מאמר שיטה

עריכה גנומית משופרת באמצעות חומצות גרעין ביציות מבוססת טכניקת אלקטרופורציה In Vivo ליצירת עכברי נוקאאוט

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68704

⸱

26 באוגוסט 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Transgenesis and Genome Editing, St. Petersburg State University, 2Resource Center Molecular and Cell Technologies, St. Petersburg State University, 3Amyloid Biology Laboratory, St. Petersburg State University, 4DNA-Nanosensoric laboratory, ITMO University, 5Laboratory of Toxinology and Molecular Systematics, L.A. Orbeli Institute of Physiology, National Academy of Sciences of the Republic of Armenia

במאמר זה

סיכום

היעילות של שיטת עריכת הגנום המשופרת באמצעות אספקת חומצות גרעין ביציות (I-GONAD) דומה למיקרו-הזרקה מסורתית, הדורשת איסוף זיגוטה מנקבות תורמות והעברה לנקבות פסאודו-בהריון. פרוטוקול זה מדגים את יעילותו על ידי החדרת מוטציות הנגרמות על ידי CRISPR/Cas9 ללוקוס ROSA26 בכרומוזום 6.

תקציר

שיטות ליצירת עכברי נוקאאוט כוללות בדרך כלל שלושה שלבים עיקריים: (1) איסוף עוברים מנקבות תורמות, (2) הזרקת מיקרו-מבנים גנטיים לתוך הזיגוטות ex vivo, ו-(3) העברתם בניתוח לתוך צינור הביצית של נקבות פסאודו-בהריון. תהליך זה דורש מספר לא מבוטל של בעלי חיים, מכיוון שהוא כולל לא רק נקבות תורמות אלא גם זכרים שעברו כריתת כלי דם ונקבות פסאודו-בהריון. יתרה מכך, מיקרו-הזרקות לציטופלזמה או לפרונוקלאוס של זיגוטות עכבר מציבות אתגרים כגון סתימת מחטים, בעיות חדירות ממברנה עקב גמישות גבוהה ומוות פוטנציאלי של עוברים. הפיתוח של אלקטרופורטורים מתקדמים, כגון Nepa21, מספק הזדמנות ייחודית לייצר עכברים עם נוקאאוט גנים ממוקדים בשלב אחד באמצעות שיטה המכונה עריכה גנומית משופרת באמצעות אספקת חומצות גרעין ביציות (I-GONAD). טכניקה זו כוללת מיקרו-הזרקה של רכיבי CRISPR-Cas (חלבון Cas9 ו-RNA מנחה) לתוך הביציות של נקבות בהריון 0.7 ימים לאחר ההתעברות, ולאחר מכן אלקטרופורציה in vivo כדי להעביר רכיבים אלה ישירות לתוך הזיגוטות. בעקבות הליך I-GONAD, העכברה ההרה נושאת וממליטה גורים עם נוקאאוט הגן הממוקד. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט, צעד-אחר-צעד, עבור מימוש שיטת I-GONAD בעכברים, המציע חלופה יעילה ונגישה יותר לטכניקות מסורתיות של יצירת עכברי נוק-אאוט.

מבוא

הבנת הבסיס הגנטי של מחלות היא קריטית לזיהוי המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס האטיולוגיה והפתוגנזה שלהן. צעד מרכזי במחקר זה הוא פיתוח מודלים של בעלי חיים עם נוקאאוט גנטי ממוקד המדמה מחלות אנושיות. עכברים הם בעלי ערך מיוחד למחקרים אלה בשל הדמיון הגנומי הכללי שלהם לבני אדם, גודלם הקטן, תוחלת החיים הקצרה והפוריות הגבוהה. מודלים של עכברים חשובים הן למחקר בסיסי והן לבדיקות פרה-קליניות1.

כדי ליצור עכבר נוקאאוט באמצעות מערכת CRISPR-Cas9, החוקרים בדרך כלל מזריקים קומפלקס של RNA מנחה ונוקלאז Cas9 לתוך זיגוטה, מה שגורם לשבירה כפולה ב-DNA המטרה ובכך מפעיל את מערכת התיקון של התא כדי לגרום למוטציה באתר השבירה 1,2. מיקרו-הזרקה לזיגוטות נותרה תקן הזהב למטרה זו. עם זאת, שיטה זו דורשת מספר שלבים: בידוד עוברים מנקבות תורמות, ביצוע מיקרו-הזרקות של מבנים גנטיים לזיגוטות והעברתם בניתוח לביציות של נקבות פסאודו-בהריון. כתוצאה מכך, יש צורך בשמירה על מספר רב של בעלי חיים, כולל נקבות תורמות, זכרים שעברו כריתת כלי דם ונקבות פסאודו-בהריון. בנוסף, בידוד הזיגוטות מחייב המתת חסד של נקבות תורמות. לכן, עדיפים פרוטוקולים הממזערים את השימוש בבעלי חיים, בהתאם לעקרונות ה-3Rs (החלפה, הפחתה, עידון)3.

התקדמות בטכנולוגיית אלקטרופורציה, כגון השימוש במערכת Nepa21, מספקת הזדמנות ייחודית ליצור עכברי נוקאאוט גנים ממוקדים בשלב אחד באמצעות טכניקה המכונה עריכה גנומית משופרת באמצעות אספקת חומצות גרעין ביציות (I-GONAD)4. ה-Super Electroporator NEPA21 Type II משתמש במערכת אלקטרופורציה מרובת פולסים בת 4 שלבים, המבטיחה יעילות אלקטרופורציה גבוהה תוך שמירה על כדאיות גבוהה של העובר. GONAD כרוך בהזרקת מיקרו-הזרקה של רכיבי CRISPR-Cas (חלבון Cas9 (500-600 ננוגרם/מיקרוליטר) ו-RNA מנחה (80-100 ננוגרם/מיקרוליטר)) לתוך הביציות של עכברים בהריון 0.7 ימים לאחר ההתעברות, ולאחר מכן אלקטרופורציה in vivo כדי להעביר רכיבים אלה ישירות לזיגוטים5. לאחר הליך I-GONAD, העכברה ההרה ממליטה גורים עם נוקאאוט של הגן הממוקד 6,7,8. היעילות של שיטה זו משתנה בהתאם למטרה הרצויה, אך ניתנת להשוואה לטכניקות סטנדרטיות המבוססות על מיקרו-הזרקה (כ-50%)9,10. בנוסף, ניתן להתאים את I-GONAD לעריכת גנום במינים אחרים.

מאמר זה מציג פרוטוקול צעד-אחר-צעד ליישום שיטת I-GONAD ליצירת עכברי נוק-אאוט. כדוגמה, יעילותו הודגמה על ידי התמקדות בלוקוס הגנום ROSA26 בכרומוזום 6 של העכבר. לוקוס זה נבחר מכיוון שהוא עובר תעתיק מכונן ללא תרגום מאוחר יותר. לכן, סביר להניח שהכנסת מוטציה בלוקוס זה לא תשפיע לרעה על בריאותם של הגורים שנוצרו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל המחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה למחקר בבעלי חיים של אוניברסיטת סנט פטרסבורג (אישור מס' 131-03-5, 11 באוקטובר 2022). כל הנהלים הקפידו על ההנחיות המפורטות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. עכברי מעבדה נפוצים מזן CD1 התקבלו ממרכז השימוש הקולקטיבי של המכון לתרכובות פעילות פיזיולוגית, האקדמיה הרוסית למדעים (IPAC RAS). נקבות עכברי CD1 בגילאי 2-3 חודשים (משקל ממוצע 27-30 גרם) שימשו להזדווגות עם עכברי CD1 זכרים בגילאי 2.5-4 חודשים (משקל ממוצע 35-37 גרם). הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. תכנון RNA חד-מוביל (sgRNA) והכנתו לטרנספקציה

  1. השתמש בכלי ניתוח חישוביים כמו CHOPCHOP, SYNTHEGO Knockout Guide Design או CRISPOR כדי לזהות רצפי sgRNA פוטנציאליים המכוונים לגן הנבחר המעניין.
    הערה: התוכנה יכולה לזהות רצפי sgRNA פוטנציאליים בכל הגן ומציעה גרסאות מרובות בפלט. כלים אלה יציעו את אפשרויות ה-sgRNA האופטימליות ביותר ויאפשרו למשתמש לבחור מבין כל הגרסאות שזוהו במידת הצורך. בעת בחירה, שקול את הקריטריונים הבאים:
    1. קרבת אקסון: בחר רצפים הממוקמים באקסונים הקרובים ככל האפשר לנקודת המוטציה הרצויה. לקבלת תוצאות טובות יותר, שקול את האיזופורמים החלופיים של החיבור ובחר את רצף היעד הקיים ברוב האיזופורמים. שקול דפדפני גנום (למשל, Ensembl) לבחירת אקסון מדויקת.
    2. שיקולים מחוץ למטרה: נתח השפעות פוטנציאליות מחוץ למטרה באמצעות מערכת הניקוד של הכלי, ובחר רצפים המציגים את הפעילות הנמוכה ביותר החזויה מחוץ ליעד.
      הערה: כלים חישוביים כמו CHOPCHOP או Synthego יעילים ביותר להערכת קרבת אקסון והשפעות מחוץ למטרה, ועוזרים לזהות רצפי sgRNA אופטימליים לעריכת גנום מדויקת. בעת תכנון RNA מדריך, חשוב לקחת בחשבון את הרצף הספציפי של הגן המעניין בזן העכבר בו נעשה שימוש. עבור זני עכברים מסוימים (למשל, C57Bl, CBA, C3H), הרצף הגנומי המלא זמין. אם נתונים כאלה אינם זמינים, מומלץ לבצע ריצוף ראשוני של גן המטרה באזור העריכה המתוכנן. אי-התאמות בודדות ב-RNA המנחה, הנגרמות על ידי פולימורפיזמים, עלולות לפגוע ביעילות העריכה. מיקום הגנום של העכבר ROSA 26 היה ממוקד ברצף sgRNA: 5'-ACTCCAGTCTCTCTAGAGA-3'.
  2. הזמינו סט פריימרים להגברת PCR של תבנית sgRNA כמתואר בטבלה 1.
    הערה: ניתן להזמין gRNA במקום אחר, כ-sgRNA או כ-crRNA:tracrRNA דופלקס.
  3. לייצר תבנית dsDNA ליניארית.
    1. הכן את תערובת המאסטר כפי שמצוין בטבלה 1. מוסיפים את הפולימראז בסוף ושומרים את תערובת המאסטר על קרח כדי לשמור על יציבות.
    2. הפעל את ה-PCR בתנאים הבאים: דנטורציה ראשונית: 30 שניות ב-95 מעלות צלזיוס; 30 מחזורים של: 20 שניות ב-95 מעלות צלזיוס (דנטורציה), 20 שניות ב-55 מעלות צלזיוס (חישול), 15 שניות ב-72 מעלות צלזיוס (הארכה); התארכות סופית: 2 דקות ב-72 מעלות צלזיוס; החזק ב-4 מעלות צלזיוס.
  4. השתמש בתערובת תגובת ה-PCR בתגובת שעתוק חוץ גופית (IVT).
    1. הכן את תערובת המאסטר IVT כפי שמצוין בטבלה 2 ודגירה למשך 1.5 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. השתמש בתרמו-סייקלר לבקרת טמפרטורה עקבית.
    2. הוסף 2 מיקרוליטר של DNase I ודגירה למשך 30 דקות נוספות ב-37 מעלות צלזיוס כדי להסיר את תבנית ה-DNA.
    3. השבת את DNase I על ידי דגירה של תערובת התגובה ב-75 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    4. טיהור RNA באמצעות ריאגנט טריזול לפי פרוטוקול היצרן.
      הערה: יש להניח את סילוק המגיב TRIZOL ו-DNAse1, תמיסותיו או כל תוצרי לוואי שלו, במיכלי פסולת כימית ייעודיים.
    5. מדוד את ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר (התפוקה האופיינית לתגובה אחת היא 3-5 מיקרוגרם). בדוק את היחסים A260/A280 ו-A260/A230. A260/A280 צריך להיות לפחות 2.0, וגם היחס A260/A230 צריך להיות לפחות 2.0 (כלומר אין זיהום על ידי חלבונים או ממיסים אורגניים). אחסן את ה-sgRNAs בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  5. הכן את תערובת ה-RNP לטרנספקציה
    1. תערובת הטרנספקציה מורכבת מקומפלקס RNP, שהוא תערובת של חלבון Cas9 ו-sgRNA. בצע את השלבים הבאים כדי להכין את תערובת ה-RNP:
    2. יש לדלל מאגר 1 M Tris-HCl (pH 7.5) ל-100 מ"מ באמצעות מים נטולי נוקלאז ולסנן באמצעות מסנן מזרק בגודל נקבוביות של 0.022 מיקרומטר, לאחסן במנות של 10 מיקרוליטר ולאחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    3. בשפופרת נטולת נוקלאז, הכינו את תערובת הטרנספקציה של הרכיבים הבאים בריכוזים הסופיים: 500 ננוגרם/מיקרוליטר spCas9 נוקלאז, 80 ננוגרם/מיקרוליטר sgRNA, 10 מ"מ Tris-HCl מדולל במים שטופלו ב-DEPC.
      הערה: נדרשים ריכוזים גבוהים של רכיבי תערובת RNP כדי להבטיח יעילות נאותה של הפרוטוקול.
    4. דגרו את תערובת הטרנספקציה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לאפשר היווצרות קומפלקס RNP.
    5. יש לחלק את התערובת לנפחים קטנים (2 מיקרוליטר) המתאימים לפגישת I-GONAD אחת.
    6. שמור על הטמפרטורה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הפעלת I-GONAD. התערובת מוכנה טרייה לכל מפגש אלקטרופורציה של I-GONAD כדי לשמור על יציבות.
      הערה: יש להכין את תערובת ה-RNP טרייה לכל מפגש I-GONAD כדי להבטיח פעילות ויעילות מיטביות.

2. הכנת עכברים נקבות לעריכת גנום באמצעות אספקת חומצות גרעין ביציות

  1. הזדווגות ובחירת עכברים נקבות: הזדווגו עכברים נקבות CD1 עם עכברים זכרים CD1 חד-ביתיים למשך הלילה. בבוקר, בדוק אם יש פקקי הזדווגות בעכברים הנקבות. בחר נקבות עם פקקי הזדווגות והעביר אותן לכלוב חדש להמשך הליכים.
    הערה: כדי למזער את הפסיפס הגנטי, הזמן האופטימלי להעברת המבנה הגנטי הוא 0.7 ימים לאחר ההזדווגות בשלב10 של תא בודד (זיגוטה). זה בערך מתאים לשעה 16:00 בצהריים ביום שבו זוהה פקק ההזדווגות. בשלב זה, דיסקציה של צינור הביצית מגלה שלזיגוטות יש פחות תאי קומולוס, אם כי הם נשארים באמפולה. יש לציין שתאי קומולוס יכולים גם לקלוט חומצות גרעין אקסוגניות או חלבונים במהלך אלקטרופורציה. אם ההליך מבוצע מוקדם יותר, למשל, 10 שעות לאחר ההזדווגות, תאי הקומולוס עדיין מקיפים היטב את הזיגוטות, מה שעלול לעכב אספקה אלקטרופורטית יעילה של חומצות גרעין לתוך הזיגוטות. אל תשתמש בעכברים המגורים הורמונלית, מכיוון שהם עלולים לתת מספר מוגזם של ביציות, וזה עלול להוביל להפלה.
  2. הכנת מכשירים כירורגיים: חיטוי כל המכשירים הכירורגיים מנירוסטה כדי להבטיח סטריליות.
  3. הרדמה והכנת עכברים: שקלו את העכברים הנקבות שנבחרו והרדימו אותן באמצעות הזרקה תוך צפקית באמצעות תערובת של קטמין (100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג) (בהתאם לפרוטוקולים המאושרים על ידי המוסד).
    1. עקוב אחר העכברים לאיבוד רפלקס צביטת הבוהן כדי לאשר הרדמה מספקת. הנח את העכבר המורדם על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף במהלך ההליך. הגן על עיני העכבר מפני יובש במהלך ההרדמה על ידי מריחת משחה וטרינרית.

3. הליך כירורגי

  1. לחטא את אזור הגב (האחורי) של העכבר באמצעות אתנול 70%.
  2. בצע חתך עור אורכי של 0.7 ס"מ באזור הגב התחתון.
  3. נגב את מקום החתך עם כרית כותנה ספוגה באתנול 70% והסר את כל השיער סביב החתך.
  4. הרחב את החתך ל -1.3 ס"מ על ידי דחיפה לרוחב עם קצות מספריים פתוחים מעט.
  5. בצע בזהירות חתך קטן (0.7 ס"מ) בצפק כדי לגשת לחלל הבטן.
  6. הרחב את החתך ל -1.1 ס"מ על ידי דחיפה לרוחב עם קצות מספריים פתוחים מעט.
  7. אתר את כרית השומן המחוברת לשחלה ומשוך אותה בעדינות החוצה באמצעות מלקחיים עד שהשחלה, הביצית והרחם נראים בבירור.
  8. אבטח את כרית השומן במקומה באמצעות כלי clamp.
  9. דמיינו את צינור הביצית תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי למניפולציה מדויקת (איור 1).
  10. טען 2 מיקרוליטר מתערובת ההזרקה לתוך נימי פלסטיק באמצעות פיפטור חשפנית.
    הערה: ה-Stripper Pipettor עם נימי פלסטיק, שתוכנן במקור למניפולציות עם עוברים במרפאות IVF, יכול לתמוך ביישומים מרובים, כולל העברת עוברים ואספקת מבנה CRISPR/Cas9 בהליכי I-GONAD. הפיפטור מתפקד כמתקן נוזלים מדויק; בשילוב עם נימים גמישים חד פעמיים, הוא מאפשר סטריליות ומונע זיהום צולב. נימי פלסטיק עדיפים על זכוכית להזרקת תערובת RNP להעברה לתוך צינור הביצית, מכיוון שהם פחות טראומטיים לרקמות עדינות. בניגוד לנימי זכוכית, פלסטיק חד פעמי אינו דורש ליטוש להבה כדי להחליק קצוות חדים לפני ההחדרה, מה שמפחית את זמן ההכנה ואת הסיכון לנזק.
  11. בעזרת מספריים מיקרו, בצע חתך קטן (0.2 ס"מ) בדופן הביצית כמה מילימטרים במעלה הזרם של האמפולה.
  12. הכנס בזהירות את ה-Stripper Pipettor עם נימי פלסטיק לתוך החתך והוציא את תערובת ההזרקה לתוך צינור הביצית.
    הערה: ודא שלא נכנס אוויר לצינור הביצית, מכיוון שהדבר עלול להשפיע על יעילות האלקטרופורציה.
    כדי למנוע זאת, מלאו את נימי הפלסטיק בהזרקה בתערובת הזרקה רבה מהנדרש והימנעו מהזרקה מלאה. נימי פלסטיק מתאימים הן להעברת אינפונדיבולום והן לדיסקציה ישירה של דופן הביציות בין האינפונדיבולום לאמפולה. שיטת דיסקציה ישירה של דופן הביצית עשויה להיות פחות טראומטית מהעברת אינפונדיבולום מכיוון שהאחרונה דורשת חתך ראשוני דרך קרום הבורסה הדק המכסה את צינור הביצית והאינפונדיבולום. בעכברי CD1, הממברנה הזו היא בעלת כלי דם גבוהים, וחיתוך שלה עלול לגרום לדימום קל, שעלול לחסום את הראות ולסבך את המיקרו-הזרקה של תערובת ה-RNP.
  13. הסר בעדינות את נימי הפלסטיק מצינור הביצית.

4. אלקטרופורציה ותפירה

  1. הפעל את האלקטרופורטור על ידי לחיצה על המתג בלוח הקדמי.
  2. פרמטרים מוגדרים של אלקטרופורציה: דופק נקבוביות: מתח: 50 וולט, אורך דופק: 5 מ', מרווח דופק: 50 אלפיות השנייה, מספר פולסים: 3, קצב דעיכה - 10%, קוטביות: +/-; דופק העברה: מתח: 10 וולט, אורך דופק: 50 אלפיות השנייה, מרווח דופק: 50 אלפיות השנייה, מספר פולסים: 3, קצב דעיכה - 40%, קוטביות: +/-; מגבלה נוכחית: in vivo.
  3. בעזרת האלקטרודות מסוג פינצטה, אחוז בזהירות בצינור הביצית ובדוק את ערך ההתנגדות על ידי לחיצה על כפתור kΩ באלקטרופורטור. ודא שהאלקטרודות דחוסות מספיק כך שההתנגדות תישאר בטווח האופטימלי של 350-400 Ω.
    הערה: ניתן להשיג זאת על ידי התאמת המרחק בין שתי האלקטרודות כאשר צינור הביצית השלם נדחק ביניהן.
    1. מיד לאחר מדידת ההתנגדות, לחץ על כפתור התחל כדי להתחיל אלקטרופורציה. שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח אספקה יעילה של רכיבי CRISPR-Cas לזיגוטות4. המתן עד שכפתור Ω יציג אות "סיום". רשמו לעצמכם את הערכים המוצגים במסגרת 'מדידות'.
      הערה: ערך העכבה צריך להיות בערך 250-400 Ω/150-250 mA מהמתח ערך כדי להבטיח איזון אופטימלי בין כדאיות ליעילות ההעברה. כדי לשמור על איזון זה, הימנע מכיסוי אזורי צינור הביצית עם פיסת נייר רטובה ספוגה בתמיסת מלח פוספט מותאמת (DPBS) של Dulbecco, המומלצת בפרוטוקולים מסוימים, מכיוון ששלב זה יכול להפחית משמעותית את ההתנגדות מעבר לטווח האופטימלי. ירידה בהתנגדות יכולה להעלות את המתח ליותר מ-250 mA, מה שמוביל למוות של תאים.
  4. לאחר השלמת אלקטרופורציה על צינור ביצית אחד, הנח בזהירות את דרכי הרבייה בחזרה לחלל הבטן. לתפור את החתך באמצעות תפר כירורגי 4-0 חומצה פוליגליקולית.
  5. חזור על הפעולה והאלקטרופורציה על צינור הביצית השני. לאחר השלמתו, החזר את דרכי הרבייה לחלל הבטן ותפור את החתך כמתואר לעיל.
  6. ניטור לאחר ההליך: הנח את העכבר בכלוב חם (37 מעלות צלזיוס) ונקי להתאוששות ופקח עד שהוא מתאושש לחלוטין מההרדמה.
    הערה: לאחר הניתוח, יש לשכן את העכברים בכלובים המכילים שני עכברים בכל כלוב. אם רק עכבר אחד עבר ניתוח, ספק לה עכבר נקבה מלווה. תרגול זה עוזר להפחית מתח מיותר עבור העכבר המנתח ומקדם סביבה חברתית טבעית יותר.

5. גנוטיפ

  1. עיצוב פריימר
    1. עבור גנוטיפ, תכנן פריימרים להגברת תוצר PCR באורך של 300-600 bp. פריימרים צריכים להיות באורך 18-21 נוקלאוטידים עם טמפרטורת התכה (Tm) של כ-60 מעלות צלזיוס.
    2. הימנע מרצפים היוצרים מבנים משניים או דימרים פריימר. השתמש בכלי תוכנה כגון PerlPrimer 1.1.2111, In-Silico PCR V39x1 או דומה כדי להבטיח איכות פריימר.
    3. בצע חיפוש BLAST מול מסד הנתונים של גנום העכבר כדי לאשר את ספציפיות הפריימר ולהימנע מהגברה לא ספציפית11.
      הערה: הפריימרים הבאים תוכננו לגנוטיפ של רצף המטרה: פריימר קדימה: 5'-CTCTCCCAAAGTCGCTCTGA-3'; פריימר הפוך: - 5'-TCTGTGGGAAGTCTTGTCCC-3', אורך מוצר PCR צפוי: 320 bp ו-Tm 62°C. לריצוף Sanger, תכנן פריימר רצף שמחסל 150-200 bp מאתר החיתוך Cas9.
  2. בצע מיצוי DNA. למיצוי DNA מהיר, פרוטוקול בידוד Hotshot12 הוא הפשוט ביותר.
    1. בעזרת אגרוף אוזניים, אסוף שבר רקמה קטן (כ -2 מ"מ) מאוזן העכבר.
    2. הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה (25 מ"מ NaOH, 0.2 מ"מ EDTA, pH = 12).
    3. דוגרים בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות, מערבבים את התערובת כל 20 דקות.
    4. הוסף 100 מיקרוליטר של חוצץ מנטרל (40 מ"מ Tris-HCl, pH = 5) ומערבולת ביסודיות.
    5. השתמש ב-1-5 מיקרוליטר מההכנה הסופית ל-PCR.
  3. הגברה וריצוף PCR. הכן את תערובת המאסטר PCR כמתואר בטבלה 3. השתמש בהגהה של DNA פולימראז כדי להבטיח נאמנות גבוהה. יש לערבב את המאסטר למספר הצינורות הנדרש ולהוסיף DNA גנומי.
    הערה: כלול תמיד דגימת DNA מסוג בר כבקרה לניתוח ריצוף.
  4. הפעל את ה-PCR עבור גנוטיפ ROSA26 . נעשה שימוש בתנאים הבאים: דנטורציה ראשונית: 30 שניות ב-95 מעלות צלזיוס; 28 מחזורים של: 20 שניות ב-95 מעלות צלזיוס (דנטורציה), 20 שניות ב-62 מעלות צלזיוס (חישול), 20 שניות ב-72 מעלות צלזיוס (הארכה); התארכות סופית: 2 דקות ב-72 מעלות צלזיוס; החזק ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: הפרוטוקול שסופק מדויק עבור הגברה של שבר לוקוס ROSA26 (גודל משוער של 320 bp) באמצעות פריימרים משלב 1.1.2. להגברה ספציפית ומדויקת יותר, הגבל את מספר מחזורי ההגברה ל-28-30.
  5. ריצוף וניתוח
    1. בצע ריצוף סנגר של מקטעי PCR שהתקבלו (שלב 5.4).
    2. ניתוח תוצאות הריצוף
      הערה: טרנספקציה מוצלחת תביא ליצירת חיות פסיפס, הניתנות לזיהוי על ידי הופעתם של רצפי DNA נוספים ליד אתר חיתוך הנוקלאז בכרומטוגרמה של הרצף. השתמש בכלים חישוביים כגון EditCo ICE Analysis או TIDE13 כדי לזהות ולכמת אינדלים מדויקים בגנום.
      1. כדי להשתמש בניתוח ICE, פשוט העלה קבצי ריצוף Sanger שהושגו (קובץ .ab1 בקרה עבור רצף מוצרי PCR של עכבר wt ללא עריכה וניסוי קובץ .ab1 עבור רצף מוצרי PCR של עכבר ניסוי), הזן את רצף ה-RNA המנחה ובחר את הנוקלאז המשמש בניסוי CRISPR.
        הערה: כלי ניתוח ICE יחשב את יעילות העריכה הכוללת, ויקבע את הפרופילים והשפע היחסי של כל סוגי העריכות השונים הקיימים במדגם.
      2. כדי להשתמש ב-TIDE, הזן את רצף ה-RNA של המדריך, העלה קבצי רצף Sanger שהושגו (קובץ .ab1 לשליטה ברצף מוצרי PCR של עכבר wt ללא עריכה וניסוי קובץ .ab1 עבור רצף מוצר PCR של עכבר ניסוי), ובדוק פרמטרים (במקרים מסוימים, הגדרות מתקדמות יכולות לעזור למצוא indels גדולים מ-10 bp).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אם האלקטרופורציה הצליחה, עכברי הניסוי: (1) ימליטו קומץ גורים, ו-(2) לחלק מהחיות יהיו אינדל שונה בגנום. אם פריימרים הגנוטיפיים מתוכננים היטב, ותוכנית ה-PCR אופטימלית, מוצר ה-PCR יהיה נוכח על ג'ל האגרוז כרצועה אחת שקופה בגודל הרצוי. אם הנוקלאז חותך בהצלחה את ה-DNA המטרה, סביר להניח שבעלי החיים המתקבלים יהיו פסיפס ויש להם מגוון של אינדל בגנום. נעשה שימוש בכלים חישוביים, כגון EditCo ICE Analysis או TIDE, כדי למצוא את האינדלים המדויקים בגנום. כקלט, הוא משתמש ברצף מרווח sgRNA, בקובץ הכרומטוגרמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

היעילות של יצירת עכברי נוקאאוט בשיטת I-GONAD דומה לזו של טכניקות מיקרו-הזרקה מסורתיות. עם זאת, שיטות מסורתיות כוללות בידוד זיגוטות מנקבות תורמות, ביצוע מיקרו-הזרקות והשתלת עוברים בביציות של נקבות פסאודו-בהריון. לעומת זאת, שיטת I-GONAD מפשטת את התהליך הזה על ידי העברת רכיבי עריכת גנום ישירות לביציות של נקבות בהריון, ומבטלת את הצורך בבידוד והשתלה של זיגוטה. הפרוטוקול המוצג מדגיש את היעילות של שיטת I-GONAD על ידי הדגמת החדרה מוצלחת של מוטציות בלוקוס ROSA26 על כרומוזום 6 של עכבר באמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

המחברים אסירי תודה לפארק המחקר של אוניברסיטת סנט פטרבורג, המרכז לטכנולוגיות מולקולריות ותאיות. הריצוף בוצע באמצעות מנתח גנטי ABI 3500 xL (Thermo Fisher Scientific, ארה"ב) במרכז המשאבים לטכנולוגיות מולקולריות ותאיות, הפארק המדעי של אוניברסיטת סנט פטרסבורג. המחברים אסירי תודה למריה רובל על עזרתה בעריכת המסמכים ובהגשתם. מחקר זה מומן על ידי האוניברסיטה הממלכתית של סנקט פטרבורג, פרויקט המחקר ID: 129658320, ולויבוב שקודנקו נתמך על ידי הקרן המדעית הרוסית (פרויקט 25-26-00247).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.5– 5 uL pipette תרמו-סיינטיפיק4642020
צינור 1.5 מ"לאפטקה1003/G
100-1000 uL pipette תרמו-סיינטיפיק4642090
צינור בנפח 200 אלו"ראקסיגןPCR-02-C
פיפטה 20-200 אלו-ליטר  תרמו-סיינטיפיק4642080
2-20 uL pipette תרמו-סיינטיפיק4642060
צבע טעינת ג'ל 4xBiolabmixD-3002
אגרוזAppliChemA8963,0500
DNase I, ללא RNase (1 U/μ L)תרמו פישרEN0521
ערכת dNTP, פתרון 100 mMתרמו-סיינטיפיקR0181
פולימראז DreamTaq Green DNA (5 U/μ L)תרמו-סיינטיפיקEP0713
דולבקו' s שונה עם מלח בופר בפוספטסיגמא אולדריץ'D8537
ניתוח ICE של EditCohttps://ice.editco.bio/#/ניגש ב-04.06.2025
תמיסת EDTA 0.5M, pH = 8AppliChemA4892,0500
הרכב  https://www.ensembl.org/index.htmlניגש ב-09.06.2025
אתידיום ברומידBiolabmixEtBr-10
טיפות ג'ל עיניים " Oftagel"URSAPHARM204604
מערכת תיעוד ג'ל ChemiDoc XRS+ביו-ראד1708265
In-Silico PCR V39x1 https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr  ניגש ב-09.06.2025
טכנולוגיות DNA משולבות https://eu.idtdna.comניגש ב-09.06.2025
מספריים מיקרוכירורגייםמדין אורלM124
אלקטרופורטור NEPA21נפה ג'יןNEPA21עם אלקטרודת CUY652P2.5X4
סט NTP, פתרון של 100 מ"מתרמו-סיינטיפיקR0481
אוליגונוקלאוטידיםאברוגןסדר ישיר, טיהור סטנדרטי של דה-מלח
Opti-MEM I מדיום סרום מופחתתרמו פישר31985070
פרלפרימרhttps://perlprimer.sourceforge.netגרסה 1.1.21.
פולימראז DNA באיכות גבוהה של Phusion (2 U/μ L)תרמו-סיינטיפיקF530L
קצות פיפטה 10 אלו"ראולפלסטHT-10-960
קצות פיפטה 1000 uLאולפלסטHT-1000-576
קצות פיפטה 200 אלו-ליטראולפלסטHT-200-960
ספק כוח " אלף-4"טכנולוגיית DNAPS-400 חדש
מים חופשיים מ-RNAse/DNAseInvitrogen10977049
תמיסת מלחPanEcoP011n
מערכת האלקטרופורזה הוריסונטלית SE-1הליקוןSE-1
נתרן הידרוקסידסיגמא-אלדריץ'S5881-500G
סולם ה-DNA של Step100BiolabmixS-8100
SMZ1000 סטריאומיקרוסקופניקון5-363376
מיקרופיפטר מפשטCooperSurgicalMXL3-STR
טיפים לחשפניותאוריג'יוMXL3-125
מחט ניתוח KMIZ4A1- 0,6&; 20
תפירת מלקחייםמדין אורלM302.2
תפירת מלקחייםמדין אורלM303
חוט תפירה POLYCON Nfigure-materials-10טונזוס 95234
עיצוב מדריך SYNTHEGO Knockout  https://design.synthego.com/#/ניגש ב-09.06.2025
מגבר T100BioRad10014822
T7 RNA פולימראז  תרמו-סיינטיפיקEP0111
מאגר TBE 10xBiolabmixTBE-500
Tide https://tide.nki.nl/ניגש ב-04.06.2025 
טריס הידרוכלורידמדעי סוז'ואו יאקוSYS-S0005-0.5
תמיסת הידרוכלוריד טריזמהסיגמא אולדריץ'T2663
ריאגנט טריזולInvitrogen15596026
חלבון TrueCut Cas9InvitrogenA36499
מספריים אוניברסליתמדין אורלM147
זילזיןInterchemie Werken de AdelaarIX2
זולטילמעבדת וירבאק2000443714739.00

מקורות

  1. Fujihara, Y., Ikawa, M. CRISPR/Cas9-Based Genome Editing in Mice by Single Plasmid Injection. Methods Enzymol. 546, 319-336 (2014).
  2. Zuo, E., et al. One-step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs. Cell Res. 27 (7), 933-945 (2017).
  3. Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754(2019).
  4. Kobayashi, Y., et al. Modification of i-GONAD suitable for production of genome-edited C57BL/6 inbred mouse strain. Cells. 9 (4), 957(2020).
  5. Takabayashi, S., et al. Successful i-GONAD in mice at early zygote stage through in vivo electroporation three minutes after intra-oviductal instillation of CRISPR-ribonucleoprotein. Int J Mol Sci. 23 (18), 10678(2022).
  6. Sato, M., et al. Sequential i-GONAD: An improved in vivo technique for CRISPR/Cas9-based genetic manipulations in mice. Cells. 9 (3), 546(2020).
  7. Kessler, S., et al. A multiple super-enhancer region establishes inter-TAD interactions and controls Hoxa function in cranial neural crest. Nat Commun. 14 (1), 3242(2023).
  8. Kaneko, T., Tanaka, S. Improvement of genome editing by electroporation using embryos artificially removed cumulus cells in the oviducts. Biochem Biophys Res Commun. 527 (4), 1039-1042 (2020).
  9. Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nat Protoc. 14 (8), 2452-2482 (2019).
  10. Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: A robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biol. 19 (1), 25(2018).
  11. Marshall, O. J. PerlPrimer: Cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite and real-time PCR. Bioinformatics. 20 (15), 2471-2472 (2004).
  12. Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT). BioTechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
  13. Brinkman, E. K., Van Steensel, B. Rapid quantitative evaluation of CRISPR genome editing by TIDE and TIDER. CRISPR Gene Editing. 1961, 29-44 (2019).
  14. Imai, Y., Tanave, A., Matsuyama, M., Koide, T. Efficient genome editing in wild strains of mice using the i-GONAD method. Sci Rep. 12 (1), 13821(2022).
  15. Iwata, S., et al. Simple and large-scale chromosomal engineering of mouse zygotes viain vitro and in vivo electroporation. Sci Rep. 9 (1), 14713(2019).
  16. Abe, M., et al. A novel technique for large-fragment knock-in animal production without ex vivo handling of zygotes. Sci Rep. 13 (1), 2245(2023).
  17. Meyer-Dilhet, G., Courchet, J. In utero cortical electroporation of plasmids in the mouse embryo. STAR Protocols. 1 (1), 100027(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CRISPR Cas9RNAPCR

מאמרים קשורים