הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

איסוף דם בנפח גדול מחזירים ליישומים במבחנה : שימוש בקנולציה תוך לבבית ובמשאבת ואקום כהליך סופי

1.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68699

⸱

25 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Animal Resources Unit, The National Bio and Agro-Defense Facility, USDA, 2Midwest Veterinary Services, Inc., 3Foreign Animal Disease Research Unit (FADRU), The National Bio and Agro-Defense Facility, 4APHIS (Vaccine Bank), The National Bio and Agro-Defense Facility

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים שיטה לאיסוף נפח גדול של דם מחזירים באמצעות קנולציה תוך לבבית מלעורית המחוברת למשאבת ואקום, כהליך סופני.

תקציר

איסוף דם שגרתי נדרש במחקרים בסיסיים ויישומיים רבים. שיטות מרובות לאיסוף דם חזירים מתוארות היטב. אלה כוללים שימוש בוורידי האפרכסת לאיסוף נפחי דם קטנים, ורידי הצוואר או הווריד הנבוב הגולגולתי לאיסוף נפחי דם גדולים יותר. ניסויים מסוימים דורשים כמויות גדולות של דם מבעל חיים בודד אחד בו זמנית לניתוח או לשימוש בתרביות תאים ראשוניות, שניתן להשיג בצורה הטובה ביותר באמצעות הוצאה. דם שנאסף לתרבית תאים ראשונית חייב להיות מעובד טרי ובזהירות כדי לשמור על שלמות התאים. אנו מתארים שיטה של קצירת דם אספטית מחזירים תחת מישור כירורגי של הרדמה, באמצעות קטטר תוך-וסקולרי בעל קדח גדול המוחדר מלעורית ללב ומשאבת ואקום, שהיא יעילה, מספקת יבול גדול וממזערת את ליזיס התאים. טכניקה זו מבוצעת פעם אחת על בעל חיים, במישור כירורגי של הרדמה, כהליך סופני, המספק סיכון מינימלי לכאב או מצוקה.

מבוא

חזירים שימשו במחקר במחקרים החל ממחקרי לב וכלי דם ועד ריפוי פצעים וטוקסיקולוגיה, כמו גם מחקר מבוסס חקלאות, אימונולוגיה ומחקרי מחלות1. דם שנאסף במחקר יכול לשמש לחקר מחלות, פרמקולוגיה, גנטיקה, חקר מערכת החיסון וגילוי סמנים ביולוגיים. תרבית תאים היא אחד ההליכים הבסיסיים ביותר שנעשים במחקר ומאפשרת לחוקרים לחקור התנהגות ותפקוד תאים, כמו גם מודלים של מחלות ופיתוח חיסונים2. גידול פתוגנים גורמי מחלות, כגון נגיף קדחת החזירים האפריקאית, נעשה לעתים קרובות במדיום תרבית קבוע מראש בתנאי מעבדה אספטיים קפדניים. התפשטות מחלה יכולה להתרחש באמצעות פלישה, התפשטות או התקשרות, הדורשים תאים בריאים ויציבים3. פתוגנים שנחקרו עשויים להיות בעלי טרופיזם תאים ספציפי שבו הם יכולים להתפשט, ונפח גדול של דם מניב כמויות גדולות יותר של תאים לשימוש.

כדי להשיג תפוקה גבוהה של תאים מבעל חיים בודד, לצורך התמיינות תאית, יש לאסוף בעדינות נפח גדול של דם כדי לשמור על שלמות התאים לפני הפרדת התאים. בחזירים, ניתן לחשב את נפח הדם הכולל ב-65 מ"ל/ק"ג 4,5. מניסיוננו באיסוף נפח גדול, ניתן לשחזר כמחצית מנפח הדם הכולל מבעל חיים. לכן, בחזירים בוגרים גדולים, במשקל של עד 600 פאונד (273 ק"ג), תיתכן יבול של 6-8 ליטר. בחזירים, ניתן לאסוף כמויות גדולות של דם מלעורית מהווריד הנבוב הגולגולתי, וריד הצוואר החיצוני, הווריד הספנוס באמצעות קנולציה או הלב 4,5,6. עם זאת, איסוף דם תוך לבבי עם צינורית בעלת קדח גדול מאפשר לאסוף ביעילות את נפח הדם הגדול ביותר עם סיכון מינימלי לליזה של תאים. כהליך סופני, יש לבצע זאת במישור כירורגי של הרדמה5. מאמר זה מתאר שיטה של שימוש במשאבת ואקום לאיסוף מספר ליטרים של דם מחזירים באמצעות גישה מלעורית ללב עם קטטר IV בעל קדח גדול המחובר למשאבת ואקום 7,8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של השירותים הווטרינריים במערב התיכון. מכיוון שהשיטה העיקרית להמתת חסד שאושרה על ידי IACUC במהלך הליך זה היא exsanguination, צפוי שחלק מהחזירים יגיעו לדום לב עקב אובדן דם. כאשר זה קורה, מבוצעת שיטת המתת חסד משנית, כגון כריתת בית חזה דו-צדדית. לאחר איסוף נפח הדם הנדרש, אם יש פעימות לב מוחשיות, מזרק עם תמיסת המתת חסד מחובר לסטילט וניתן תוך לב כשיטת המתת החסד העיקרית, ואחריה שיטה פיזית משנית. חזירים מוחזקים בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות משק במחקר והוראה, המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה וחוק רווחת בעלי חיים, לפי העניין.

1. הכנת חומרים ובעלי חיים (טבלת חומרים ואיור 1A-C)

  1. הרכיבו את הצינור לקשיות נירוסטה והצמידו את קצה הצינור לצינור הבועות.
  2. חבר את הצינור לבקבוק הגלילה באמצעות פקק גומי עם שתי קשיות מתכת לא אחידות ובקבוק זכוכית.
    הערה: הזכוכית מעכבת את קריסת המיכל שנוצר על ידי משאבת הוואקום, אך ניתן להשתמש בכל חומר שאינו מתמוטט בלחץ.
  3. יש להחדיר אספטית 10 מ"ל נתרן הפרין (1,000 USP/mL) דרך צינור היניקה והצנתר כדי למנוע קרישה. יש להוסיף באופן אספטי 50 מ"ל נתרן הפרין (1,000 USP/mL) לכל בקבוק רולר כדי להשיג ריכוז סופי של 50 IU/mL בכל ליטר דם ולמנוע קרישת דם במהלך האיסוף. ודא שמשאבת הוואקום מוגדרת ללא יותר מ-7 פאונד של משיכה כדי למנוע נזק לתאים.

2. הרדמה ומיקום בעלי חיים

  1. שקלו את בעל החיים לא יותר מ-24 שעות לפני ההליך כדי לחשב את המינון הנדרש של שילוב תרופות ההרדמה.
  2. יש להזריק טלזול (3.0-5.0 מ"ג/ק"ג), קטמין (8-12 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (4.0-6.0 מ"ג/ק"ג) תוך שרירית בצוואר, או בבטן שרירים גדולה אחרת (למשל שרירים אפקסיאליים), באמצעות ערכת הארכה בגודל 30 אינץ' ומחט בגודל 18 גרם x 1.5 אינץ' כדי לגרום להרדמה עמוקה.
    הערה: בחזירים גדולים, נפח הזרקת ה-IM המרבי המומלץ הוא 10 מ"ל, כך שייתכן שיהיה צורך בשינוי מיקומים לאחר כל 10 מ"ל של מתן9. למרות שבחרנו בקוקטייל זה, ניתן לבצע הליך זה תחת כל פרוטוקול הרדמה המאושר על ידי IACUC המייצר מישור כירורגי של הרדמה.
  3. לאחר שאושר כי בעל החיים נמצא במישור כירורגי של הרדמה (~5-8 דקות), ללא רפלקס פלפברלי, טונוס לסת רופף וללא תגובה לגירוי כאב, הנח את החזיר על שולחן הרמה, רצפה או משטח שטוח אחר, בשכיבה רוחבית ימנית.
  4. גזוז את השיער על בית החזה הממוקם מעל הלב, במידת הצורך, ליד החלל הבין-צלעי הרביעי והחמישי, רק זנב עד לקצה המרפק.
  5. אם זמין, השתמשו באולטרסאונד (איור 2A) כדי לזהות את החדר השמאלי. אם אינו זמין, החדר השמאלי ממוקם קרוב ביותר לחלל הבין-צלעי הרביעי או החמישי עד לנקודת הדחף המקסימלי8.
  6. קרצפו את האזור באופן אספטי עם ספוגי גזה בגודל 4 אינץ' על 4 אינץ' ספוגים בפילינג כלורהקסידין 2% וספוגי גזה בגודל 4 אינץ' על 4 אינץ' ספוגים באלכוהול איזופרופיל 70%. הכינו את העור על ידי קרצוף בצורה מעגלית, החל מנקודת ההזרקה וסיבוב כלפי חוץ, למשך 3x לפחות, לסירוגין בין שני חומרי החיטוי.

3. איסוף דם תוך לבבי

  1. ודא שהחיה נשארה במישור כירורגי של הרדמה על ידי בדיקת רפלקס פלפברלי, טונוס לסת ורפלקס דוושה.
    הערה: בדוק את עומק ההרדמה, כמו גם את קצב הלב והנשימה, לאורך כל ההליך כדי להבטיח שהחיה תישאר במישור כירורגי של הרדמה.
  2. הסר את הסטילט מהצנתר העירוי. הניחו את הסטילט מעל החדר השמאלי וקדמו אותו בניצב לעור כדי להכניס את הסטילט לחדר השמאלי (איור 2B). כאשר הדם מתחיל לפעום החוצה מהסטילט, חבר אותו למחבר קצה צינור צינור הבועות המחובר לבקבוק הגליל ולאחר מכן, הפעל את משאבת הוואקום (איור 1A ואיור 2C).
  3. ודא שהדם זורם בזרם קבוע. כאשר הדם נשאב לתוך בקבוק הרולר, סובב בעדינות את הבקבוק כדי לאפשר ערבוב של הדם עם נוגד הקרישה כדי למנוע היווצרות קרישים.
  4. לאחר איסוף 1 ליטר דם, השתמש בהמוסטטים כדי להדק את צינור הבועות ליד בקבוק הגליל. נתק את פקק הגומי והחל אותו על בקבוק הגלילה הבא. הסר את המוסטט ואפשר לדם לזרום בחופשיות תוך כדי סיבוב עדין של בקבוק הרולר.
  5. המשך בתהליך זה עד לאיסוף הדם הנדרש. לאחר השלמתו, clamp את הצינור כדי למנוע שפיכת דם עודפת וכבה את המשאבה.
  6. הסר את מחבר הצינור מהקטטר וחבר את מזרק הנתרן פנטוברביטל לסטילט. משוך לאחור את המזרק כדי להבטיח הבזק של דם ואז הזריק את תמיסת המתת החסד. אשר מוות על ידי היעדר דופק, נשימה, טונוס שרירים ורפלקסים. לאחר אישור המוות, הוציאו את המחט מהלב והניחו במיכל חד.
  7. השלך צינורות בועות למיכל פסולת ביולוגית. הסר דם ברוטו מפריטי הנירוסטה הנותרים (למשל, קשיות נירוסטה, מחברי קצה צינור) באמצעות מברשת צינור ולאחר מכן חיטוי לשימוש עתידי.
  8. הנח את פקקי הגומי הנקיים, הקשיות, מחברי קצה הצינור וההמוסטטים לתוך נרתיק חיטוי חדש ועיקר לפני השימוש הבא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לפני איסוף הדם, הזרעים נבדקו מראש למיקופלזמה היופנאומוניה (Mycoplasma hyopneumoniae), אדנו-וירוס חזיר, נגיף פרוו חזירי, נגיפי קורונה של חזירים (גסטרואנטריטיס מועברת, שלשול מגיפת חזירים), דלקת מוח המואגלוטינציה של חזיר, תסמונת רבייה ונשימה של חזירים, שפעת מקבוצה A, סירקו-וירוס 1 ו-2 ווירוס סנקה A. חזרנו על הליך זה מספר פעמים בנקבות יורקשייר במשקל 300-600 ק"ג. איסוף הדם הניב בין 3 ליטר מהחזירים הקטנים ל-8 ליטר מהחזירים הגדולים יותר. חשד להיווצרות קריש דם בשני מקרים דרש הסרה והחלפה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ההליך כאן מתאר מכלול קטטר למשאבת ואקום לאיסוף נפח גדול חד פעמי של דם מלב הזורעים. בגלל הפוטנציאל לכאב ומצוקה, יש לבצע הליך זה רק בבעלי חיים הנמצאים במישור כירורגי של הרדמה. חוסר תנועה מההרדמה מאפשר ללמוד הליך זה על ידי מתחילים ולשלוט בו במהירות. ניתן להשתמש במספר ורידים לאיסוף דם מבעלי חיים. המסלולים הנפוצים והנגישים ביותר הם ורידי הצוואר, הווריד הנבוב הגולגולתי ווריד האוזן, כאשר וריד הזנב, וריד הירך או הווריד הצפלי הם אפשרויות נוספות 5,6

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות במיוחד לענף משאבי בעלי החיים של מרכז מחלות בעלי חיים באי פלאם, הן לטכנאי בריאות בעלי חיים והן לטיפול בבעלי חיים על הסיוע הטכני המצוין. המימון לפרויקט בארגון המחקר החוזי סופק על ידי USDA, ARS, יחידת משאבי בעלי חיים ב-NBAF.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
משאבת דיאפרגמה מדגם מעבדה 1/8 כ"ס ו-ndash; 115 VAC, 60 psi מקסימלי ו-nbsp;מרכז האספקה הבסיסי 80058845 
10 G x 6 אינץ' קטטר מעל המחט   Covetrus North American Veterinary Supplies 024616 
מזרק 50 מ"ל, נעילת לואר פישר סיינטיפיק  13-689-8 
ג'ל אולטרסאונד Aquasonic 100 כחול Midwest Veterinary Supply 001.02109.2 
צינור בועות ארגייל, לא מוליך (¼ ")   פישר סיינטיפיק  NC2282605 (קטלוג ספקים # 8888280412) 
Chlorhexidine Q Scrub 2% Midwest Veterinary Supply   562.30804.3 
בקבוקי רולר חד-פעמיים קורנינג.  פישר סיינטיפיק  06-413 
Corning PYREX זכוכית עם פה צר כבד Erlenmeyer פלאסק או דומה ליצירת יניקה  פישר סיינטיפיק  10-040F 
מברשת מבחנה מניילון Eisco  פישר סיינטיפיק  S13962
פקקי גומי דו-חוריים של פישרברנד פישר סיינטיפיק  תלוי בגודל ו-nbsp;
קטמין (10 מ"ג/מ"ל) Midwest Veterinary Supply 275.22100.3 
MLL עד קצה צינור 6 מ"מ (נירוסטה) Cadence Science 6547IND 
קצה צינור MLL עד 8 מ"מ (נירוסטה) Cadence Science 6549IND 
ספוג גזה MVet לא ארוג 4x4 4 שכבות;  Midwest Veterinary Supply   000.30156.2 
אלכוהול איזופרופיל MVet 70% Midwest Veterinary Supply 000.50054.3 
מלקחיים המוסטטיים של MVet Kelly 5.5" ישרים  Midwest Veterinary Supply 000.36800.2 
נתרן הפארין (1000 U/mL) Midwest Veterinary Supply 191.46701.3 
נתרן פנטוברביטל (390 מ"ג/מ"ל) Midwest Veterinary Supply 749.20000.3     
קשיות מפלדת אל-חלד  הובי לובי  1893635 
טלאזול (100 מ"ג/מ"ל) Midwest Veterinary Supply   275.40000.3 
זילזין (100 מ"ג/מ"ל) Midwest Veterinary Supply   310.01150.3 

מקורות

  1. Almond, G. W. Research applications using pigs. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 12 (3), 707-716 (1996).
  2. Sageritz, C. P., Vallier, L. Cell culture. Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. , 151-172 (2017).
  3. Mothes, W., Sherer, N. M., Jin, J., Zhong, P. Virus cell-to-cell transmission. Virol. J. 84 (17), 8360-8368 (2010).
  4. Stærk, K., Langhorn, L., Palarasah, Y., Andersen, T. E. A method for collecting high numbers of blood samples in standard vacuum tubes from non-heparinized pigs. Lab Anim. 57 (3), 336-340 (2023).
  5. Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
  6. Schwartz, W. L., Smallwood, J. E. Collection of blood from swine. N Z Vet J. 25 (9), 237-238 (1977).
  7. Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. J Vis Exp. (130), e55852(2017).
  8. Calvert, G. D., Scott, P. J., Sharpe, D. N. Percutaneous cardiac puncture in domestic pigs. Aust Vet J. 53 (7), 337-339 (1977).
  9. Costea, R., Ioana, E., Pavel, E. Pig sedation and anesthesia for medical research. J Animals. 13 (24), 3807(2023).
  10. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Appendix 3: Appendix 3B. , (2001).
  11. Veterinary ergonomic guidelines. , American Veterinary Medical Association. https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/veterinary-ergonomic-guidelines (2025).
  12. Velazquez-Salinas, L., et al. Confirming the absence of parental African swine fever virus as a potential contaminant of recombinant live attenuated ASF vaccines. Biologicals. 83, 101685(2023).
  13. Soleimani, S. A review of the establishment of the seed lot system in the production of biological products and its importance. Arch Razi Inst. 77 (6), 2023-2035 (2022).
  14. Anil, M. H., Whittington, P. E., McKinstry, J. L. The effect of the sticking method on the welfare of slaughter pigs. Meat Sci. 55 (3), 315-319 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

איסוף דם בנפח גדול מחזירים ליישומים במבחנה : שימוש בקנולציה תוך לבבית ובמשאבת ואקום כהליך סופי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.