מאמר שיטה

חקר אינטראקציות חלבון-גליקן: התקדמות בתהודה מגנטית גרעינית

850 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68674

⸱

26 באוגוסט 2025

 ,  , 
1Institute of Medical Biochemistry Leopoldo de Meis (IBqM), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2National Center for Structural Biology and Bioimaging (CENABIO), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 3Laboratory of Connective Tissue, Clementino Fraga Filho University Hospital

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול מבוסס NMR זה חוקר אינטראקציות חלבון-גליקן חלשות באמצעות ציאנובירין-N ו-D-מאנוז. בשילוב שיטות זיהוי ליגנד וחלבון, הוא ממפה אתרי קשירה, מזהה השפעות אלוסטריות ומזהה קומפלקסים של מפגשים. הגישה מתארת הכנת דגימה וניתוח נתונים, ומציעה תובנות מבניות ודינמיות בעלות ערך עבור מנגנוני אבחון וזיהוי ספציפיים לגליקן.

תקציר

אינטראקציות חלבון-גליקן הן מרכזיות בתהליכים ביולוגיים רבים ומוכרות יותר ויותר כמטרות מבטיחות לאסטרטגיות אבחון במחלות זיהומיות, דלקתיות וניאופלסטיות. עם זאת, אפיון האינטראקציות הללו, במיוחד כאשר הן חלשות וחולפות, נותר מאתגר מבחינה טכנית. ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR) מציעה יתרונות ייחודיים לחקר אינטראקציות כאלה בתנאים כמעט פיזיולוגיים, ומספקת תובנות ברזולוציה אטומית לגבי היבטים מבניים ודינמיים כאחד. במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול NMR משולב שנועד לחקור אינטראקציות חלבון-גליקן בעלות זיקה נמוכה באמצעות הלקטין ציאנובירין-N הספציפי למאנוז והחד-סוכר D-מנוז כמערכת מודל. הפרוטוקול משלב גישות NMR מבוססות ליגנד וחלבון כדי למפות אתרי קשירה באופן מקיף ולזהות אירועי קשירה עדינים, כולל השפעות אלוסטריות פוטנציאליות או קומפלקסים של מפגש. השלבים הקריטיים של הפרוטוקול כוללים הכנת דגימה קפדנית, בקרה מדויקת של ריכוזים וסטנדרטיזציה ספקטרלית כדי להבטיח שחזור ואמינות נתונים. תמ"ג בתמיסה מאפשר זיהוי אינטראקציות חולפות שלעתים קרובות אינן נגישות בטכניקות אחרות. למרות שאינטראקציות חלשות חיוניות לחיים, קיימת הטיה בספרות לכיוון קומפלקסים בעלי זיקה גבוהה יותר, למרות שמתחמים בעלי זיקה נמוכה רלוונטיים בפונקציות ביולוגיות חשובות רבות, כגון העברת אותות ותקשורת תא-תא. טכניקה זו מספקת פלטפורמה רבת עוצמה לחקירת זיהוי חלבון-גליקן ועשויה לשמש כלי רב ערך לזיהוי סמני אבחון חדשים על בסיס אינטראקציות ספציפיות לגליקן.

מבוא

אינטראקציות חלבון-גליקן הן בסיסיות למגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כולל זיהוי תא-תא, אפנון תגובה חיסונית ואינטראקציות פתוגן-מארח 1,2. אינטראקציות מולקולריות אלו הן מאוד ספציפיות ודינמיות וממלאות תפקידים מכריעים במנגנונים פיזיולוגיים ופתולוגיים כאחד 3,4,5. דוגמה קלאסית לאינטראקציות כאלה מתרחשת עם לקטינים, חלבונים המזהים ונקשרים באופן ספציפי לגליקנים. Cyanovirin-N (CVN), למשל, נחקר רבות כמודל ניסיוני בגלל יכולתו לקיים אינטראקציה בזיקה גבוהה עם אוליגוסכרידים גבוהים של מנוז 5,6,7.

בנוסף לקטינים, חלבונים מגליקוזיליים רבים, כגון אינטגרינים, ממלאים גם תפקידים חיוניים בזיהוי ובאיתות תאי. אינטגרינים הם קולטנים טרנסממברניים שעוברים לעתים קרובות גליקוזילציה של יחידות המשנה שלהם, ומשפיעים על יציבותם וזיקתם לליגנדים, כולל גליקנים 5,8,9,10. עם זאת, האפיון המבני של אינטראקציות אלה נותר מאתגר בשל ההטרוגניות והגמישות הפנימית של גליקנים, מה שמסבך את הגישות המסורתיות של ביולוגיה מבנית. בהקשר זה, פיתוח מתודולוגיות מתקדמות המסוגלות ללכוד את האינטראקציות הללו בתמיסה הוא בעל ערך רב לתחום זה, במיוחד עבור גליקוביולוגיה11,12.

ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR) התגלתה ככלי רב עוצמה לחקירת אינטראקציות חלבון-ליגנד ברמה האטומית. בניגוד לטכניקות אחרות, כגון קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ומיקרוסקופ אלקטרונים קריו, NMR מאפשר לחקור אינטראקציות ביומולקולריות בתנאים כמעט פיזיולוגיים, ומספק תובנות הן לגבי המבנה והן לגבי הדינמיקה. גמישות זו מאפשרת לחוקרים לווסת פרמטרים סביבתיים כגון pH (בדרך כלל בין 4.0-8.0), חוזק יוני (למשל, 0-500 מ"מ NaCl) וטמפרטורה (בדרך כלל 273-330 K), ובכך להתאים את התנאים לספציפיות של קומפלקסים של חלבון-גליקן. בנוסף, NMR מועיל במיוחד לניתוח אינטראקציות חולפות וחלשות, האופייניות לרוב לאירועי זיהוי חלבון-גליקן13,14.

מספר טכניקות NMR שימשו כדי לחקור אינטראקציות חלבון-גליקן, תוך שימוש בגישות מבוססות חלבון וליגנד. מנקודת המבט של החלבון, טיטרציה של קוהרנטיות קוונטית יחידה הטרו-גרעינית (HSQC) נמצאת בשימוש נרחב למיפוי אתרי קשירה על ידי ניטור הפרעות בשינוי כימי עם הוספת ליגנד. ניסויי פיזור הרפיה מאפשרים לזהות תהליכי קונפורמציה וחילופי כימיקלים המתרחשים בסולם הזמן של מיקרו עד אלפית השנייה, ומספקים תובנות לגבי ההיבטים הדינמיים של זיהוי גליקן15,16. טכניקות מבוססות חלבון אלו דורשות בדרך כלל ריכוזי דגימה בטווח של 50 מיקרומטר עד 2 מ"מ, תלוי ביציבות החלבון וביעילות התיוג17,18.

טכניקות NMR מבוססות ליגנד מציעות מידע משלים על ידי התמקדות בשינויים בגליקן במהלך הקשירה. הפרש העברת רוויה (STD-NMR) שימושי במיוחד לזיהוי אפיטופים של גליקן המעורבים בזיהוי, מכיוון שהוא מרווה באופן סלקטיבי את אותות ה-NMR של אזורי ליגנד במגע הדוק עם החלבון19,20. ליגנדי מים שנצפו באמצעות ספקטרוסקופיה שיפוע (WaterLOGSY)21,22 וספקטרוסקופיה של אפקט אוברהאוזר גרעיני מועבר (Tr-NOESY) מספקים אמצעים נוספים להערכת קשירת ליגנד ושינויים קונפורמטיביים במהלך אינטראקציות23. יתר על כן, ניסויי הרפיה של Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) מסייעים בזיהוי אינטראקציות חלשות וחולפות שקשה לזהות בשיטות קונבנציונליות24. ניסויים מבוססי ליגנד מבוצעים לרוב בריכוזי חלבון של 10-50 מיקרומטר ועשויים לדרוש אופטימיזציה של זמני ערבוב ופרמטרי רוויה25. יש לציין כי שיטות אלו יכולות להיות מוגבלות על ידי המסיסות הנמוכה של גליקנים או יחס האות לרעש הגרוע בעבודה עם ליגנדים קטנים.

יחד, שיטות NMR אלו מספקות מסגרת מקיפה להבהרת התכונות המבניות והדינמיות של אינטראקציות חלבון-גליקן. עם ההתקדמות המתמשכת באסטרטגיות רגישות ותיוג איזוטופי, טכניקה זו הופכת חיונית יותר ויותר בגליקוביולוגיה, ומציעה נקודות מבט חדשות על מנגנוני זיהוי מולקולרי עם יישומים פוטנציאליים בפיתוח תרופות וגילוי סמנים ביולוגיים. עם זאת, הצלחתן של גישות אלו תלויה בגורמים כמו הומוגניות מדגם, מורכבות גליקן ונוכחות של אזורים גמישים או לא מסודרים שעלולים להרחיב אותות NMR או לעכב את הפרשנות26. תמ"ג היא שיטה רבת עוצמה לחקר אירועים חולפים, המהווה אתגר מרכזי בביולוגיה מבנית.

CVN מזהה שאריות מנוזיל המקושרות ל-α(1,2) הקיימות באוליגוסכרידים בעלי מנוז גבוה עם זיקות ננו-מולריות, 27,28,29. עם זאת, הוא מזהה בצורה גרועה את ה-D-מנוז החד-סוכר. בעבודה הנוכחית, חקרנו את האינטראקציה של CVN עם D-mannose כדרך להמחיש כיצד NMR חזק בהבנת אינטראקציות חולפות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: בצע את כל השלבים הכרוכים בתרביות חיידקים ותכשירי חיץ בהתאם לפרוטוקולי בטיחות ביולוגית מוסדיים. השתמש בציוד מגן אישי (PPE) ובעת טיפול בתרביות פתוחות או כימיקלים, עבוד בארון בטיחות ביולוגית או במכסה אדים כימי במידת הצורך.

1. ביטוי של ציאנובירין-N

  1. הפוך תאי E. coli BL21 עם פלסמיד המקודד את גן ה-CVN המוחדר לווקטור pET26a.
  2. לטפח את התאים ב-1 ליטר של סופר מרק (32 גרם טריפטון, 20 גרם תמצית שמרים, 5 גרם NaCl לליטר), בתוספת קנמיצין (50 מיקרוגרם/מ"ל), 0.5% (משקל/נפח) גלוקוז ו-1.6 מ"מ MgSO4. דגירה תחת תסיסה מתמשכת ב-~250 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס.
  3. לייצור של 15CVN עם תווית N, גדל את התאים במדיום מינימלי M9 מותאם תוך שימוש ב-15NH4Cl כמקור החנקן היחיד.
    1. הכן 1 ליטר של מדיום מינימלי M9 על ידי ערבוב של 200 מ"ל של תמיסת מלחים סטרילית 5x M9 המכילה 64 גרם/ליטר של Na2HPO4, 15 גרם/ליטר של KH2PO4, 2.5 גרם/ליטר של NaCl, 5 גרם/ליטר של NH4Cl.
    2. הוסף 2 מ"ל של 1 M MgSO4 (0.22 מיקרומטר מעוקר מסנן), 0.1 מ"ל של 1 M CaCl2 (0.22 מיקרומטר מעוקר מסנן), ו-4 גרם גלוקוז (ריכוז סופי 0.4%, מומס במים מזוקקים סטריליים ו-0.22 מיקרומטר מעוקר בפילטר).
    3. הביאו את הנפח הסופי ל-1 ליטר עם מים מזוקקים סטריליים.
      הערה: ניתן להוסיף תוספי מזון כגון חומצות אמינו או ויטמינים לפי הצורך.
  4. עקוב אחר התרבית עד שהיא מגיעה לצפיפות אופטית (OD600) של כ-1.2. לאחר מכן, הוסף איזופרופיל-בטא-D-תיוגלקטופירנוזיד (IPTG) לריכוז סופי של 1.0 מ"מ כדי לגרום לביטוי חלבון.
  5. דגירה למשך 20 שעות לאחר האינדוקציה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  6. קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 7,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  7. בודד את השבר הפריפלזמי באופן הבא:
    1. השעו מחדש את כדורי התא ב-0.4 נפחים של 30 מ"מ Tris-HCl buffer (pH 8.0) המכילים 20% סוכרוז ו-1 מ"מ EDTA ודגרו בטמפרטורת החדר עם ניעור למשך 10 דקות.
    2. צנטריפוגה בטמפרטורה של 10,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    3. השעו מחדש את הכדורים המתקבלים ב-0.4 נפחים של מים מזוקקים קרים כקרח ודגרו על קרח עם ניעור למשך 10 דקות.
    4. שוב צנטריפוגה ב-10,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    5. אסוף את הסופרנטנט, המתאים לשבר הפריפלזמי, למיצוי חלבון.
      הערה: כל המאגרים חייבים להכיל קוקטייל מעכב פרוטאז כדי למנוע פירוק חלבון.

2. ניסויי תמ"ג

הערה: כל הניסויים נרכשו ב-14.1 T באמצעות בדיקה לגילוי תהודה משולשת של 1H/15N/13C (ראה טבלת חומרים) ב-298K.

  1. ניסויים מבוססי ליגנד
    1. הכנת מדגם
      1. הכן שתי דגימות: אחת המכילה CVN ואחת ללא CVN (בקרת ליגנד בלבד). כל דגימה מכילה 600 מיקרוליטר של 80 מיקרומטר CVN במאגר נתרן פוספט (pH 7.4) המכיל 50 מ"מ NaCl.
      2. הוסף D-מנוז לריכוז סופי של 4 מ"מ.
      3. הוסף 5% (v/v) D2O לכל דגימה.
      4. העבירו את הדגימה לצינור NMR בקוטר 5 מ"מ.
      5. השתמש בעודף טוחנת פי 50 של הליגנד ביחס לחלבון.
        הערה: עודף ליגנד בטווח של פי 10 עד פי 1000 מומלץ בדרך כלל, כאשר עודפים נמוכים יותר עדיפים לחלבונים קטנים.
    2. רכישה ספקטרלית למשימת D-מנוז
      1. רכוש ספקטרום 2D TOCSY ו-2D 1 H-13C HMBC באמצעות רצפי פולסים סטנדרטיים:
        TOCSY: ספקטרוסקופיה רגישה לפאזה (TOCSY) עם פיסול עירור לדיכוי מים (DIPSI2ESGPPH).
        HMBC דו-ממדי: 1 H-13C מתאם מרובה קשרים הטרו-גרעיני עם בחירת שיפוע ורכישה לא מנותקת (HMBCGPNDQF).
        הערה: ניסויים אלה בוצעו לצורך הקצאת D-מנוז אך אינם מוצגים, מכיוון שהקצאת הסטה כימית אינה במסגרת מחקר זה.
    3. מיפוי קשירת ליגנד באמצעות הפרעת הזזה כימית (CSP) של הליגנד
      1. להכנת הדגימה ורכישתה של ספקטרום ¹H-¹³C HSQC, הכינו תמיסה של 4 מ"מ של D-מנוז במאגר נתרן פוספט (pH 7.4), עם 50 מ"מ NaCl ו-5% D2O. חלקו את התמיסה לשתי דגימות: אחת עם 80 מיקרומטר CVN ואחת ללא CVN (התייחסות ליגנד בלבד).
        הערה: ספקטרום זה ישמש לקביעת ה-CSP של D-מנוז בעת אינטראקציה עם CVN.
      2. להגדרה של פרמטרירכישה של 1 H-13C HSQC, השתמש ברצף הדופק הסטנדרטי HSQCETGPSI (בחירת שיפוע ורגישות משופרת 1 H-13C HSQC). הגדר את הפרמטרים הבאים לרכישה:
        תחום זמן (TD): 1024 × 128 נקודות מורכבות (מידות ¹H × ¹³C)
        רוחב ספקטרלי (SW): 10.0171 עמודים לדקה (6009.615 הרץ) עבור ¹H, 80 עמודים לדקה (12069.106 הרץ) עבור ¹³C
        תדרי ספק: 4.7 עמודים לדקה עבור ¹H, 75 עמודים לדקה עבור ¹³C
        - מספר סריקות: 448.
      3. חשב את ה- CSP באמצעות המשוואה הבאה:
        figure-protocol-1
        כאשר figure-protocol-2 ומייצגים figure-protocol-3 את הבדלי ההסטה הכימית בין D-מנוז בנוכחות CVN (איור 1A, מסומן באדום) לבין D-מנוז חופשי (איור 1B).
    4. מיפוי קשירת ליגנד דרך הפרש העברת הרוויה (STD)
      1. צור מערך נתונים חדש והגדר פרמטרים עבור ניסויי STD-NMR. ניתן ליישם שתי אסטרטגיות ניסיוניות: (i) הקרנה של תדרי רוויה שונים כדי לייעל את יחס האות לרעש; (ii) קביעת תדירות הרוויה ושינוי זמן הרוויה כדי להעריך את ההצטברות.
      2. הגדר ניסויי תמ"ג 1D ¹H באמצעות רצף הדופק zgpr. כוונו את הספקטרומטר ל-¹H, בצעו שימינג ומדדו פולס קשה של 90° (למשל, ~10 μs בהנחתה של -10.6 dB, שווה ערך ל-~11.482 W).
      3. מרכז את תדר המוביל ¹H בכ-4.7 עמודים לדקה, המתאים לאות המים.
      4. בחר את רצף הדופק STDDIFFESGP.3 והגדר את פרמטרי הרכישה באופן הבא:
        הגדר את הרוחב הספקטרלי בהתאם לדרישות המדגם.
        הגדר את עיכוב הסריקה (d1) ל-4 שניות.
        הגדר את זמן הרוויה (d20) על סמך הניסוי הרצוי.
        טען את FQ2LIST המכיל את תדר הרוויה מחוץ לתהודה (-40 עמודים לדקה) ואת תדרי התהודה כדי להרוות את אות החלבון בלבד.
        הערה: תדרי תהודה חייבים להתאים לפרוטונים חלבונים וחייבים להיות במרחק של לפחות 1000 הרץ מכל אות ליגנד כדי למנוע רוויה ישירה.
      5. בדוק את תדרי הרוויה הבאים בתהודה כדי לקבוע תנאים אופטימליים: -0.59 עמודים לדקה, 0.73 עמודים לדקה ו-8.1 עמודים לדקה (ראה איור 2A).
        הערה: 0.73 עמודים לדקה נבחר כתדר רוויה בתהודה, מכיוון שהוא סיפק את יחס האות לרעש הטוב ביותר. באמצעות תדר זה, גורם ההגברה של STD (ASTD) כומת כפונקציה של זמן הרוויה. לשם כך, ספקטרום STD נרכש בזמנים שונים של רוויה (0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 ו-4 שניות) כדי לבנות את עקומת הצטברות מחלות המין (איור 2B). ערכי ASTD המתאימים תווו לאחר מכן כפונקציה של זמן הרוויה (איור 2C), מה שמאפשר להעריך את היעילות של העברת הרוויה, שהיא פרופורציונלית לזמן ולקרבה של מימן הליגנד לחלבון. גורםSTD מוגדר כ:
        figure-protocol-4
        ISTD הוא ההבדל בעוצמת האות בין ספקטרום התהודה המופעל והכבוי, I0 הוא עוצמת האות בספקטרום התהודה הלא-תהודה, [L]T הוא ריכוז הליגנד הכולל, ו-[P] הוא ריכוז החלבון. נורמליזציה זו לוקחת בחשבון את השפעות הריכוז ומאפשרת השוואה בין תנאי ניסוי שונים. STD מסתמך על דיפוזיה של ספין ונפילה מולקולרית איטית כדי להעביר ביעילות רוויה מהחלבון לליגנד הקשור. חלבונים גדולים יותר (נפילה איטית) מאפשרים רוויה והתפשטות יעילה יותר של מגנטיזציה בתוך החלבון 19,30,31,32.
      6. הגדר את מספר הסריקות (ns) ל-64 וממוצע הניסוי l4 (לולאה 4) פעמים.
      7. חשב את המספר הכולל של סריקות כ: סה"כ סריקות = ns × l4. השתמש ב-32,768 נקודות מורכבות בממד הישיר (TD) עם רוחב ספקטרלי (SW) של 10.0171 עמודים לדקה (6,009.615 הרץ).
      8. הגדר את ההשהיה הבין-סריקה (d1) ל-4 שניות ואת זמן הרכישה (AQ) ל-2.7262976 שניות. עיכוב הרפיה כולל שווה ל-d1 + AQ.
      9. הגדר את דופק הרוויה באופן הבא: משך 50 אלפיות השנייה; צורה גאוס (עמ' 42); נשלט באמצעות תוכנית מעוצבת 9 (SP9).
      10. השתמש בגרסת רצף דופק STD הכוללת מסנן T1ρ כדי לדכא אותות חלבון שיוריים. הגדר את זמן נעילת הסיבוב (d29) בהתבסס על המשקל המולקולרי של החלבון. עבור חלבונים גדולים יותר, השתמש בזמני נעילת ספין קטנים יותר (~20 אלפיות השנייה) ועבור חלבונים קטנים יותר, גדולים יותר (> 40 אלפיות השנייה).
        הערה: כל ספקטרום STD נרכש ב-599.93 מגה-הרץ (BF1). התאמה של d29 היא קריטית כדי למזער את הרקע של החלבון תוך שמירה על שלמות אות הליגנד. בצע אופטימיזציה של פרמטר זה באופן אמפירי במידת הצורך.
    5. מיפוי קשירת ליגנד באמצעות 1H-R2
      1. בחר את תוכנית הדופק CPMG_ESGP2D מהספרייה הסטנדרטית של Bruker. רצף זה מבוסס על ניסוי Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG), המשלב פיסול עירור לדיכוי מים33.
      2. הגדר את הניסוי כרכישה דו-ממדית.
        הערה: זהו ניסוי פסאודו-דו-ממדי שבו רק הממד הישיר משמש למידע על הסטה כימית.
      3. הגדר את פרמטרי הרכישה באופן הבא:
        תחום זמן (TD): 32,768 נקודות מרוכבות בממד הישיר ¹H.
        (ט"ד1): 2 נקודות.
        רוחב ספקטרלי (SW): 7.9932 עמודים לדקה (4,795.396 הרץ).
        עיכוב בין-סריקה (d1): 4 שניות.
        תדר מוביל (o1): 4.7 עמודים לדקה (ממורכז באות מים).
        מספר סריקות (ns): 8.
        מספר סריקות דמה (ds): 4.
        עיכוב CPMG (d20): ≤1 אלפיות השנייה (כלומר, קצר מ-1⁄3 J_HH).
        מספר ממוצעים (TDav): 200.
      4. הפעל את הניסוי במשך 200 מחזורים של 8 סריקות כל אחד, וכתוצאה מכך הצטברות כוללת של 1,600 סריקות. התאם את רשימת המונה המשתנה (vclist) בהתאם לזמן הכולל הרצוי של מחזור CPMG (TCPMG). כאן, נבחרו 2 מחזורים עבור TCPMG=8 ms ו-200 מחזורים נבחרו עבור TCPMG=800 ms.
      5. הפעל שני ניסויים של 1H-CPMG, אחד עבור הדגימה המכילה את החלבון (4 מ"מ D-מנוז ו-80 מיקרומטר CVN) והשני עבור D-מנוז חופשי (4 מ"מ D-מאנוז).
      6. שרטט את ספקטרום ה-1H עבור כל TCPMGבאמצעות הפקודה efp (כפל אקספוננציאלי ואחריו התמרת פורייה ותיקון פאזה) או sinm (כפל סינוס מוסט ב-90°, SSB=2) ואחריו fp (התמרת פורייה ותיקון פאזה). התאם את פונקציית החלון בהתאם לאסטרטגיית העיבוד הטובה ביותר.
        הערה: בניסוי זה נעשה שימוש ב-sinm ו-fp. הסדרה הראשונה תהיה הספקטרום עםT CPMG של 8 אלפיות השנייה (הראשונה ב-vclist),והסדרה השנייה תהיה 800 אלפיות השנייה (שנייה ב-vclist). ספקטרום ה-H המעובד1 משורטט באיור 3.
      7. חשב את מנת ה-CPMG (Q) באמצעות משוואה 3.
        ​figure-protocol-5
  2. ניסויים מבוססי חלבון
    1. הכנת מדגם
      1. הכן 600 מיקרוליטר של דגימה המכילה 436 מיקרומטר באופן אחיד 15CVN עם תווית N במאגר נתרן פוספט (pH 7.4) בתוספת 50 מ"מ NaCl ו-5% תחמוצת דאוטריום (D2O). טיטרט D-מנוז לתוך הדגימה לריכוז סופי של 60 מ"מ. עבור הטיטרציה, השתמש בצינור NMR 5 מ"מ.
    2. הקצאת תהודה (שלב אימות אופציונלי)
      1. אשר את הקצאת ה-CVN החופשי בתמיסה באמצעות ערכי הסטה כימית שדווחו בעבר34. רכוש את ספקטרום התהודה המשולש הבא: HNCO, HNCA, HNCACB ו-CBCACONH 35,36,37.
        הערה: ניסויים אלה משמשים רק לאימות ההקצאה ואינם מוצגים, מכיוון שהקצאת משמרת כימית אינה המטרה העיקרית של פרוטוקול זה.
    3. מיפוי הקישור של D-מנוז על CVN על ידי הפרעה כימית של החלבון
      1. רכוש 1 H-15N ספקטרום HSQC של 15CVN עם תווית N ב-298 K. בצע טיטרציה על ידי הוספת D-מנוז כדי להגיע לריכוזים הסופיים הבאים: 0, 1, 2, 5, 10, 20, 40 ו-60 מ"מ.
      2. הגדר את ניסוי 1 H-15N Fast-HSQC באמצעות רצף הפולסים הרגיש לפאזה של FHSQCF3GPPH מספריית הסטנדרטים של Bruker. השתמש בפרמטרים הבאים:
        תחום זמן (TD): 1024 × 140 נקודות מרוכבות בממדים 1H ו-15N.
        רוחב ספקטרלי (SW): 16.0274 עמודים לדקה (9615.385 הרץ) בממד 1H ו-34 עמודים לדקה (2067.119 הרץ) בממד 15N.
        תדר ספק: 4.7 עמודים לדקה (שעה אחת) ו-119 עמודים לדקה (15N).
        מספר סריקות: 128.
      3. חשב את הפרעת ההיסט הכימי (Δδ) באמצעות המשוואה הבאה:
        figure-protocol-6
        היכן figure-protocol-7 והם figure-protocol-8 הבדלי ההסטה הכימית בין ה-CVN בנוכחות ובהיעדר D-מנוז (איור 4A).
        הערה: פקטור 10 מסביר את ההבדל ברוחב הספקטרלי בין מידות הפרוטון והחנקן.
      4. חשב את קבוע הדיסוציאציה (KD) על ידי התוויית ערכי CSP עבור כל שארית כפונקציה של ריכוז D-מאנוז. התאם את הנתונים המתקבלים לאיזותרמית קשירה של אתר יחיד באמצעות המשוואה הבאה (5).
        figure-protocol-9משוואה 5
        כאשר [PT] הוא ריכוז החלבון המשמש בטיטרציה (CVN), [PT] הוא ריכוז הליגנד (D-mannose), ו-CSPmax הוא ה-CSP בריכוז הרוויה של הליגנד ו-CSPmin בהיעדר הליגנד.
    4. מיפוי הקישור של D-מנוז ל-CVN באמצעות מיקום 15N-R2 של החלבון.
      1. מדוד את ערכי 15N-R2 של השאריות הבודדות של CVN בהיעדר ונוכחות של 60 מ"מ D-מנוז. בצע את כל הניסויים ב-298 K.
      2. הגדר את ניסוי 15N-R2 באמצעות רצף הדופק המבוסס על CPMG רגיש לפאזה HSQCT2ETF3GPSI3D מהספרייה הסטנדרטית של Bruker. השתמש בפרמטרים הבאים:
        תחום זמן (TD): 1024 × 128 נקודות מרוכבות בממדים 1H ו-15N, עם 8 נקודות בממד הפסאודו.
        רוחב ספקטרלי (SW): 16.0274 עמודים לדקה (1H; 9615.385 הרץ) ו-34 עמודים לדקה (15N; 2067.119 הרץ).
        תדר ספק: 4.7 עמודים לדקה (שעה אחת) ו-119 עמודים לדקה (15N).
        מספר סריקות: 32. (v) רשימת מונים משתנים: 1, 8, 2, 6, 3, 5, 4 ו-7, המתאימים לעיכובים בהרפיה (T relax) של 16.96, 135.68, 33.92, 101.76, 50.88, 84.96, 67.84 ו-118.72 אלפיות השנייה, בהתאמה.
      3. עבד את הספקטרום הפסאודו-תלת-ממדי כסדרה של ספקטרום הרפיית מתאם 1H/15N דמוי HSQC באמצעות NMRPipe38, בעקבות מדריך התוכנה (ראה טבלת חומרים לקישור למדריך).
      4. ייבא את הספקטרום המעובד לפלטפורמת ניתוח NMR מתאימה (למשל, CCPNMR39). בחר את כל הספקטרום והחל את הכלי "עקוב אחר שינויי עוצמה". שרטט את העוצמה של כל שיא צולב כפונקציה של Tהרפיה והתאם את הדעיכה לפונקציה חד-מעריכית כדי לחלץ 15ערכיN-R 2 עבור כל שאריות.
      5. חשב את השגיאה הניסיונית מיחס האות לרעש של הספקטרום דמוי HSQC ב-67.84 אלפיות השנייה. עבדו אזור בספקטרום המכיל רעש בלבד והמירו אותו לקובץ טקסט בעזרת הפקודה הבאה:
        pipe2txt.tcl ./PROCs/ft/R2_67_84.ft2 > noise67_84.txt"
      6. קבע את סטיית התקן של אזור הרעש באמצעות תוכנה סטטיסטית (למשל, Origin(Pro), גרסה 2021). הגדר ערך זה כעוצמת הרעש Iרעש.
      7. חשב את שגיאת הניסוי עבור כל שאריות באמצעות המשוואה הבאה:
        figure-protocol-10
        הערה: חשוב להשתמש בשגיאת הניסוי ולא בשגיאת ההתאמה. שגיאת הניסוי מגדירה את גבולות הפרשנות כאשר משווים את 15N-R2 בהיעדר ונוכחות של D-מאנוז.

figure-protocol-11
איור 1: הפרעה בהסטה כימית של D-מנוז בנוכחות CVN. (A) 1ספקטרום H-13C-HSQC של D-מנוז בנוכחות CVN. (B) 1ספקטרום H-13C-HSQC של D-מנוז חופשי. התוויות בספקטרום מציגות כל אחת מהקצאות ההסטה הכימית ואת התצורה האנומרית המתאימה (α או β). התוויות באדום הן אלה שהוקצו לקונפורמציה המאוגדת, ואלה בשחור הן אלה שהוקצו לקונפורמציה החופשית. (C) סופרפוזיציה של ספקטרום 1 H-13C-HSQC בנוכחות (ירוק) ובהיעדר (כחול) של CVN. (D) המבנה הכימי של α ו-β-D-mannose המדגיש את ה-CSP הנצפה, שחושב לפי משוואה (1). ערכי CSP מתוארים מתחת לעיגולים הירוקים. העיגול האדום מייצג את המימן β-אנומרי שנעלם בנוכחות CVN. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-12
איור 2: ספקטרום הפרש העברת רוויה (STD) של D-מנוז בנוכחות CVN. (A) מחלות מין הנרכשות בתדרי רוויה שונים: -0.59, 0.73 ו-8.1 ppm. (B) STD נרכש בזמני רוויה שונים: 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 ו-4 שניות. (C) מקדם הגברה STD (ASTD) מחושב לפי משוואה 2 כפונקציה של זמן הרוויה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-13
איור 3: 1H-R2 של D-מנוז בנוכחות ובהיעדר CVN. (A) ייצוג של ספקטרום D-mannose 1H-CPMG הצפוי עבור קלסר ולא-מקשר שנרכש עם זמני הרפיה R2 של 8 ו-800 אלפיות השנייה בהיעדר (למטה) ונוכחות (למעלה) של CVN. Q חושב לפי משוואה 3. בהיעדר אינטראקציה (Q ≈ 1), עוצמות האות נשארות דומות בשני זמני ההרפיה של הליגנד עם או בלי החלבון. עם הקישור (Q < 1), עוצמות האות יורדות עם הגדלת ההרפיה עבור הדגימה המכילה את החלבון. (B) ייצוג סכמטי של חילופי הכימיקלים בין מצבים חופשיים וקשורים של D-מאנוז. בהתאם לערכים היחסיים של הפרש ההיסט הכימי (Δω) וקבוע שער החליפין (kex = kon + koff), המערכת נופלת למשטרי חילופין איטיים, בינוניים או מהירים. (ג)1ספקטרום H NMR של D-מנוז חופשי ו-D-מנוז בנוכחות CVN, המראה הבדלים בעוצמות האות בזמני הרפיה של 8 אלפיות השנייה ו-800 אלפיות השנייה. גורמי ה-Q המחושבים עבור מימנים ספציפיים (H6β, H3β, H5α, H4β) מוצגים, כאשר ערכי Q נמוכים יותר מצביעים על אינטראקציות חזקות יותר עם CVN ומזהים את אזורי הסוכר המעורבים בקשירה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-14
איור 4: ניתוח הפרעות הזזה כימית (CSP) החושף שאריות CVN המעורבות בקשירת D-מאנוז. (A) תרשימי עמודות המציגות את CSPs של אמיד עמודת השדרה (15 N-1H) של CVN בעת טיטרציה עם D-מנוז בריכוזים של 10 מ"מ (למעלה) ו-60 מ"מ (למטה). הקווים האופקיים מציינים את ה-CSP הממוצע בתוספת סטיית תקן אחת או שתיים (av + sd, av + 2 sd), ששימשו כסף לזיהוי שאריות מופרעות משמעותית. (B) מיפוי של שאריות מופרעות באופן משמעותי על המבנה של CVN המורכב עם הדו-סוכר Manα1-2Manα (מזהה PDB: 1IIY40). שאריות עם CSPs מעל סף av + 2 sd מודגשות באדום, ואלה שבין av + sd ל- av + 2 sd מוצגות בכחול. מולקולות Manα1-2Manα הדו-סוכריות מוצגות בכתום כדי לציין את מיקום הקישור שלהן. (C) עקומות קשירה נבחרות המייצגות CSPs כפונקציה של ריכוז D-מאנוז. הנתונים הותאמו על פי משוואה 5 כמודל קשירה של אתר יחיד כדי להעריך את KD, וחשפו מגוון של זיקות, כאשר D44 מציג את האינטראקציה החזקה ביותר (KD = 1.1 ± 0.35 mM) ו-E41 החלש ביותר (KD = 35 ± 29 mM). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-15
איור 5: ניתוח של 15N-R2 עבור CVN חופשי וקשור ל-D-מאנוז. (א, ב) שיעורי הרפיה רוחבית (15N-R2) נמדדו עבור כל שארית של CVN במצבים החופשיים (A) ו-(B) הקשורים ל-D-mannose. (C) הפרש בערכי R2 (ΔR2 = R2bound− R2חופשי) משורטט לכל שאריות. הקווים הכחולים והאדומים מייצגים סטיית תקן אחת ושתי סטיות תקן מהממוצע (av ± sd ו-av ± 2 sd), בהתאמה. שאריות עם ערכי ΔR2 משמעותיים מסומנות. (D) מיפוי של ערכי ΔR2 עבור המבנה של CVN מורכב עם הדו-סוכר Manα1-2Manα (מזהה PDB: 1IIY40). שאריות עם ΔR2 מעל או מתחת av± 2 sd מוצגות באדום; אלה שבין Av± SD ל-Av± 2 SD מוצגים בכחול. מולקולות D-מנוז מוצגות בכתום כדי לציין את מיקום הקישור שלהן. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעבודה הנוכחית הצגנו ניסויי NMR כדי לחקור אינטראקציות חלבון-גליקן. זיהוי מולקולרי של חלבון-גליקן עומד בבסיס תהליכים ביולוגיים רבים הכוללים את המטריצה החוץ-תאית (ECM), כולל ויסות הידבקות תאים, נדידה, התפשטות וצורות שונות אחרות של תקשורת תאית.

כאן, בחרנו לעבוד עם החד-סוכר D-מנוז, המתואר כקלסר חלש. המטרה הייתה לתאר שיטות למדידת אינטראקציות חולפות ולהדגיש את חשיבותן בהבהרת מנגנוני קשירה. שלוש גישות NMR שונות מבוססות ליגנד שימשו כדי לאפיין את אתרי האינטראקציה של הליגנד.

...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ספקטרוסקופיה של תמ"ג מייצגת גישה רב-תכליתית לחקירת אינטראקציות חלבון-גליקן, במיוחד בגלל יכולתה לזהות אינטראקציות חלשות וחולפות, כמו אלה שנצפו בין CVN ל-D-מאנוז. הפרוטוקול המתואר כאן משלב שיטות NMR מבוססות ליגנד וחלבון, ומאפשר אפיון מקיף יותר של ממשק האינטראקציה.

השלבים הקריטיים של הפרוטוקול כוללים הכנת דגימות קפדנית עם בקרה מדויקת של ריכוזי החלבון והליגנד, סטנדרטיזציה של פרמטרים ספקטרליים ובחירה מתאימה של ניסויי NMR. יכולת השחזור של הנתונים תלויה מאוד ביציבות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

אנו מודים ל-Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear Jiri Jonas (CNRMN) על השימוש בספקטרומטרים של NMR. אנו אסירי תודה לד"ר קרול באולי על ששיתפה אותנו בהקצאות השינוי הכימי של CVN במתחם עם Manα1-2Manα. אנו מודים גם לסוכנויות המימון FAPERJ ו-CNPq.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
13C גלוקוזמעבדה איזוטופית של קמבריג'.CLM-481
15N אמוניום כלורידמעבדה איזוטופית של קמבריג'.NLM-467
סידן כלוריסיגמא-אולדריץ'C4901
קוקטל מעכב פרוטאזסיגמא-אולדריץ'4693159001
D2Oמעבדה איזוטופית של קמבריג'.DLM-4
די-מנוזסיגמא-אולדריץ'M2069-5G
מגנזיום כלורידסיגמא-אולדריץ'M8266
NMRPipeקישור למדריך התוכנה: https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/demo.html
אשלגן כלורי (K2HPO4)סיגמא-אולדריץ'עמ' 3786
אשלגן כלורי (KCl)סיגמא-אולדריץ'עמ' 3911
אשלגן כלורי (KH2PO4)סיגמא-אולדריץ'עמ' 0662
שפופרת ShigemiברוקרZ1Z10684A
נתרן כלורי (NaCl)סיגמא-אולדריץ'S9625
נתרן פוספט (Na2HPO4)סיגמא-אולדריץ'567545
נתרן פוספט (NaH2PO4)סיגמא-אולדריץ'S97263
ספקטרומטר Bruker 600 מגה-הרץברוקר
ספקטרומטר Bruker 800 מגה-הרץברוקר
טיאמיןסיגמא-אולדריץ'T1270
בדיקת TXI תהודה משולשתברוקר
טריפטוןסיגמא-אולדריץ'93657
תמצית שמריםסיגמא-אולדריץ'Y1625

מקורות

  1. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2017).
  2. van Kooyk, Y., Rabinovich, G. A. Protein-glycan interactions in the control of innate and adaptive immune responses. Nat. Immunol. 9 (6), 593-601 (2008).
  3. Gagneux, P., Hennet, T., Varki, A. Biological functions of glycans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2022).
  4. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2017).
  5. He, M., Zhou, X., Wang, X. Glycosylation: Mechanisms, biological functions and clinical implications. Signal Transduct. Target. Ther. 9 (1), 194(2024).
  6. Maier, I., Kontaxis, G., Zimmermann, C., Steininger, C. Cyanovirin-N binding to N-acetyl-d-glucosamine requires carbohydrate-binding sites on two different protomers. Biochemistry. 63 (10), 1270-1277 (2024).
  7. Muñoz-Basagoiti, J., et al. Cyanovirin-N binds to select SARS-CoV-2 spike oligosaccharides outside of the receptor binding domain and blocks infection by SARS-CoV-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 120 (10), e2214561120(2023).
  8. Margraf-Schönfeld, S., Böhm, C., Watzl, C. Glycosylation affects ligand binding and function of the activating natural killer cell receptor 2B4 (CD244) protein. J. Biol. Chem. 286 (27), 24142-24149 (2011).
  9. Thomas, D., Rathinavel, A. K., Radhakrishnan, P. Altered glycosylation in cancer: A promising target for biomarkers and therapeutics. Biochim. Biophys. Acta Rev. Cancer. 1875 (1), 188464(2021).
  10. Vasconcelos, A. A., Estrada, J. C., David, V., Wermelinger, L. S., Almeida, F. C. L., Zingali, R. B. Structure-function relationship of the disintegrin family: Sequence signature and integrin interaction. Front. Mol. Biosci. 8 (December), 1-20 (2021).
  11. Gimeno, A., Valverde, P., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Glycan structures and their interactions with proteins. A NMR view. Curr. Opin. Struct. Biol. 62, 22-30 (2020).
  12. Haslam, S. M., et al. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2022).
  13. Angulo, J., et al. NMR investigations of glycan conformation, dynamics, and interactions. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 144 - 145, 97-152 (2024).
  14. Bewley, C. A., Shahzad-Ul-Hussan, S. Characterizing carbohydrate-protein interactions by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biopolymers. 99 (10), 796-806 (2013).
  15. Quintana, J. I., Atxabal, U., Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Exploring multivalent carbohydrate-protein interactions by NMR. Chem. Soc. Rev. 52 (5), 1591-1613 (2023).
  16. Pomin, V. H., Wang, X. Glycosaminoglycan-protein interactions by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Molecules. 23 (9), 2314(2018).
  17. Walinda, E., Morimoto, D., Sugase, K. Overview of relaxation dispersion NMR spectroscopy to study protein dynamics and protein-ligand interactions. Curr. Protoc. Protein Sci. 92 (1), e57(2018).
  18. Altincekic, N., et al. Large-scale recombinant production of the SARS-CoV-2 proteome for high-throughput and structural biology applications. Front. Mol. Biosci. 8, 89(2021).
  19. Mayer, M., Meyer, B. Characterization of ligand binding by saturation transfer difference NMR spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 38 (12), 1784-1788 (1999).
  20. Haselhorst, T., Lamerz, A. C., von Itzstein, M. Saturation transfer difference NMR spectroscopy as a technique to investigate protein-carbohydrate interactions in solution. Methods Mol. Biol. 534, 375-386 (2009).
  21. Dalvit, C., Fogliatto, G. P., Stewart, A., Veronesi, M., Stockman, B. WaterLOGSY as a method for primary NMR screening: Practical aspects and range of applicability. J. Biomol. NMR. 21 (4), 349-359 (2001).
  22. Dalvit, C., Fasolini, M., Flocco, M., Knapp, S., Pevarello, P., Veronesi, M. Spectroscopy experiments: Detection of high-affinity ligands. J. Med. Chem. 45, 2610-2614 (2002).
  23. Lucas, L. H., Yan, J., Larive, C. K., Zartler, E. R., Shapiro, M. J. Transferred nuclear Overhauser effect in nuclear magnetic resonance diffusion measurements of ligand-protein binding. Anal. Chem. 75 (3), 627-634 (2003).
  24. Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 121 (10), 2331-2332 (1999).
  25. Di Carluccio, C., et al. Investigation of protein-ligand complexes by ligand-based NMR methods. Carbohydr. Res. 503, 108313(2021).
  26. Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Structural analysis of glycans. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2009).
  27. Driessen, N. N., et al. Cyanovirin-N inhibits mannose-dependent Mycobacterium-C-type lectin interactions but does not protect against murine tuberculosis. J. Immunol. 189 (7), 3585-3592 (2012).
  28. Botos, I., et al. Structures of the complexes of a potent anti-HIV protein cyanovirin-N and high mannose oligosaccharides. J. Biol. Chem. 277 (37), 34336-34342 (2002).
  29. Shenoy, S. R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: Calorimetric and NMR characterization. Chem. Biol. 9 (10), 1109-1118 (2002).
  30. Mayer, M., Meyer, B. Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor. J. Am. Chem. Soc. 123 (25), 6108-6117 (2001).
  31. Meyer, B., Peters, T. NMR spectroscopy techniques for screening and identifying ligand binding to protein receptors. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (8), 864-890 (2003).
  32. Marchetti, R., et al. 34;Rules of engagement" of protein-glycoconjugate interactions: A molecular view achievable by using NMR spectroscopy and molecular modeling. Chem. Open. 5 (4), 274-296 (2016).
  33. Carr, H. Y., Purcell, E. M. Effects of diffusion on free precession in nuclear magnetic resonance experiments. Phys. Rev. 94 (3), 630-638 (1954).
  34. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Manα1-2Manα complex: Structural basis for high-affinity carbohydrate-mediated binding to gp120. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  35. Weisemann, R., Rüterjans, H., Bermel, W. 3D triple-resonance NMR techniques for the sequential assignment of NH and 15N resonances in 15N- and 13C-labelled proteins. J. Biomol. NMR. 3 (1), 113-120 (1993).
  36. Muhandiram, D. R., Kay, L. E. Gradient-enhanced triple-resonance three-dimensional NMR experiments with improved sensitivity. J. Magn. Reson. B. 103 (3), 203-216 (1994).
  37. Whitehead, B., Craven, C. J., Waltho, J. P. Double and triple resonance NMR methods for protein assignment. Methods Mol. Biol. 60, 29-52 (1997).
  38. Delaglio, F., Grzesiek, S., Vuister, G. W., Zhu, G., Pfeifer, J., Bax, A. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  39. Skinner, S. P., et al. Structure calculation, refinement and validation using CcpNmr Analysis. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 71 (Pt 1), 154-161 (2015).
  40. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Manα1-2Manα complex. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  41. Sanches, K., Caruso, I. P., Almeida, F. C. L., Melo, F. A. The dynamics of free and phosphopeptide-bound Grb2-SH2 reveals two dynamically independent subdomains and an encounter complex with fuzzy interactions. Sci. Rep. 10 (1), 1-13 (2020).
  42. Almeida, F. C. L., Sanches, K., Caruso, I. P., Melo, F. A. NMR relaxation dispersion experiments to study phosphopeptide recognition by SH2 domains:the Grb2-SH2-phosphopeptide encounter complex. SH2 Domains. 2705, 135-151 (2023).
  43. Huang, R., Bonnichon, A., Claridge, T. D. W., Leung, I. K. H. Protein-ligand binding affinity determination by the WaterLOGSY method: An optimised approach considering ligand rebinding. Sci. Rep. 7 (March), 1-6 (2017).
  44. Caruso, I. P., et al. Insights into the specificity for the interaction of the promiscuous SARS-CoV-2 nucleocapsid protein N-terminal domain with deoxyribonucleic acids. Int. J. Biol. Macromol. 203 (January), 466-480 (2022).
  45. Luna, R. E., Akabayov, S. R., Ziarek, J. J., Wagner, G. Examining weak protein-protein interactions in start codon recognition via NMR spectroscopy. FEBS J. 281 (8), 1965-1973 (2014).
  46. Qin, J., Gronenborn, A. M. Weak protein complexes: Challenging to study but essential for life. FEBS J. 281 (8), 1948-1949 (2014).
  47. Perkins, J. R., Diboun, I., Dessailly, B. H., Lees, J. G., Orengo, C. Transient protein-protein interactions: Structural, functional, and network properties. Structure. 18 (10), 1233-1243 (2010).
  48. Ross, J. L. The dark matter of biology. Biophys. J. 111 (5), 909-916 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NMRD MannoseCyanovirin N

מאמרים קשורים