הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הנדסת 3D Flipwell לפיתוח מערכות אסינכרוניות לטיפולים טוקסיקולוגיים ואימונומודולטוריים בתאי חיידקים, מעיים ומערכת החיסון

649 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68701

⸱

17 באוקטובר 2025

 , 
1Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 2MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט עם שלבי מפתח להנחיית ההנדסה והניצול של 3D Flipwell. אנו מתארים ומראים כיצד להרכיב את ערימות התוספות של תרבית משותפת ולהשתמש בהן לתרבית משותפת של שכבות מרובדות של חיידקי מעיים, אפיתל מעיים ומקרופאגים כדי לדגמן את סביבת רירית המעי.

תקציר

כדי לחקור את התפקידים של הפרשה חיידקית בקיטוב תאי חיסון והומאוסטזיס ברירית המעי, פיתחנו מודל תרבית משותפת תלת מימדי באמצעות תוספות זמינות מסחרית בפורמט מוערם גב אל גב. קראנו למערכת זו 3D Flipwells, ותרבית משותפת בהצלחה חיידקים, אפיתל המעי הגס ותאי חיסון בשכבות מרובדות כדי לסכם את המיקרו-סביבה של רירית המעי. מערכת תרבית משותפת זו מאפשרת זריעה של תאי אפיתל המעי הגס בצד אחד של הממברנה ומונוציטים לא מובחנים שאינם נדבקים בצד השני, מה שמאפשר התקדמות סינכרונית של קיטוב אפיתל המעי הגס, היווצרות ריר והתמיינות וקיטוב מונוציטים-מקרופאגים בתוך תרבית משותפת אחת ללא צורך בניתוק וציפוי מחדש של מקרופאגים מובחנים מראש. מערכת זו קלה לבנייה ודורשת רק כמה חומרים וכלים זמינים. בדקנו את התועלת שלו על ידי ניתוח התגובות של רכיבי תרבית משותפת לספיפטרין (SEP), המבשר האנדוגני של BH4 (טטרה-הידרו-ביופטרין) - קופקטור של תחמוצת החנקן סינתאז (NOS). הראינו שטיפול SEP ב-3D Flipwell גרם להיווצרות ביופילם על ידי חיידקי מעיים, ייצור ריר על ידי אפיתל המעי הגס וקיטוב פרו-אימונוגני של מקרופאגים. זה הצביע על כך ש-SEP הפעיל הפעלה של מנגנון הגנה רירית באמצעות דיבור צולב בין רכיבים תאיים שונים. יש צורך בניסויים נוספים כדי לחקור את תפקידה של תקשורת רירית המובילה לתכנות מחדש של תאי החיסון ולהעריך את התועלת של מערכת קו-תרבית זו לסינון טיפולים אימונומודולטוריים חדשים.

מבוא

דיבור צולב בין תא חיסוני למיקרוביום המעי משפיע מאוד על יעילותם של טיפולים שונים במחלות. דיבור צולב כזה משתנה באופן ניכר על ידי גירויים חיצוניים, כולל אך לא רק הפרעות מטבוליות מארח, שינויים תזונתיים, ביטוי מחלות וטיפול תרופתי. שינויים אלה עלולים להוביל לחוסר איזון בהרכב המיקרופלורה, מצב המכונה דיסביוזה 1,2,3.

כדי להבין טוב יותר את האינטראקציות בין חיידקים לתאי חיסון מארחים במעיים, פותחו מערכות קו-תרבית משוכללות על ידי קבוצות שונות בניסיון לסכם את הסביבה הרירית של המעי. ממערכת המעיים על השבב שפותחה על ידי Kim et al.4 ועד להרכבה מורכבת יותר באמצעות מצע סופג מיוחד5, מערכות קו-תרבית אלו אינן פשוטות לבנייה ואינן מסוגלות לשמור על הספקטרום המלא של הרכיבים המופרשים עקב ספיגתם על ידי מצע התרבות המשותפת. נואל ועמיתיו פיתחו אפוא מערכת תרבית משותפת חלופית למודל רירית המעי שקל יחסית לייצר6. מערכת חדשה זו משתמשת בתוספת תרבית אחת עם תאי אפיתל של המעי הגס שנזרעו בצד אחד של הממברנה ומקרופאגים מובחנים מראש בצד השני6. עם זאת, זריעת מקרופאגים מובחנים מראש דורשת התמיינות מוקדמת שלהם במקום אחר ודיסוציאציה וציפוי מחדש שלהם לתרבית משותפת, מה שעלול להשפיע על שלמותם התאית ויכולת הקיום שלהם.

על ידי שילוב שיפורים למערכות קודמות אלה, פיתחנו מערכת תלת מימדית (תלת מימדית) רב-שכבתית חדשה שכינינו מערכת 3D Flipwell 7,8. מערכת זו מורכבת מתוספות תרבית תאים מוערמות גב אל גב, מה שמאפשר התקדמות סינכרונית של קיטוב אפיתל המעי הגס, היווצרות ריר, התמיינות מקרופאגים וקיטוב בתוך תרבית משותפת אחת. מערכת זו מאפשרת לנו לבחון שינויים בסביבת רירית המעי ואינטראקציות בין חיידקי המעיים, תאי האפיתל ותאי החיסון. בנוסף, ניתן להשתמש במערכת זו כדי לבחון את ההשפעות של גירויים חיצוניים, כולל מטבוליטים חיידקיים, רעלים, חומרים מזינים תזונתיים ותרופות, על רירית המעי ושאר הגוף 7,8.

על ידי שימוש במערכת ההכנסה החדשנית של תרבית משותפת, בחנו את התגובות של רכיבים תאיים שונים לספיפטרין (SEP), המבשר האנדוגני של BH4 (טטרה-הידרו-ביופטרין) - קופקטור של תחמוצת החנקן סינתאז (NOS). הראינו בעבר כי SEP מפעיל פעילויות פרו-אימונוגניות על מיקרו-סביבת גידול השד על ידי תכנות מחדש של מקרופאגים הקשורים לגידול לסוג פרו-אימונוגני 9,10,11,12. הראינו כי SEP גורם לאירועים סינכרוניים של היווצרות ביופילם על ידי חיידקי מעיים, ייצור ריר על ידי אפיתל המעי הגס וקיטוב פרו-אימונוגני של מקרופאגים בתרביות משותפות, מה שמעיד על הפעלת מנגנון הגנה רירית7. ממצאים אלה תומכים בתועלת של מערכת תרבית משותפת חדשה זו במידול המיקרו-סביבה הרירית של המעי7.

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק הוראות שלב אחר שלב לבניית תרבית משותפת חדשה זו של חיידקי מעיים, אפיתל מעיים, ריר ותאי חיסון כדי לדגמן את סביבת רירית המעי. אנו גם מדגימים כיצד אנו יכולים לדמיין את הדיבור ההדדי של תאים בתרבית משותפת בהשפעת גירוי חיצוני, למשל, טיפול ב-SEP. יש צורך במחקר נוסף המשתמש במערכת קו-תרבית זו כדי לקבוע רכיבים תאיים מופרשים המאפשרים את האינטראקציות בין תאים שונים בתרבית משותפת, כמו גם כדי לבחון את התועלת של מודל קו-תרבית זה לסינון תפוקה גבוהה של טיפולים חדשים. יתר על כן, כדי להשיג את המצב הפיזיולוגי של הסביבה הרירית של המעי, מערכת קו-תרבית זו תדרוש שינויים נוספים. לדוגמה, כדי לתרבית משותפת של תאי יונקים אירוביים עם חיידקים אנאירוביים, חיידקים אלה יצטרכו לעבור תרבית נפרדת במדיה אנאירובית המסירה חמצן או לכסות פרפין נוזלי המונע כניסת חמצן, כפי שדווח במקום אחר. תועלת מתקדמת כזו ויישום של מערכת קו-תרבותית זו יצדיקו חקירה נוספת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. 3D הנדסת Flipwell

  1. כל העבודה צריכה להיעשות בתוך ארון תרבית תאים. הנח את כל האספקה בתוך הארון.
  2. פותחים את מכסה צלחת הפטרי ומניחים בצד. פתח את להב האזמל ממעטפת המגן שלו והנח אותו על קצה תחתית צלחת הפטרי. הקפידו על סטריליות.
    זהירות: נדרש טיפול זהיר בלהב האזמל. השתמש בכפפות עמידות בפני חיתוך ומחוזקות בסיבים כדי להגן על הידיים במידת הצורך.
  3. פתח את אריזת המגן הסטרילית של התוספת המסחרית בת 12 הבארות. הקפידו על סטריליות. קח סט פינצטה סטרילית. תפוס בעדינות את התוספת והסר אותה מהאריזה.
  4. החזק את התוספת כך שתחתיתה פונה כלפי מעלה. ביד השנייה, קח את להב האזמל הסטרילי והביא אותו אל התוספת.
  5. בעזרת תנועה בצורת C, חודרים את הממברנה בקצה ומחליקים בעדינות את להב האזמל סביב תחתית התוספת, תוך שמירה על קשר הפלסטיק.
  6. חותכים את קרום ה-PET ומשתמשים בסט הפינצטה השני כדי להסיר את הממברנה. השלך את הממברנה.
  7. השתמש בלהב האזמל כדי לגרד את כל שבבי הממברנה הלבנה כדי לנקות את הקצה והשפה של התוספת. החזר בזהירות את התוספת החדשה שהוכנה בחזרה לאריזה הסטרילית המקורית שלה.
  8. לאחר מכן, קח את צינור דבק הסיליקון וחתך את קצה הזרבובית עם להב האזמל כדי ליצור פתח. פתח זה צריך להיות ברוחב 3 מ"מ.
  9. בדוק את גודל החרוז על ידי סחיטת הדבק החוצה על מגבת הנייר. החרוז צריך להיות בעובי 2-3 מ"מ. כוונן את הזרבובית אם החרוז קטן מ-2 מ"מ וקשה לסחוט אותו מהצינור.
    1. דרך נוספת למרוח ולמרוח את חרוז הדבק היא להשתמש בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר כשקצהו מנותק. חותכים 3-4 מ"מ עם מספריים ומשתמשים במרית כדי לפזר את הדבק סביב שפת התוספת.
  10. קלף את כיסוי המגן מהתוספת השנייה והניח בצד. הרם מלקחיים סטריליים, תפוס את התוספת השנייה מאריזתו כשהממברנה פונה כלפי מעלה.
  11. מורחים בעדינות חרוז סיליקון דק של 2-3 מ"מ לאורך כל תחתית התוספת, נזהרים לא לגעת בקרום.
  12. הרם את הסט השני של מלקחיים סטריליים והרם בזהירות את התוספת הראשונה (ללא הממברנה) מחבילת המגן שלה.
  13. קרבו את שני התוספות מלמטה למטה כך שהשוליים התחתונים יתיישרו. דבק עודף עלול להיאלץ החוצה מהמפרק. השאירו את הדבק לייבוש. ניתן לנתק אותו לאחר ייבוש הדבק לחלוטין (24-72 שעות). אפשרות זו היא אופציונלית.
    הערה: המחסנית הסופית של Flipwell Co-culture Insert (FCI) צריכה להיות בעלת קרום PET אחד בלבד באמצע. עדיף למקם את הידיות בצורת L של התוספות המסחריות כך שהן ממוקמות במרחק של 180 מעלות זו מזו (בשעה 3 ו-6). עקוב אחר המלצות יצרן דבק הסיליקון לזמן הייבוש, שעשוי להיות 24-72 שעות בהתאם למותג. עבור רוב הדבקים המבוססים על סיליקון, עדיף זמן ייבוש של 72 שעות. ניתן לייבש את הדבק גם למשך 24 שעות בלבד עם עיקור UV.
  14. כאשר ערימת ה-FCI מודבקת, הנח אותה בתוך האריזה הסטרילית המקורית לייבוש או בתוך צלחת פטרי עמוקה. השתמש במכסה מצלחות הפטרי שצוינו כדי לכסות את מכלול הערימה.
  15. כדי לעקר את מכלולי הערימה, פתח את מכסה צלחת הפטרי. השתמש במלקחיים סטריליים כדי למסור את ערימת ה-FCI על שפת צלחת הפטרי העמוקה שצוינה.
  16. סגור את אבנט הזכוכית של ארון ה- BSC. הפעל את נורת ה-UV. התרחק מהארון ליתר ביטחון ועקר כל צד של הממברנה 30 דקות-שעה. כבה את אור ה-UV לאחר השלמת כל מחזור עיקור.
  17. מניחים את מכסה צלחת הפטרי (כמפורט) מעל צלחת הפטרי עם ערימות התוספות ומניחים בצד.

2. בדיקת דליפה לפני ציפוי קולגן

  1. הסר את מכסה צלחת הפטרי. הוסף 500 מיקרוליטר PBS סטרילי או מים נטולי יונים סטריליים.
    הערה: לסיוע חזותי, נעשה שימוש ב-DMEM כדי לסייע בהמחשת תקינות ערימות ה-FCI.
  2. מכסים את צלחת הפטרי. תן לזה לנוח למשך הלילה. בדוק את תקינות ה-FCI בבוקר. השלך את ה-FCI אם מתגלה דליפה. צור ערימות הוספה חדשות לפי הצורך.
  3. שאפו את הנוזל (PBS או מים) המשמש לבדיקה. מכסים את צלחת הפטרי במכסה.
  4. הניחו לערימות להתייבש (1-2 שעות) בתוך ה-BSC. אחסן את ה-FCI ב-BSC עד שהם מוכנים לשימוש או המשך לצפות אותם בקולגן לזריעת התאים הדבקים.

3. ציפוי קולגן של קרום Flipwell

  1. הכן מלאי עבודה של תמיסת הקולגן על ידי דילול תמיסת הקולגן המסופקת ב-3 מ"ג/מ"ל עד דילול של 1:30 ב-100 מיקרוגרם/מ"ל. הוסף 33 מיקרוליטר של תמיסת קולגן מתוצרת מסחרית ל-1 מ"ל של מים סטריליים נטולי יונים בצינור מיקרו-צנטריפוגה. מערבבים על ידי מערבולת.
    הערה: לנפח גדול יותר, הגדל והשתמש בצינור חרוטי של 15 מ"ל בהתאם למספר ערימות ההכנסה שיצופו משני צידי הממברנה. הפוך את זה לרענן בכל פעם. אין לעשות שימוש חוזר במלאי העבודה.
  2. פתח את מכסה צלחת הפטרי. תן ל-Flipwell לתלות את שפת צלחת הפטרי. יש להוסיף בזהירות 200 מיקרוליטר של תמיסת קולגן לצד אחד של ערימת התוספות.
  3. תן לזה לשבת שעה. שאפו את תמיסת הקולגן. הוסף 200 מיקרוליטר PBS סטרילי. שאפו PBS.
  4. מכסים את צלחת הפטרי במכסה ונותנים לקרום להתייבש במשך 60 דקות בתוך הארון. כשהממברנה יבשה, קחו את המלקחיים/פינצטה הסטריליים והפכו את ה-Flipwell לצד הנגדי ותנו לו לתלות על שפת צלחת הפטרי.
  5. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת קולגן לצד הלא מצופה (כעת העליון) של הממברנה. תן לזה לשבת שעה.
  6. שאפו את תמיסת הקולגן. הוסף 200 מיקרוליטר PBS סטרילי. שאפו PBS. מכסים את צלחת הפטרי במכסה ונותנים לקרום להתייבש במשך 60 דקות בתוך הארון. הניחו לערימת ה-FCI להתייבש למשך הלילה או לזרוע באותו היום.
    הערה: תקינות ציפוי הקולגן לא נבדקה בתנאי אחסון ארוכים. לאחר ציפוי מראש של ה-Flipwells, יש להשתמש בהם תוך 24 שעות.

4. בניית הכנסת חיידקים לתרביות חיידקים

  1. הנח שני סטים של מלקחיים סטריליים ואת 24 הבארות בתוך ה-BSC. פתחו בזהירות את התוספות והשאירו אותן בתוך האריזה הסטרילית שלהן.
  2. בעזרת פינצטה סטרילית, הרם את התוספת מהאריזה הסטרילית שלה. בעזרת הסט השני של פינצטה/מלקחיים, שברו את רגלי הפלסטיק הקטנות בתחתית התוספת.
  3. בדוק את התוספת של 24 בארות על ידי התקנתה בתוך אחת מערימות ה-FCI הסטריליות או תוספות מקוריות של 12 בארות.
  4. אם התוספת אינה מחליקה לתוך הבאר, השתמש שוב בפינצטה כדי לנתק חומר פלסטי נוסף מהשפה שבה השפה והרגליים נפגשות.
  5. בדוק את ההתאמה שוב עד שהתוספת של 24 הבארות מסוגלת להחליק לתוך באר ההכנסה של 12 הבארות. הנח את התוספת בתוך האריזה הסטרילית שלה או בתוך צלחת פטרי סטרילית.
  6. לעקר UV או אתנול את התוספת (לא חובה). מכסים את החבילה בחזרה או מכסים במכסה צלחת הפטרי עד שמוכן לשימוש.

5. בניית מחט

  1. הביאו את הכלים וכל הציוד לתוך BSC. החזק מחט בזהירות עם צבת האף.
  2. מדוד את המיקום של כל עיקול על המחט באמצעות סרגל. בעזרת הסט השני של צבת האף, אחזו במחט במיקום שנבחר וכופפו את המחט.
  3. צור את העיקול השני. כדי לסובב את המחט, אחזו במחט עם צבת בבסיס ובעיקול בצורת U וסובבו בכיוון ההפוך ליצירת טוויסט של 4-5 מ"מ. שלב זה הוא קריטי כדי להכניס בקלות את המחט לתוך ה-Flipwell להסרת בועות האוויר.
  4. הצמד את המחט למזרק סטרילי בגודל 3 או 5 מ"מ. עקר את המחט ואת בסיס המזרק ב -20 מ"ל של 70%-95% אתנול בתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל.
  5. משוך אתנול דרך המחט והמזרק כדי להבטיח שהמחט ובסיס המזרק מעוקרים.
  6. הסר את המזרק והמחט מהצינור החרוטי עם אתנול ותן לאוויר להתייבש על ידי מנוחה על צלחת פטרי. נקה את המחט באוויר לייבוש והשאיר אותה לייבוש מספר דקות.

6. זריעת קווי התאים של אפיתל המעי הגס Caco-2:HT29-MTX-E12

  1. התחל לגדל קווי תאים Caco-2 ו-HT29-MTX 2-3 שבועות לפני הניסוי בכלים נפרדים מצופים TC 100 מ"מ במצעי הגידול שלהם.
    1. עבור מדיה HT-29-MTX, השתמש ב-440 מ"ל של DMEM עם רמת גלוקוז גבוהה (4.5 גרם/ליטר) ו-1% (v:v) של חומרי גלוטמקס עם 50 מ"ל של 10% (v:v) של FBS מנוטרל בחום, 5 מ"ל של 1% (v:v) Pen Strep ו-5 מ"ל של HEPES 10 מ"מ ריכוז סופי.
    2. עבור מדיה Caco-2, השתמש ב-440 מ"ל של DMEM עם גלוקוז גבוה (4.5 גרם/ליטר) ו-1% (v:v) מדיה Glutamax עם 50 מ"ל של 10% (v:v) FBS מומת בחום, 5 מ"ל של 1% (v:v) Pen Strep ו-5 מ"ל של חומצות אמינו לא חיוניות.
      הערה: קבע את צפיפות הזריעה עבור קו התאים Caco-2 באמצעות בארות צלחת 12 בארות מצופות בתרבית רקמות. חשב את מספר הימים עד 100% מפגש בהתאם לצפיפות הזריעה ההתחלתית. אנו מספקים צפיפות זריעה כקו מנחה; עם זאת, זה ישתנה עם ניסוח מדיית הצמיחה, הספק וה-FBS בשימוש. שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח שכבה אחת לצד האפיתל של המעי של ה-Flipwell לאחר ציפוי תאי THP-1 וביצוע טיפולי חיידקים/SEP.
  2. כדי לעבור תאי Caco-2 ו-HT-29, שאפו את אמצעי התרבית. שוטפים עם 10 מ"ל PBS.
  3. נסה את התאים על ידי הוספת 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA. יש לדגור 5-10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2.
  4. הוסף 7 מ"ל ממצע הגידול המתאים לתא לצלחות. העבר תאים לצינורות חרוטיים סטריליים של 15 מ"ל.
  5. גלולה על ידי צנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 500 x גרם בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא.
  6. השהה מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיה HT-29 מבוססת DMEM מחוממת מראש. ספרו תאים בעזרת המציטומטר או מונה תאים.
  7. שלב את שני סוגי התאים תאי Caco-2:HT-29 ביחס של 9:1 בצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל או 50 מ"ל, תלוי במספר התאים הדרושים למספר הרצוי של Flipwells.
  8. השתמש ב-Flipwells מצופה מראש של קולגן עבור השלבים הבאים. תלו את ערימות ה-FCI המצופות מראש בקולגן על שפת צלחת הפטרי העמוקה.
  9. זרע 500 מיקרוליטר של 7.5 x 104 תאים לס"מ2 (2.6 x 105 תאים / 12 באר הכנסה) לכל הצד האפיקלי של Flipwell. חשב את ספירת התאים ההתחלתית על סמך מספר הערימות שנמצאות בשימוש. זה יכלול את שני סוגי התאים ביחס של 9:1.
  10. מכסים את המכלולים במכסה צלחת פטרי. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך הלילה עד שהתאים נצמדים. התאים מתחילים לייצר ריר בסביבות 7-10 ימים בתרבית. החליפו מדיה כל יומיים כדי לשמור על תרבויות.
    הערה: יש לחשב מראש את סך כל הימים בתרבית עם טיפולים. ההיפוך וצפיפות הזריעה הראשונית יהיו תלויים במשך זמן זה.

7. היפוך ה-3D Flipwell כהכנה לזריעת תאי THP-1

  1. כאשר תאי Caco-2:HT-29 מתחברים ומתחילים להתרבות (יש להעריך את המפגש המדויק על סמך המדיה/FBS המשמשת ומשך התרבית) אך אינם במפגש של 100%, הפוך את ה-Flipwell כדי לזרוע תאי THP-1 בצד השני של הממברנה.
    הערה: תאי THP-1 צריכים להיות מורחבים בתרבית נפרדת עד לנקודה זו, ומספרי התאים המדויקים הדרושים יוערכו על סמך מספר ערימות ה-FCI המשמשות.
  2. פתח את מכסה צלחת הפטרי ושאף את אמצעי ה-DMEM מהצד האפיקלי (אפיתל המעיים) של ערימת ה-FCI.
  3. בעזרת מלקחיים סטריליים, הרם את ה-Flipwell בזהירות על ידי הוו וסובב 180°. עם הסט השני של מלקחיים סטריליים, תפוס את ערימת ה-FCI בקרס השני שפונה כעת כלפי מעלה.
  4. הורד את המכלול בחזרה לתוך צלחת הפטרי ותלה את הוו מעל שפת צלחת הפטרי. אם לא מוכנים לזרוע את תאי ה-THP-1, הוסיפו מספיק מדיה לצלחת הפטרי העמוקה כדי להעלות את רמת המדיה ורק לחלק העליון של הממברנה.
    הערה: ה-Flipwell צריך להיות יציב במצב זה, ויש לשקול מיד זריעה עם תאי THP-1 ותוספת מדיה. שלבים אלה נעשים במהירות. יש לספור תאי THP-1 ולהיות מוכנים לציפוי. תאי THP1 נזרעו תחילה כדי להכביד על ערימת ה-FCI ליציבות רבה יותר ומשקל סופי. לאחר מכן נוספה מדיה DMEM לצלחת הפטרי העמוקה כדי להעלות את רמת המדיה לחלק התחתון של הממברנה. לאחר מכן נעשה שימוש במחט המותאמת אישית להסרת בועת האוויר, מה שייצב עוד יותר את ערימת ה-FCI ואיפשר את התאמות הנפח הסופיות.
  5. השתמש במחט כדי להסיר את בועת האוויר כמתואר בשלב הבא.

8. הסרת בועות אוויר

  1. יש לחטא מראש את המחט והמזרק באתנול ולייבש באוויר לפני השימוש (ראה שלב 5). צללו את בוכנת המזרק.
  2. החזק את ערימת ה-FCI בזרוע בעזרת מלקחיים סטריליים. הורד בזהירות את המחט פנימה ומתחת למכלול ההכנסה והנח בעדינות רבה את הקצה הרך של מחט הגוואג' עד לבועת האוויר.
  3. משוך בזהירות ולאט לאט את בוכנת המזרק כלפי מעלה וראה את בועת האוויר נעלמת לאט. עצור כאשר בועת האוויר בקוטר של כ-2 מ"מ, וזה מספיק כדי לשמור על כיסוי DMEM טוב לתאי האפיתל של המעי הגס.
  4. הסר בזהירות את המחט והמזרק מה-Flipwell. המשך למכלול ההכנסה השני בצלחת הפטרי העמוקה.

9. זריעה THP-1 וטיפול PMA

  1. הכינו מדיה THP1 עם 420 מ"ל של מכון רוזוול פארק ממוריאל (RPMI)-1640 בינוני, 50 מ"ל של 10% (v:v) FBS מומת חום, 5 מ"ל של גלוטמקס 1% (v:v), 5 מ"ל של HEPES (ריכוז סופי של 10 מ"מ), 11 מ"ל גלוקוז (4.5 גרם/ליטר ריכוז סופי), ו-5 מ"ל של Pen-Strep (1% v:v).
    הערה: יש לגדל תאי THP-1 במדיום תרבית מבוסס RPMI במשך מספר ימים לפני הזריעה בתוספות. בצע חישובי ספירת תאים לפני הזריעה והגדל את קנה המידה על סמך מספר ערימות ה-FCI שיש להשתמש בהן.
  2. הכן את תרחיף התאים על בסיס נפח של 500 מיקרוליטר וב-0.5 x 106 תאים לכל 500 מיקרוליטר של מדיה THP-1. אם יש צורך להשתמש ב-PMA לבידול וקיטוב, הוסף אותו למדיית RPMI ב-100 ננוגרם/מיקרוליטר.
    1. כדי לייצר PMA, יש להרכיב מחדש 5 מ"ג פורבול מיריסטאט אצטט (PMA) ב-1 מ"ל של DMSO כדי ליצור תמיסת מלאי של 5 מ"ג/מ"ל. מערבבים על ידי מערבולת. מכניסים לצינורות מיקרו-צנטריפוגה ב-20 מיקרוליטר כל אחד ומאחסנים ב-20 מעלות צלזיוס.
    2. כדי להשתמש ב-PMA, צור מלאי עובד ב-50 מיקרוגרם/מ"ל על ידי דילול של 1 מיקרוליטר של מלאי 5 מ"ג/מ"ל ב-99 מיקרוליטר (1:100) של מצע גידול מלא. הוסף 1 μL של מלאי עבודה ל-500 μL של חומרי הדפסה, או 20 μL של מלאי עבודה ל-10 מ"ל של חומרי הדפסה.
  3. תאי צנטריפוגה THP-1 ב-94 x גרם למשך 5 דקות ב-RT לגלולה. השעו מחדש ב-5-10 מ"ל של מדיית RPMI. ספור תאי THP-1 בכל שיטת ספירה מועדפת.
  4. צנטריפוגה שוב ב-94 x g למשך 5 דקות ב-RT. השעיה מחדש ב-0.5 x 106 תאים לכל 500 מיקרוליטר של מדיה THP-1.
  5. הוסף 500 מיקרוליטר של תרחיף תאי THP-1 לצד האפיקלי של ערימת הכנסת התרבות המשותפת. התאם את מדיית HT-29 לתאי האפיתל של המעי הגס על ידי הוספת מדיה לצלחת פטרי העמוקה.
  6. הסר את בועת האוויר בעזרת מחט גבאז' לפי שלב 8, במידת הצורך. תרבית את שני סוגי התאים בחממת תרבית התאים ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 100% לחות עד שתאי THP-1 נצמדים (בן לילה) ומתרבים במשך 1-2 ימים.
  7. התכוננו לבצע טיפולים עם SEP או תרופות אחרות או להתכונן לתוספות חיידקים (ראה שלב 4). התחל לגדל חיידקים יום אחד לפני היפוך ערימת ה-FCI הבא.

10. Flipwell Flip שני והסרת בועות אוויר עבור SEP ותוספות חיידקים

  1. פתח את מכסה צלחת הפטרי. שאפו את המדיה של RPMI מהצד האפיקלי. החזק את ה-Flipwell בזרוע בעזרת פינצטה סטרילית והרם את הערימה.
  2. סובב את הערימה הפוכה. בעזרת סט הפינצטה השני, החזק את מכלול הערימה על הזרוע הזמינה.
  3. הורד את הערימה לצלחת פטרי עמוקה וסטרילית חדשה ותלה מעל השפה. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיית DMEM לצד האפיתל האפיקלי/מעי כעת.
  4. הוסף מספיק מדיית RPMI לצלחת הפטרי העמוקה עד שהמדיה נמצאת רק בחלק העליון של הממברנה. נפח ה-RPMI הוערך בכ-40-55 מ"ל, אך הוא ישתנה בהתאם למספר ערימות ה-FCI המשמשות לכל צלחת פטרי עמוקה.
  5. הסר את בועת האוויר באמצעות שלב 8 והשאיר בועה של 2-3 מ"מ. התאם את מדיית ה-RPMI במידת הצורך. מכסים את הצלחת.
  6. תרבית עד שתאי האפיתל של המעי הגס מתחילים לייצר ריר. החליפו את המדיה באופן חלקי כל יומיים.
    הערה: אם תאי האפיתל של המעי הגס היו מתורבתים מספיק זמן וכבר ייצרו ריר, הם יכולים להמשיך לתוספת החיידקים או לטיפולים. אל תאפשר למדיה בתא התחתון לרדת מתחת לחלק התחתון של הממברנה של התוסף. הוסף עוד מדיית DMEM כדי לשמור על רמת המדיה בממברנה. השיטה האידיאלית להחלפת מדיה היא להוציא מחצית מהמדיה מהתא הבסיסי ולהשאיר נפח קטן של מדיה בתא האפיקלי כדי למנוע חדירת אוויר.
  7. עבור טיפולי SEP, הוסף SEP לריכוז הסופי של 100 מיקרומטר לבארות בשלב זה אם לא נעשה שימוש בתרבית החיידקים. אם משתמשים בתרבית חיידקים והכנסה, הוסף SEP לתרבית החיידקים. לתרבית החיידקים, ראה שלב 11.
    1. כדי לייצר SEP, הוסיפו 100 מ"ג L-Sepiapterin ל-84.3 מ"ל של DMSO וערבבו על ידי מערבולת. מכניסים לצינורות מיקרו-צנטריפוגה ב-100 מיקרוליטר כל אחד. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. השתמש ב-SEP ב-1 μL לכל מדיה של 500 μL לכל מכלול הכנסה (ריכוז סופי של 100 μM).

11. התחלת תרבית החיידקים (לא חובה)

  1. כדי לחקור את השפעת מטבוליטים חיידקיים על תאי החיסון, הריר ואפיתל המעי הגס, הוסף תוספת חיידקית לצד האפיקלי של מכלול התוספת. לבניית תוספת חיידקים בצע את שלב 4. גידלנו Bacillus subtilis יום לפני השימוש בתוסף החיידקים.
  2. הכינו וחיטטו את ה-Miller LB יומיים לפני השימוש בהכנסת חיידקים. כדי להכין LB, שלב 6.25 גרם של Miller LB עם 250 מ"ל מים נטולי יונים בבקבוק זכוכית של 500 מ"ל. מכסים בנייר אלומיניום. אוטוקלאב, התקררו ל-RT. ניתן לאחסן LB סטרילי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או RT.
  3. התחל לגדל חיידקי Bacillus subtilis ממלאי גליצרול יום לפני השימוש בתוספות חיידקים.
  4. כדי להתחיל בתרבית החיידקים, יש לחסן 10 מ"ל של מילר LB עם Bacillus subtilis ממאגר גליצרול קפוא בתוך צינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל. אל תתנו למלאי הגליצרול להפשיר.
  5. בעזרת קצה סטרילי של 200 מיקרוליטר, בחר כמות קטנה של חיידקים ממלאי הגליצרול. הוצא את הקצה לתוך 10 מ"ל של LB בצינור החרוטי הסטרילי של 50 מ"ל.
  6. אם משתמשים ב-SEP, התחל את הטיפול ב-20 מיקרוליטר של מלאי SEP (הריכוז הסופי צריך להיות 100 מיקרומטר). הוסף ישירות לתרבית חיידקים של 10 מ"ל בתרבית המתנע של צינור חרוטי של 50 מ"ל.
  7. תרבית Bacillus subtilis למשך 8 שעות באינקובטור רועד ב-220 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס. הוסף את הטיפול השני ב- SEP בסוף היום - הוסף 20 מיקרוליטר SEP לריכוז הסופי של 100 מיקרומטר ל -10 מ"ל של LB עם חיידקים.
  8. תרבית לילה ב-220 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס. הוסיפו את הטיפול השלישי של 20 מיקרוליטר SEP ל-10 מ"ל של LB עם Bacillus subtilis למחרת בבוקר והמשיכו לנער עד שמוכנים לבצע את החדרת החיידקים.

12. תוספת של תוספת חיידקים ל-Flipwell (אופציונלי)

  1. בצע בניית הכנסת חיידקים כמתואר בשלב 4. בצע תרבית חיידקים כמתואר בשלב 11.
    הערה: אם ארון תרבית תאים נפרד זמין, זה יעבוד בצורה הטובה ביותר. אחרת, חלקו את אזור העבודה בתוך ארון תרבית תאים לשניים. שמור על תרביות חיידקים ותאים בנפרד. אין להחזיר את תרביות התאים לחממת תרביות התאים. יהיה צורך לעקר את ה-BSC ולחשוף אותו ל-UV במשך 24 שעות או יותר לאחר ביצוע שיטה זו.
  2. השתמש בשני זוגות מלקחיים סטריליים עבור השלבים הבאים. כל השלבים שלהלן אמורים להיעשות ב-BSC.
  3. בעזרת מלקחיים, הרם את התוספת הסטרילית המוכנה מראש עם 24 בארות מאריזתה. הניחו את התוספת בתוך צלחת פטרי סטרילית וכסו את המכסה.
  4. חזור על מספר תוספות החיידקים הדרושות. מעבירים את צלחת הפטרי עם ה-Flipwells מהחממה לתוך ה-BSC ומניחים בצד בצד הנגדי של המנה עם תוספות חיידקים.
  5. הוצא 300 מיקרוליטר ממדיית ה-DMEM מהצד האפיקלי (העליון) של ה-Flipwell כדי לאפשר את הכנסת החיידקים. השאירו כ-200 מיקרוליטר בצד העליון של ערימת ה-FCI. הנח את מכסה צלחת הפטרי מעל מכלולי התוספות.
  6. הוסף 50-100 מיקרוליטר של תרבית B.subtilis לתוספות החיידקים של 24 הבארות. הקפד לא לשפוך או לזהם את הדופן החיצונית ואת השפה של תוספת החיידקים. ניתן לקחת OD600 כדי לעקוב אחר שלב הצמיחה של התרבית.
  7. בעזרת מלקחיים סטריליים, הרם את תוספת החיידקים בתרבית והכנס אותה בזהירות לתוך הצד העליון של Flipwell. סובב את הזרוע ותלה אותה משפת ערימת ה-FCI. החזק את הערימה עם הסט השני של מלקחיים סטריליים.
  8. חזור על הפעולה עבור שאר ערימות ה-FCI. מכסים את צלחת הפטרי ומונחים בתוך ה- BSC 3 שעות. אין להכניס את החממה פנימה.
  9. לאחר 3 שעות, השתמש במלקחיים סטריליים כדי להסיר את תוספת החיידקים מה-Flipwell. חזור על הפעולה עבור שאר מכלולי התוספות. השליכו את תוספות החיידקים.
    הערה: השלך חיידקים ותוספות חיידקים בהתאם למדיניות פינוי הפסולת הביולוגית המסוכנת של המוסד והנחיות הבטיחות והבריאות. מרכיבי חיידקים או חיידקים עצמם לא נבדקו.
  10. כדי לנתח שינויים בתאי התאים הריריים, האפיתל והחיסון, המשך לשטיפת הממברנות והכנתן להדמיה.
  11. שאפו את מדיית ה-DMEM מהחלק העליון של Flipwell. שוטפים עם 500 מיקרוליטר PBS סטרילי. בעזרת מלקחיים מרימים את ערימת ה-FCI מצלחת הפטרי ומעבירים אותה לצלחת פטרי חדשה.
  12. הפוך את ה-Flipwell ותלה אותו מעל שפת צלחת הפטרי. שוטפים את הממברנה עם 500 מיקרוליטר PBS סטרילי.
  13. אם נדרש אחסון, אחסן את ערימות ה-FCI לטווח קצר (30 דקות למשך הלילה) ב-PBS סטרילי בתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל.
    הערה: חשוב לקבוע באיזו שיטת הדמיה תשמש בהמשך ואם הממברנה תיחתך לשניים הן עבור מיקרוסקופ אלקטרונים והן עבור תיוג נוגדנים פלואורסצנטיים.

13. פירוק ה-Flipwell לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)

הערה: כדי לבחון שינויים מורפולוגיים בתאי אפיתל המעי הגס ובמקרופאגים לאחר טיפולי SEP/חיידקים, קיבענו את הממברנות במאגר קיבוע ולאחר מכן פירקנו את ה-Flipwells למיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). PFA שימש כקיבוע; עם זאת, ניתן להשתמש גם בגלוטרלדהיד. חשוב להתייעץ עם ליבת המיקרוסקופיה לגבי מאגר הקיבוע המועדף עליהם, שלבי התייבשות ספציפיים וריכוזי מאגר הקיבוע הראשוניים. ניתן לאחסן ממברנות במאגר הקיבוע אם יש צורך באחסון. העבודה יכולה להיעשות מחוץ ל-BSC. אם ליבת ההדמיה תדביק את הממברנה כלפי מטה, ניתן לחתוך אותה לשניים ולמקם אותה כך שתצלם את שני הצדדים בנפרד.

  1. בעזרת טוש חסין ממס, סמן את דפנות הפלסטיק של מחסנית ה-FCI עם קידוד סמל לסוג התא בו נעשה שימוש. לחלופין, סמן את הממברנה ישירות בנקודה, סימן ביקורת או x כדי לסמן את סוג התא בו נעשה שימוש.
  2. הנח את ה-Flipwell בתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל ללא פירוק. הוסף 4% PFA מספיק כדי להטביע את הערימה. יש לשמור ב-4% PFA למשך הלילה.
    1. כדי לייצר 4% PFA (ללא מתנול), ממיסים 40 גרם פרפורמלדהיד ב-800 מ"ל של 1x PBS. כדי לייצר 0.4% PFA, ממיסים 4 גרם פרפורמלדהיד ב-800 מ"ל של 1x PBS או מדללים 4% PFA 1:10 עם 1x PBS על ידי הוספת 100 מ"ל של 4% PFA ל-900 מ"ל של 1x PBS.
  3. החלף PFA ב-0.4% לאחסון ארוך יותר. התייעץ עם ליבת המיקרוסקופיה לגבי משך האחסון והמאגרים.
  4. כדי לפרק את ה-Flipwell, החזק אותו בשתי ידיים וסובב כל חלק מודבק של הערימה. הערימה תתפרק לשני חלקים: חלק אחד יהיה הממברנה והשני יהיה התוספת ללא הממברנה. השלך את התוספת ללא הממברנה.
  5. סובב את התוספת עם הממברנה והנח אותה כשהממברנה פונה כלפי מעלה. יכול לתייג את הממברנה עם נקודה קטנה או x בקצה הממברנה כדי לדעת באיזה צד יש איזה סוג תא.
  6. החזק את התוספת ליד הקיר בעזרת מלקחיים. חותכים בזהירות את הממברנה בעזרת להב אזמל ומניחים אותה בתוך צינור של 1.7 מ"ל או בקבוק זכוכית קטן עם 500 μL-1 מ"ל של תמיסת PFA של 0.4%-4%.
  7. הגש לליבת המיקרוסקופיה לשלבי ההתייבשות וההדמיה. שלבי התייבשות מתוארים ב-Beamer et al7.
  8. השלך PFA או מקבעים אחרים בהתאם למדיניות פינוי הפסולת המסוכנת שנקבעה על ידי הארגון והנחיות הבריאות והבטיחות.

14. שיטת טיפות גדולות לפירוק ה-Flipwell למיקרוסקופיה קונפוקלית

הערה: נוצרה שיטה חדשה לצביעה והדמיה של הממברנות. ערימת הכנסת התרבות המשותפת נשמרה שלמה עם קיבוע ראשוני, חדירות ושלבי חסימה שנעשו בתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל. תיוג אימונו-פלואורסצנטי ומיקרוסקופיה קונפוקלית שימשו להדמיית שני צידי הממברנה. שיטת הצלחת החדשה של 12 בארות שימשה לשלבי הדגירה הליליים, ושיטת טיפות גדולות שימשה להכתמת החלק התחתון של התוספת המפורקת. מחסנית Z קונפוקלית שימשה להדמיית שני הצדדים עם הממברנה. הממברנות המוכתמות נדחקו בין שני כיסויי זכוכית עגולים, והמכלול הסנדוויץ' הוצב באמצע בין שתי טבעות מתכת של החדר העגול המיוצר באופן מסחרי לתמונה. מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר מרובה פוטונים שימש עם תוכנת הדמיה מסחרית.

  1. כדי לשטוף את הממברנה, הנח את ערימת הכנסת התרבות המשותפת ישירות לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל והוסף 15 מ"ל PBS סטרילי או שטוף כל צד בנפרד (מתואר להלן).
  2. שאפו את ה-DMEM והוסיפו 300 מיקרוליטר של PBS סטרילי לצד האפיקלי. שאפו PBS והוציאו בזהירות את הערימה מצלחת הפטרי.
  3. הפוך את ה-Flipwell והוסף 300 מיקרוליטר של PBS ל-RPMI הפונה כעת כלפי מעלה של ערימת ה-FCI. שאפו את ה-PBS.
  4. בעזרת סמן עמיד לממס תווית את הצד העליון והתחתון של הערימה כדי לדעת באיזה צד יש איזה סוג תא.
  5. הנח את ה-Flipwell בתוך צינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל. הוסף 15 מ"ל של PFA סטרילי של 4% כמאגר הקיבוע הראשוני למשך 10 דקות. אם יש צורך בדגירה למשך הלילה, החלף ב-15 מ"ל של 0.4% PFA ב-PBS, כסה והשאיר למשך הלילה.
  6. כדי להמשיך עם הצביעה החיסונית, פנו מקום ספסל לשיטת הטיפות הגדולות.
    קרעו חתיכות ניילון בגודל 10X14 אינץ' והדביקו אותן לספסל בפינות ליצירת משטח חלק.
  7. באמצעות פיפט של 200 מיקרוליטר יוצרים טיפה גדולה עם 200 מיקרוליטר PBS. סובב את מכלול התוספות כדי להפריד לתוך התוספות.
  8. בעזרת טוש עמיד לממס, הניחו נקודה קטנה קרוב לקצה צד אחד של הממברנה כדי לדעת איזה סוג תא משמש לצביעה והדמיה.
  9. הסר את כל אטם הסיליקון שנותר מתחתית התוסף אם לתוספת עם הממברנה עדיין יש שאריות דבק. זה נעשה כדי להבטיח שהתוספת תישאר זקופה עבור השלבים הבאים.
  10. מקם בזהירות את מחסנית ה-FCI (עם תאי THP-1) על גבי הטיפה הגדולה של 200 מיקרוליטר של PBS. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר חדירות לצד העליון עם תאי אפיתל במעי הגס ושמור למשך 10 דקות.
    1. כדי להכין את מאגר החדירה, השתמש ב-0.1% v/v Triton-X100 ב-PBS.
  11. שואבים ומוסיפים 200 מיקרוליטר PBS. חזור על כביסה זו פעמיים. צור טיפה חדשה עם 250 מיקרוליטר של מאגר חסימה.
    1. כדי ליצור חיץ חוסם, הוסף 250 מיקרוליטר של סרום עיזים רגיל ב-5 מ"ל של 1x PBS (סרום סופי של 5%). מוסיפים 15 מיקרוליטר של Triton-X100 (0.3% v:v). מערבבים היטב ושומרים בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ימים.
  12. הנח את התוספת על גבי המאגר החוסם. חוסמים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו PBS מהצד האפיקלי והוסיפו 200 מיקרוליטר של מאגר חוסם לחלק העליון של התוספת. שני צידי הממברנה מוכנים כעת להכתמת נוגדנים במהלך הלילה.

15. צביעה אימונופלואורסצנטית (IF).

הערה: הצביעה נעשית במהלך הלילה בשיטת צלחת 12 בארות או על ספסל בשיטת טיפות גדולות.

  1. הכן את הנוגדנים הדרושים לשימוש לצביעה של שני צידי הממברנה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס או על הספסל ב-RT. לדלל את כל הנוגדנים 1:100 ב-1% BSA ב-PBS. לחלופין, עקוב אחר המלצות היצרן וייעל את הצביעה כדי לקבוע ריכוזים אידיאליים ומאגר דילול נוגדנים.
  2. שיטת טיפות גדולות
    1. צרו מלבן גדול בעזרת ניילון נצמד על גבי הספסל והדביקו את הפינות כלפי מטה. פיפט 200 מיקרוליטר של נוגדן מדולל על גבי הפלסטיק ליצירת טיפה גדולה. הנח את קרום ההכנסה כלפי מטה על גבי הטיפה הגדולה.
    2. הוסף 200 מיקרוליטר של Ab ראשוני לחלק העליון של התוספת. דגירה ב-RT למשך שעתיים.
  3. שיטת צלחת 12 בארות
    1. אם משתמשים בשיטת צלחת של 12 בארות למשך הלילה, הוסיפו 300 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני לחלק העליון של התוספת.
    2. הוסף 300 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני לבאר של צלחת 12 הבארות. הנח את התוספת בתוך צלחת 12 הבארות היטב על גבי הטיפה. מכסים את הצלחת במכסה ומניחים אותה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  4. בסיום הצביעה, יש לשטוף את שני צידי הממברנה עם PBS. בעזרת פיפטה וקצה של 200 מיקרוליטר, שטפו בזהירות את הצד התחתון של התוספת פי 3 עם 200 מיקרוליטר PBS. עבור החלק העליון של התוספת, יש לשטוף על ידי הוספת 200 מיקרוליטר PBS לחלק העליון, שאיבה וחזרה על כביסה פי 3.
  5. הכן את כל הנוגדנים המשניים (ראה טבלת חומרים לנוגדנים הספציפיים המשמשים) לפי המלצות היצרן או דילול של 1:1000 ב-1% BSA ב-PBS או אחר. צביעת נוגדנים משנית צריכה להיעשות בחושך; השתמש בקופסת קרטון או במגירה של ארון כדי ליצור סביבה נטולת אור.
  6. בשיטת טיפות גדולות או בשיטת צלחת 12 בארות, הכינו צלחת סטרילית חדשה. דגירה למשך שעתיים ב-RT בסביבה חשוכה. שטיפה כמתואר בסעיף 15.4.

16: הכנה להדמיה קונפוקלית

  1. אם הממברנה עדיין לא סומנה כמתואר בשלב 14, סמן אותה כדי לדעת את מיקום סוג התא. הנח סימן קטן (נקודה, x, צ'ק וכו') עם טוש עמיד בפני ממס בכל מקום (עדיף קצה).
  2. הסר את החלקות הכיסוי העגולות בזהירות ממיכל האחסון והנח אותן בעדינות על משטח הספסל.
  3. לדלל DAPI ב-PBS בדילול של 1:100. לחלוקת DAPI עם מתקן הטיפות, הוסף 1-3 טיפות לאמצע החלקת הכיסוי. אחרת, פיפטה 1-3 טיפות DAPI לאמצע הכיסוי.
  4. החזק את התוספת בעזרת מלקחיים. חותכים בזהירות את הממברנה בעזרת להב אזמל בתנועה סיבובית סביב השפה/הקצה התחתון. אל תתנו לקרום ליפול על הספסל. הנח את תוספת הפלסטיק על הספסל והחזק את הממברנה בעזרת מלקחיים תוך חיתוך הסיבים הסופיים בעזרת להב האזמל.
  5. הנח את התוסף כלפי מטה על גבי ה-DAPI. יש להוציא 1-3 טיפות DAPI (דילול של 1:100) לחלק העליון של הממברנה כך שלשני צידי הממברנה יש DAPI.
  6. הרם את תלוש הכיסוי בסיבוב השני בעזרת האצבעות (ללבוש PPE). אל תשתמש במלקחיים מכיוון שהחלקת הכיסוי שבירה מאוד.
  7. יישר את החלקת הכיסוי השנייה מעל החלקת הכיסוי הראשונה והורד אותה בזהירות על גבי הממברנה.
  8. בעזרת טוש עמיד בפני ממס, סמן בזהירות את צד החלקת המכסה במידת הצורך כדי לקודד את סוג/כיוון התא (אופציונלי). אם הממברנה סומנה, דלג על שלב זה.
  9. בהתאם למספר הכיסויים שיש לצלם ומספר טבעות המתכת הזמינות, הרכיבו את הכיסויים בין טבעות המתכת המיוצרות באופן מסחרי כדי להחזיק את הכיסויים העגולים יחד להדמיה או אחסן אותם בחושך עד להדמיה.
  10. כדי לצלם, הרכיב את החלקת הכיסוי עם הממברנה בין טבעות המתכת של תא התא והנח אותה במחזיק המיקרוסקופ הקונפוקלי. צור קשר עם ליבת המיקרוסקופיה הקונפוקלית לפני שתראה איזה מחזיק עשוי להידרש כדי לצלם את החלקות הכיסוי העגולות.
  11. כשמוכנים לצלם, עטפו כל כריך בנייר אלומיניום וקחו אותו למתקן.
  12. באמצעות תכונת Z-stack, סרוק כל צד של הממברנה בנפרד באמצעות אורך הגל המתאים בהתאם לפלואורופורים המשמשים. הפוך ודמיין את הצד השני. כדי לאחסן את הכיסויים, שמור אותם בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לקבוע את הרלוונטיות הביולוגית של תרביות משותפות של Flipwell של חיידקי מעיים, אפיתל המעי הגס ומקרופאגים, טיפלנו בתרבויות המשותפות עם sepiapterin (SEP), מודולטור של חילוף החומרים של ארגינין, כדי לקדם את ייצור תחמוצת החנקן 9,10,11 בהשוואה ל-DMSO הבקרה. קבענו את ההשפעות של טיפול SEP על כל מרכיב של תרביות משותפות באמצעות מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי (IF) ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). צביעה הראת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כדי לשחזר את ארכיטקטורת רירית המעי במבחנה, תכננו מערכת תרבית משותפת פשוטה הכוללת שכבות מרובדות של חיידקי מעיים, תאי אפיתל של המעי הגס המייצרים ריר ומקרופאגים. מערכת רב-תרביות זו אפשרה לנו לחקור את ההשפעות של דיבור צולב בין הפרשות החיידקים, אפיתל המעיים והמקרופאגים על השראת תכנות מחדש אימונוגני ומנגנוני הגנה רירית.

אחת האזהרות החשובות ליצירת Flipwells תלת מימדיים היא שההרכבה חייבת להתבצע בסביבה סטרילית, ולאחר מכן עיקור UV במשך מספר ימים לפני זריעת התאי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים. המחברים מתנערים בזאת מכל אחריות, בין אם מפורשת או משתמעת, במידה המרבית המותרת על פי חוק. בשום פנים ואופן לא יישאו המחברים, בין אם על פי כל חוק, חוזה, נזיקין או כל תיאוריה משפטית אחרת, לכל נזק מיוחד, מקרי, עקיף, עונשי, מרובה או תוצאתי הנובע או קשור לשימוש בכלים בבניית ה-Flipwells, שימוש בריאגנטים של BSL, קווי תאים, תרביות חיידקים, שימוש במערכת Flipwell בסביבה אנאירובית בתא אנאירובי. הגבלת אחריות זו כוללת, בין היתר, כל אופן לא מפורט של שימוש ב-Flipwell שאינו מתואר במפורש כאן.

תודות

המחבר הראשי מביע הכרת תודה כנה לד"ר סאורי פורוטה על כישורי החונכות המעולים שלה, הדרכה ותמיכה מתמשכת למרחקים ארוכים, ותכנון פרויקטים מיומן ומתמשך המטפחים הזדמנויות למידה פנטסטיות. המחברים מודים גם לד"ר ונדנה שארמה על המומחיות וההדרכה במיקרוביולוגיה ולד"ר ואני ר. פרננדו על הכנת מקרופאגים THP-1.  בנוסף, המחברים מודים לד"ר אנדרו קליינהנץ וויליאם ט. גאנינג מהמתקן למיקרוסקופיה אלקטרונית, ולקסנדרה זמורה וקריסטין קירשבאום ממרכז המכשור באוניברסיטת טולדו על הצעות בונות להדמיית EM. עבודה זו נתמכה על ידי קרן הסטארט-אפ מקמפוס מדעי הבריאות של אוניברסיטת טולדו, המכללה לרפואה ומדעי החיים, המחלקה לביולוגיה של הסרטן ועד S.F; מענק מחקר חוזר לסרטן באוהיו (פרויקט #: 5017) ל-S.F; פרס האגודה למחקר רפואי (קרן טולדו, #206298) ל-S.F; מענק חוקר של האגודה האמריקאית לסרטן (RSG-18-238-01-CSM) ל-S.F; ומענק מחקר של המכון הלאומי לסרטן (R01CA248304) למדע בדיוני

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.4% PFA (ראו מתכון ב-Reagents and Solutions)מתואר בטקסט
פיפטה סרולוגית בנפח 10 מ"לקורנינג4488
פלטת TC עם 12 בארים,  קוסטארקורנינג3513
צינורות חרוטיים בגודל 15 מ"ל, SpectraTubeאלקלי סיינטיC2715
200 ומיקרו; טיפים ו-nbsp;USA Scientific1111-1700
תוספות ל-24 בארות - תוספות תרבית לצלחות עם 24 בארות, PET 0.4 ומיקרו; m ברנדטק סיינטיפיק782710
תלת-ממד פליפלוול מוכן, מחוטא ב-UV  תוצרת במעבדה
4% PFA (ראו מתכון ב-Reagents and Solutions)מתואר בטקסט
ציר ספיאפטרין 50 מ״מ (SEP, ראו מתכון ב-Rečets and Solution)קריירה בחברת הנאן כימיקליםCAS#: 17094-01-8
צינורות חרוטיים בקוטר 50 מ"לגריינר ביו-וואן227261
פיפטה סרולוגית בגודל 5 מ"לקורנינג4487
70-95% אתנול (אלכוהול אתילי)דיקון לאבס04-355-151
נייר אלומיניוםפישר סיינטיפיק01-213-100
מחטי האכלה לבעלי חיים, 20 גייג' 1.5" אורך, לשימוש חד-פעמי פישר סיינטיפיק01-208-87
בופר דילול נוגדנים (ראו מתכון ב-Reagents and Solutions)מתואר בטקסט
תא תא אטופלואור תרמופישר סיינטיפיקA7816
סרט אוטוקלבפישר סיינטיפיק15-901-111
בזני Bacillus subtilis wt (3A1T) במאגר גליצרול ()מרכז המלאי הגנטי של חיידקים (https:// bgsc. org/
כפפות BioGrip ורודות ללא אבקת ניטריל ללא לטקסייצור באיכות גבוההP2810
בופר חסימה (ראו מתכון ב-Reagents and Solutions - 10% סרום עזים רגיל ב-PBS)מתואר בטקסט
מאגר חסימה (ראו מתכון ב-Reagents and Solutions)מתואר בטקסט
מיקרוסקופ ברייטפילד (ניקון או מקביל) Eclipse Ts2ניקוןTS2
תאי Caco-2ATCCHTB-37
חממת תרביות תאים, 37 מעלות; C, 5% CO2 (Eppendorf CellXpert)אפנדורף6734010015
צנטריפוגה (אפנדורף, צנטריפוגה 5804/5804 R או שווה ערךאפנדורף22622501
צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל SpectraTubeאלקלי סיינטיC2750
תוספות תרבית לפלטת 12 בארות, PET, 0.4 ומיקרו; m, סטריליBrandTech Scientific, BRAND Insert 2in1, BIO-CERT782730
מדיום התקנה DAPI VectaShieldמעבדות וקטורH-1000
תחתית צלחת פטרי עמוקה, 100 x 25 מ"מ צלחת פוליסטירן עמוקה ניתנת לערום, סטרילית USA Scientific8609-0625
דרומונד פיפט אייד XPדרומונד  4-000-101
צנטריפוגה אפנדורף 5804 עם רוטור דלי מתנדנד לצינורות קוניים בנפח 50 מ"לאפנדורף22622501
מלקחיים, פלדת אל-חלד, אוטוקלב סטרילי, סטים כפוליםVWR82027-438
מלקחיים, פלדת אל-חלד, אוטוקלב סטרילי, סטים כפולים, מלקחיים לדוגמהVWR82027-438
בקבוק זכוכית 500 מ"לקורנינג 4980-500
המציטומטר (נויבאואר עם מחליפות כיסוי)תרמו פישר סיינטיפיק50-312-90
תאי HT-29-MTX-E12מיליפור סיגמא12040401
ImmunoPen (אופציונלי)פישר סיינטיפיק4021761EA
כפפות מבוססות קבלר או כפפות עמידות לחיתוך אחרות (אופציונלי)חנות כלי עבודה או אמזון
קלטת מעבדה או סרט משלוחפישר סיינטיפיק  159015R
מכסה מנוע זרימה למינרי סדרה 1300 A2 BSC Class IIתרמופישר סיינטיפיק1375
מכסה זרימה למינרי עם אור UV SterilGARDחברת בייקרSG403A-HE
הוכחת ממס על ידי סמניםVWR52877-310 או 95042-566
מדיה לתאי Caco-2 (מבוססת סוכר גבוה DMEM, ראו מתכון ב-Reacts and Solutions)תואר ב-  טקסט
מדיה לתאי HT-29 (DMEM High Glucose, ראו מתכון ב-Reacts and Solutions)מתואר בטקסט
מדיה לתאי THP-1 (RPMI, ראו מתכון ב-Reagents and Solutions)מתואר בטקסט
צינור מיקרוצנטריפוגה, 1.7 מ"ל, סטרילי אלקלי סיינטיC3017-ST
צינורות מיקרוצנטריפוגהתרמו פישר3451
מדיית מילר LB (ראו מתכון ב-Reagents and Solutions)סיגמא-אלדריץ'  L3522
פליירים עם אף מחט, סטים כפוליםחנות כלי עבודה או אמזון
כפפות ללא אבקת ניטריל ללא לטקס Aurelia AmazingMidSci92885
מכסי צלחת פטרי, צלחת פטרי סטרילית בסגנון 100x15 מ"מקורנינג בע"מ351029
פורבול מיריסטאט אצטט (PMA) (100 ng/μ l, ראו מתכון ב-Reagents and Solutions) InvivoGenTlrl-pma
טיפים לפיפט (10 ומיקרו; l, 200 ומיקרו; l, 1000 ומיקרו; l) PurePoint או מקבילאלקלי סיינטיפיק ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
ניילון נצמדמכולת
תמיסת קולגנאז עובדת Purecol (100 ומיקרו; g/mL)ביומטריקס מתקדם5005-100ML
כיסוי עגול #1 1 אונקיות (Corning Float Glass או Fisherbrand)קורנינג או פישרברנד50143822 או 12-546-2 25CIR-2
להבי סקלפל, סטריליים, חד-פעמיים מופק או נוצה #10AJ136 או 2975#10
ספיאפטרין (SEP, 100 ומיקרו; M, ראו מתכון ב-Reagents and Solution)קריירה בחברת הנאן כימיקליםCAS#: 17094-01-8
חממת רעידות מוגדרת ל-220 סל"ד 37 מעלות לדקה; Cאפנדורף ניו ברונסוויק סיינטיפיקM12990080
סיליקון עם דבק סיליקון Loctite Clear IDH או 3M Marine Grade Cell Silicon Clear עם קצה אףלוקטיט או 3M1745658 או PN08019
פיפט חד-ערוצי Eppendorf Research Plus, 200 ומיקרו; lאפנדורף
פיפטות חד-ערוציות (10 ומיקרו; l, 200 ומיקרו; l, 1000 ומיקרו; l)אפנדורף2231001122
ספקטרופוטומטר NanoDropOneCתרמו פישר סיינטיפיק13-400-519
מים סטריליים דה-יוניים    
סרין בופר סטרילי עם זרח (PBS) ללא סידן או מגנזיוםפישר סיינטיפיק  BSS-PBS-1X6
מזרק 3 מ"ל או 5 מ"ל עם Luer-Lok TipBD309585 או 309603
תאי THP-1ATCCTIB-202
פיפטות העברה, סטריליותפישרברנד13-711-20
טריטון X-100מיליפור סיגמאX100
תמיסת טרייפן בלוVWR97063-702
Trypsin-EDTA 0.25%תרמו פישר סיינטיפיק25200-056
מגבונים Kimwipes Professional עם LintGuard Anti-Stat Polyshieldקימברלי-קלארק34120
<חזקים>נוגדנים ראשיים: 
אנטי-אנושי CD163אבקאם156769
CD68 אנטי-אנושיNovus BiologicalsNB100-683-0.1 מ"ג
אנטי-אנושי CD80, E3Q9Vטכנולוגיות איתות סלולריות15416
אנטי-אנושי CK20 טכנולוגיות חייםPA5-82875
MUC2 אנטי-אנושי (996/1)תרמופישרMA5-12345
<נוגדנים חזקים>נוגדנים משניים:
Alexa Fluor 488 Goat נגד Rabbit IgG (ל-CD80 ו-CK20)תרמופישרA11008
Alexa Fluor 594 IgG נגד עכבר עזים (ל-MUC2 ו-CD68 או CD163)תרמופישרA11005
<חזק>מגבים ופתרונות:   
<חזק>Caco-2 בינוני:
DMEM עם רמות גלוקוז גבוהות (4.5 גרם לליטר) ו-1% (v:v) גלוטמקס  תרמו פישר סיינטיפיק35050061
FBS 10% (v:v) מנוטרל חוםסיגמאF2242-500ML
חומצות אמינו לא חיוניות 1% עבור מדיום Caco-2תרמו פישר סיינטיפיק11140076
סטרפטוק עט 1% (v:v)סיגמאF2242-500ML
<חזק>HT-29-MTX בינוני
DMEM עם רמות גלוקוז גבוהות (4.5 גרם לליטר) ו-1% (v:v) גלוטמקס  תרמו פישר סיינטיפיק35050061
FBS 10% (v:v) מנוטרל חוםסיגמאF2242-500ML
HEPES (ריכוז סופי של 10 מ"מ)תרמו פישר סיינטיפיק15630080
סטרפטוק עט 1% (v:v)סיגמאF2242-500ML
<חזק>THP-1 בינוני:
סרום בקר עוברי מנותק חום FBS (10% v:v)Sigma F2242-500ML
גלוקוז (ריכוז סופי של 4.5 גרם לליטר)תרמו פישר סיינטיפיקA249001
GlutaMax 1% (v:v)  ריכוז סופי של 2 מ"מתרמו פישר סיינטיפיק35050061
HEPES (ריכוז סופי של 10 מ"מ)תרמו פישר סיינטיפיק15630080
סטרפטוק עט 1% (v:v)סיגמאF2242-500ML
מכון רוזוול פארק ממוריאל (RPMI)-1640 בינוניתרמו פישר סיינטיפיק11875119
נתרן פירובט (ריכוז סופי של 1 מ"מ)תרמו פישר סיינטיפיק11360070
Purecol תמיסת קולגנאז עובדת (דילול ל-1:30 100 ומיקרו; g/ML):
פיורקול 3 מ"ג/מ"ל 1:30 עד 100 ומיקרו; g/ml ביומטריקס מתקדם5005-100ML
מים דה-יוניים סטריליים
L-Sepiapterin תמיסת חומר (50 mM):
L-Sepiapterin (SEP)קריירה בחברת הנאן כימיקליםCAS#: 17094-01-8
<חזק>פורבול פירבול מיריסטאט אצטט (PMA, 5 מ"ג/מ"ל)InvivoGenTlrl-pma
BSA 1% סרום בקר אלבומין סיגמא-אלדריץ'5470
DMSO Sigma D2650
מילר LBסיגמא-אלדריץ'  L3522
סרום תקין מאותו מין כמו הנוגדן המשניSigma NS02L-1ML
פאראפורמלדהידסיגמא-אלדריץ'441244

מקורות

  1. Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
  2. Xuan, C., et al. Microbial dysbiosis is associated with human breast cancer. PLoS One. 9 (1), e83744(2014).
  3. Yoo, J. Y., Groer, M., Dutra, S. V. O., Sarkar, A., McSkimming, D. I. Gut Microbiota and Immune System Interactions. Microorganisms. 8 (10), 1587(2020).
  4. Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (1), E7-E15 (2016).
  5. Donkers, J. M., Eslami Amirabadi, H., van de Steeg, E. Intestine-on-a-chip: Next level in vitro research model of the human intestine. Curr Opinion Toxicol. 25, 6-14 (2021).
  6. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Sci Rep. 7, 45270(2017).
  7. Beamer, M. A., et al. Novel 3D Flipwell system that models gut mucosal microenvironment for studying interactions between gut microbiota, epithelia and immunity. Sci Rep. 13 (1), 870(2023).
  8. Beamer, M. A., Furuta, S. Redefining Cell Culture Using a 3D Flipwell Co-culture System: A Mimetic for Gut Architecture and Dynamics In Vitro. Curr Protoc. 5 (2), e70107(2025).
  9. Fernando, V., et al. Reprogramming of breast tumor-associated macrophages with modulation of arginine metabolism. Life Sci Alliance. 7 (11), e202302339(2024).
  10. Sharma, V., et al. Immunogenic shift of arginine metabolism triggers systemic metabolic and immunological reprogramming to suppress HER2 + breast cancer. Cancer Metab. 13 (1), 15(2025).
  11. Zheng, X., et al. Correction of arginine metabolism with sepiapterin-the precursor of nitric oxide synthase cofactor BH(4)-induces immunostimulatory-shift of breast cancer. Biochem Pharmacol. 176, 113887(2020).
  12. Ren, G., et al. Reduced Basal Nitric Oxide Production Induces Precancerous Mammary Lesions via ERBB2 and TGFβ. Sci Rep. 9 (1), 6688(2019).
  13. Trejo, M., et al. Elasticity and wrinkled morphology of Bacillus subtilis pellicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (6), 2011-2016 (2013).
  14. Sadaghian Sadabad, M., et al. A simple coculture system shows mutualism between anaerobic faecalibacteria and epithelial Caco-2 cells. Sci Rep. 5, 17906(2015).
  15. Umehara, Y., Aoyagi, H. Development of a simple cultured cell-anaerobic microbial co-culture system using liquid paraffin. J Biosci Bioeng. 135 (6), 487-492 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

קו-קלטורה בתלת-ממדמודל רירית המעיסקרטום חיידקיקיטוב תאי חיסוןתאי אפיתל של המעי הגסקיטוב מקפגיםהיווצרות ביופילםטיפול בספיאפטריןצביעה אימונופלואורסצנטית
הנדסת 3D Flipwell לפיתוח מערכות אסינכרוניות לטיפולים טוקסיקולוגיים ואימונומודולטוריים בתאי חיידקים, מעיים ומערכת החיסון
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.