ב-ΔR2 בהקשר של המבנה הקומפלקסי הדו-סוכר CVN-Manα1-2Manα (איור 5D). שאריות C58, R59, K74 ו-R76 הציגו ערכי ΔR2 בולטים ותואמים את אתר הקישור בעל הזיקה הגבוהה ל-Manα1-2Manα. בנוסף, שאריות F4, C8, R24, G27, G28, A92 ו-G96 הראו גם ΔR2 משמעותי והן חלק מאתר הקישור בעל הזיקה הנמוכה.

מעניין לציין שניתוח ΔR2 סיפק תובנות משלימות לאלו שהתקבלו מ-CSPs, והציע ראיות עצמאיות לאינטראקציות D-מנוז עם שני אתרי הקישור.

ראינו גם שינויים ב-ΔR2 בשאריות אחרות הממוקמות הרחק מאתרי הקישור הידועים. שאריות אלה נמצאות בעיקר ליד האזור המרכזי של החלבון, בממשק בין תחומי הזיקה הגבוהה והנמוכה (איור 5C). פרשנות מתקבלת על הדעת היא שקשירת D-מנוז גורמת לסידורים מבניים אלוסטריים עדינים. לחלופין, ההשפעות הנצפות עשויות לשקף אינטראקציות חולפות המהוות חלק ממכלול מפגש ראשוני במהלך זיהוי ליגנד.

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.