מאמר שיטה

כריתת לימפאדנקטומיה מזנטרית של עכברים לשיבוש סלקטיבי בתקשורת לימפה עם מערכת העיכול הספציפית לאזור

DOI:

10.3791/68696

⸱

30 בדצמבר 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Yale University School of Medicine, 2Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, 3Department of Internal Medicine, Section of Rheumatology, Yale University, 4Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר הליך הישרדות עבור לימפאדנקטומיה מזנטרית של עכברים בטוחה ונסבלת היטב, בכל אחת מארבע תחנות לאורך שרשרת בלוטות הלימפה המזנטריות. הליך זה ניתן להתאמה כדי לאפשר הפרעה סלקטיבית בתקשורת הלימפה עם המעי הגס הדיסטלי, המעי הגס הפרוקסימלי ו/או המעי הדק.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הניטור החיסוני מול סבילות לאנטיגן הוא איזון עדין בתוך מיקרו-סביבת המעי, שבו ידוע היטב התפקיד הקריטי של פריימינג תאי T במחזור בתוך בלוטות הלימפה המקומיות. לאחר פריימינג של תאי T, הספרות האחרונה החלה להראות תפקיד ייחודי ולא-מיותר של תאי T שאינם במחזור הדם השוהים בבלוטת הלימפה המנקזת של איבר. זה נכון במיוחד במערכת העיכול, שם ידוע כי ניקוז הלימפה הוא מאוד ספציפי. עם זאת, כדי להבין באמת את ההשפעה הייחודית של תאים מקומיים אלה לעומת יתירות פונקציונלית מערכתית, הקהילה המדעית זקוקה להליך מתואר היטב לבידוד והפרעה סלקטיבית של הצמתים הללו. כאן מתוארת הליך הישרדות לכריתת לימפהאדנקטומיה מזנטרית של עכברים בטוחה ונסבלת היטב בכל אחת מארבע תחנות לאורך שרשרת בלוטות הלימפה המזנטריות. הליך זה ניתן להתאמה כדי לאפשר הפרעה סלקטיבית בתקשורת הלימפה עם המעי הגס הדיסטלי, המעי הגס הפרוקסימלי ו/או המעי הדק. כלולים הוראות מפורטות, עזרים ויזואליים, טיפים מועילים לשיפור ההצלחה, ופתרון תקלות להישרדות לא מיטבית. בלוטות הלימפה שנחתכו מוכנות מיד לעיבוד נוסף במסגרת המשך אם ירצו. טכניקה זו מתאימה במיוחד למחקרים הדורשים הפרעה סלקטיבית של ניקוז הלימפה מהמעי הגס הדיסטלי, המעי הגס הפרוקסימלי ו/או המעי הדק.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי T הם אחד מסוגי תאי האפקטור המרכזיים בחסינות אדפטיבית, עם תפקידים מתוארים בקטגוריות מחלה מגוונות, כולל זיהומים, אוטואימוניות וממאירות 1,2,3. שלב קריטי לתפקוד תאי T הוא הפריימינג התלת-שלבי על ידי תאים מציגים אנטיגן בתוך איברי לימפה משניים, כגון בלוטות לימפה מקומיות4. ברפואה המודרנית, עיקרון הכריה אונקולוגית תקינה במערכות איברים מרובות כולל מידה מסוימת של דגימה מקומית או כריתת בלוטות לימפהבלוק 5,6,7,8. לדוגמה, בסרטן המעי הגס, הנחיות קונצנזוס ממליצות להסיר ולהיבדק 12 בלוטות לימפה בכריתה בכוונה מרפאת, בשל קשר ברור עם שיפור בהישרדות לטווח הארוך 6,7. עם זאת, האם באמת ניתן לכרות בלוטות לימפה מקומיות ללא עונש? מחקרים עדכניים בעכברים הראו כי בלוטת הלימפה המנקזת גידול מכילה מאגר של קודמים של תאי T אנטי-גידוליים, אשר עשויים להיות מוגנים מפני התמיינות סופית והתשה של תאי T המתרחשים במיקרו-סביבת הגידול 9,10,11. דבר זה מרמז שהסרת אוכלוסייה קריטית כזו עלולה לפגוע ביכולות הפיקוח החיסוני המתמשך.

דפוס ניקוז הלימפה של המעי בעכברים ידוע כמיוחד לאורך שרשרת בלוטות הלימפה המזנטריות; לדוגמה, המעי הגס הפרוקסימלי מתנקז כמעט אך ורק על ידי תחנת בלוטת הלימפה הראשונה, המעי הדק על ידי התחנה השנייה/שלישית, והמעי הגס הדיסטלי מתנקז בעיקר על ידי תחנת בלוטת הלימפההרביעית 12 (איור 1, איור משלים 1). לכן, תקשורת ישירה בין מקטעי המעי והלימפה עלולה להיפגע באמצעות אבלציה ממוקדת של קשרים אלו. כדי לחסום תנועה בין קשרי לימפה לרקמות, משתמשים בדרך כלל באגוניסטים של קולטני S1P, כגון FTY720, וחסימת אינטגרין; עם זאת, תרופות אלו מעכבות במידה רבה את הסחר ולכן אינן יכולות לשמש לחקירת תרומתן של בלוטות לימפה ספציפיות13,14. עם זאת, היכולת של הקהילה המדעית הרחבה לחקור את ההשפעה המקומית של אינטראקציות חיסוניות בתוך בלוטות הלימפה של המעי מוגבלת בשל היעדר כריתה כירורגית מתוארת היטב לכל תחנה. בהתחשב בפער זה, פותח הליך הישרדות לכריתת לימפאדנקטומיה מזנטרית עכברית בכל תחנת צמת, ומתואר כאן. המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג כריתה בטוחה ואמינה של תחנת קשרי הלימפה המזנטרית בעכברים עם הישרדות וסבילות גבוהה לאחר הניתוח.

הליך זה נבדק וניתן לבצע בקלות בעכברים צעירים ובוגרים במספר זנים (למשל, Balb/c, C57BL/6J, 129S4), אך הוא מוגבל על ידי הצורך בבלוטות לימפה נגישות ומזוהות. לכן, ייתכן שאינו מתאים לשילוב עם מודלים של עכברים או גנוטיפים עם בלוטות לימפה קטנות מהרגיל או בלתי מורגשות (למשל, עכברים חסרי לימפטוקסין-אלפא)15. בנוסף, עכברים מבוגרים יותר (>15 שבועות) נוטים לסבול ממשקל ויזרלי יותר, מה שמקשה על זיהוי ובידוד בלוטות הלימפה, ולמרות שזה אינו מניעה, זה עלול להוות הצלחה או להגביל את הפרוצדורה. מלבד מגבלות אלו, הלימפאדנקטומיה המזנטרית מציעה הפרעה מבוקרת ובררנית מאוד של בלוטות הלימפה. הליך זה יתאים במיוחד לפענוח שאלות לגבי ההשפעה המקומית של בלוטות הלימפה ותאי החיסון התושבים והאינטראקציות שלהן על מקטעי המעי (למשל, המעי הגס הפרוקסימלי, המעי הגס הרחוק, המעי הדק).

figure-introduction-1
איור 1: נקודות ציון אנטומיות של תחנות בשרשרת בלוטות הלימפה המזנטריות. (א) תיאור לא מסומן ו-(ב) מסומן של ארבע תחנות קשרי לימפה מזנטריות עיקריות במקום. ניקוז המעי הגס הפרוקסימלי הוא בעיקר דרך תחנה 1, המעי הדק הוא בעיקר תחנה 2/3, והמעי הגס הדיסטלי הוא בעיקר תחנה 4. (DC= מעי גס מרוחק, ICV= כלי דם אילאוקוליים, PC= מעי גס פרוקסימלי, CEC= צקום, IV/JV= כלי דם אילאליים/כלי דם ג'יונליים, SI= מעי דק). פסי קנה מידה: 1.5 ס"מ. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים מתבצעים בהתאם לפרוטוקולי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של ייל. לפיתוח ההליך הזה, נעשה שימוש בזן C57BL/6 בן 8-12 שבועות, עכברים מסוג בר, ובקרות דמה תואמות גיל/מין/גנוטיפ. גם עכברים זכרים וגם נקבות נכללו. משקל הגוף נע בין 18 ל-25 גרם. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת מכשירים, בעלי חיים וחדר הניתוח

  1. לחטא את כל כלי הניתוח. ודא שמשטח הפעולה וקונוס האף של ההרדמה מנוקים ב-70% אתנול.
  2. התקן את מכונת הרדמה שנשאפה עם קונוס אף ויניקה לצורך איסוף עודף של חומרי הרדמה. הקימו משטח פעולה עם משטח מים חמים לשמירה על טמפרטורת גוף בעלי החיים והאספקה במקום נוח וסטרילי.
    הערה: הליך זה אינו דורש מיקרוסקופ תפעולי; עם זאת, שקלו לכלול את הכלי הזה כדי לשפר את הוויזואליזציה.
  3. השרה הרדמה על ידי מתן איזופלורן שנשאף 2%-3% עם קצב זרימת חמצן של 2 ליטר לדקה דרך קונוס האף ממכשיר אידוי הרדמה שנשאף (בהתאם לפרוטוקולים מאושרים על ידי המוסד).
    1. ודאו מישור הרדמה מתאים על ידי אישור קצב נשימה של כ-30-40 נשימות לדקה וחוסר תגובה לצביטה בכף הרגל האחורית. בדקו מחדש מדי פעם את מישור ההרדמה המתאים והתאימו את קצב זרימת האיזופלוראן בהתאם.
      הערה: לחלופין, הרדמה בהזרקה מתאימה גם כן.
  4. פעל לפי הנחיות המכון שלך לשיכוך כאבים והרדמה מקומית מתאימים. לדוגמה, מתן משכך כאבים ארוך טווח כמו 3.25 מ"ג/ק"ג בופרנורפין XR תת-עורית ומתן עד 0.04 מ"ל/5גרם משקל גוף של 1 מ"ג/מ"ל לידוקאין תת-עורית בחתך המתוכנן.
  5. הכינו את החיה להליך על ידי הצבת ישיבה על הגב, מריחת חומר סיכה לעיניים, פריטה או גזירה של פרווה בטנית, ועיקור הבטן בתמיסת פובידון/יוד, ואחריה 70% אתנול (איור 2A).
  6. השתמש בכפפות סטריליות והניח וילונות סטריליים על החיה עם חלון לשדה הניתוח. שמרו על סטריליות לאורך כל ההליך.

figure-protocol-1
איור2: תמונות מייצגות של שלבים פרוצדורליים מרכזיים בניתוח לימפאדנקטומיה מזנטרית. (א) חלון בטן שנלקח ועוקר. (B) חתך של 0.5 ס"מ דרך העור והלינאה אלבה. (ג) חשיפת שרשרת בלוטת הלימפה המזנטרית על ידי כיוון האילאום ימינה, המעי הגס הפרוקסימלי שמאלה, והצקום התחתון. בלוטת הלימפה המזנטרית הראשונה נמצאת לאורך העורק האילאוקולי (חץ לבן). (ד) בלוטת לימפה מזנטרית שנכרתה (חץ דהוי). פסי קשקש: 0.5 ס"מ (מזרח) בלוטת לימפה מזנטרית אקס-ביבו (חץ לבן; 2.5 מ"מ x 3 מ"מ). קרציות = 1 מ"מ. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

2. הכנה ללימפאדנקטומיה מזנטרית

  1. עשה חתך בקו האמצע של 0.5-1 ס"מ דרך העור. נתח בצורה ישירה את העור הרחק מדופן הבטן וזהה את הלינאה אלבה. בצע חתך של 0.5-1 ס"מ דרך הלינאה אלבה כדי להגיע לחלל הפריטונאלי (איור 4B).
    הערה: כדי לשפר את הגישה לקשרים בתחנה 2/3/4, שקול להאריך את החתך בראש, אך לא לעבור את תהליך הזקפואיד הסחוסי.
  2. הזרקו 1 מ״ל מלח סטרילי בטמפרטורת הגוף לחלל הפריטונאלי באמצעות מחט קהה בקצה והרטיב את הווילונות הסטריליים כהכנה למיקום המעיים. השתמשו במקלמות סטריליות ולחות עם קצה כותנה כדי לזהות ולפרק את הקרום דרך החתך.
    1. הימנעו משימוש במכשירים חדים לטיפול במעי, שכן זה עלול לגרום לפציעה. הרטיב מחדש מדי פעם את הווילונות והמעיים כדי למנוע נזק מהתייבשות.
      הערה: הסקום של העכברו נמצא בדרך כלל ברבע התחתון השמאלי של הבטן, אך יכול להיות מאוחסן בכל רבע.
  3. הבהירו את תחנה(ים) בלוטת הלימפה המזנטרית היעד לכריתה ופעל לפי הוראות ספציפיות להלן (כלומר, 3.1-3.4). ראו איור 1A,B לנקודות ציון אנטומיות וזיהוי.

3. ניתוח וכריתה של תחנות בלוטות לימפה מזנטריות

  1. תחנת בלוטת הלימפה הראשונה (ניקוז מעי הגס הפרוקסימלי; איור משלים 1A,B').
    1. כיוון את המעי החיצוני על וילונות לחים עם צקום תחתון, המעי הגס הפרוקסימלי כלפי מעלה, והאילאום הסופי לכיוון ימין של המנתח (צד שמאל של החיה; איור 1A, איור 2C).
    2. זהה את שרשרת בלוטות הלימפה המזנטריות, אשר עוברת לאורך המעי הגס. באמצעות מלקחיים עם קצה דק בזווית, יש לנתח בצורה ישירה את תחנת בלוטת הלימפה הראשונה הרחק מהכלי האילאוקולי על ידי הצבת מלקחיים סגורים במרחב שבין המבנים הללו ומתן אפשרות למלקחיים להיפתח בעדינות.
      1. הסר מלקחיים וחזר על המניפולציה 2-3 פעמים או עד שנוצר מישור מספיק לכריתה בטוחה. הימנעו מנזק לכלי דם עיקריים במעי הגס (איור 3A,B).
        הערה: אם מתרחש דימום משמעותי, יש להפסיק את ההליך ולהטיל המתת חסד הומנית של בעל החיים (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד).
    3. אופציונלי: כדי להפחית סיכון תיאורטי לנזקים לבלוטות סמוכים, יש לבצע קשירת תפר אופציונלית עם תפרים בודדים מופרעים לאורך שרשרת בלוטת הלימפה (1 מ"מ דיסטלי אחד ואחד 1 מ"מ פרוקסימלי לתחנת הלימפה הראשונה) באמצעות תפר ניילון שחור 9-0 ומלקחיים דקים להנעת המחט (איור 3C,D).
    4. משכו בעדינות את קאודאד תחנת הלימפה הקשורה, ובאמצעות מספריים דקים, חתכו את תחנת בלוטת הלימפה היעד מהראש לזנב (איור 3E).
      הערה: לעיתים קרובות, לעכברים יש כלי הזנה קטן אך גלוי מהעורק האילאוקולי אל החלק האחורי של בלוטת הלימפה. ניתן לשלוט בדימום מכלי זה באמצעות לחץ עדין באמצעות מטוש עם קצה כותנה עד להשגת המוסטזיס.

figure-protocol-2
איור3: תמונות סטילס ופרשנות ממוסרות מהלימפאדנקטומיה המזנטרית (התחנה הראשונה). (א) כיוון נכון של המעי חושף את תחנת בלוטת הלימפה המזנטרית הראשונה (חץ לבן). (ב) נוצר מישור בין העורק האילאוקולי (חץ כחול) לבין הצומת. (ג) קשירת תפרים של כלי ההזנה הנכנסים לקצה בלוטת הלימפה (חץ כחול) מתבצעת תוך הדרה של כלי הדם האילאוקוליים על ידי יציאה מהמרחב שבין המבנים הללו (חץ לבן). (ד) מתבצעת קשירת תפרים של בסיס בלוטת הלימפה, שוב תוך זיהוי והימנעות מהענפים הדיסטליים של העורק האיליאוקולי. (ה) הגשר נחתך לאורך מישור הרקמה שנוצר קודם, נשאר גבוה לכיוון בלוטת הלימפה ומשאיר מאחור קשירות תפרים (חצים שחורים). (F) מאומת המוסטזיס, נצפו ענפים דיסטליים של העורק האילאוקולי כדי להבטיח זרימת דם תקינה, והחלל הריק (חץ דהוי) שבו היה הגוש בעבר נמצא נקי מקשרים שאריתיים. פסי קנה מידה: 0.5 ס"מ. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

  1. תחנת בלוטת הלימפה השנייה (ניקוז מעי דק באמצע-דיסטל)
    1. תפרק בעדינות גם את המעי הדק. כוון את המעי החיצוני על וילונות לחים כאשר הצקום תחתון, המעי הגס הפרוקסימלי כלפי מעלה, והמעי הדק לכיוון ימין של המנתח (הצד השמאלי של החיה; איור 1A).
    2. זהה את שרשרת בלוטות הלימפה המזנטריות, אשר עוברת לאורך המעי הגס. התחנה השנייה מתחילה במפגש כלי האיל/ג'ונל (איור 1B).
      1. באמצעות מלקחיים עם קצה דק בזווית, יש לנתח בצורה ישירה את תחנת הלימפה השנייה הרחק מכלי המעי הגס על ידי הנחת מלקחיים סגורים במרחב שבין המבנים הללו ומתן אפשרות למלקחיים להיפתח בעדינות.
      2. הסר מלקחיים וחזר על המניפולציה 2-3 פעמים או עד שנוצר מישור מספיק לכריתה בטוחה. הימנע מנזק לכלי דם עיקריים במעי הגס. כמו כן, שים לב במיוחד לכלי האיליאל והג'ונל, שיכולים להיות מזיקים אם ייפגעו.
        הערה: אם מתרחש דימום משמעותי, יש להפסיק את ההליך ולהטיל המתת חסד אנושית של בעל החיים.
    3. אופציונלי: כדי להפחית סיכון תיאורטי לנזקים לקשרים סמוכים, יש לבצע קשירת תפר אופציונלית עם תפרים בודדים מופרעים לאורך שרשרת בלוטת הלימפה (אחד במרחק 1 מ"מ דיסטלי ואחד 1 מ"מ פרוקסימלי לתחנת הלימפה השנייה) באמצעות תפר ניילון שחור מונופילמנט 9-0 ומלקחיים דקים להנעת המחט (איור משלים 2A).
    4. משכו בעדינות את תחנת הלימפה הקשורה, ובאמצעות מספריים דקים, חתכו את תחנת בלוטת הלימפה היעד מהראש לזנב (איור משלים 2B).
      הערה: לעיתים קרובות, לעכברים יש כלי הזנה קטן אך גלוי מהעורק האילאוקולי אל החלק האחורי של בלוטת הלימפה. ניתן לשלוט בדימום מכלי זה באמצעות לחץ עדין באמצעות מטוש עם קצה כותנה עד להשגת המוסטזיס.
  2. תחנת בלוטת הלימפה השנייה והשלישית (ניקוז מעי דק קרוב-אמצע-דיסטלי; איור משלים 1C,D'
    1. קרע בעדינות את כל המעי הדק עד לנקודת הקשירה האחורית (רצועת טריץ). כוון את המעי החיצוני על וילונות לחים כאשר הצקום תחתון, המעי הגס הפרוקסימלי כלפי מעלה, והמעי הדק לכיוון ימין של המנתח (הצד השמאלי של החיה; איור 1A).
    2. זהה את שרשרת בלוטות הלימפה המזנטריות, אשר עוברת לאורך המעי הגס. התחנה השנייה מתחילה במפגש כלי האיל/ג'ונל (איור 1B).
      1. באמצעות מלקחיים עם קצה דק בזווית, יש לנתח בצורה ישירה את תחנות הלימפה השנייה והשלישית הרחק מכלי המעי הגס על ידי הצבת מלקחיים סגורים במרחב שבין המבנים הללו ומתן אפשרות למלקחיים להיפתח בעדינות.
      2. הסר מלקחיים וחזר על המניפולציה 2-3 פעמים או עד שנוצר מישור מספיק לכריתה בטוחה. הימנע מנזק לכלי דם עיקריים במעי הגס. כמו כן, שים לב במיוחד לכלי האיליאל והג'ונל, שיכולים להיות מזיקים אם ייפגעו.
        הערה: אם מתרחש דימום משמעותי, יש להפסיק את ההליך ולהטיל המתת חסד אנושית של בעל החיים.
    3. אופציונלי: כדי להפחית סיכון תיאורטי לנזקים לנקודות סמוכות, בצע קשירת תפר אופציונלית עם תפרים בודדים מופרעים לאורך שרשרת בלוטת הלימפה (בדרך כלל תפר אחד מרוחק 1 מ"מ, שניים צדדיים של 1 מ"מ, ואחד 1 מ"מ פרוקסימלי לתחנות הלימפה השנייה/שלישית) באמצעות תפר ניילון מונופילמנט שחור 9-0 ומלקחיים דקים להנעת המחט (איור משלים 3B, ג).
      1. שימו לב למסלולי הלימפה האפרנטיים, השוכנים רק שטחיים לצרורות כלי הדם האיליאלי/הג'ונליים (איור משלים 3B). יש להיזהר ולוודא שקשירת התפרים מגיעה עמוק ללימפה ומבנים וסקולריים עיקריים שטחיים, שכן נזק לחבילות כלי הדם האיליאלי/הג'ונלי עלול להזיק.
    4. משכו בעדינות את תחנות הלימפה הקשורות בראש, ובאמצעות מספריים דקים או דקים במיוחד, חתכו את תחנות בלוטת הלימפה היעד מהקואד לראש.
      הערה: לפני הממשיך, ודאו שהמעי הדק נשאר ורוד ומפוזר היטב. קשירה מקרית של כלי הדם האיליאליים/הג'ונליים תוביל למעי הדק איסכמי.
  3. תחנת בלוטת הלימפה הרביעית (ניקוז מעי הגס הרחוק; איור משלים 1E,F')
    1. קרע בעדינות את כל המעי הדק עד לנקודת הקשירה האחורית (רצועת טריץ). כוון את המעי החיצוני על וילונות לחים כאשר הצקום תחתון, המעי הגס הפרוקסימלי כלפי מעלה, והמעי הדק לכיוון ימין של המנתח (הצד השמאלי של החיה; איור 1A).
    2. זהה את שרשרת בלוטות הלימפה המזנטריות, אשר עוברת לאורך המעי הגס. התחנה הרביעית נמצאת ממש במרכז המעי הגס הרחוק ולרוחב לתחנה השלישית (איור 1B, איור 4A).
      1. באמצעות מלקחיים עם קצה דק בזווית או מספריים דקים במיוחד, נתח באופן ישיר את תחנת הלימפה הרביעית הרחק מכלי המעי הגס ומהשומן הסובב, על ידי הנחת מלקחיים/מספריים סגורים במרחב שבין המבנים הללו ומתן אפשרות למלקחיים/מספריים להיפתח בעדינות.
      2. הסר מלקחיים/מספריים וחזור על התמרון הזה 2-3 פעמים או עד שנוצר מישור מספיק לכריתה בטוחה. הימנע מנזק לכלי דם עיקריים במעי הגס.
        הערה: אם מתרחש דימום משמעותי, יש להפסיק את ההליך ולהטיל המתת חסד אנושית של בעל החיים.
    3. אופציונלי: כדי להפחית סיכון תיאורטי לנזקים צמודים לצמתים סמוכים, יש לבצע קשירת תפר אופציונלית עם תפרים בודדים מופרעים בכל בלוטת לימפה מזוהה (בדרך כלל אחד במרחק 1 מ"מ מהצומת) באמצעות ניילון מונופילמנט שחור 9-0 ומלקחיים דקים להנעת המחט (איור 4B - D).
    4. משכו בעדינות את תחנות הלימפה הקשורות בראש, ובאמצעות מספריים דקים במיוחד חתכו את תחנת בלוטת הלימפה היעד מהזנב לראש (איור 4D,E).

figure-protocol-3
איור 4: תמונות עם הערות ופרשנות מהלימפאדנקטומיה המזנטרית (התחנה הרביעית). (א) כיוון המעי הנכון חושף את תחנת בלוטת הלימפה המזנטרית הרביעית (חצים לבנים) מדיאלית למעי הגס הדיסטלי ולטרלית לתחנה השלישית. (B,C) לאחר ניתוח קהה של תחנת הצומת, מתבצעת קשירת תפר (חץ שחור) בכל צומת מזוהה, תוך שמירה על הכללה של כל כלי ההזנה של בלוטת הלימפה (חצים כחולים). (D) הצומת נחתך לאורך מישור הרקמה שנוצר קודם, נשאר גבוה לכיוון בלוטות הלימפה ומשאיר מאחור קשירות תפר (חצים שחורים). (ה) לאחר כריתת תחנת הצומת (חצים לבנים), מאומת המוסטזיס, קשירי התפרים נראים (חצים שחורים), והחלל הריק (חצים דהויים) שבו היה הצומת שחי קודם נרשם כנקי מצומת שאריתי. פסי קנה מידה: 0.2 ס"מ. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

4. השלמת לימפאדנקטומיה מזנטרית

  1. יש להתבונן בענפים הרחוקים של כלי הדם האילאוקוליים, כלי הדם האיליאליים ו/או כלי הדם הג'ונליים כדי לוודא שאספקת הדם שלמה. המעי המפוזר היטב בהיר וורוד עם פעימות נראות לעין.
    1. באמצעות מטוש עם קצה כותנה, החזר את תוכן הבטן לחלל הפריטונאלי. הקפד להסיר שברי כותנה, סיכה, וילון או תפר מהמעיים לפני החזרה, שכן הדבר עלול לגרום לדלקת ניתוחית נוספת.
    2. ודא שהמעי לא מעוות במזנטריה על ידי אישור שהמעי נשאר בהיר/ורוד (מפוזר) ולא עמום/אפור/סגול (איסכמי).
  2. הזרקו 1 מ"ל של מי מלח סטריליים בטמפרטורת הגוף לבטן ממש לפני הסגירה כדי להשלים איבוד/אידוי נוזלים בלתי מורשים. סגור את הבטן בשתי שכבות (דופן הבטן והעור) עם תפר פוליפרופילן מונופילמנט 6-0 בצורה רצינית.
  3. מרחו דבק ניתוחי סטרילי על הפצע.
    הערה: לחילופין, ניתן להשתמש בתפרים מופרעים או קליפסים לפצע לסגירת העור.

5. טיפול לאחר הניתוח

  1. העבירו את החיה לכלוב נקי, שהוא חצי על כרית מים חמים עם גישה לאוכל ומים באופן חופשי.
  2. אפשר לבעל החיים להתאושש מההרדמה ולעקוב מקרוב אחר סימני מצוקה. אם בעלי חיים אינם מחלימים במהירות מההרדמה עם התנהגויות מתאימות (כגון עלייה בקצב הנשימה, תיישר עצמי, הליכה ניידת, טיפוח), יש להמתים את החיה באופן הומני.
  3. כאשר כל בעלי החיים החלימו מהרדמה, החזירו את הכלובים למתקן הטיפול בבעלי חיים עם גישה למים, מזון, מצעים וחומרי העשרה בתוספת תשלום.
  4. הערכו עכברים לאחר הניתוח כל 12 שעות במשך 3 ימים לסימני כאב או מצוקה (למשל, יציבה כפופה, ירידה בפעילות, ירידה במעורבות, טיפוח לקוי). הורד עכברים באופן הומני שמראים סימני מצוקה.
  5. אם משתמשים בתפר קבוע (כגון פוליפרופילן מונופילמנט 6-0), בדקו את החתכים ביום העשירי לאחר הניתוח והסירו כל חומר תפר שנותר.

6. טיפול בבלוטות לימפה

  1. לבצע מיד בדיקת ציפה על ידי הנחת הרקמה שנכרתה בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל עם 500 מיקרוליטר מלח מפוזר פוספט (PBS). אשר הסרת בלוטת לימפה על ידי צפייה בשקיעת רקמה ב-PBS לעומת שומן שנחתך בטעות, אשר יצוף (איור 5A).
    הערה: תחנת בלוטת הלימפה שהוצאו מוכנות מיד להיכנס לעיבוד נוסף במורד הזרם.
  2. לטכניקות תאים חיים, יש למקם תחנות בלוטות לימפה שנלקחו במדיות תרבית תאים (כגון DMEM, RPMI) או PBS על קרח. בהיסטולוגיה מתוכננת, יש להניח תחנות בלוטות לימפה שנלקחו במצב קיבע (למשל, 10% פורמלין ניטרלי עם בופר, 4% פאראפורמלדהיד).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לאשר את דיוק ההליך הזה, בוצעו לימפאדנקטומיות מזנטריות על אחד עשר בני זן C57BL/6J בגיל, מין וגנוטיפ בגיל 4-6 שבועות. זמני הטיפול נעו בין 5 ל-15 דקות לעכבר. כל העכברים סבלו את ההליך היטב, עם הישרדות מלאה סביב הניתוח. דגימות שנלקחו הונחו ב-PBS על קרח. כל הדגימות שקעו מיד, ואישרו תכולת שומן נמוכה. דגימות שנכרתו (וארבעה בקרי שומן ויסרליים נפרדים) נמעכו לאחר מכן דרך מסננת תאים בקוטר 100 מיקרון ונשטפו באמצעות PBS. השעיות התאים צנטריפוגה ב-450 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4°C, ולא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתואר כאן הליך הישרדות לכריתת לימפאדנקטומיה מזנטרית של עכברים בטוחה ונסבלת היטב בכל אחת מארבע תחנות הצמת. המגבלה העיקרית של הליך זה היא הקשר העקיף בין חשיפה להתקדמות קשרי הלימפה לאורך שרשרת המזנטרית. תחנת בלוטת הלימפה הראשונה נחשפה בקלות ובקלות במלואה. תחנת בלוטת הלימפה השנייה נראית לעיתים קרובות, והחשיפהלעמדות ה-2עד ה-4 יכולה להשתפר על ידי הארכת ראש החתך של העור/דופן הבטן. עם זאת, בשל ההצמדות האחורית של המעי הגס הדיסטלי, יש גישה מוגבלת למעבר (כלומר, המעי הגס המרוחק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R.A.F. הוא יועץ ל-GlaxoSmithKline, Plythera Inc. ו-Ventus Therapeutics. כל שאר המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים ל-J. Alderman, B. Cadugan, E. Hughes-Picard, ו-J. Horrocks על סיוע מנהלי, ול-C. Hughes על ניהול מושבת העכברים. H.N.B. הוא עמית בתוכנית ההכשרה למדעני מנתח של ייל, שמימנה ותמכה חלקית בפרויקט זה. עבודה זו מומנה גם על ידי מכון הווארד יוז לרפואה (ל-R.A.F.) ופרס המחקר המתמחה של הקולג' האמריקאי לכירורגים (ל-H.N.B.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מעגל הרדמהכלאו הרדמה בהזרקה
BD LSRII זרימת ציטומטר (או שווה ערך)BD ביוסיינססמצויד בתוכנת FACS Diva (לציטומטריית זרימה) 
בופרנורפין XRכללשיכוך כאבים
מדיה לתרבות תאים כל(לטכניקות תאים חיים; כלומר DMEM או RPMI)
DAPIביולג'נד422801ריכוז עבודה: 15 מיקרוגרם/מ"ל
אתנול (70% במים)כללניקוי
CD45.2 (104) אנטי-עכבר מצומד FITC (104)ביולג'נד109806ריכוז עבודה: 5 מיקרוגרם/מ"ל
מלקחיים: מלקחיים עם קצה עדין בזוויתרובוזRS-5058חומר: דומוקסל; דגם #5, זווית של 45 מעלות; גודל קצה 0.1 X 0.06 מ"מ
מלקחיים: מלקחיים עם קצה דקרובוזRS-4960חומר: דומוסטאר; תבנית #1; גודל הקצה: 0.20 x 0.12 מ"מ
מלקחיים: מלקחיים עם קצה דקרובוזRS-4966חומר: Dumostar, טיפ Biologie; תבנית #3; גודל קצה: 0.08 x 0.04 מ"מ
לידוקאיןכללשיכוך כאבים
מחט ממתכת גוואג'כלמחט אוראלית ישרה רב-פעמית 20/22 גייג', נירוסטה.
דרייברי מחטרובוזRS-6410מחזיק מחט קסטרובייחו; סטרייט
OPTIONAL:      נורות LED עם מיקרוסקופ צוואר אווז כפול/כפולכל
<הם>אופציונלי: צבע כחול של אוונססיגמאE2129-10Gלמעקב לימפה אופציונלי.
<הם>אופציונלי: מיקרוסקופ תפעולילייקהMZ9.5מיקרוסקופ ראש סטריאו Leica Mz9.5
סליין ממוגן בפוספט (PBS)כל
תמיסת פובידון/יודכללהכנה/עיקור עור
מספריים: מספריים עם קצה דק במיוחדרובוזRS-5605מקפרסון-ואנס; קצה חיתוך 3 מ"מ; מעוקלת (לתחנה 3/4 צמתים)
מספריים: מספריים עם קצה דקרובוזRS-5650SCSurecut Castroviejo Sissors (לתחנה 1/2/3 צמתים)
מספריים: מספריים בינונייםרובוזRS-5676נויס; קצה חיתוך 13 מ"מ; ישר
דבק כירורגיכלדבק רקמות 3M Vetbond
תפר: פוליפרופילנקס מונופילמנט כחול 6-0כל
תפר: 9-0 תפר ניילון שחור מונופילמנטכל(אופציונלי) אפשר גם להשתמש ב-8-0 קצת יותר גדול גודל תפר.
קיבוע רקמותכל(להיסטולוגיה מתוכננת; כלומר 10% פורמלין ניטרלי עם בופר או 4% פאראפורמלדהיד)
כרית חימום מחזור מים חמיםכל

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chopp, L., Redmond, C., O'shea, J. J., Schwartz, D. M. From thymus to tissues and tumor: A review of T cell biology. J Allergy Clin Immunol. 151 (1), 81-97 (2023).
  2. Rouiz-Argüelles, A. Autoimmunity: From bench to bedside. Anaya, J. -M. , El Rosario University Press. Colombia. (2013).
  3. Crespo, J., Sun, H., Welling, T. H., Tian, Z., Zou, W. T cell anergy, exhaustion, senescence, and stemness in the tumor microenvironment. Curr Opin Immunol. 25 (2), 214-221 (2013).
  4. Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427 (6970), 154-159 (2004).
  5. Divi, V., et al. Lymph node count from neck dissection predicts mortality in head and neck cancer. J Clin Oncol. 34 (32), 3892-3897 (2016).
  6. Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: Systematic review. JNCI. 99 (6), 433-441 (2007).
  7. Simoes, P., et al. Lymph node yield in the pathological staging of resected nonmetastatic colon cancer: The more the better. Surg Oncol. 43, 101806(2022).
  8. Resio, B. J., et al. Commission on cancer standards for lymph node sampling and oncologic outcomes after lung resection. Ann Thorac Surg. 119 (2), 308-315 (2025).
  9. Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like CD8 T cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836(2021).
  10. Saddawi-Konefka, R., et al. Lymphatic-preserving treatment sequencing with immune checkpoint inhibition unleashes cdc1-dependent antitumor immunity in HNSCC. Nat Commun. 13, 4298(2022).
  11. Saddawi-Konefka, R., Schokrpur, S., Gutkind, J. S. Let it be: Preserving tumor-draining lymph nodes in the era of immuno-oncology. Cancer Cell. 42 (6), 930-933 (2024).
  12. Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
  13. Brinkmann, V., Pinschewer, D., Chiba, K., Feng, L. Fty720: A novel transplantation drug that modulates lymphocyte traffic rather than activation. Trends Pharmacol Sci. 21 (2), 49-52 (2000).
  14. Mehandru, S., Colombel, J. -F., Juarez, J., Bugni, J., Lindsay, J. O. Understanding the molecular mechanisms of anti-trafficking therapies and their clinical relevance in inflammatory bowel disease. Mucosal Immunol. 16 (6), 859-870 (2023).
  15. Mariathasan, S., et al. Absence of lymph nodes in lymphotoxin-alpha (lt alpha)-deficient mice is due to abnormal organ development, not defective lymphocyte migration. J Inflam. 45 (1), 72-78 (1995).
  16. Kwon, S., Agollah, G. D., Wu, G., Sevick-Muraca, E. M. Spatio-temporal changes of lymphatic contractility and drainage patterns following lymphadenectomy in mice. PLoS One. 9 (8), e106034(2014).
  17. Blum, K. S., Proulx, S. T., Luciani, P., Leroux, J. -C., Detmar, M. Dynamics of lymphatic regeneration and flow patterns after lymph node dissection. Breast Cancer Res Treat. 139 (1), 81-86 (2013).
  18. Shaikh, H., et al. Mesenteric lymph node transplantation in mice to study immune responses of the gastrointestinal tract. Front Immunol. 12, 689896(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TCD45

מאמרים קשורים