מאמר שיטה

בדיקת דילול FRET לניתוח חילופי חלבונים דינמיים בין מכלולי חלבון

DOI:

10.3791/68678

⸱

19 בספטמבר 2025

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology and the Institute for Collaborative Biotechnologies, University of California, Santa Barbara

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את הטיהור והתיוג הקוולנטי של רפלקטין A1 וכן בדיקת דילול FRET לאפיון ההחלפה הדינמית של חלבון רפלקטין בין מכלולי חלבון כפונקציה של גיל.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כמניע המולקולרי לססגוניות מתכווננת בצפלופודים, התנהגות הפאזה הניתנת לכוונון של חלבון רפלקטין A1 ממשיכה להיות מוקד של הנדסת ביו-חומרים. אפנון ריכוז המלח וצפיפות המטען נטו של החלבון של רפלקטין A1 מניע את החלבון ליצור מכלולים דינמיים כמתווכים להפרדת פאזה נוזלית-נוזלית. מכלולי רפלקטין, למרות שהם מוגבלים בגודלם על ידי מידת נטרול המטען של הדחייה הקטיונית, הקולומבית של החלבון, נמצאים בתחילה בחילופים דינמיים עם מונומרים או אוליגומרים מהתמיסה שמסביב. נעשה שימוש בבדיקת דילול אנרגיית תהודה פלואורסצנטית חדשה (FRET), בשילוב עם פיזור אור דינמי (DLS) ומבחני ריכוז חלבון, כדי לאפיין את השטף הדו-כיווני של החלבון בין מכלולי רפלקטין A1 לשלב מדולל כפונקציה של גיל ההרכבה. בדיקת דילול FRET זו מבחינה בין שטף חד-כיווני ודו-כיווני של חלבון לתוך ומחוץ למכלולי חלבון, ולכן ניתן ליישם אותו במהלך היווצרות ההרכבה. ההבחנה בין מכלולי חלבון דינמיים ועצורים קינטית היא חיונית להבנת מקורותיהם הביופיזיים, וניתן להתאים את בדיקת דילול ה-FRET החדשנית הזו להשלמת חקירות ביופיזיקליות של מכלולי חלבונים אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ססגוניות מתכווננת בדיונון לוליגיני מתווכת על ידי חלבוני רפלקטין בתאי אירידוציטים 1,2,3. אירידוציטים מכילים פלישות ממברנה נרחבות וסדירות היוצרות ערימות של למלות בראג צפופות חלבון, המשקפות אור באופן תלוי זווית ואורך גל 1,4,5,6. מפל אותות המופעל על ידי אצטילכולין מגיע לשיאו בזרחון של חלבוני רפלקטין קטיוניים 1,2,7, מפחית דחייה אלקטרוסטטית תוך-חלבונית ובין-חלבונית ומניע את עיבוי הרפלקטינים בלמלות בראג מחלקיקי רדיוס הידרודינמיים של 10-50 ננומטר לעיבוי נוזלי צפוף 3,8,9. רפלקטין A1 במבחנה יוצר מכלולים ברדיוס 10+ ננומטר יציבים בגודל שגודלם מכוון במדויק על ידי צפיפות המטען נטו של החלבון 10,11,12, והתנהגות קולואידית מתכווננת זו זכתה לעניין ביו-הנדסי רב בתכנון חומרים ביופוטוניים מתכווננים מבוססי רפלקטין 13,14,15,16,17,18. לאחרונה הוכח כי NaCl מניע מכלול רפלקטין A1 ו-LLPS (הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית) על ידי הגדלה אנטרופית של התרומה האנרגטית של האפקט ההידרופובי ועל ידי סינון המטענים הדוחים של המקשרים הקטיוניים המתחלפים19.

עבור עיבוי דמוי נוזל צפוף חלבון, ניתן לנתח בקלות חילופי דינמיים בין השלב הצפוף לשלב המדולל באמצעות FRAP טיפה שלמה (התאוששות פלואורסצנטית לאחר פוטו-הלבנה)20; יש צורך בבדיקה אנלוגית למכלולי חלבון בקנה מידה ננומטרי. דיווחים אחרונים על מכלולי חלבון רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית כמתווכים ל-LLPS 19,21,22 הציעו את הצורך בשיטות שוות ערך לחקירת דינמיקת הרכבה וחילופי דינמיקה בין מכלולים לשלב הדילול המתקיים במקביל. אשכולות חלבונים יכולים לכלול קולואידים דמויי זכוכית שנעצרו קינטית המיוצרים על ידי פירוק ספינודלי עצור, מכלולי שיווי משקל דינמיים המחליפים מונומרים או אוליגומרים משלב הדילול, ואשכולות מטה-יציבים 23,24,25,26,27. דינמיקת הרכבת חלבונים תלוית גיל היא אפוא המפתח להבנת התהליכים הפיזיקליים המניעים את היווצרותם של מכלולי חלבונים בהקשר של התנהגות פאזה מורכבת יותר.

גישות מבוססות FRET המנתחות את האינטראקציה בין מכלולים של חלבון המסומן בפלואורופור תורם לבין מכלולים של חלבון המסומן במקבל-פלואורופור שימשו לאפיון הדינמיקה של אשכולות חלבון מטה-יציבים21. עם ערבוב אשכולות אלה, הופעתו של FRET מדגימה חילופי והובלה של חלבון לתוך האשכולות21. עם זאת, עבור חלבונים מסוימים, כגון רפלקטין A1, אשכולות נוצרים וגדלים ללא הרף במהלך הניסוי19. עבור חלבונים כאלה, יש צורך בגישה המבטלת הובלה חד-כיוונית של חלבון לאשכולות, כפי שעשוי להתרחש במהלך היווצרות מתמשכת של אשכולות שנעצרים דינמית, והובלה דו-כיוונית של חלבון בין מכלולים.

גישת דילול FRET משיגה זאת באמצעות דילול פלואורופור (איור 1), שבו ירידה ב-FRET מסמלת הובלה דו-כיוונית של חלבון בין מכלולים. הוכנו מכלולי חלבון של רפלקטין שהכילו כמויות שוות של חלבון המסומן ב-Acceptor-fluorophore או donor-fluorophore. מכלולי רפלקטין אלה דוללו בתמיסה המכילה מכלולי רפלקטין ללא תווית, וחילופי חלבון דינמיים בין מכלולים נותחו כפונקציה של גיל ההרכבה. שיטה זו מבחינה בין היווצרות מתמשכת של אשכולות חלבון שנעצרו קינטית מאשכולות דינמיים, כולל אך לא רק אשכולות יציבים, אשכולות הגדלים עקב הבשלת אוסטוולד או תהליכי גסות דומים, אשכולות הגדלים על ידי היתוך, ואשכולות שאינם מתווכים ל-LLPS. זה לא רק מבחין בין מנגנונים שונים אלה של חילוף דינמי, מה שדורש שיטות אורתוגונליות כגון פיזור אור דינמי, ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) ומבחני ברדפורד19,21. פרוטוקול זה מתאר שיטות לטיהור רפלקטין מסוג פרא A1 והמוטציה היחידה המכילה ציסטאין A1-C232S, התיוג הקוולנטי של A1-C232S וניתוח דילול FRET.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. טיהור חלבונים ותיוג קוולנטי

  1. שינוי
    1. שיבוט רפלקטין A1 ורפלקטין A1 C232S (GenBank KF661517.1) לתוך הפלסמידים pj411.
    2. תאי Transfect Rosetta 2 (DE3) עם פלסמידים באמצעות טיפול בהלם חום28.
    3. צלחת תאים שהועברו על אגר המכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין.
    4. בחרו מושבה מבודדת והוסיפו ל-5 מ"ל TB (מרק נהדר) המכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר ב-250 סל"ד למשך הלילה.
    5. בודד פלסמידים באמצעות פרוטוקול ערכת בידוד הפלסמיד לריצוף.
  2. ביטוי חלבונים, ליזה והכללה של טיהור גוף
    1. יש להוסיף 5 מ"ל תרבית ל-1 ליטר (מרק ליזוגני) עם 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין, ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך כדי ניעור. ב-A600 של 0.6-0.7, לגרום לביטוי על ידי הוספת IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) לריכוז סופי של 5 מ"מ.
    2. לאחר 16 שעות, תאי הגלולה צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 10 דקות. שפכו כדורי סופרנטנט והקפיא כדורי תאים במקפיא של -80 מעלות צלזיוס.
    3. תאי ליז ולטהר גופי הכללה באמצעות מגיב לטיהור גוף הכללה לפי פרוטוקול היצרן, כולל טיפול של 20 דקות עם 1 מיקרוליטר (25-29 יחידות) של בנזונאז ו-3-5 KU של ליזוזים לכל מ"ל מגיב לטיהור גוף הכללה לאחר השעיה ראשונית של גלולת התא. גופי הכללה מטוהרים יופיעו ככדורים חומים כהים.
  3. FPLC (כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהירה)
    1. הכן 2 ליטר של 8 M אוריאה: 5% v/v תמיסת חומצה אצטית (Buffer A) ו-1 ליטר של 8 M guanidinium hydrochloride: 5% v/v תמיסת חומצה אצטית (Buffer B). סנן את שניהם באמצעות מסנן בקבוק ואקום של 0.22 מיקרומטר.
      זהירות: הימנע משאיפה, מגע עיניים ועור עם גואנידיניום הידרוכלוריד וללבוש PPE (ציוד מגן אישי) מתאים בעת הטיפול. יש להשליך למיכל פסולת ייעודי.
    2. השעו מחדש את כדורי הגוף באוריאה 8 M: תמיסת חומצה אצטית 5% על ידי ערבוב נמרץ עם מוט ערבוב מגנטי. הפתרון ייראה עכור. צנטריפוגה מצננת מראש ל-4 מעלות צלזיוס, צנטריפוגה ב-18,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 70 דקות, ואיסוף סופרנטנט עבור FPLC. הסופרנטנט ייראה חום ושקוף.
    3. באמצעות קצב זרימה של 2 מ"ל/דקה עבור כל השלבים הבאים, אזנו 10 מ"ל של עמודת חילופי הקטיון עם 5 נפחי עמודות (CVs) של 95% מאגר A, 5% מאגר B וטען את הדגימה. שטפו את הדגימה הלא מאוגדת עם 5 CVs, ולאחר מכן בצעו את שיפוע הצעד: 5 CVs של 94% Buffer A/6% Buffer B, ואז 5 CVs 10% Buffer B. Reflectin A1 נפלט ב-10% Buffer B.
    4. הערך את טוהר השברים המתאימים לשינוי השלב הראשוני ל-10% מאגר B על ידי SDS-PAGE ומאגר אם דומה. מצננים מראש צנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס ומרכזים שברים לנפח סופי של 4-5 מ"ל באמצעות רכז ספין 15 מ"ל 10 kDa MWCO.
  4. HPLC (כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים)
    1. הכינו 2 ליטר של 18 mΩ מים עם 0.1% חומצה טריפלואורואצטית (TFA) ו-2 ליטר אצטוניטריל עם 0.1% TFA. סנן את שניהם באמצעות מסנן בקבוק ואקום של 0.22 מיקרומטר.
      זהירות: TFA היא חומצת אידוי חזקה. טפל במכסה אדים, לבש PPE מתאים, והעביר רק באמצעות זכוכית. הימנע משאיפה, מגע עיניים ועור עם אצטוניטריל, ולבש PPE מתאים בעת הטיפול. יש להשליך למיכל פסולת ייעודי.
    2. באמצעות קצב זרימה של 1 מ"ל/דקה עבור כל השלבים הבאים, אזנו את עמודת C4 עם 5 CVs של 85% 18 mΩ מים, 0.1% TFA ו-15% אצטוניטריל, 0.1% TFA.
    3. התחל לזרום והזריק את הדגימה. זרם 2 CVs, ואז התחל שיפוע קבוע ל-80% אצטוניטריל, 0.1% TFA על פני 5 CVs. רפלקטין A1 בדרך כלל נפלט ב-73% אצטוניטריל.
    4. הקפאת מעטפת שברים המכילים חלבון רפלקטין בצינורות של 5 מ"ל באמצעות אתנול ואמבטיית קרח יבש. ליופיליזציה, ואחסון בטמפרטורה של - 80 מעלות צלזיוס. חלבון יופיע כיריעות לבנות דקות.
  5. הכנת מלאי חלבון ללא תווית
    1. הכן 4 ליטר של pH 4, 25 מ"מ חומצה אצטית (21.05 מ"מ חומצה אצטית, 3.95 מ"מ נתרן אצטט טריהידרט) באמצעות חומצה אצטית קרחונית ונתרן אצטט טריהידרט. התאם את ה-pH במידת הצורך עם 4 M HCl או 4 M NaOH. סנן באמצעות מסנן ואקום של 0.22 מיקרומטר.
      זהירות: טפל בחומצות/בסיסים חזקים כשהם לובשים PPE מתאים. לעולם אל תוסיף מים לחומצה חזקה או לבסיס מרוכז.
    2. הפשירו את הצינור המכיל חלבון רפלקטין ליופילי, ועם הצינור באמבט קרח, התמוססו עם pH 4, 25 מ"מ חומצה אצטית. תמיסת חלבון מסיס לחלוטין תיראה חסרת צבע ללא עכירות או משקעים נראים לעין.
      1. באמצעות קלטת דיאליזה מנותקת במשקל מולקולרי של 10 kDa, דיאליזה של חלבון רפלקטין מסיס בנפח דגימה של פי 1000 של pH 4, חומצה אצטית של 25 מ"מ מקורר מראש ל-4 מעלות צלזיוס באמצעות שני שינויים של 12 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
    3. מדללים את הדגימה עם מאגר חומצה אצטית pH 4, 25 מ"מ כדי לקבל ריכוז חלבון סופי של 100 מיקרומטר ונפח סופי של לפחות 150 מיקרוליטר. בעזרת ספקטרומטר UV-VIS, מדוד את הספיגה ב-280 ננומטר והשתמש במקדם הספיגה המולארי29 של רפלקטין A1 (123,685 M-1 ס"מ-1) כדי לקבוע את ריכוז החלבון.
    4. העבירו את מלאי חלבון הרפלקטין לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 0.5 מ"ל ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 7 ימים. מיד לפני הניסויים, צנטריפוגה משקפת את מלאי החלבון ב-4 מעלות צלזיוס במיקרו-צנטריפוגה מקוררת מראש ב-18,000 x גרם למשך 15 דקות. הכן את מלאי הרפלקטין A1 C232S באופן דומה באמצעות מקדם הספיגה המולרי של 123,540 M-1 ס"מ-1.
  6. תיוג חלבונים
    1. הכינו בנפרד מלאי של 10 מ"ג/מ"ל של FMTS (פלואורסצאין-מתאנטיוסולפונט) ו-SRMT (סולפורהודמין מתאנטיוסולפונט) על ידי הוספת 1 מ"ל של דימתיל-סולפוקסיד יבש (DMSO) לבקבוקון המכיל 10 מ"ג של בדיקה פלואורסצנטית וערבוב פיפטה.
      זהירות: יש להימנע משאיפה, מגע בעיניים ובעור עם ריאגנטים של מתאנטיוסולפונט.
    2. הוסף 7.7 מיקרוליטר ממלאי 10 מ"ג/מ"ל FMTS או 10.4 מיקרוליטר ממלאי SRMT של 10 מ"ג/מ"ל למאגר חומצה אצטית pH 4, 25 מ"מ לנפח סופי של 150 מיקרוליטר וריכוז סופי של 500 מיקרומטר FMTS או SRMT. הפתרון ייראה עכור. הקפיא והקפיא את שארית מלאי הבדיקה הפלואורסצנטית ב-80 מעלות צלזיוס.
    3. שלב עם 150 מיקרוליטר של 100 מיקרומטר מלאי חלבון רפלקטין וערבב היטב פיפטה. ריכוז החלבון הסופי הוא 50 מיקרומטר, וריכוז הבדיקה הפלואורסצנטית הסופי הוא 500 מיקרומטר. עכירות התמיסה תפחת.
    4. עוטפים בנייר כסף, ודוגרים זקוף תוך ערבוב מסלולי עדין בטמפרטורת החדר למשך 4 שעות, ולאחר מכן לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. עכירות הפתרון לא אמורה להשתנות.
    5. אם יש משקעים כלשהם, השעו על ידי ערבוב פיפטה נמרץ. הפתרון יהיה עכור. לרכז רפלקטין באמצעות מסנן צנטריפוגלי של 10,000 kDa MWCO לנפח יעד של 100 μL וריכוז של 150 μM.
    6. השתמש באותה שיטת HPLC וליופיליזציה כמו לטיהור חלבון כדי להסיר בדיקה פלואורסצנטית לא קשורה ולאחסן חלבון בטמפרטורה של - 80 מעלות צלזיוס עטוף בנייר כסף. המיס מחדש את החלבון המסומן באותה שיטה עבור החלבון הלא מסומן. קבע את מידת התיוג.
      הערה: חלבון רפלקטין מסיס עם תווית פלואורסצנטית יופיע צהוב-ירוק (C199-F) או אדום כהה (C199-R) ללא עכירות או משקעים.
  7. הכנת מלאי חלבון עם תווית משותפת
    1. הוסף 27 מיקרוליטר של מלאי חלבון A1 של 100 מיקרומטר למיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ"ל.
    2. הוסף 1.5 מיקרוליטר של רפלקטין A1-C232S עם תווית פלואורסצאין (המכונה C199-F כדי לציין את מיקום חומצת האמינו של פלואורסצאין) לאותו צינור.
    3. הוסף 1.5 מיקרוליטר של רפלקטין A1-C232S עם תווית סולפורהודמין (המכונה C199-R כדי לציין את מיקום חומצת האמינו של פלואורסצאין) לאותו צינור. הריכוזים הסופיים הם 90 מיקרומטר A1, 5 מיקרומטר C199-F ו-5 מיקרומטר C199-R.
    4. עוטפים בנייר כסף ושומרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 7 ימים.

2. סדרת זמן FRET

  1. הכנת מאגרים וסינון
    1. הכן 500 מ"ל של 25 מ"מ 3-(N-morpholino) חומצה פרופנסולפונית (MOPS). התאם את ה-pH של התמיסה ל-7 על ידי הוספה איטית של 4 M נתרן הידרוקסיד. סנן 10 מ"ל באמצעות מזרק 10 מ"ל ומסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
  2. חלבון צנטריפוגה
    1. מצננים מראש מיקרו-צנטריפוגה על השולחן ל-4 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה ללא תווית ותווית משותפת של רפלקטין A1 ב-18,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  3. הכנת מכלולי A1 מסומנים
    1. כדי להכין שלושה שכפולים, פיפטה 9.6 מיקרוליטר של מאגר MOPS (pH 7, 25 מ"מ) לשלושה צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 0.5 מ"ל.
    2. הוסף 0.4 מיקרוליטר של מלאי חלבון מסומן לכל צינור שכבר מכיל 9.6 מיקרוליטר של מאגר MOPS לריכוז חלבון סופי של 4 מיקרומטר.
    3. עוטפים מיד בנייר כסף ומניחים בחממה בחום בחום של 25 מעלות צלזיוס. פתרון זה וכל הפתרונות הבאים של מכלולים חסרים עכירות או משקעים נראים לעין לפני או אחרי הדגירה.
  4. הכנת מכלולי A1 ללא תווית
    1. כדי להכין שלושה שכפולים, פיפטה 38.4 מיקרוליטר של מאגר MOPS לשלושה צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 0.5 מ"ל.
    2. הוסף 1.6 מיקרוליטר של מלאי חלבון רפלקטין A1 לכל צינור שכבר מכיל 38.4 מיקרוליטר של מאגר MOPS לריכוז חלבון סופי של 4 מיקרומטר.
    3. עוטפים מיד בנייר כסף ומניחים בחממה בחום בחום של 25 מעלות צלזיוס.
  5. תזמון וערבוב של מכלולי A1 עם תווית משותפת וללא תווית
    1. הזמינו את הכנת המכלולים באופן הבא: הכינו בו זמנית ובנפרד מכלולים של רפלקטין ניסיוני אחד עם תווית משותפת וניסוי אחד ללא תווית. חזור על שלבים 2.3 ו-2.4.
    2. מערבבים על ידי הוספת 40 מיקרוליטר של מכלול A1 ניסיוני ללא תווית ל-10 מיקרוליטר של ניסיוני עם תווית משותפת בהתאמה, ומערבבים פיפטות בעדינות על ידי שאיבה וחלוקה של כל הנפח פעמיים. המדידות יבוצעו 24 שעות לאחר שלב זה.
    3. הזמן בין הנעת הרכבה של רפלקטין A1 על ידי דילול למאגר MOPS (pH 7, 25 מ"מ) לבין ערבוב של מכלולים מסומנים וללא תווית הוא גיל ההרכבה. גילאי המכלולים ששימשו לנתונים אלה היו 0 דקות, 1 דקה, 10 דקות, 30 דקות, 60 דקות, 120 דקות, 180 דקות, 540 דקות, 1080 דקות ו-1620 דקות.
  6. פקדים
    1. שליטה חיובית
      1. ממלאי החלבון A1 וממלאי החלבון המסומן, הכינו 20 מיקרוליטר של מלאי חלבון שהם 80 מיקרומטר A1 ו-20 מיקרומטר מלאי חלבון עם תווית משותפת.
      2. הוסף 38.4 מיקרוליטר של מאגר MOPS לצינורות מיקרו-צנטריפוגה עם מכסה הצמד של 0.5 מ"ל, ולאחר מכן הוסף 1.6 מיקרוליטר של 80 מיקרומטר A1/20 מיקרומטר חלבון ופיפטה לערבב פעמיים על ידי שאיבה איטית והוצאה של כל הנפח. מכסים מיד בנייר כסף ומכניסים לחממה בחום של 25 מעלות צלזיוס. חזור על הפעולה בסך הכל 9 דוגמאות.
    2. שליטה שלילית
      1. הוסף 0.4 מיקרוליטר של מלאי מסומן לצינור מיקרו-צנטריפוגה עם מכסה הצמד של 0.5 מ"ל שכבר מכיל 9.6 מיקרוליטר של מאגר MOPS. מערבבים פיפטה לאט פעמיים על ידי שאיבה וחלוקה של כל נפח הדגימה.
      2. הוסף 40 מיקרוליטר של מאגר MOPS ותערובת פיפטות פעמיים על ידי שאיבה וחלוקה של כל נפח הדגימה. מכסים מיד בנייר כסף ומכניסים לחממה בחום של 25 מעלות צלזיוס. חזור על הפעולה בסך הכל 9 דוגמאות.
  7. קובטה ומאגר ריקים
    1. הגדר את הפלואוריומטר לרגש ב-488 ננומטר והקלט ספקטרום רציף מ-520-700 ננומטר.
    2. מלאו קובטה נקייה של תת-מיקרו פלואוריומטר קוורץ ב-50 מיקרוליטר של מאגר MOPS (pH 7, 25 מ"מ) ומדדו.
    3. הסר את המאגר.
  8. הליך ניסוי
    הערה: יש להקליט את כל הניסויים 24 שעות לאחר ערבוב מכלולי רפלקטין A1 עם תווית משותפת וללא תווית. פיפטה בעדינות 50 מיקרוליטר מתמיסת הניסוי לתוך הקובטה ומדוד.
    1. הסר את הדגימה, שטוף עם מאגר חומצה אצטית של 500 מיקרוליטר ולאחר מכן עם מים מסוננים של 500 מיקרוליטר 0.22 מיקרומטר 18 mΩ. בצע מאגר ריק.
  9. פקדים
    1. יש למדוד ב-1440 דקות, 1960 דקות ו-3060 דקות לאחר הכנת פקדים (מתאים לגילאי הרכבה של 0 דקות, 520 דקות ו-1620 דקות). מדידות אלה מסכמות את החלק הניסיוני של הפרוטוקול.

3. ניתוח נתונים

  1. הפחיתו את הספקטרום של המאגר הריק מהספקטרום הניסיוני.
  2. קבע את היחס בין Em588/Em520.
  3. עבור כל שכפול, קבע את הממוצע וסטיית התקן של כל קבוצה של שלושה שכפולים. חלקהEm 588/Em520 כפונקציה של גיל ההרכבה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר דילול מכלולי רפלקטין A1 המכילים גם חלבון תורם עם תווית פלואורופור וגם חלבון מקבל עם תווית פלואורופור עם מכלולי רפלקטין A1 ללא תווית, נצפתה ירידה ראשונית בפליטת FRET ב-588 ננומטר ביחס למכלולים לא מדוללים (איור 2A). FRET עבור מכלולים בגיל 0 דקות היה דומה לבקרה החיובית, ו-FRET עבור מכלולים בגיל 1620 דקות (הזמן בין היווצרות ההרכבה לערבוב של מכלולי רפלקטין לא מסומנים ומסומנים) היה פחות מהבקרה השלילית (איור 2A). שרטוט Em588/Em520 כפונקציה של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נקודה נפוצה של אובדן חלבון במהלך הטיהור היא השעיה לא מלאה של כדורי גוף ההכללה עבור כל השלבים בפרוטוקול טיהור גוף ההכללה, והשעיה סופית של גופי הכללה מטוהרים בחומצה אצטית 8 M אוריאה 5% v/v. המסה מחדש של גוף ההכללה יכולה להימשך עד 24 שעות של ערבוב נמרץ עם מוט ערבוב מגנטי קטן בצינור חרוטי של 40 מ"ל. כדי למנוע אובדן חלבון משמעותי למסננים, הסינון שקדם ל-FPLC ו-HPLC הוחלף בצנטריפוגה ב-15,000 x גרם למשך 70 דקות כדי להבהיר את התמיסה ולהסיר חלקיקים גדולים שיכולים לסתום מערכות כרומטוגרפיה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר נתמך על ידי המכון לביוטכנולוגיות שיתופיות באמצעות מענקים W911NF-19-2-0026 ו-W911NF-23-1-0330 ממשרד המחקר של צבא ארה"ב. תוכן המידע אינו משקף בהכרח את עמדת הממשלה או את מדיניותה, ואין להסיק מכך תמיכה רשמית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10 μ מיקרופיפטה בקיבולת L
2 μ מיקרופיפטה בקיבולת L
2-[(5-פלואורססיניל)אמינוקרבוניל]אתיל מתנתיוסולפונאטסנטה קרוז ביוטכנולוגיותSC-216155CAS  351330-42-2
20 μ מיקרופיפטה בקיבולת L
200 μ מיקרופיפטה בקיבולת L
3-(N-מורפולינו)חומצה פרופנסולפונית, 4-חומצה מורפולין-פרופנסולפוניתסיגמא-אולדריץ'M1254CAS 1132-61-2
חומצה אצטיתסיגמא-אולדריץ'א6283CAS 64-19-7
אצטוניטרילסיגמא-אולדריץ'ברקוד 34851-1LCAS 75-05-8
אבקת אגרקרולינה ביולוגית842133CAS 9002-18-0
רדיד אלומיניום
מסנן Amicon אולטרה צנטריפוגלי, 10 kDa MWCOמיליפור סיגמאUFC501008קיבולת 0.5 מ"ל
מסנן Amicon אולטרה צנטריפוגלי, 10 kDa MWCOמיליפור סיגמאUFC901008קיבול של 15 מ"ל
איזון אנליטי
בנזונאזמיליפופר-סיגמא70664-3CAS 9025-65-4
מגיב מיצוי חלבון BugBusterמיליפור סיגמא70584-3
ספקטרומטר פלואורסצנטי של Cary Eclipseקארי-אקליפס
תוכנת Cary Eclipse
צינורות צנטריפוגה קורנינג 50 מ"למיליפופר-סיגמאCLS430829
מזרקים חד פעמיים, Luer-Lok 10 מ"לקול-פארמרUX-12915-02
DMSOסיגמא-אולדריץ'D8418CAS 67-68-5
קרח יבש
מערכת FPLC כפולה
מערכת HPLC כפולה
אתנולמיליפור סיגמאEX0280-3CAS 64-17-5
רוטור צנטריפוגה רצפתי קיבולת בקבוקון 500 מ"ל
צנטריפוגה רצפתית 
מקפיא, -80° C
מכסה אדים
גואנידין הידרוכלורידתרמו סיינטיפיקAAA135430B50-01-1
HiTrap SP עמודת כרומטוגרפיה של חילופי קטיון של HPציטיבה17115101
חומצה הידרוכלוריתסיגמא-אולדריץ'258148-25 מ"לCAS 7647-01-0
אינקובטור
איזופרופיל ובטא;-D-1-תיוגלקטופירנוסידסיגמא-אולדריץ'I6758-1G
קנמיצין סולפטסיגמא-אולדריץ'K1637CAS 25389-94-0
ליופילייזר
ליזוזיםתרמו סיינטיפיק90082
מוט ערבוב מגנטי
צלחת ערבוב מגנטית
אלקטרודה מיקרו pH S7מטלר טולדו51343160
מיקרוצנטריפוגה עם בקרת טמפרטורה
מסנן מזרק Millex PVDFמיליפורSLGVR33RS0.22 μ M, קוטר 33 מ"מ.
מסנן Milli-Q Millipakמיליפור סיגמאMPGP002A1
מערכת טיהור מים Milli-Q UltraPureמיליפור סיגמא
NaClתרמו סיינטיפיקAA12314A9CAS 7647-14-5
בקבוקי צנטריפוגה של נלג'ן, סגנון 3120מיליפופר-סיגמאB1283-4EAלכדורי חיידקים
מעבדת אורביטל  שייקר עם אינקובטור
מחשב אישי
צלחות פטריסיגמא-אולדריץ'P5731-500EA
פלסמיד PJ411דנ"א 2.0
חלבון LoBind  צינורות חרוטייםאפנדורףEP30108302קיבולת של 5 מ"ל
חלבון LoBind  צינורות מיקרוצנטריפוגהאפנדורףEP022431102קיבולת 0.5 מ"ל
בקבוק ארלנמאייר מבולבל פיירקס 1,000 מ"למיליפופר-סיגמאCLS44501לדגירת תרביות חיידקים
כוסות פיירקס גריפין 2,000 מ"למיליפופר-סיגמאCLS10002Lלכל הכנת המאגר והתמיסה 
בקבוקי אחסון מדיה עגולים פיירקס 1,000 מ"למיליפופר-סיגמאCLS13951Lלאחסון כל הכנת המאגר והתמיסה, השתמש עם מסנני בקבוק ואקום
ערכת Qiaprep Spin Miniprepקיגן27104
מקרר
תאים מוכשרים Rosetta 2(DE3)נובגן71397-3
קלטות דיאליזה Slide-a-lyzer 10K MWCOתרמו סיינטיפיקPI66383קיבולת 0.5 מ"ל
נתרן אצטט טריהידרטסיגמא-אולדריץ'S8625CAS 6131-90-4
נתרן הידרוקסידסיגמא-אולדריץ'ברקוד 567530-250 ג"מCAS 1310-73-2
מסנן עליון בקבוק ואקום של Steritopמיליפור סיגמאS2GPT05RE0.22 μ מסנן סטרילי M
תת-מיקרו-קובטה, קיבולת 50 uLתאי סטארנה16.40F-Q-10/Z15
סולפורהודמין מתנתיוסולפונאטסנטה קרוז ביוטכנולוגיותSC-220172CAS  386229-71-6
חומצה טריפלואורואצטיתסיגמא-אולדריץ'106232-25GCAS 407-25-0
טריפטוןספקטרום כימיקלים T1333
אוריאהתרמו סיינטיפיקAAA123600ECAS 57-13-6
ספקטרומטר UV-VIS
תמצית שמריםג'יבקו211929

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DeMartini, D. G., Izumi, M., Weaver, A. T., Pandolfi, E., Morse, D. E. Structures, organization, and function of reflectin proteins in dynamically tunable reflective cells. J Biol Chem. 290 (24), 15238-15249 (2015).
  2. Izumi, M., et al. Changes in reflectin protein phosphorylation are associated with dynamic iridescence in squid. J R Soc Interface. 7 (44), 549-560 (2010).
  3. Tao, A. R., et al. The role of protein assembly in dynamically tunable bio-optical tissues. Biomaterials. 31 (5), 793-801 (2010).
  4. Ghoshal, A., DeMartini, D. G., Eck, E., Morse, D. E. Optical parameters of the tunable Bragg reflectors in squid. J R Soc Interface. 10 (85), 20130386(2013).
  5. Ghoshal, A., DeMartini, D. G., Eck, E., Morse, D. E. Experimental determination of refractive index of condensed reflectin in squid iridocytes. J R Soc Interface. 11 (95), 20140106(2014).
  6. Ghoshal, A., Eck, E., Gordon, M., Morse, D. E. Wavelength-specific forward scattering of light by Bragg-reflective iridocytes in giant clams. J R Soc Interface. 13 (120), 20160285(2016).
  7. Mäthger, L. M., Collins, T. F. T., Lima, P. A. The role of muscarinic receptors and intracellular Ca2+ in the spectral reflectivity changes of squid iridophores. J Exp Biol. 207 (11), 1759-1769 (2004).
  8. Morse, D. E., Taxon, E. Reflectin needs its intensity amplifier: Realizing the potential of tunable structural biophotonics. Appl Phys Lett. 117 (22), 220501(2020).
  9. Hanlon, R. T., Cooper, K. M., Budelmann, B. U., Pappas, T. C. Physiological color change in squid iridophores. Cell Tissue Res. 259, 3-14 (1990).
  10. Levenson, R., et al. Calibration between trigger and color: Neutralization of a genetically encoded coulombic switch and dynamic arrest precisely tune reflectin assembly. J Biol Chem. 294 (45), 16804-16815 (2019).
  11. Levenson, R., Bracken, C., Bush, N., Morse, D. E. Cyclable condensation and hierarchical assembly of metastable reflectin proteins, the drivers of tunable biophotonics. J Biol Chem. 291 (8), 4058-4068 (2016).
  12. Levenson, R., et al. Protein charge neutralization is the proximate driver dynamically tuning a nanoscale Bragg reflector. bioRxiv. 9, (2021).
  13. Tobin, C. M., et al. Reversible and size-controlled assembly of reflectin proteins using a charged azobenzene photoswitch. Chem Sci. 15, 13279-13289 (2024).
  14. Loke, J. J., Hoon, S., Miserez, A. Cephalopod-mimetic tunable photonic coatings assembled from quasi-monodispersed reflectin protein nanoparticles. ACS Appl Mater Interfaces. 14 (18), 21436-21452 (2022).
  15. Kramer, R. M., Crookes-Goodson, W. J., Naik, R. R. The self-organizing properties of squid reflectin protein. Nat Mater. 6 (7), 533-538 (2007).
  16. Xu, C., Stiubianu, G. T., Gorodetsky, A. A. Adaptive infrared-reflecting systems inspired by cephalopods. Science. 359 (6383), 1495-1500 (2018).
  17. Ordinario, D. D., et al. Bulk protonic conductivity in a cephalopod structural protein. Nat Chem. 6 (7), 596-602 (2014).
  18. Ordinario, D. D., et al. Protochromic devices from a cephalopod structural protein. Adv Opt Mater. 5 (20), 1600751(2017).
  19. Gordon, R., et al. Charge screening and hydrophobicity drive progressive assembly and liquid-liquid phase separation of reflectin protein. J Biol Chem. 301 (3), 108277(2025).
  20. Bracha, D., Walls, M. T., Brangwynne, C. P. Probing and engineering liquid-phase organelles. Nat Biotechnol. 37 (12), 1435-1445 (2019).
  21. Kar, M., et al. Phase separating RNA binding proteins form heterogeneous distributions of clusters in subsaturated solutions. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2202222119(2022).
  22. Lan, C., et al. Quantitative real-time in-cell imaging reveals heterogeneous clusters of proteins prior to condensation. Nat Commun. 14 (1), 4831(2023).
  23. Vekilov, P. G. The two-step mechanism of nucleation of crystals in solution. Nanoscale. 2 (11), 2346(2010).
  24. Gibaud, T., Schurtenberger, P. A closer look at arrested spinodal decomposition in protein solutions. J Phys Condens Matter. 21 (32), 322201(2009).
  25. Cardinaux, F., Gibaud, T., Stradner, A., Schurtenberger, P. Interplay between spinodal decomposition and glass formation in proteins exhibiting short-range attractions. Phys Rev Lett. 99 (11), 118301(2007).
  26. Sciortino, F., Mossa, S., Zaccarelli, E., Tartaglia, P. Equilibrium cluster phases and low-density arrested disordered states: The role of short-range attraction and long-range repulsion. Phys Rev Lett. 93 (5), 055701(2004).
  27. Segrè, P., Prasad, V., Schofield, A., Weitz, D. Glass-like kinetic arrest at the colloidal-gelation transition. Phys Rev Lett. 86 (26), 6042-6045 (2001).
  28. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  29. Gill, S. C., Von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).
  30. Lychko, I., Soares, C. L., Dias, A. M. G. C., Roque, A. C. A. A scalable method to purify reflectins from inclusion bodies. Sep Purif Technol. 315, 123736(2023).
  31. Berliner, L. J., Grunwald, J., Hankovszky, H. O., Hideg, K. A novel reversible thiol-specific spin label: Papain active site labeling and inhibition. Anal Biochem. 119 (2), 450-455 (1982).
  32. Kenyon, G. L., Bruice, T. W. Novel sulfhydryl reagents. Methods Enzymol. 47, 407-430 (1977).
  33. Renault, K., Fredy, J. W., Renard, P. Y., Sabot, C. Covalent modification of biomolecules through maleimide-based labeling strategies. Bioconjug Chem. 29 (8), 2497-2513 (2018).
  34. Northrop, B. H., Frayne, S. H., Choudhary, U. Thiol-maleimide "click" chemistry: Evaluating the influence of solvent, initiator, and thiol on the reaction mechanism, kinetics, and selectivity. Polym Chem. 6 (18), 3415-3430 (2015).
  35. Stauffer, D. A., Karlin, A. Electrostatic potential of the acetylcholine binding sites in the nicotinic receptor probed by reactions of binding-site cysteines with charged methanethiosulfonates. Biochemistry. 33 (22), 6840-6849 (1994).
  36. Bressloff, P. C. Active suppression of Ostwald ripening: Beyond mean-field theory. Phys Rev E. 101 (4), 042804(2020).
  37. Berry, J., Brangwynne, C. P., Haataja, M. Physical principles of intracellular organization via active and passive phase transitions. Rep Prog Phys. 81 (4), 046601(2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Reflectin A1

מאמרים קשורים