Method Article

הנדסת 3D Flipwell לפיתוח מערכות אסינכרוניות לטיפולים טוקסיקולוגיים ואימונומודולטוריים בתאי חיידקים, מעיים ומערכת החיסון

DOI:

10.3791/68701

⸱

October 17th, 2025

 , 
1Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 2MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט עם שלבי מפתח להנחיית ההנדסה והניצול של 3D Flipwell. אנו מתארים ומראים כיצד להרכיב את ערימות התוספות של תרבית משותפת ולהשתמש בהן לתרבית משותפת של שכבות מרובדות של חיידקי מעיים, אפיתל מעיים ומקרופאגים כדי לדגמן את סביבת רירית המעי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לחקור את התפקידים של הפרשה חיידקית בקיטוב תאי חיסון והומאוסטזיס ברירית המעי, פיתחנו מודל תרבית משותפת תלת מימדי באמצעות תוספות זמינות מסחרית בפורמט מוערם גב אל גב. קראנו למערכת זו 3D Flipwells, ותרבית משותפת בהצלחה חיידקים, אפיתל המעי הגס ותאי חיסון בשכבות מרובדות כדי לסכם את המיקרו-סביבה של רירית המעי. מערכת תרבית משותפת זו מאפשרת זריעה של תאי אפיתל המעי הגס בצד אחד של הממברנה ומונוציטים לא מובחנים שאינם נדבקים בצד השני, מה שמאפשר התקדמות סינכרונית של קיטוב אפיתל המעי הגס, היווצרות ריר והתמיינות וקיטוב מונוציטים-מקרופאגים בתוך תרבית משותפת אחת ללא צורך בניתוק וציפוי מחדש של מקרופאגים מובחנים מראש. מערכת זו קלה לבנייה ודורשת רק כמה חומרים וכלים זמינים. בדקנו את התועלת שלו על ידי ניתוח התגובות של רכיבי תרבית משותפת לספיפטרין (SEP), המבשר האנדוגני של BH4 (טטרה-הידרו-ביופטרין) - קופקטור של תחמוצת החנקן סינתאז (NOS). הראינו שטיפול SEP ב-3D Flipwell גרם להיווצרות ביופילם על ידי חיידקי מעיים, ייצור ריר על ידי אפיתל המעי הגס וקיטוב פרו-אימונוגני של מקרופאגים. זה הצביע על כך ש-SEP הפעיל הפעלה של מנגנון הגנה רירית באמצעות דיבור צולב בין רכיבים תאיים שונים. יש צורך בניסויים נוספים כדי לחקור את תפקידה של תקשורת רירית המובילה לתכנות מחדש של תאי החיסון ולהעריך את התועלת של מערכת קו-תרבית זו לסינון טיפולים אימונומודולטוריים חדשים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דיבור צולב בין תא חיסוני למיקרוביום המעי משפיע מאוד על יעילותם של טיפולים שונים במחלות. דיבור צולב כזה משתנה באופן ניכר על ידי גירויים חיצוניים, כולל אך לא רק הפרעות מטבוליות מארח, שינויים תזונתיים, ביטוי מחלות וטיפול תרופתי. שינויים אלה עלולים להוביל לחוסר איזון בהרכב המיקרופלורה, מצב המכונה דיסביוזה 1,2,3.

כדי להבין טוב יותר את האינטראקציות בין חיידקים לתאי חיסון מארחים במעיים, פותחו מערכות קו-תרבית משוכללות על ידי קבוצות שונות בניסיון לסכם את הסביבה הרירית של המעי. ממערכת המעיים על השבב שפותחה על ידי Kim et

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 3D הנדסת Flipwell

  1. כל העבודה צריכה להיעשות בתוך ארון תרבית תאים. הנח את כל האספקה בתוך הארון.
  2. פותחים את מכסה צלחת הפטרי ומניחים בצד. פתח את להב האזמל ממעטפת המגן שלו והנח אותו על קצה תחתית צלחת הפטרי. הקפידו על סטריליות.
    זהירות: נדרש טיפול זהיר בלהב האזמל. השתמש בכפפות עמידות בפני חיתוך ומחוזקות בסיבים כדי להגן על הידיים במידת הצורך.
  3. פתח את אריזת המגן הסטרילית של התוספת המסחרית בת 12 הבארות. הקפידו על סטריליות. קח סט פינצטה סטרילית. תפוס בעדינות את התוספת והסר אותה מהאריזה.
  4. החזק את התוספת כך שתחתיתה פונה כלפי מעלה. ביד השנייה, קח את להב האזמל הסטרילי והביא אותו אל התוספת.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לקבוע את הרלוונטיות הביולוגית של תרביות משותפות של Flipwell של חיידקי מעיים, אפיתל המעי הגס ומקרופאגים, טיפלנו בתרבויות המשותפות עם sepiapterin (SEP), מודולטור של חילוף החומרים של ארגינין, כדי לקדם את ייצור תחמוצת החנקן 9,10,11 בהשוואה ל-DMSO הבקרה. קבענו את ההשפעות של טיפול SEP על כל מרכיב של תרביות משותפות באמצעות מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי (IF) ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). צביעה הראת.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לשחזר את ארכיטקטורת רירית המעי במבחנה, תכננו מערכת תרבית משותפת פשוטה הכוללת שכבות מרובדות של חיידקי מעיים, תאי אפיתל של המעי הגס המייצרים ריר ומקרופאגים. מערכת רב-תרביות זו אפשרה לנו לחקור את ההשפעות של דיבור צולב בין הפרשות החיידקים, אפיתל המעיים והמקרופאגים על השראת תכנות מחדש אימונוגני ומנגנוני הגנה רירית.

אחת האזהרות החשובות ליצירת Flipwells תלת מימדיים היא שההרכבה חייבת להתבצע בסביבה סטרילית, ולאחר מכן עיקור UV במשך מספר ימים לפני זריעת התאי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים. המחברים מתנערים בזאת מכל אחריות, בין אם מפורשת או משתמעת, במידה המרבית המותרת על פי חוק. בשום פנים ואופן לא יישאו המחברים, בין אם על פי כל חוק, חוזה, נזיקין או כל תיאוריה משפטית אחרת, לכל נזק מיוחד, מקרי, עקיף, עונשי, מרובה או תוצאתי הנובע או קשור לשימוש בכלים בבניית ה-Flipwells, שימוש בריאגנטים של BSL, קווי תאים, תרביות חיידקים, שימוש במערכת Flipwell בסביבה אנאירובית בתא אנאירובי. הגבלת אחריות זו כוללת, בין היתר, כל אופן לא מפורט של שימוש ב-Flipwell שאינו מתואר במפורש כאן.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר הראשי מביע הכרת תודה כנה לד"ר סאורי פורוטה על כישורי החונכות המעולים שלה, הדרכה ותמיכה מתמשכת למרחקים ארוכים, ותכנון פרויקטים מיומן ומתמשך המטפחים הזדמנויות למידה פנטסטיות. המחברים מודים גם לד"ר ונדנה שארמה על המומחיות וההדרכה במיקרוביולוגיה ולד"ר ואני ר. פרננדו על הכנת מקרופאגים THP-1.  בנוסף, המחברים מודים לד"ר אנדרו קליינהנץ וויליאם ט. גאנינג מהמתקן למיקרוסקופיה אלקטרונית, ולקסנדרה זמורה וקריסטין קירשבאום ממרכז המכשור באוניברסיטת טולדו על הצעות בונות להדמיית EM. עבודה זו נתמכה על ידי קרן הסטארט-אפ מקמפוס מדעי הבריאות של אוניברסיטת טולדו, המכללה לרפואה ומדעי החיים, המחלקה לביולוגיה של הסרטן ועד S.F; מענק מחקר חוזר לסרטן באוהיו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.4% PFA (ראו מתכון ב-Reagents and Solutions)מתואר בטקסט
פיפטה סרולוגית בנפח 10 מ"לקורנינג4488
פלטת TC עם 12 בארים,  קוסטארקורנינג3513
צינורות חרוטיים בגודל 15 מ"ל, SpectraTubeאלקלי סיינטיC2715
200 ומיקרו; טיפים ו-nbsp;USA Scientific1111-1700
תוספות ל-24 בארות - תוספות תרבית לצלחות עם 24 בארות, PET 0.4 ומיקרו; m ברנדטק סיינטיפיק782710
תלת-ממד פליפלוול מוכן, מחוטא ב-UV  תוצרת במעבדה
4% PFA (ראו מתכון ב-Reagents and Solutions)מתואר בטקסט
ציר ספיאפטרין 50 מ״מ (SEP, ראו מתכון ב-Rečets and Solution)קריירה בחברת הנאן כימיקליםCAS#: 17094-01-8
צינורות חרוטיים בקוטר 50 מ"לגריינר ביו-וואן227261
פיפטה סרולוגית בגודל 5 מ"לקורנינג4487
70-95% אתנול (אלכוהול אתילי)דיקון לאבס04-355-151
נייר אלומיניוםפישר סיינטיפיק01-213-100
מחטי האכלה לבעלי חיים, 20 גייג' 1.5" אורך, לשימוש חד-פעמי פישר סיינטיפיק01-208-87
בופר דילול נוגדנים (ראו מתכון ב-Reagents and Solutions)מתואר בטקסט
תא תא אטופלואור תרמופישר סיינטיפיקA7816
סרט אוטוקלבפישר סיינטיפיק15-901-111
בזני Bacillus subtilis wt (3A1T) במאגר גליצרול ()מרכז המלאי הגנטי של חיידקים (https:// bgsc. org/
כפפות BioGrip ורודות ללא אבקת ניטריל ללא לטקסייצור באיכות גבוההP2810
בופר חסימה (ראו מתכון ב-Reagents and Solutions - 10% סרום עזים רגיל ב-PBS)מתואר בטקסט
מאגר חסימה (ראו מתכון ב-Reagents and Solutions)מתואר בטקסט
מיקרוסקופ ברייטפילד (ניקון או מקביל) Eclipse Ts2ניקוןTS2
תאי Caco-2ATCCHTB-37
חממת תרביות תאים, 37 מעלות; C, 5% CO2 (Eppendorf CellXpert)אפנדורף6734010015
צנטריפוגה (אפנדורף, צנטריפוגה 5804/5804 R או שווה ערךאפנדורף22622501
צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל SpectraTubeאלקלי סיינטיC2750
תוספות תרבית לפלטת 12 בארות, PET, 0.4 ומיקרו; m, סטריליBrandTech Scientific, BRAND Insert 2in1, BIO-CERT782730
מדיום התקנה DAPI VectaShieldמעבדות וקטורH-1000
תחתית צלחת פטרי עמוקה, 100 x 25 מ"מ צלחת פוליסטירן עמוקה ניתנת לערום, סטרילית USA Scientific8609-0625
דרומונד פיפט אייד XPדרומונד  4-000-101
צנטריפוגה אפנדורף 5804 עם רוטור דלי מתנדנד לצינורות קוניים בנפח 50 מ"לאפנדורף22622501
מלקחיים, פלדת אל-חלד, אוטוקלב סטרילי, סטים כפוליםVWR82027-438
מלקחיים, פלדת אל-חלד, אוטוקלב סטרילי, סטים כפולים, מלקחיים לדוגמהVWR82027-438
בקבוק זכוכית 500 מ"לקורנינג 4980-500
המציטומטר (נויבאואר עם מחליפות כיסוי)תרמו פישר סיינטיפיק50-312-90
תאי HT-29-MTX-E12מיליפור סיגמא12040401
ImmunoPen (אופציונלי)פישר סיינטיפיק4021761EA
כפפות מבוססות קבלר או כפפות עמידות לחיתוך אחרות (אופציונלי)חנות כלי עבודה או אמזון
קלטת מעבדה או סרט משלוחפישר סיינטיפיק  159015R
מכסה מנוע זרימה למינרי סדרה 1300 A2 BSC Class IIתרמופישר סיינטיפיק1375
מכסה זרימה למינרי עם אור UV SterilGARDחברת בייקרSG403A-HE
הוכחת ממס על ידי סמניםVWR52877-310 או 95042-566
מדיה לתאי Caco-2 (מבוססת סוכר גבוה DMEM, ראו מתכון ב-Reacts and Solutions)תואר ב-  טקסט
מדיה לתאי HT-29 (DMEM High Glucose, ראו מתכון ב-Reacts and Solutions)מתואר בטקסט
מדיה לתאי THP-1 (RPMI, ראו מתכון ב-Reagents and Solutions)מתואר בטקסט
צינור מיקרוצנטריפוגה, 1.7 מ"ל, סטרילי אלקלי סיינטיC3017-ST
צינורות מיקרוצנטריפוגהתרמו פישר3451
מדיית מילר LB (ראו מתכון ב-Reagents and Solutions)סיגמא-אלדריץ'  L3522
פליירים עם אף מחט, סטים כפוליםחנות כלי עבודה או אמזון
כפפות ללא אבקת ניטריל ללא לטקס Aurelia AmazingMidSci92885
מכסי צלחת פטרי, צלחת פטרי סטרילית בסגנון 100x15 מ"מקורנינג בע"מ351029
פורבול מיריסטאט אצטט (PMA) (100 ng/μ l, ראו מתכון ב-Reagents and Solutions) InvivoGenTlrl-pma
טיפים לפיפט (10 ומיקרו; l, 200 ומיקרו; l, 1000 ומיקרו; l) PurePoint או מקבילאלקלי סיינטיפיק ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
ניילון נצמדמכולת
תמיסת קולגנאז עובדת Purecol (100 ומיקרו; g/mL)ביומטריקס מתקדם5005-100ML
כיסוי עגול #1 1 אונקיות (Corning Float Glass או Fisherbrand)קורנינג או פישרברנד50143822 או 12-546-2 25CIR-2
להבי סקלפל, סטריליים, חד-פעמיים מופק או נוצה #10AJ136 או 2975#10
ספיאפטרין (SEP, 100 ומיקרו; M, ראו מתכון ב-Reagents and Solution)קריירה בחברת הנאן כימיקליםCAS#: 17094-01-8
חממת רעידות מוגדרת ל-220 סל"ד 37 מעלות לדקה; Cאפנדורף ניו ברונסוויק סיינטיפיקM12990080
סיליקון עם דבק סיליקון Loctite Clear IDH או 3M Marine Grade Cell Silicon Clear עם קצה אףלוקטיט או 3M1745658 או PN08019
פיפט חד-ערוצי Eppendorf Research Plus, 200 ומיקרו; lאפנדורף
פיפטות חד-ערוציות (10 ומיקרו; l, 200 ומיקרו; l, 1000 ומיקרו; l)אפנדורף2231001122
ספקטרופוטומטר NanoDropOneCתרמו פישר סיינטיפיק13-400-519
מים סטריליים דה-יוניים    
סרין בופר סטרילי עם זרח (PBS) ללא סידן או מגנזיוםפישר סיינטיפיק  BSS-PBS-1X6
מזרק 3 מ"ל או 5 מ"ל עם Luer-Lok TipBD309585 או 309603
תאי THP-1ATCCTIB-202
פיפטות העברה, סטריליותפישרברנד13-711-20
טריטון X-100מיליפור סיגמאX100
תמיסת טרייפן בלוVWR97063-702
Trypsin-EDTA 0.25%תרמו פישר סיינטיפיק25200-056
מגבונים Kimwipes Professional עם LintGuard Anti-Stat Polyshieldקימברלי-קלארק34120
<חזקים>נוגדנים ראשיים: 
אנטי-אנושי CD163אבקאם156769
CD68 אנטי-אנושיNovus BiologicalsNB100-683-0.1 מ"ג
אנטי-אנושי CD80, E3Q9Vטכנולוגיות איתות סלולריות15416
אנטי-אנושי CK20 טכנולוגיות חייםPA5-82875
MUC2 אנטי-אנושי (996/1)תרמופישרMA5-12345
<נוגדנים חזקים>נוגדנים משניים:
Alexa Fluor 488 Goat נגד Rabbit IgG (ל-CD80 ו-CK20)תרמופישרA11008
Alexa Fluor 594 IgG נגד עכבר עזים (ל-MUC2 ו-CD68 או CD163)תרמופישרA11005
<חזק>מגבים ופתרונות:   
<חזק>Caco-2 בינוני:
DMEM עם רמות גלוקוז גבוהות (4.5 גרם לליטר) ו-1% (v:v) גלוטמקס  תרמו פישר סיינטיפיק35050061
FBS 10% (v:v) מנוטרל חוםסיגמאF2242-500ML
חומצות אמינו לא חיוניות 1% עבור מדיום Caco-2תרמו פישר סיינטיפיק11140076
סטרפטוק עט 1% (v:v)סיגמאF2242-500ML
<חזק>HT-29-MTX בינוני
DMEM עם רמות גלוקוז גבוהות (4.5 גרם לליטר) ו-1% (v:v) גלוטמקס  תרמו פישר סיינטיפיק35050061
FBS 10% (v:v) מנוטרל חוםסיגמאF2242-500ML
HEPES (ריכוז סופי של 10 מ"מ)תרמו פישר סיינטיפיק15630080
סטרפטוק עט 1% (v:v)סיגמאF2242-500ML
<חזק>THP-1 בינוני:
סרום בקר עוברי מנותק חום FBS (10% v:v)Sigma F2242-500ML
גלוקוז (ריכוז סופי של 4.5 גרם לליטר)תרמו פישר סיינטיפיקA249001
GlutaMax 1% (v:v)  ריכוז סופי של 2 מ"מתרמו פישר סיינטיפיק35050061
HEPES (ריכוז סופי של 10 מ"מ)תרמו פישר סיינטיפיק15630080
סטרפטוק עט 1% (v:v)סיגמאF2242-500ML
מכון רוזוול פארק ממוריאל (RPMI)-1640 בינוניתרמו פישר סיינטיפיק11875119
נתרן פירובט (ריכוז סופי של 1 מ"מ)תרמו פישר סיינטיפיק11360070
Purecol תמיסת קולגנאז עובדת (דילול ל-1:30 100 ומיקרו; g/ML):
פיורקול 3 מ"ג/מ"ל 1:30 עד 100 ומיקרו; g/ml ביומטריקס מתקדם5005-100ML
מים דה-יוניים סטריליים
L-Sepiapterin תמיסת חומר (50 mM):
L-Sepiapterin (SEP)קריירה בחברת הנאן כימיקליםCAS#: 17094-01-8
<חזק>פורבול פירבול מיריסטאט אצטט (PMA, 5 מ"ג/מ"ל)InvivoGenTlrl-pma
BSA 1% סרום בקר אלבומין סיגמא-אלדריץ'5470
DMSO Sigma D2650
מילר LBסיגמא-אלדריץ'  L3522
סרום תקין מאותו מין כמו הנוגדן המשניSigma NS02L-1ML
פאראפורמלדהידסיגמא-אלדריץ'441244

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
  2. Xuan, C., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D Co CultureFlipwell EngineeringGut Mucosal ModelBacterial SecretomeImmune Cell PolarizationColon Epithelial CellsMacrophage PolarizationBiofilm FormationSepiapterin TreatmentImmunofluorescent Staining

Related Articles