מאמר שיטה

אופטימיזציה והערכה של ציור ידני וספינינג רטוב לייצור סיבי משי עכביש רקומביננטיים

DOI:

10.3791/68714

⸱

29 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Dalhousie University, 2Department of Chemistry, Dalhousie University, 3School of Biomedical Engineering, Dalhousie University

* These authors contributed equally

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המוצג מספק סט רב תכליתי של שיטות לייעול המסיסות של חלבוני משי רקומביננטיים לטוויה; בדיקת ספינביליות על ידי ציור ידני; לייצר סיבים ארוכים ורציפים, עם ספינינג רטוב אוטומטי; ולהעריך באופן השוואתי מורפולוגיה, יישור מולקולרי, התנהגות מכנית ותכולת מבנית משנית של חלבון של סיבים או בתוכם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משי עכביש ידוע בתכונות המכניות שלו, עם חוזק גבוה, יכולת הרחבה גבוהה או שילוב של אלה המובילים לקשיחות גבוהה. נקבת עכביש אורגת כדורים טיפוסית מייצרת שבעה סוגים שונים של משי, כל אחד מהם טוויה בדרך כלל מחלבון (ים) ספציפי לסוג ומותאם מכנית לפונקציית הישרדות מובחנת. ייצור משי עכביש רקומביננטי מספק מסלול מבטיח להשגת חומרים אלה, עוקף אתגרים בהשגת כמויות גדולות של משי טבעי ומספק יתרונות במתן אפשרות להתאמה אישית של חלבון, למשל, באמצעות מוטגנזה מכוונת אתר או בניית חלבון היתוך.

בפרוטוקול המוצג, אנו מתארים מתודולוגיה להערכת התאמת חלבון לספינינג באמצעות גישות ציור ידני וספינינג רטוב. החל מאבקת חלבון ליופילית מטוהרת כראוי, מפורטות שיטות למיטוב מצב החלבון המסיס הראשוני כדי לספק מצב "סם מסתובב" בריכוז גבוה. לאחר מכן, משווים גישות ציור ידני וספינינג רטוב, כולל דיון בשיטות לווסת את התנהגות הסיבים באמצעות משיכה לאחר סיבוב כחלק מתהליך הספינינג. לאחר מכן מפורט תהליך עבודה טיפוסי לאפיון סיבי המשי המתקבלים וקבלת החלטה אילו תנאי ספינינג הם בעלי הסיכוי הגבוה ביותר להיות פוריים, כולל מיקרוסקופיה אופטית להערכת קוטר הסיבים ואחידותו; מיקרוסקופ אור מקוטב כדי להעריך את מידת היישור (העל) המולקולרי המושג בתוך הסיב; בדיקות מתיחה להערכת חוזק, יכולת הרחבה, מודול יאנג וקשיחות; וספקטרומיקרוסקופיה אינפרא אדום טרנספורמציה פורייה (FTIR) כדי להעריך את המבנה המשני של החלבון בתוך הסיב.

פרוטוקול זה הוכח כמתאים למספר חלבוני משי עכביש רקומביננטיים שונים המבוססים על תחומים חוזרים ולא חוזרים של משי אציניפורם (עטיפה); משי פירפורמי; וחלבוני היתוך המורכבים ממשי aciniform, pyriform ו/או ampullate (dragline). ישימות רחבה יותר ניתנת באמצעות מספר שלבים מודגשים שבהם ניתן לשנות את התנאים והפרמטרים כדי להתאים להתנהגות של חלבון בודד ולהשיג הבדלים בתוצאה התפקודית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכבישים מייצרים משי למשימות מיוחדות שונות, כולל בניית קורים, לכידת טרף והגנה על ביצים1. משי עכביש מציג תכונות מכניות יוצאות דופן העולות על אלו של רוב החומרים הטבעיים והסינתטיים הידועים2, מה שמניע מאמצים ניכרים לייצור חומרי משי עכביש מהונדסים ומשופרים ליישומים תעשייתיים וביו-רפואיים מגוונים. Spidroin, החלבון היוצר משי עכביש, מורכב מתחום גדול יחסית שחוזר על עצמו התחום על ידי תחומים N-terminal ו-C-terminal3 שאינם חוזרים על עצמם, כאשר התכונות המכניות הייחודיות של כמה סוגי משי נקשרו לחזרה על מוטיבים קצרים בתחום החוזר על עצמו 4,5,6. בניגוד לתולעת המשי המעובדת באופן מסחרי (Bombyx mori), המייצרת כמויות גדולות של משי בצורת פקעת עקבית המתאימה לקציר, עכבישים הם אורגניזמים קניבליים וטריטוריאליים מטבעם המייצרים משי בכמויות מוגבלות, ובכך מהווים אתגר לייצור חקלאי ולאיסוף7. בהתחשב במגבלות אלה, ייצור משי עכביש רקומביננטי פותח כחלופה ריאלית ובת קיימא יותר להשגת כמויות מספיקות של משי עכביש ליישום.

ייצור משי עכביש רקומביננטי דורש בחירת מארח מתאים לביטוי חלבון. משי עכביש התבטא במערכות מארחות שונות, כולל חיידקים 8,9, שמרים10,11, תאי חרקים12, צמחים13,14 ותאי יונקים15,16, כאשר Escherichia coli היא מערכת המארח הנפוצה ביותר. המשקלים המולקולריים הגבוהים של ספידרואינים, שיכולים להגיע עד 700 kDa7, מציבים אתגרים משמעותיים לביטוי מבנים באורך מלא. כדי לייצר משי עכביש רקומביננטי עם תכונות דומות או משופרות ביחס לאלו של משי עכביש טבעי, האסטרטגיה העיקרית הננקטת היא ביטוי של גרסאות קטומות, כגון מבנים עם מספר מוגבל של יחידות חוזרות (עם או בלי תחומים שאינם חוזרים על עצמם), כימרות המורכבות משילובים של סוגי משי שונים, ומשי היברידי המותך עם חלבונים שאינם משי. לדוגמה, ספידרואין אמפולאט מז'ורי רקומביננטי (284.9 kDa) בא לידי ביטוי בהצלחה ב-E. coli מהונדס מטבולית, והמשי שנוצר הפגין תכונות מכניות דומות לאלו של משי אמפולט מז'וריטבעי 9. בנוסף, סיבי משי מהונדסים המורכבים משתי יחידות חוזרות של ספידרואין פירפורמי ושתי יחידות חוזרות של ספידרואין אציניפורם הראו יכולת הרחבה עדיפה על כל אחד מהמשי הפיריפורמי או האציניפורמי המרכיב, הדומה לזו של משי דגל טבעי17.

ייצור חלבון רקומביננטי מאפשר גם שילוב פשוט של מקטעי פפטיד או חלבון פונקציונליים בחלבוני משי, מה שמאפשר ייצור של ביו-חומרים בעלי תכונות המותאמות ליישומים ספציפיים. לדוגמה, המיזוג הגנטי והכימי של מוטיבים של קשירת תאי RGD עם משי מהונדס גנטית שמקורו בספידרואינים אמפולטים עיקריים הביא לסרטים ששיפרו משמעותית את ההידבקות וההתפשטות של פיברובלסטים18. במחקר נפרד, מבנה משי היברידי המורכב ממוטיב קושר גורם גדילה עצבי-β (NGF) התמזג לחלבון כימרי המורכב משתי יחידות חוזרות של אציניפורם ספידרואין ותחום C-terminal של ספידרואין אמפולאט עיקרי הוכח כתומך בצמיחה והתמיינות של תאים דמויי נוירונים19.

בהינתן ביטוי וטיהור מוצלח של חלבון משי רקומביננטי, ניתן לעבד אותו לצורות שונות כגון הידרוג'לים, סרטים, סיבים, ננו-חלקיקים, קצף וספוגים, בהתאם ליישום המיועד20,21. כדי לאפשר ייצור סיבי משי מלאכותיים, פותחו שיטות ספינינג המחקות היבטים מסוימים של תהליך ספינינג הסיבים הטבעיים המורכב והמסודר היטב של עכבישים. במשי טבעי של אמפולט גדול, ספידרואין מיוצרים על ידי תאי אפיתל בבלוטת האמפולטה העיקרית ומאוחסנים במצב מסיס בתוך הלומן בריכוזים גבוהים (עד 50% (w/v)))22, ויוצרים סם מסתובב מימי. כאשר הסם המסתובב נע דרך צינור המסתובב, הוא חווה שינויים ב-pH, ריכוז היונים, תכולת המים וכוחות הגזירה הן מהיצרות הצינור והן מתהליך פולטרוזיה הסיבים, מה שגורם להפיכת חלבוני משי נוזלי לסיבים מוצקים23,24. זיהוי ממס מתאים שיכול להמיס או להשעות חלבוני משי רקומביננטיים בריכוז גבוה ליצירת סם מסתובב הוא, אם כן, צעד ראשון קריטי בתהליך טוויית הסיבים המלאכותיים.

מגוון רחב של ממיסים שימש לניסוח סמים מסתובבים של חלבון משי, והוכח כי בחירת הממס משפיעה על היווצרות סיבים ותכונות מכניות25,26. כתוצאה מכך, שיקול זהיר של בחירת ממס סמים חיוני כדי לייעל את מאפייני הסיבים המתקבלים. ניתן לנסח סמים מסתובבים באמצעות ממיסים אורגניים או מימיים, כגון 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol (HFIP)27, hexafluoroacetone (HFA)28, תערובות של חומצה טריפלואורואצטית (TFA) ו-2,2,2-trifluoroethanol (TFE)26, חומצה פורמית29 ונתרן פוספט/טריס בופר30. מכיוון שמסיסות החלבון מושפעת בדרך כלל מגורמים כמו pH, חוזק יוני וריכוז, זיהוי ממס סמים מתאים כרוך בדרך כלל בהערכה שיטתית של ממיסים שונים, אופטימיזציה של pH וריכוזי חלבון, ובמקרים מסוימים, שימוש בתערובות ממס-מים לקביעת תנאי סמים ספינינג אופטימליים. יתר על כן, צמיגות הסם המסתובב היא פרמטר חשוב שיש להעריך לפני תהליך הספינינג מכיוון שתמיסת סמים צמיגה מאוד עלולה לעכב את זרימת הנוזל במהלך הספינינג, בעוד שסם לא צמיג מספיק בדרך כלל לא יתאים להיווצרות סיבים31,32. יש לציין כי השימוש בתנאי סם ספין קשים עלול לשנות את מבנה החלבון בחשיפה ממושכת; לכן, פיתוח ממיסי סמים ידידותיים לסביבה נותר תחום מחקר פעיל.

ציור ידני וטוויה רטובה הן שתי שיטות נפוצות של טוויית סיבי משי רקומביננטיים. התכונות המכניות של הסיבים המיוצרים בכל שיטה תלויות מאוד הן בתנאי הספינינג עצמם והן בעיבוד שלאחר הסיבוב. ציור ידני, המכונה גם ספינינג משיכה, הוא שיטת ייצור סיבים פשוטה שבה נשלפים סיבים מתמיסות של חלבונים מטוהרים, בדרך כלל באמצעות קצה פיפטה, מלקחיים או פינצטה, ולאחר מכן ייבוש אוויר ואפיון 33,34,35,36,37. בעוד שציור ידני מספק גישה מצוינת לסינון מהיר של מגוון תנאי היווצרות סיבי משי ובאופן כללי לסווג את ההתנהגות המכנית של הסיבים המתקבלים, טכניקה זו אינה ניתנת להרחבה בקלות לסיבים רציפים ארוכים (כלומר, אורך רב מטר). כחלופה, אנו משתמשים בספינינג רטוב, המפעיל שחול רציף של סם מסתובב במהירות קבועה לתוך אמבט קרישה, בדרך כלל ממס מימי או אורגני המורכב מתערובת של מים ואתנול או מתנול 9,15,31,38,39,40 . טבילת הסם המסתובב באמבט הקרישה גורמת להמסת חלבון מהירה, וכתוצאה מכך להיווצרות סיבים רציפים24. לאחר מכן, סיבים נשאבים מאמבט הקרישה במהירות קבועה, מותאמים לקצב האקסטרוזיה כדי לספק סיבים מסתובבים (AS) או נתונים למשיכה לאחר סיבוב כדי לספק סיבים לאחר סיבוב (PS) שבדרך כלל יש להם תכונות מכניות משופרות. המשיכה לאחר הסיבוב כוללת בדרך כלל מתיחה של סיבים ביחס של פי 2-8 מאורכם המקורי באוויר, בממס או לאחר טבילה בממס, כאשר כל פרמטר תורם לתכונות מכניות ספציפיות 15,17,31,38.

בעוד שפרוטוקול זה מתמקד בשיטות ציור ידני וספינינג רטוב, חשוב למקם את השיטות הללו בהקשר. דווח על שיטות אלקטרו-ספינינג עבור משי עכביש רקומביננטי מתנאים מימיים ואורגניים כאחד, המאפשרות ייצור של מחצלות סיבים, סיבים מיושרים וחוטים, כאשר הסיבים הם בדרך כלל בקנה מידה ננומטרי בקוטר41. זה מספק את היתרון הפוטנציאלי של סיבים בקנה מידה ננומטרי, ואתגר מקביל אם רוצים סיבים בקנה מידה מיקרוני, בדרך כלל עם דרישה לבצע עיבוד לאחר ספין כדי לגרום לטרנספורמציה למבנה β גיליון כדי לשפר את המכניקה ותאימות המים. סרטי משי עכביש רקומביננטיים רב-מטריים ברוחב ועובי בקנה מידה מיקרוני הושגו על ידי ספינינג יבש מממס אורגני42, עם הוכחה לאחרונה כי שילוב יוני מתכת בשלב סם הספין משפר את המכניקה43. ספינינג44 מבוסס מיקרופלואידיקה, כולל שילוב עדכני של טכנולוגיית הדפסת תלת מימד עם סביבונים מיקרו-מחטים שנועדו לחקות את הספינר הטבעי45, מתאים לטוויית סיבי משי רקומביננטיים הניתנת לשליטה גבוהה. למרות המגוון הרחב של שיטות שדווחו כמתאימות לייצור סיבי משי (או דמויי משי), הפרוטוקול הנוכחי מפרט ייצור סיבי משי רקומביננטיים על ידי ציור ידני וטוויה רטובה, שכן שיטות אלו הוכיחו את עצמן כניתנות לתרגום למספר גרסאות שונות של משי רקומביננטי בידינו ומספקות נקודת התחלה ניתנת לביצוע לפיתוח ביו-חומרים והערכה השוואתית.

לאחר ספינינג ואיסוף סיבים, נעשה שימוש שגרתי בשילוב של טכניקות אופטיות, מכניות וספקטרוסקופיות לאפיון תכונות לאחר ספינינג. כל שיטה מספקת תובנות מפתח לגבי תהליך היווצרות הסיבים והמתאם שלו עם ביצועי החומר. כאן, אנו מתמקדים בתת-קבוצה של שיטות אלו, ומציינים שישנן מתודולוגיות רבות אחרות המספקות מידע מרכזי על תכונות וביצועים של סיבי משי. מיקרוסקופיה אופטית משמשת להערכת מורפולוגיה של סיבים, ומאפשרת השוואה של קוטר של סיבים שטוו בתנאים זהים ומשתניםכאחד 17,31,38,46. טכניקה זו חשובה גם לזיהוי וביטול מקטעי סיבים עם פגמים או חריגות לפני האפיון שלאחר מכן. בנוסף, ניתן להשתמש במיקרוסקופ אור מקוטב כדי להעריך את מידת היישור המולקולרי בתוך הסיב, שכן רמות גבוהות יותר של יישור קשורות בדרך כלל לתכונות מכניות משופרות 17,26,47. האפיון המכני מתבצע באמצעות בדיקות מתיחה, שבהן נמדדות עקומות מתח-מתח ומשמשות לכימות פרמטרים כגון חוזק מתיחה, יכולת הרחבה, מודול יאנג וקשיחות, ומספקים מידע חיוני להערכת התאמת סיבים ביישומים מבניים או ביו-רפואיים 17,33,48 . הטכניקה האחרונה המכוסה כאן, ספקטרומיקרוסקופיה אינפרא אדום טרנספורמציה פורייה (FTIR), מיושמת כדי לחקור את המבנה המשני של החלבון, במיוחד את מידת היווצרות β היריעות, מכיוון שהיא ממלאת תפקיד מכריע ביציבות הסיבים ובחוזק המכני 17,46,49. יחד, טכניקות אלו מספקות הבנה מקיפה של המורפולוגיה, המבנה וההתנהגות המכנית של סיבי משי המיוצרים רקומביננטית.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, אנו מניחים שנקודת ההתחלה היא אבקת חלבון משי ליופילית. זה בדרך כלל יהיה חלבון משי עכביש רקומביננטי בעבודה שלנו. סקירה כללית של הפרוטוקול מסופקת באיור 1, כאשר כל אחד מחמשת השלבים הבאים מפורט להלן: (1) הכנה ואופטימיזציה של סמים מסתובבים; (2) ציור ידני של סיבי משי או ספינינג רטוב; (3) קוטר סיבים והערכה מורפולוגית על ידי מיקרוסקופיה אופטית; (4) הערכה מכנית על ידי בדיקת מתיחה; ו-(5) הערכת מבנה משני על ידי ספקטרומיקרוסקופיה FTIR.

figure-protocol-1
איור 1: סקירה סכמטית של שלבי המפתח בפרוטוקול לייצור, איסוף ואפיון של סיבי חלבון משי עכביש רקומביננטיים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

1. הכנה ואופטימיזציה של סמים מסתובבים

הערה: לאופטימיזציה של תמיסת סמים מסתובבת סיבים, נסה להמיס ריכוזים משתנים של חלבון משי עכביש רקומביננטי בממיסים שונים להכנת תמיסות סמים (טבלה 1). יש להשתמש רק בממיסים הממיסים את החלבון, הנותנים תמיסת סמים שקולה ונטולת משקעים, לניסיונות לסובב סיבים.

  1. הכנת ממיסים
    1. כדי ליצור 8:1:1 TFA/TFE/H2O, מדוד 800 מיקרוליטר של TFA, 100 מיקרוליטר של TFE ו-100 מיקרוליטר של מים אולטרה-טהורים מסוג 1 לתוך צינור זכוכית בתוך מכסה אדים. מערבבים היטב את כל הרכיבים. מכסים את צינור הזכוכית ומכסים אותו בפרפילם כדי למנוע אידוי של רכיבים נדיפים.
      הערה: הכינו תמיד תמיסה טרייה לספינינג סיבים.
      זהירות: טפל בזהירות ב-TFA וב-TFE, TFA הוא מאכל ונדיף מאוד, בעוד ש-TFE דליק ורעיל. יש ללבוש ציוד הגנה אישי מתאים, כולל כפפות, מעילי מעבדה ומשקפי מגן, כדי למנוע מגע עם העור וסיכוי לשאיפה.
    2. כדי ליצור 3:1:1 TFA/TFE/H2O, בתוך מכסה אדים, העבירו 300 מיקרוליטר של TFA, 100 מיקרוליטר של TFE ו-100 מיקרוליטר של מים אולטרה-טהורים מסוג 1 לתוך צינור זכוכית וערבבו את הרכיבים. כסו את צינור הזכוכית וכסו אותו בפרפילם כדי למזער את האידוי של רכיבים נדיפים.
      הערה: הכינו תמיד תמיסה טרייה לספינינג סיבים.
    3. כדי להכין 7:3 HFIP/H2O, מערבבים 700 מיקרוליטר של 1,1,1,3,3,3-hexafluroro-2-propanol (HFIP) עם 300 מיקרוליטר של מים אולטרה-טהורים מסוג 1 ליצירת תמיסה של 1 מ"ל. הכן את התמיסה טרי בעת הצורך.
      זהירות: טפל ב-HFIP בתוך מכסה אדים והימנע משאיפה או מגע בעור.
    4. כדי ליצור מאגר אשלגן פוספט של 50 מ"מ (pH 7.5), קח 800 מ"ל מים נטולי יונים בכוס והמיס 1.199 גרם של אשלגן דימימן פוספט (KH2PO4- MW. 136. 09 גרם/מול) ו-7.173 גרם אשלגן פוספט דו-בסיסי (K2HPO4- MW. 174.18 גרם/מול) בו. מערבבים היטב את כל הרכיבים ומתאימים את ה-pH של התמיסה באמצעות NaOH או HCl. מלאו את הנפח ל-1 ליטר במים נטולי יונים ואחסנו בטמפרטורת החדר.
    5. כדי ליצור מאגר Tris-Cl של 10 מ"מ (pH 8.0), ממיסים 1.21 גרם של טריס-הידרוכלוריד (MW. 157.60 גרם/מול) ב-800 מ"ל של מים נטולי יונים. התאם את ה-pH באמצעות NaOH ומלא את הנפח הסופי ל-1 ליטר במים נטולי יונים. אחסן את התמיסה בטמפרטורת החדר.
    6. כדי ליצור מאגר Na-אצטט של 20 מ"מ (pH 5.0), ב-450 מ"ל של מים נטולי יונים, ממיסים 0.55 גרם נתרן אצטט (MW. 82.03 גרם/מול) ו-0.02 M (6 מ"ל) חומצה אצטית. מלאו את הנפח ל -500 מ"ל במים נטולי יונים ואחסנו בטמפרטורת החדר.
    7. כדי ליצור מאגר פוספט ציטראט 1 M (pH 7.0), ממיסים 11.69 גרם של דיסודיום מימן פוספט (Na2HPO4- MW. 141.96 גרם/מול) ו-1.85 גרם חומצת לימון (MW. 192.12 גרם/מול) ב-400 מ"ל של מים נטולי יונים. התאם את ה-pH של התמיסה באמצעות HCl או NaOH, והתאם את הנפח הסופי ל-500 מ"ל באמצעות מים נטולי יונים.
    8. כדי להכין את תמיסת 98% חומצה פורמית-CaCl2 , יש לדלל חומצה פורמית ל-98% על ידי ערבוב של 98 מ"ל של חומצה פורמית עם 2 מ"ל מים נטולי יונים לתמיסה כוללת של 100 מ"ל. כעת, הוסף 4 גרם של CaCl2 ל-100 מ"ל של תמיסת חומצה פורמית 98% להכנת תמיסת חומצה פורמית 4% w/v CaCl2 . אחסן את התמיסה בטמפרטורת החדר.
      הערה: ראה טבלה 1. יש להשתמש רק בממיסים הממיסים את החלבון, הנותנים תמיסת סמים שקולה ונטולת משקעים, לניסיונות לסובב סיבים.
  2. הכנת תמיסת סמים מסתובבת סיבים
    1. שקלו את חלבון משי העכביש הליופילי לפי הריכוז הרצוי (למשל, 10 מ"ג לתמיסה של 10% (w/v) ב-100 מיקרוליטר של ממס) וערבבו עם נפח הממס המתאים (למשל, 100 מיקרוליטר לריכוז של 10% (w/v).
    2. מערבלים את התערובת עד שאבקת החלבון מומסת במלואה בממס.
    3. מכיוון שהמסיסות של חלבון משי עכביש משתנה בהתאם לסוג הממס והחלבון, התחל בריכוז חלבון נמוך (10% w/v) והגדל בהדרגה את הריכוז (25-30% w/v) לפי הצורך.
    4. לאחר פירוק מוחלט של החלבון, יש להעריך באופן איכותי את צמיגות תמיסת הסמים. אם תמיסת הסם נראית לא צמיגה מספיק, הגדל בהדרגה את ריכוז החלבון עד לקבלת תמיסה צלולה וצמיגה. השתמש במים כתקן ייחוס.
הממסריכוז חלבון (% - w/v)הפניה
8:1:1 TFA/TFE/H2O10 – 2519
3:1:1 TFA/TFE/H2O10 – 3026
7:3 HFIP/H2O15 – 3031
50 מ"מ מאגר אשלגן פוספט (pH 7.5)10 – 2550
מאגר Tris-Cl 10 מ"מ (pH 8.0)10 – 2034
20 מ"מ מאגר Na-אצטט (pH 5.0)10 – 2549
1 M מאגר פוספט ציטראט (pH 7.0)10 – 2551
98% חומצה פורמית – CaCl220 – 2552

טבלה 1: ממיסים וריכוזי חלבון מומלצים להכנת סמים מסתובבים סיבים.

2. סיבוב ואיסוף סיבים

הערה: עיין באיור 2 לתיאור סכמטי של ציור ידני ובאיור 3 עבור התצורות השונות של התקני ספינינג רטוב המפורטות להלן.

figure-protocol-2
איור 2: ציור ידני של סיבי משי עכביש. (A) מכינים מסגרת נייר בצורת C ומחוברים לשקופית זכוכית עם סרט שקוף משמאל וסרט דו צדדי מימין כדי לאפשר ציור סיבים משמאל לימין. (B) טיפה של סם מסתובב מונחת על הסרט השקוף, וסיב בודד נמשך ידנית לסרט הדו-צדדי על פני הפתח של המסגרת בצורת C באמצעות קצה פיפטה מפלסטיק. (ג) הסיב מהודק למסגרת הנייר במגלשת הזכוכית באמצעות סרט בצד שמאל וימין. (ד,ה) הדגמה של תהליך ציור ידני מייצג (D) עבור משי עכביש רקומביננטי מסיס ביעילות בסם ספין ו- (E) הסיב המתקבל לפני אבטחתו בסרט. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-3
איור 3: טוויה רטובה של סיבי משי עכביש. בכל המקרים, הסם המסתובב מונח במזרק אטום מזכוכית ומוחלץ בקצב קבוע באמצעות משאבת מזרק דרך מחט מתכת קהה (כלומר, הספינרט) לתוך אמבט קרישה (למשל, 95% אתנול). (A) סיבים מסובבים נאספים על רולר 1, מסתובבים תחת שליטת מחשב במהירות התואמת את קצב האקסטרוזיה. (B) מתיחה באוויר לאחר סיבוב מושגת על ידי הנחיית סיבים על פני רולר 1 ואיסוףם על רולר 2, שמסתובב בכפולה מהמהירות של רולר 1 (למשל, כפול מהמהירות ליחס משיכה פי 2). באופן דומה, ניתן לייצר סיבים (C) לאחר טבילה בממס (למשל, 40% אתנול, מים וכו' כמתאים למשי נתון) על ידי הנחיית סיבים מרולר 1 לגליל 3 (שקועים באמבט ממס ומסתובבים באותו קצב כמו רולר 1) לפני הנחתם לגליל 2 (מסתובב בכפולה מהמהירות של גלילים 1 ו-3); או (D) בממס על ידי הנחיית סיבים מרולר 1 לגליל 3 (שקוע באמבט ממס ומסתובב באותו קצב כמו רולר 1) ואז לגליל 4 (שקוע גם בממס ומסתובב בכפולה מהמהירות של גלילים 1 ו-3) לפני איסוף על רולר 2 (מהירות תואמת לזו של רולר 4). התצורה המודולרית פירושה שניתן לבדוק בקלות תמורות שונות בתנאי סיבוב סיבים, בוודאי לא מוגבלות לארבע המוצגות כאן באופן סכמטי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. ציור ידני
    1. הכינו מסגרת נייר בצורת C עם חלון בגודל 1 ס"מ על 0.5 ס"מ (אורך x רוחב) והניחו אותה על מגלשת זכוכית (איור 2). אבטח את החלק העליון של מסגרת הנייר לשקופית הזכוכית באמצעות סרט דבק. הצמד סרט שקוף לזרוע אחת של מסגרת הנייר כדי ליצור משטח הידרופובי לתצהיר תמיסת סמים והצמד סרט דו צדדי לזרוע הנגדית לאבטחת סיבים.
    2. הפקידו 10-20 מיקרוליטר של תמיסת סמים מסתובבת על הסרט השקוף בטמפרטורת החדר (22 ± 2 מעלות צלזיוס).
    3. טבלו קצה פיפטה מפלסטיק של 200 מיקרוליטר לתוך טיפת תמיסת הסמים ושאבו אותה אנכית מהתמיסה במהירות עקבית (~6 מ"מ לשנייה), מה שמאפשר למשוך סיבים מהתמיסה.
    4. הנח את הסיב הנמשך ביד על פני חלון המסגרת והצמד אותו לסרט הדו-צדדי. יבש את הסיבים באוויר בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן אבטח את שני קצוות הסיבים בעזרת סרט נוסף.
    5. התמקד בחלק הסיב המשתרע על מסגרת הנייר לאפיון לאחר מכן.
  2. ספינינג רטוב
    1. בנה מכשיר ספינינג רטוב, כאשר למנגנון המפורט כאן יש יכולות בקרת מנוע משופרות ביחס לאיטרציות קודמות31,38.
      1. בנה לוחית הרכבה ממתכת קשיחה המוחזקת אנכית ומעובדת בתצורה מתאימה לחיבור סט מנועי צעד (ראה איור 3). כל הרכבה של מנוע דורשת קידוח חורים כדי לאפשר הברגה מאובטחת של מנועי צעד בחלק האחורי של לוחית ההרכבה (כלומר, ארבעה חורים מרווחים ובגודל מתאימים) וחור חמישי כדי לאפשר לציר המנוע לעבור דרכו.
      2. בחר מנועי צעד דו-קוטביים עם צעד של 1.8°, המחזיק מומנט של 45 N∙cm, אורך 24 מ"מ וקוטר 5 מ"מ עם חיתוך "D" באורך 15 מ"מ, גוף 39 מ"מ, זרם נקוב 1.50 A, התנגדות פאזה 2.3.
      3. לפתח מערכת לשליטה במהירות ובכיוון הסיבוב של כל מנוע, כמו זו ששימשה בעבר למגוון סוגי סיבי משי 17,53,54, המשתמשת בממשק משתמש גרפי (GUI) המקודד ב-Python עבור Raspberry Pi המחובר למספר בקרי מנועי צעד כמפורט ב-https://github.com/raineylab/MotorController.git.
      4. לצורך ספינינג, חבר כל מנוע המשמש בתצורת ספינינג נתונה לגליל מתכת מעובד (קוטר 6 ס"מ, אורך 8 ס"מ למי שנמצא במיקומים 1 ו-2 באיור 3, גלילים מחורצים בקוטר 9 ס"מ בשני הקצוות מתחדדים לקוטר של 6 ס"מ במרכז הגליל, אורך של 7 ס"מ במיקומים 3 ו-4 באיור 3; ראה, למשל, איור 4 לתצורה לדוגמה).
      5. עבור הספינר (איור 3), השתמש במזרק זכוכית של 0.25 מ"ל עם מחט מתכת מחוברת באופן קבוע עם קצה קהה (קוטר פנימי 0.127 מ"מ) המותקן במשאבת מזרק המוציאה את סם הסיבוב בקצב מבוקר לתוך אמבט קרישה.
    2. צנטריפוגה את תמיסת הסמים בטמפרטורה של 20,000-21,000 × גרם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ואוספים את הסופרנטנט לספינינג סיבים.
      הערה: הסר חלקיקים שנותרו כדי למנוע סתימת מחט האקסטרוזיה במהלך סיבוב רטוב.
    3. טען 50-80 מיקרוליטר של תמיסת סמים מסתובבת לתוך המזרק המשמש כספינרט.
    4. אבטח את המזרק במשאבת מזרק והגדר את האקסטרוזיה לקצב של 600 מיקרוליטר לשעה.
      הערה: התאם וייעל את קצב האקסטרוזיה כדי לאפשר היווצרות סיבים למצב סמים מסתובב חלבון נתון.
    5. הכן אמבט קרישה (95% אתנול/5% מים נטולי יונים, v/v).
    6. מקם את משאבת המזרק כך שמחט המזרק המכילה את תמיסת הסם טובלת באמבט הקרישה.
    7. חבר גלילים למנגנון הספינינג, התאם את מהירות הגליל באמצעות תוכנת בקרת מנוע והפעל את המנועים הנדרשים לתצורת ספינינג נתונה.
      הערה: התאם את קצב הסיבוב של רולר 1 לקצב האקסטרוזיה. קצבי שחול של 400 מיקרוליטר לשעה או 600 מיקרוליטר לשעה מתאימים ל-6 סל"ד או 9 סל"ד עבור רולר 1. אם מועברת הגרלה לאחר הסיבוב, יש להגדיר אחד או יותר מהגלילים 2-4 להסתובב מהר יותר בהתאם.
    8. הפעל את משאבת המזרק והשתמש בפינצטה כדי להנחות את הסיבים הנוצרים באמבט הקרישה באחת מהדרכים הבאות.
      1. כדי לאסוף סיבי AS, הנח את הסיב שנוצר באמבט הקרישה אל הגלגל הראשון (מהירות שווה לקצב האקסטרוזיה) לאיסוף.
      2. כדי לבצע מתיחה לאחר סיבוב באוויר, הגדר את קצב הסיבוב של רולר 2 למכפלה של רולר 1. הנח את הסיב מהקרישה מעל רולר 1 מבלי להסתובב סביב רולר 1 ואסוף אותו על רולר 2.
        הערה: יחס משיכה לאחר סיבוב של פי 2 דורש שקצב הסיבוב של רולר 2 יהיה כפול מזה של רולר 1; פי 3, משולש; וכן הלאה.
      3. כדי לבצע מתיחות לאחר הסיבוב לאחר טבילה בממס, מלאו את אמבט הממס בממס הרצוי (למשל, מים נטולי יונים; 2:3 v/v אתנול/H2O; וכו') והנחו את הסיב מאמבט הקרישה סביב רולר 1 (קצב סיבוב מותאם לקצב האקסטרוזיה), סביב רולר 3 (קצב סיבוב שווה לרולר 1) באמבט הממס, ולאסוף את הסיבים על רולר 2 באוויר (מסתובב בקצב מהיר יותר מאשר גלילים 1 ו-3).
        הערה: קצב הסיבוב של רולר 2 ביחס לגלילים 1 ו-3 יקבע את יחס המשיכה לאחר הסיבוב כמו בשלב 2.2.8.2.
      4. כדי לבצע מתיחה לאחר הסיבוב בממס, מלאו את אמבט הממס בממס הרצוי (למשל, מים נטולי יונים; 2:3 v/v אתנול/H2O; וכו') והנחו את הסיב מאמבט הקרישה סביב רולר 1 (קצב סיבוב מותאם לקצב האקסטרוזיה), סביב רולר 3 (קצב סיבוב שווה לרולר 1) באמבט הממס, סביב רולר 4 באמבט הממס (קצב סיבוב כפול מזה של גלילים 1 ו-3) ואסוף הסיב על רולר 2 באוויר (קצב סיבוב מותאם לרולר 2).
        הערה: קצב הסיבוב של גלילים 2 ו-4 ביחס לזה של גלילים 1 ו-3 יקבע את יחס המשיכה לאחר הסיבוב כמו בשלב 2.2.8.2.
        אסוף סיבים בתנאי סביבה מבוקרים כדי למנוע את השפעת הלחות והטמפרטורה על התנהגות הסיבים. אנו מכוונים ללחות יחסית ~ 28.2 ± 2.4% וטמפרטורה ~ 28.0 ± 2.2 מעלות צלזיוס.

figure-protocol-4
איור 4: שלבי מפתח בספינינג רטוב של סיבי משי עכביש. (A) שחול סמים מסובב לאמבט קרישה ואחריו איסוף סיבים (מלבן אדום משמאל מדגיש את המחט המשמשת לשחול סמים; מלבן אדום מימין הוא הנתיב של סיבי המשי הטווים הרטובים. (ב) איור של סיבים הנתונים למתיחה באוויר לאחר הסיבוב (מלבן אדום להנחיית העין). (C) איור של מתיחת סיבים לאחר סיבוב לאחר טבילה במים (מלבן אדום להנחיית העין). (D) סיבי משי רקומביננטיים רציפים שנאספו על רולר (למשל, סיבים סליליים בחץ אדום). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

3. הערכה מיקרוסקופית אופטית של סיבים

  1. הרכבה בסיבים
    1. צור מחזיק נייר בצורת C על ידי חיתוך ריבוע בגודל 1 x 1 ס"מ מפיסת נייר מלבנית בגודל 3 x 2 ס"מ (איור 5).
    2. חבר את המחזיק בצורת C לשקופית מיקרוסקופ זכוכית באמצעות סרט.
    3. הדבק שתי חתיכות של סרט דו-צדדי משני צידי הרווח של 1 ס"מ של מחזיק הנייר בצורת C.
    4. הסר סיב מהגלגלת עליו נאסף וחתך קטע באורך של כ -2 ס"מ.
      הערה: הימנע משימוש בכוח מופרז בעת טיפול בסיבים כדי למנוע עיוות חומר או שינוי אחר בתכונות.
    5. הנח את קטע הסיבים בחלק העליון של הסרט הדו-צדדי, וודא שהציר הארוך של הסיבים מיושר במקביל לקצה התחתון של המחזיק (איור 5).
    6. אבטח את הסיב בעזרת נייר דבק על גבי סרט דו צדדי משני הצדדים.
    7. חבר פיסת נייר דבק נוספת כדי לקבע היטב את החלק התחתון של מחזיק הנייר למגלשת הזכוכית כדי למנוע תנועה של הסיב עד לשימוש.
    8. אחסן סיבים רכובים בקופסת אחסון שקופיות עד לשימוש להדמיה ובדיקת מתיחה.
  2. קביעת קוטר והערכת פגמים
    1. בדוק את הסיבים המותקנים באמצעות מיקרוסקופיה אופטית. ראשית, סנן את כל אורך הסיבים לאיתור פגמים גלויים, כגון צוואר, פיתול, בליטה או סיבים כפולים. אם נצפים פגמים כלשהם, אל תכלול את הסיבים הללו מבדיקות מכניות.
    2. עבור סיבים שנראים נטולי פגמים, קח שלושה מיקרוגרפים בהגדלה של פי 10 לאורך הציר הארוך של הסיבים, אחד באמצע ואחד ליד כל קצה של סיב.
    3. מדוד את קוטר הסיבים באמצעות תוכנת ImageJ55 :
      1. ב-ImageJ, עבור לתפריט ניתוח ובחר הגדר קנה מידה (קובץ משלים 1 - איור משלים S1). כוונן את קנה המידה בהתאם להגדרות הכיול של המיקרוסקופ והגדר את יחידת המדידה למיקרומטר (מיקרומטר) (משלים file 1 - איור משלים S2).
      2. בעזרת הכלי קו, ציירו קו ישר בניצב לציר הארוך של הסיב, המשתרע מקצה אחד של הסיב לקצה השני.
      3. עבור כל מיקרוגרף, מדדו את קוטר הסיבים בשישה אזורים שונים לאורך הסיב.
      4. לאחר ציור כל קו, לחץ על מדידה בתפריט ניתוח כדי להציג את קוטר הסיבים (קובץ משלים 1 - איור משלים S3).
  3. הערכה איכותית של יישור מולקולרי באמצעות מיקרוסקופ אור מקוטב
    1. השתמש במיקרוסקופ אור מקוטב כדי להעריך יישור מולקולרי בתוך הסיב לאחר הערכת קוטר ופגמים על ידי מיקרוסקופיה אופטית.
      1. בדוק את הסיב באמצעות מיקרוסקופ אופטי הפוך המצויד בבמה מסתובבת, מחוון מנתח קבוע ומקטב מסתובב ב-90°.
      2. מקם את הסיב בכ-45 מעלות ביחס לאור המקוטב במישור האירוע כדי למקסם את הבהירות עקב שבירה כפולה, ולשפר את הנראות של המבנה המולקולרי.
      3. צלם תמונה של הסיב בתנאים אלה כדי להעריך את השבירה הכפולה שלו.
        הערה: שבירה כפולה גבוהה מרמזת על מבנה מולקולרי מיושר היטב, בעוד שבירה נמוכה או ללא שבירה מצביעה על מבנה אמורפי יותר או בעל אוריינטציה אקראית.

figure-protocol-5
איור 5: הרכבה של סיבי משי עכביש על מגלשת זכוכית המאפשרת ניתוח במורד הזרם באמצעות מחזיק נייר בצורת C וסדרה של שכבות סרט. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

4. בדיקת מתיחה

הערה: ניתן לייצר בקלות מכשיר לבדיקת מתיחה המתאים להערכה מדויקת של סיבי משי בעלות נמוכה יחסית25,56. בקצרה, ייצרו זוג מהדקי נירוסטה כדי לאפשר אחיזה איתנה של כל קצה של כל סיב במסגרת בצורת C הנבדקת (למשל, איור 6). חבר אחד מהמהדקים הללו למשקולת המונחת על איזון אנליטי ואת השני למשאבת מזרק. יש להגדיר את משאבת המזרק כך שתאפשר משיכה מתמדת בקצב מתח מוגדר. האיזון האנליטי חייב להיות ממשק למחשב לאיסוף נתוני משקל/מסה מתועדים כפונקציה של זמן.

figure-protocol-6
איור 6: תרשים סכמטי המציג את שלבי ההכנה לבדיקת מתיחה. (A) מחזיק נייר עם סיבים (ראה איור 5 לתצורה) מנותק ממגלשת הזכוכית ומותקן אנכית באמצעות קליפ המחובר למשקולת. (ב) מהדק משוקלל זה מונח על האיזון האנליטי, והחלק העליון של מחזיק הנייר מאובטח למהדק המחובר למוט המודבק היטב במשאבת מזרק. מחזיק הנייר נחתך אופקית באמצע לפני תחילת בדיקת המתיחה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. רכישת נתונים של עקומת מתח-מתח
    1. לאחר מדידת קוטר הסיב, בצע בדיקות מתיחה על אותו סיב עם מכשיר ביתי (איור 6).
      1. נתק את מסגרת הנייר בצורת C המחזיקה את הסיב ממגלשת הזכוכית והדק למהדק המחובר למשקולת (איור 6A).
      2. חבר את האיזון האנליטי לתוכנת רישום/בקרה של נתונים ונווט אל שולחן העבודה (קובץ משלים 1 - איור משלים S4).
      3. הגדר את הניסוי בתוכנת בקרת האיזון על ידי לחיצה על כפתור התחל . הזן את שם הניסוי כאשר תתבקש (קובץ משלים 1 - איור משלים S5).
      4. ודא שהאיזון האנליטי ריק והנח את המשוקלל clamp עם הסיב עליו.
      5. חבר את החלק העליון של מסגרת הנייר למהדק המחובר למשאבת המזרק וחתוך צד אחד של מחזיק הנייר כדי לאפשר לסיב לנוע בחופשיות (איור 6B).
        הערה: ודא ששני clamps מקבילים זה לזה ושהסיב מרוכז בתוך ה-clamp באורך מד של 10 מ"מ.
      6. הפעילו את האיזון כדי לאפס את מסת המשקל והדק ולחצו על כפתור ההפעלה במשאבת המזרק ולחצו על אישור בתוכנת בקרת האיזון (קובץ משלים 1 - איור משלים S6).
      7. כאשר הסיב נשבר, לחץ על עצור במשאבת המזרק ועל כפתור כן בתוכנת בקרת האיזון (קובץ משלים 1 - איור משלים S7) כדי לרשום את המשקל הנמדד כפונקציה של זמן.
      8. העבר נתונים לגיליון אלקטרוני או לחבילת תוכנה מתאימה אחרת לעיבוד נתונים לצורך עיבוד. העתק את יומן נתוני המשקל לעומת הזמן ללוח והדבק בגיליון האלקטרוני של הבדיקה המכנית המצורף (קובץ משלים 2) או על ידי ייצוא הנתונים כקובץ טקסט וייבוא עם ניתוח מתאים.
  2. עיבוד נתונים של עקומת מתח-מתח
    הערה: הפרוטוקול הבא מבוסס על גיליון הבדיקה המכנית האלקטרוני המעוצב לשימוש ב- Microsoft Excel (קובץ משלים 2).
    1. ודא שהפרמטרים הניסיוניים נכונים (עמודה C).
    2. הוסף את ההקלטות ההמוניות כפונקציה של זמן לגיליון האלקטרוני ("המסה נטו" בעמודה F). אם נרשמו ערכי מסה לפני תחילת המתיחה, הסר ערכים אלה על ידי מחיקת התאים המתאימים עם הסטת הנתונים כלפי מעלה. אם יש ערכי מסה שנרשמו לאחר שבירת הסיבים, מחק תאי נתונים אלה.
    3. מילוי אוטומטי של ערכי האינדקס בעמודה E באמצעות הוספת מרווחים של 1 כך שמספר המדדים הכולל יתאים למספר הכולל של ערכי המסה הנמדדים בעמודה F.
    4. קנה מידה מחדש של המסה נטו כך שאלה יתחילו ב-0 גרם ויגדלו במהלך ניסוי המתיחה על ידי הפחתת המסה נטו הראשונית מכל ערך מסה נטו והכפלת הפרש זה ב-1 (עמודה G).
    5. חשב את השינוי באורך הסיבים בכל מדידה על ידי הכפלת מדד המדידה בקצב המשיכה של משאבת המזרק ובפער הזמן בין מדידות המסה המתועדות (עמודה H).
    6. חשב את המתח ההנדסי על ידי חלוקת השינוי באורך הסיבים באורך המקורי (עמודה I).
      הערה: חישוב זה נותן את המתח ההנדסי במ"מ/מ"מ. כדי להמיר את ערכי המתח ההנדסי ל-%, הכפל את הערכים בעמודה I ב-100 %.
    7. רשום את יכולת ההרחבה כערך המתח ההנדסי המרבי (תא T3).
    8. חשב את הכוח (ב-N) הנדרש להשגת כל שינוי אורך מתועד על ידי המרת המסה מ-g לק"ג והכפלה בכוח הכבידה הסטנדרטי (9.81 m/s2; טור J).
    9. חשב את הלחץ ההנדסי (ב-Pa) על ידי חלוקת הכוח שנקבע בדרגת הארכה נתונה על ידי שטח חתך הסיבים והכפל ב-10-6 כדי להמיר ל-MPa (עמודה K).
    10. רשום את הלחץ המקסימלי שנצפה כמתח האולטימטיבי (תא U3) ואת הלחץ בהפסקה כערך המתח הסופי שנרשם לפני שבירת הסיבים (תא V3).
    11. חשב את השטח מתחת לעקומת המתח-מתח כדי לקבל את הקשיחות באמצעות כלל הטרפז כדי לחשב את השטח מתחת לעקומה לאחר כל מדידה (עמודה L). סכם אזורים אלה כדי למצוא את הקשיחות (תא W3).
    12. חשב את מודול יאנג (ב-MPa) על ידי קביעת השיפוע של האזור הליניארי ההתחלתי של עקומת המתח-מתח באמצעות הפונקציה LINEST. המר ל-GPa על ידי הכפלה ב-10,3 (תא X3).

5. ספקטרומיקרוסקופיה אינפרא אדום פורייה (FTIR).

  1. הכן דגימה ל-FTIR על ידי הדבקת שקופית זכוכית שנייה לתחתית שקופית שהוכנה למיקרוסקופיה אופטית.
  2. תמונה אופטית ואוסף ספקטרלי FTIR
    1. מלאו את הגלאי בחנקן נוזלי כדי לקרר את הגלאי.
    2. פתח את תוכנת בקרת מכשירי FTIR.
    3. בחלון View and Collect (משלים file 1 - משלים איור S8) פתח את הכרטיסייה Collection , הגדר את מצב האיסוף ל-ATR ואת הגלאי ל-Cooled (משלים file 1 - איור משלים S9).
    4. הנח את השקופית לתוך מחזיק השקופיות והנח את המחזיק על הבמה.
    5. הגדר את התאורה העליונה ל-100 ואת הצמצם והתאורה התחתונה ל-0.
    6. מקד את מרכז שדה הראייה עבור תמונת המיקרוסקופ האופטי של הדגימה על הסיב באמצעות הג'ויסטיק הפיזי או הג'ויסטיק הדיגיטלי בתוכנה כדי לשלוט במיקום מרכז שדה הראייה ומישור המוקד.
    7. הגדר את מצב האיסוף למיפוי (קובץ משלים 1 - איור משלים S8).
    8. בחר את האזור להדמיה ולמדידה באמצעות Map View - Area Tool. לחץ וגרור את הסמן כדי לציין את האזור שעבורו יש לרכוש ספקטרום בתצוגה המקדימה של המיקרוגרף (קובץ משלים 1 - איור משלים S8). כל עיגול בתמונה מייצג ספקטרום נרכש אחד במיקום זה. במידת הצורך, שנה את הקצוות של תיבה זו על-ידי ריחוף עם הסמן מעל קצה תיבה נתון ולאחר מכן לחיצה וגרירה למיקום הרצוי. תרגם את התיבה כולה על-ידי לחיצה וגרירה בתוך המלבן. שנה את אזור התיבה ואת מספר נקודות הנתונים תחת שלב, צמצם ותצוגה (קובץ משלים 1 - איור משלים S10).
    9. לחץ לחיצה ימנית על התצוגה המקדימה של המיקרוגרף ובחר לכידת פסיפס כדי לשמור את התמונה (קובץ משלים 1 - איור משלים S8).
    10. הגדר את לחץ ATR על ידי לחיצה על התפריט הנפתח פרופיל לחץ נוכחי . עבור סיבי חלבון, השתמש בלחץ של 2% (כלומר, לחץ ה-ATR הנמוך ביותר האפשרי) כדי למזער את הנזק לסיבים (קובץ משלים 1 - איור משלים S8).
    11. הכנס את קצה ה-ATR FTIR.
    12. לחץ על כפתור האיסוף (קובץ משלים 1 - איור משלים S8) כדי לרכוש ספקטרום רקע ולאחר מכן את הספקטרום בכל אחת מהנקודות שנבחרו. לאחר השלמת האיסוף, הנתונים יוצגו בחלון חדש.
  3. הכנת נתונים לניתוח במורד הזרם
    1. לחץ לחיצה ימנית על מפת החום או על המיקרוגרף כדי להציג את הספקטרום שנרכש במיקום המתאים (קובץ משלים 1 - איור משלים S11).
    2. לחץ לחיצה ימנית על ספקטרום לניתוח ובחר העתק (קובץ משלים 1 - איור משלים S11).
    3. לחץ לחיצה ימנית בסרגל Windows בחלק העליון של המסך ובחר חלון חדש (קובץ משלים 1 - איור משלים S11).
    4. לחץ על כפתור הדבק בחלק העליון של המסך כאשר החלון החדש נפתח (קובץ משלים 1 - איור משלים S11).
    5. השתמש באותה גישה כדי להעתיק ולהדביק כל ספקטרום אחר הרצוי לניתוח בחלון זה.
    6. הדגש ספקטרום או ספקטרום על ידי לחיצה על Ctrl תוך לחיצה על כל ספקטרום רצוי או על ידי הדגשת הספקטרום הרצוי בתפריט הנפתח.
    7. לחץ על Save As... ושמור את הקבצים כקבצי .spa כדי לנתח את הנתונים בתוכנת בקרת הספקטרומטר או כ-.csv כדי לנתח את הנתונים בחבילת תוכנה אחרת (קובץ משלים 1 - איור משלים S12).
  4. ניתוח נגזרות שני באמצעות תוכנה ספציפית למכשיר
    1. פתח את הספקטרום לניתוח בחבילת תוכנת העיבוד והניתוח הספקטרלי הספציפי למכשיר.
    2. כדי להמיר בין מצבי % העברה למצב ספיגה, השתמש ב- Ctrl+A (% העברה לספיגה) או Ctrl+T (ספיגה ל- % שידור).
    3. בחר את אזור העניין על-ידי לחיצה על הצג | מגבלות תצוגה (או, Ctrl+D) (קובץ משלים 1 - איור משלים S13A). כדי להציג את רצועות ה-Amide I (1,700-1,600 ס"מ-1) ו-amide II (1,600-1,500 ס"מ-1), באופן ספציפי, הגדר את גבולות ציר ה-X התחלה וסיום למספרי הגל המתאימים. אם אתה מנתח יותר מספקטרום אחד, בחר החל על כל הספקטרום. לחץ על אישור (קובץ משלים 1 - איור משלים S13B).
    4. כדי להתוות את הנגזרת השנייה, לחץ על תהליך | נגזרת... ובחר שני מהתפריט הנפתח (קובץ משלים 1 - איור משלים S14A). בחר נגזרת נוריס עם אורך מקטע של 5 ופער בין מקטעים של 5 (קובץ משלים 1 - איור משלים S14B). המינימום של ספקטרום הנגזרת השני חופף לפסגות הרכיבים בספקטרום הספיגה המקורי.
      1. אם הספקטרום רועש מכדי להעריך את המינימום, החלק את הספקטרום על ידי לחיצה על תהליך>החלקה אוטומטית (קובץ משלים 1 - איור משלים S15). לאחר מכן, חשב את הנגזרת השנייה ומצא את המינימום.
    5. קשר את מספרי הגל במינימום הנגזרת השני למיקומי פס אופייניים עבור מבנים משניים באמצעות טבלת ייחוס (למשל, טבלה 2) כדי לקבל תובנות לגבי המבנה המשני של החלבון.
  5. שיא דה-קונבולוציה באמצעות תוכנת ניתוח ספציפית למכשיר
    1. הגדר את אזור התצוגה לאזור שיש לפרק כמו בשלב 5.4.3. רק האזור הזה יהיה מפורק.
    2. Baseline תקן את האזור הספקטרלי שנבחר באחת מהשיטות הבאות:
      1. לחץ על תהליך | תיקון בסיסי אוטומטי (קובץ משלים 1 - איור משלים S16); או
      2. לחץ על תהליך | Baseline Correct (Supplemental File 1 - Supplemental Figure S17A) ולאחר מכן בחר Linear מהתפריט הנפתח וציין את האזור הספקטרלי שיש לתקן בקו הבסיס בספקטרום המיקום על ידי לחיצה וגרירה של שתי הנקודות המציינות את הגבולות התחתונים והעליון של האזור שיש לתקן למטרות דה-קונבולוציה. לאחר מכן, בחר הוסף לחלון בתפריט הנפתח השני ולחץ על כפתור הוספה (קובץ משלים 1 - איור משלים S17B).
    3. כשקשת הצבעים המתוקנת של קו הבסיס נבחרה, לחץ על Analyze | שיא הנחישות... כדי לפתוח את החלון Peak Resolve (קובץ משלים 1 - איור משלים S18).
    4. בחר את הספקטרום והעקומות לניתוח באמצעות סרגל הבחירה בצד שמאל של המסך.
    5. בחר Gaussian/Lorentzian עם הגדרת רגישות של נמוכה והגדרת FWHH של 2 בכרטיסייה Find Peaks ולאחר מכן לחץ על כפתור Find Peaks (קובץ משלים 1 - איור משלים S19).
    6. לחץ על כפתור הפסגות כדי לפתוח טבלה המתארת את הפסגות.
      1. אם נבחרו יותר פסגות מהסביר מבחינה פיזית, לחץ על מחק שיא עד לקבלת המספר הנכון של פסגות לניתוח (קובץ משלים 1 - איור משלים S20). לדוגמה, עבור אזור amide I, 5-11 פסגות מדווחות בדרך כלל בספרות (טבלה 2).
      2. כדי להבטיח שכל הפסגות יהיו חיוביות לאחר ההתאמה, לחץ על Edit Peak והגדר את הגובה המינימלי ל- 0. לאחר מכן, לחץ על הבא וחזור על כל שיא ואחריו אישור כדי לסגור את חלון העריכה (קובץ משלים 1 - איור משלים S21).
      3. אם ישנם מספרי גל ספציפיים שצריכים להיות נוכחים בפירוק הסופי, לחץ על ערוך שיא וקבע את מרכז השיא למספר הגל שצוין בתיבה ערך על-ידי בחירה קבוע או ספק טווח באמצעות התיבות גבול נמוך וגבול גבוה. לחצו על 'אשר' כדי להחיל קביעות אלה על השיא הנתון.
        הערה: בשלב זה, עדיף להשתמש במיקומי שיא שנמצאו במהלך ניתוח הנגזרת השני או בשיאים מטבלת ייחוס של מבנים משניים של FTIR, המבוארים באופן אידיאלי עבור סוג דגימת משי דומה (למשל, טבלה 2).
    7. לחץ על כפתור Fit Peaks (קובץ משלים 1 - איור משלים S22).
      1. אם אלגוריתם התאמת השיא אינו מתכנס בהצלחה, לחצו שוב על 'התאם פסגות' כדי להמשיך להתאים את הפסגות באופן איטרטיבי.
    8. לחץ על כפתור פסגות... כדי לקבל מידע על מיקום, גובה, FWHH ושטח כל הפסגות שהיו מתאימות.
      1. ניתן להעתיק את הפסגות הללו ללוח על ידי לחיצה על הלוח כדי לאפשר להדביק אותן בחלון או בקובץ אחר (קובץ משלים 1 - איור משלים S23).
      2. העתק פסגות וספקטרום לחלון אחר על ידי בחירת היעד בתפריט הנפתח לבחירת החלון לצד כפתור ההוספה (קובץ משלים 1 - איור משלים S24).
      3. לחץ על הלחצן בחר הכל והשתמש בקובץ | Save As כדי לשמור את הפסגות והספקטרום כקבצי .spa ו/או .csv (קובץ משלים 1 - איור משלים S25).
    9. קשר כל שיא רכיב למבנה משני באמצעות טבלת הפניה. השטח היחסי של פסגות המתאים למבנה משני נתון ביחס לשטח הכולל של כל הפסגות שהוקצו מספק את החלק היחסי של החלבון שיש לו את המבנה המשני הזה.
  6. הכנת נתונים לניתוח במורד הזרם באמצעות תוכנת צד שלישי
    1. פתח חוברת עבודה וטען את הנתונים הספקטרליים לתוכנת העיבוד והניתוח הספקטרלי של הספק החיצוני על-ידי בחירה בלחצן נתונים | התחברות לקובץ | פריט תפריט טקסט/CSV (קובץ משלים 1 - איור משלים S26). בחר את הקובץ הרצוי בסייר הקבצים ולחץ על פתח.
    2. שרטט את הספקטרום על ידי הדגשת העמודות שיש להתוות ובחירת העלילה | דו-ממד בסיסי | פריט תפריט שורה (קובץ משלים 1 - איור משלים S27).
    3. לחץ פעמיים על ציר ה-x והשתמש בכרטיסייה קנה מידה כדי להתאים את הטווח כך שיתאים לשיא ה-Amide I (קובץ משלים 1 - איור משלים S28).
    4. אם הנתונים רועשים מאוד, החלק את העקומה על ידי בחירה באפשרות ניתוח | עיבוד אותות>דיאלוג חלק>פתוח... פריט תפריט (קובץ משלים 1 - איור משלים S29A).
      1. הגדר את אפשרות החישוב מחדש ל-Auto, את השיטה ל-Savitzky-Golay, את נקודות החלון ל-5, את תנאי הגבול ל-None ואת הסדר הפולינומי ל-2 (קובץ משלים 1 - איור משלים S29B).
      2. לחץ על אישור כדי לעבד.
  7. ניתוח נגזר שני באמצעות תוכנת צד שלישי
    1. בחר את הניתוח | מתמטיקה | הבדלה | פתח תיבת דו-שיח... פריט תפריט (קובץ משלים 1 - איור משלים S30).
    2. הגדר את האפשרות חישוב מחדש לאוטומטי, הגדר את סדר הנגזרות ל-2, בחר באפשרות עקומת נגזרת עלילה ולחץ על אישור (קובץ משלים 1 - איור משלים S31).
    3. אם עקומת הנגזרת השנייה המתקבלת רועשת מאוד, בצע את שלבים 5.7.1. ו-5.7.2, בחירת Savitzky-Golay Smooth בכרטיסייה Smooth של תיבת הדו-שיח Differentiate .
    4. כמו ב-5.4.5, קשר את מספרי הגל במינימום של הנגזרת השנייה למבנים משניים.
  8. שיא דה-קונבולוציה באמצעות תוכנת צד שלישי
    1. לאחר לחיצה על העלילה של ספקטרום הספיגה amide I, בחר באפשרות ניתוח | פסגות וקו בסיס | מנתח שיא | פתח תיבת דו-שיח... פריט תפריט (קובץ משלים 1 - איור משלים S32).
    2. בתיבת הדו-שיח Goal - Fit Peaks (Pro), הגדר את האפשרות Recalculate ל- Auto, בחר Fit Peaks ולחץ על Next. (קובץ משלים 1 - איור משלים S33A).
    3. בתיבת הדו-שיח מצב בסיסי , הגדר את הפרמטר מצב בסיסי לקו ישר ולחץ על הבא (קובץ משלים 1 - איור משלים S33B).
    4. בתיבת הדו-שיח Baseline Treatment , בחר Auto Subtract Baseline, לחץ על הלחצן Subtract Now ולחץ על Next (Supplemental File 1 - Supplemental Figure S33C).
    5. בתיבת הדו-שיח Find Peaks , השביתו את האפשרות Enable Auto Find ולחצו על Add.
      1. לחץ פעמיים על החלון המכיל את העלילה של ספקטרום עם הפסגות שיש להתאים.
      2. בחר פסגות על סמך המינימום שנצפה בנגזרת השנייה (שלב 5.7.4) או בטבלאות הייחוס (למשל, טבלה 2).
      3. לחץ על סיום ולאחר מכן לחץ על הבא (קובץ משלים 1 - איור משלים S33D).
    6. בתיבת הדו-שיח Fit Peaks (Pro), בחר Generate Report from Current Fitting Result ולחץ על Fit. ואחריו פיניש (קובץ משלים 1 - איור משלים S33E).
    7. הערך את הכרטיסיה PeakProperties1 של חוברת העבודה כדי לראות את המרכז, האזור המשולב וה- FWHM של כל שיא (קובץ משלים 1 - איור משלים S34). כמו בשלב 5.5.9, קשר כל שיא רכיב לסוג מבנה משני והעריך את אחוז מבנה החלבון עם אותו מבנה משני.
טווח מספרי גל (ס"מ-1)הקצאה
1605-1615שרשראות צד טיר/β גדילים מצטברים
1616-1621β גדילים מצטברים/β גיליונות תוך-מולקולריים [חלש]
1622-1627גיליונות β בין-מולקולריים [חזק]
1628-1637גיליונות β תוך-מולקולריים [חזק]
1638-1646סליל אקראי/שרשראות מורחבות
1647-1655סליל אקראי
1656-1662α-Helices
1663-1696פונה
1697-1703גיליונות β בין-מולקולריים [חלש]

טבלה 2: הקצאות להקת רטט באזור אמיד I עבור משי בומביקס מורי בהתבסס על הערכה השוואתית של מספר מחקרים על ידי Hu et al.57.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תמיסת סמים אידיאלית הניתנת לספינינג היא תמיסה שקופה, נטולת משקעים וצמיגה, המעידה על פירוק חלבון מוחלט (איור 7A). לעומת זאת, פירוק לא שלם מביא לתרחיף חלבי או למשקעים גלויים (איור 7B,C). הזמן הנדרש לפירוק חלבון מלא משתנה כפונקציה של ממס, כאשר ממיסים מסוימים, כגון תערובות TFA/TFE/H2O, בדרך כלל ממיסים חלבון לחלוטין במרווח זמן של 30 דקות, בעוד שאחרים, כגון HFIP, עשויים לדרוש תסיסה לילית לצד מערבולת מדי פעם.

figure-results-1
איור 7: אופטימיזציה של תמיסת סמים מסתובבת. (A) ממס שמסוגל להמיס את החלבון במלואו נותן תמיסת סמים שקופה וצמיגה. פירוק חלקי או השעיה של החלבון על ידי בחירת ממס לא אופטימלית עלול לגרום ל-(B) מצב צמיג מדי, בדרך כלל עם משקעים גלויים או (C) תרחיף חלבי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2E מציג סיב מייצג שצויר ביד ואילו איור 4D מציג סיב מסובב רטוב. לפני כל ניתוח במורד הזרם, מיקרוסקופיה אופטית חיונית להערכת איכות הסיבים. מיקרוגרפים אופטיים מייצגים של סיבי משי רקומביננטיים רטובים המתאימים לניתוח במורד הזרם ומסתובבים בשני תנאים שונים (ראה איור 3 לתצורות ספינינג רטוב לדוגמה) מוצגים באיור 8. על ידי מיקרוסקופיה אופטית (איור 8A), ברור שסיבים אלה מציגים קוטר אחיד, עם קוטר מופחת הניכר בעת יישום משיכה לאחר סיבוב (כלומר, כפי שמסתובב (AS) לעומת נמתח לאחר סיבוב ביחס של פי 4 באתנול 40% (4x-EtOH)). מידת השבירה הכפולה הגדולה יותר וכתוצאה מכך ניגודיות גדולה יותר במיקרוסקופ אור מקוטב (איור 8B) עולה בקנה אחד עם יישור מולקולרי משופר בסיב כתוצאה מתהליך המשיכה שלאחר הסיבוב. לבסוף, יש לציין כי סביר להניח שייצפו פגמים בחלק כלשהו של הסיבים המוערכים, מה שהופך קטע נתון של סיבים לבלתי מתאים לניתוח במורד הזרם. שתי דוגמאות כאלה מוצגות באיור 9.

figure-results-2
איור 8: מיקרוגרפים אופטיים מייצגים של סיבי משי עכביש רקומביננטיים רטובים. סיבים במצב AS ובעקבות מתיחה של 4x לאחר הסיבוב באתנול (EtOH) מומחשים עבור מבנה משי פיריפורמי-אציניפורמי כימרי (Py2W2) שנצפה על ידי מיקרוסקופיה אופטית (עמודה שמאלית) ומיקרוסקופ אור מקוטב (עמודה ימנית). התמונות משוכפלות באישור של Ghimire et al.17. פסי קנה מידה = 30 מיקרומטר. קיצורים: AS = כפי שמסתובב; EtOH = אתנול. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 9: דוגמה לפגמים פוטנציאליים בסיבים הניתנים לצפייה באמצעות מיקרוסקופיה אופטית. (A) דוגמה לפגם "בולט". (ב) דוגמה לפגם ב"צוואר". פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

לאחר הבטחה שאין פגמים במקטע סיבים נתון ולאחר קביעת הקוטר (סעיף פרוטוקול 3.2), ניתן לבצע בדיקות מתיחה (למשל, איור 6). עקומות מתח-מתח מייצגות המתקבלות עבור משי עכביש רקומביננטי כימרי שטוו בתנאים שונים מוצגות באיור 10. בהתאם לתנאי הספינינג, הסיבים המתקבלים נעים בין שבירים (מצב AS) לניתנים להרחבה גבוהה עם חוזק דומה למצב AS (מצב אוויר 2x) לסיבים חזקים בהרבה ופחות ניתנים להרחבה (מצב 4x-EtOH). יש לציין כי יש להעריך מקטעי סיבים מרובים ואצוות של סיבים מסובבים כדי להעריך באופן חד משמעי וקפדני את ההתנהגות המכנית.

figure-results-4
איור 10: עקומת מתח-מתח מייצגת של סיבים שהסתובבו מתנאים שונים. הסיבים נותחו במצב מסתובב (AS) או באמצעות ייצור באמצעות מתיחה אוטומטית לאחר הסיבוב (יחס משיכה ומצב מתיחה (אוויר לעומת ממס) מצוין). האיור מותאם באישור Ghimire et al.(2024)17. קיצור: AS = כפי שמסתובב. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

לבסוף, ניתן להעריך את המבנה המשני של מצב סיבים באמצעות ספקטרומיקרוסקופיה ATR-FTIR. ספקטרום סיבי משי טיפוסי שנרכש על ידי מתודולוגיה זו (איור 11A,B) יהיה בעל רצועות חלבון אופייניות, כולל שיא אמיד A רחב (מרוכז סביב ~3,300 ס"מ-1), שיא אמיד I (~1,600-1,700 ס"מ-1) ושיא אמיד II (~1,500-1,600 ס"מ-1). כאן, אנו מתמקדים בהערכת אזור amide I (למשל, איור 11C,D). ניתוח נגזרת שני שימושי כאמצעי לזיהוי מרכיבי מפתח של שיא האמיד I (איור 11E,F), ומספק אמינות לדה-קונבולוציה של שיא כמותי (איור 11G-J) המאפשר הערכה והשוואה של הפרופורציות של סוג המבנה המשני שנצפה בסיבי משי שטוו בתנאי נתון.

figure-results-5
איור 11: ספקטרום FTIR וניתוח מבנה משני. (א,ב) ספקטרום FTIR של סיבי Py2W2 המיוצרים על ידי ספינינג רטוב במצב (A) כפי שמסתובב (AS) ו-(B) המשלב מתיחה של 4 לאחר סיבוב באתנול. (ג,ד) אזורי אמיד I של ספקטרום FTIR המוצגים ב-A ו-B, בהתאמה. (ה-ו) נגזרת שנייה של אזורי amide I המוצגים ב-C ו-D, בהתאמה, מחושבת באמצעות חבילת תוכנה מצוינת. (ג-ג') שיא הדה-קונבולוציה של אמיד I מבוצע באמצעות חבילות התוכנה (G ו-I) OMNIC או (H ו-J) OriginPro, כאשר לוחות G ו-I הם הדה-קונבולוציה המתאימה ל-C ו-H ו-J ל-D. קיצורים: FTIR = התמרת פורייה אינפרא אדום; AS = כפי שמסתובב. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מעבר לטכניקות הבודדות, מתאם של מבנה משני, ביצועים מכניים ונתוני אוריינטציה (על) מולקולרית הוא בדרך כלל חיוני הן להבנת ההשפעות של פרמטרי סיבוב שונים על החומר המתקבל והן לאופטימיזציה רציונלית של תהליך הספינינג. בדה-קונבולוציות FTIR המוצגות באיור 11, למשל, השוואת תנאי ה-AS ל-4×-EtOH עבור משי כימרי, תרומות משמעותיות של β יריעות לרצועת האמיד I ברורות עבור שני התנאים אך מהוות חלק גדול יותר מהמבנה המשני הכולל עבור המצב המתוח שלאחר הסיבוב ביחס למצב AS, ללא קשר לשיטת הדה-קונבולוציה (למשל, איור 11G,H לעומת איור 11I,J). זה עולה בקנה אחד עם החוזק הגבוה משמעותית שנצפה במצב 4×-EtOH מאשר במצב AS (איור 10) וגם עם השיפור ביישור המולקולרי במצב 4×-EtOH ביחס למצב AS (איור 9). אפיון וניתוח מפורטים, המכסים את מגוון המצבים המוצגים באיור 10, דווחו בעבר17. לכן לא סיכמנו כאן את כל הניתוח, במקום זאת השתמשנו בהשוואה זוגית זו כהדגמה לאופן שבו שלושת סוגי הנתונים הללו משלימים זה את זה ומאפשרים פיתוח הבנה מקיפה הרבה יותר של התנהגות סיבים מכל טכניקה אחת בנפרד.

קובץ משלים 1: קובץ המכיל איורים משלימים S1-S34 המתארים מדידת קוטר סיבים, עיבוד נתונים מכני ואיסוף ועיבוד נתוני FTIR. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 2: גיליון אלקטרוני המאפשר קביעת תכונות מכניות מרכזיות (כלומר, מתח, מודול יאנג וקשיחות) מנתוני מסה לעומת זמן. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ייצור חלבון רקומביננטי מאפשר את הפוטנציאל המרגש לייצר חומרים במגוון רחב של פורמטים, כאשר ההתקדמות האחרונה מרמזת על כך שחומרים מבוססי חלבון אלה מתקרבים לשימוש תעשייתי נרחב יותר58. כאן, התמקדנו בייצור סיבים ממשי רקומביננטי מכיוון שזהו הפורמט של משי רקומביננטי הקשור ישירות למשי עכביש סיבי מקומי. סיבי משי הוצגו כבעלי יישומים פוטנציאליים רבים בשל התכונות המכניות הידועות של משי עכביש טבעי ובשל הפוטנציאל לייצר סיבים בעלי ביצועים גבוהים באופן בר קיימא32. היישומים המוצעים נעים בין טקסטיל בעל ביצועים גבוהים לחומרים סופגי אנרגיה למוצרי טיפוח אישי לשימוש בבריאות58,59. מכשירים וחומרים מבוססי משי עכביש בפורמטים לבישים או בהקשרים אחרים שבהם המוליכות החשמלית משופרת נמצאים גם הם במחקר פעיל הן ליישום ביו-רפואי והן ליישום רחב יותר60. לפיכך יש עניין נרחב בפיתוח, אופטימיזציה והתאמה אישית של חומרים מבוססי משי עכבישים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים סדרה של הליכים המיועדים לייצור מהיר של סיבים לאחר הכנת חלבון משי רקומביננטי חדש או לווסת את תכונות החומרים של משי רקומביננטי שכבר הוכח כניתן לטוויה.

ללא קשר לשיטת הספינינג בה נעשה שימוש, קריטי לקבוע תנאים המאפשרים ייצור סם ספין באמצעות סינון תנאי ממס/חיץ וריכוז חלבון, כמפורט כאן. המטרה הסופית היא המסה של החלבון בריכוז גבוה מספיק כדי לאפשר המרה מהירה לסיב ללא הרכבה עצמית מחוץ למסלול לאגרגטים או מינים בלתי מסיסים אחרים שימנעו ספינינג "פרודוקטיבי". זהו בדרך כלל פתרון שקוף, צמיג יחסית, המורכב ככל הנראה ממינים בהרכבה עצמית כגון מיצלות/ננו-חלקיקים26,61 ו/או הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית62. פרוטוקול זה אינו מפרט שיטות להערכה מקיפה של מצב סם הספין, שכן ניתן להשיג ספינינג סיבים מוצלח באמצעות הערכה איטרטיבית של תצורות ספינינג וספינינג שונות. ניתן להשיג תובנה מולקולרית וסופרמולקולרית מפורטת לגבי מצב סם הספין באמצעות טכניקות כגון ויסקומטריה, פיזור אור, ספקטרוסקופיה דיכרואיזם מעגלי UV רחוק, ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית ו/או מיקרוסקופ אלקטרונים26. כמו כן, יש לציין כי ניתן לשנות את החלבון הרקומביננטי עצמו כדי לשפר את התנהגותו לספינינג, כאשר הכללת התחומים הכדוריים הלא חוזרים על עצמם N- ו-C-terminal היא דוגמה אחת לשיטה להגברת מסיסות הספידרואין32. בקיצור, ללא זיהוי סם ספין מתאים, לא ניתן להמשיך לבדיקה השוואתית של תנאי ספינינג.

לאחר שזוהה מצב סם ספין אחד או יותר, ציור ידני מספק מסלול מהיר להערכת תכונות סיבי המשי. מכיוון שנדרשים כמויות נמוכות משמעותית של סמים לציור ידני פרודוקטיבי, נדרשות מסות נמוכות בהרבה של חלבון טהור, מה שהופך את זה לקודמן מצוין לגישות אוטומטיות של ספינינג רטוב. זה גם מספק שיטה מאוד קלה ופשוטה להשוואה ישירה של תכונות סיבים של ספידרוינים שונים33, שוב עם היתרון שייצור סיבים הוא פשוט יחסית עם כמויות קטנות של חלבון. משמעות הדבר היא שאופטימיזציה של ביטוי חלבון ופרוטוקולי טיהור כדי להשיג את התשואות הגבוהות יותר הדרושות לספינינג רטוב יכולה להתמקד בספידרואינים המבטיחים ביותר. החיסרון, כמובן, הוא שציור ידני אינו מתאים לייצור של סיבים רציפים ארוכים או של כמויות משמעותיות של סיבים בצורה יעילה.

בהינתן מספיק חלבון, ספינינג רטוב מספק יתרונות לייצור יעיל שלסיבים ארוכים ורציפים. לא רק זה, אלא שתכונות הסיבים עשויות להיות מווסתות בקלות באמצעות תהליך הספינינג. הבחירה בתנאי סמים מסתובבים, למשל, מספקת דרך אחת ברורה לשיפור מכניקת הסיבים. במקרה של חלבון משי רקומביננטי של ~60 kDa, למשל, שינוי מסם ספין אחד למשנהו כאשר כל שאר פרמטרי הסיבוב נשארים קבועים הוביל לשינויים דרמטיים ביכולת הרחבת הסיבים26. זה היה, בתורו, קשור לאופן שבו ה-aciniform spidroin התאסף בסם הספין לפני הסיבוב, כאשר הומוגניות משופרת של ננו-חלקיקים בהרכבה עצמית בסם הספין הייתה בקורלציה למכניקת סיבים משופרת. שילוב של משיכה לאחר סחיטה, תוך ציון כי יש לייעל את יחס המשיכה עבור סוג סיב נתון, משפר בדרך כלל גם את מכניקת סיבי המשי באמצעות שילוב כלשהו של יישור מולקולרי משופר והמרה משופרת, למשל, לגבישים β יריעות המחזקים סיבים32. לבסוף, השימוש בתנאים שונים בשלב המשיכה שלאחר הסיבוב מספק אמצעי לווסת את תכונות הסיבים. חשיפה לממס מיד לפני או במהלך המשיכה עשויה לשנות באופן מהותי את התכונות המכניות והמבניות של הסיבים17,38, תוך ציון שלספידרוינים שונים יהיו העדפות וסובלנות שונות לממס (למשל, כאשר סיבים רקומביננטיים של אציניפורם תואמים מאוד למים26,31 לעומת סיבים פירפורמיים רקומביננטיים העוברים התכווצות במים38 לעומת סיבים של כימרי pyriform-aciniform spidroin המציגים את תאימות המים של aciniform spidroin למרות שזה פחות ממחצית החלבון במסה17).

הפרוטוקול המתואר מספק גישה רב-תכליתית הניתנת להתאמה אישית כדי להעריך ולייעל את יכולת הספינינג ותכונות הסיבים של משי עכביש רקומביננטי. בכל המקרים, יש לנתח ולהשוות את תכונות הסיבים המתקבלות באופן עקבי וחזק. כאן, אנו מציעים שימוש במיקרוסקופיה אופטית, כולל מיקרוסקופ אור מקוטב, בדיקות מתיחה וספקטרומיקרוסקופיה FTIR כ"ערכת כלים סטנדרטית" של טכניקות למטרה זו. ניתן ליישם טכניקות נוספות לאפיון ביופיזיקלי וחומרים כדי להרחיב את ההבנה של הסיבים המתקבלים, אך סט טכניקות זה מספק כיסוי יוצא מן הכלל של תכונות המפתח של מורפולוגיה, יישור תוך-פיברילרי/אניזוטרופיה, ביצועים מכניים ומבנה משני של חלבון. בפרט, למרות שספקטרומיקרוסקופיה FTIR מספקת אמצעי פשוט יחסית להערכת מבנה משני של סיבי משי ומיקרוסקופ אור מקוטב מאפשר להסיק מסקנות לגבי מידת היישור המולקולרי המשופר שהושג, מתודולוגיות אחרות כגון ספקטרוסקופיה NMR במצב מוצק63,64, עקיפה של קרני רנטגן64, ספקטרומיקרוסקופ ראמאן מקוטב65 ו/או מיקרוסקופיה אופטית לא ליניארית54 יש לשקול על מנת להעריך באופן מקיף יותר את הגבישיות, היישור והמבנה בתוך סיבי המשי להבהרת יחסי מבנה-מכניקה מלאה. בהתחשב בהתאמה של טוויה רטובה לסוגים אחרים של חלבונים66, אנו צופים שפרוטוקול זה יהיה ישים באופן כללי מעבר למשי רקומביננטי.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יאן ק. רייני מדווח על מערכת יחסים עם 3DBioFibR Inc. הכוללת הון עצמי או מניות ומענקי מימון. למחברים האחרים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המימון לעבודה זו ניתן על ידי מענקי גילוי של מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) (RGPIN-2020-06083 ל-X-QL ו-RGPIN-2023-05912 ל-JKR), נספח של משרד ההגנה הלאומי/NSERC (DGDND-2023-05912 ל-JKR), מענק NSERC Alliance (ALLRP-578541-22 ל-JKR) בשותפות עם 3DBioFibR Inc, ומענקי כלי מחקר ומכשירים של NSERC. AG זכתה במלגת בוגר נובה סקוטיה ברמת דוקטורט (NSGS-D) ובמלגת לימודים לתארים מתקדמים של הפקולטה לרפואה של דלהאוזי לשנת 2024 הממומנת על ידי תמיכה מתורמי Molly Appeal; HB הוא זוכה במלגת Vanier Canada Graduate במימון NSERC, מלגת קדם דוקטורט של Killam (רמה 2) ו-NSGS-D; ו-SE זכתה במלגת NSERC לדוקטורט לתואר שני (PGS-D), פרס מימון משלים של NSERC/המחלקה להגנה לאומית, ומלגת זיכרון וולטר ס. סאמנר. המחברים אסירי תודה על התמיכה הטכנית של סופי הברסטוק ואמילי סמית'.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1,1,1,3,3,3-hexafluroropropanol (HFIP)Thermo Fisher Scientific445820500משמש להכנת סמים
מזרק 1725LTSN עם מחט מלט בקצה Luer המילטון81100משמש לספינינג רטוב
2,2,2-trifluoroethanol (TFE)Sigma-AldrichT63002-500Gמשמש להכנת סמים
אתנול מוחלטFisher ScientificBP28184משמש לאמבטיית קרישה 
חומצה אצטיתפישר סיינטיפיקA38-212משמש להכנת סמים
איזון אנליטימטלר טולדו XS105מכשיר בדיקת מתיחה
סידן כלורי (CaCl2)Sigma-AldrichC-3881משמש להכנת
סמים חומצת לימון Millipore Sigma77-92-9משמש להכנת סמים
מחשבRaspberry PiRaspberry Pi 4 דגם B Deivce מסתובב רטוב - מספק יכולת להשתמש בממשק משתמש גרפי כדי לשלוט במנועי צעד
דיסודיום מימן פוספט (Na2HPO4)Millipore Sigma7558-79-4משמש להכנת סמים
חומצה פורמית פישר סיינטיפיקA118-500משמש להכנת סמים
שקופיות זכוכית Millipore SigmaS8902-1PAKמשמש להרכבה
סיבים חומצה הידרוכלורית (HCl)EM ScienceHX0603-53משמש להכנת סמים
גלאי מקורר MCT-A Thermo Fisher Scientific840-199300FTIR הערכת מבנה משני של סיבים
לוחית הרכבהמיוצר בביתמכשיר ספינינג רטוב
NEMA 17 מנוע צעד ביו-קוטביSTEPPERONLINE17HS15-1504S-X1מכשיר ספינינג רטוב - הערה: מנועים מרובים הנדרשים לביצוע מתיחת לאחר סיבוב
Nicolet iN10 FTIR ספקטרומיקרוסקופתרמו פישר סיינטיפיק912A0604הערכת FTIR של מבנה משני סיבים
ניקולט iN10 שלב מיפויתרמו פישר מדעי840-198800הערכת FTIR של מבנה משני סיבים
ניקולט iN10 ג'ויסטיק שלב ממונע Thermo Fisher Scientific840-199800FTIR הערכת מבנה משני של סיבים
ניקולט Slide-On Ge Micro Tip ATR 350תרמו פישר סיינטיפיק840-194800 הערכת FTIR של מבנה משני סיבים
OMNIC Picta ver. 1.7.224Thermo Fisher ScientificINQSOF018FTIR תוכנת בקרת מכשירים
OMNIC גרסה 9.11.745Thermo Fisher ScientificINQSOF018FTIR תוכנת עיבוד וניתוח נתונים ספציפית למכשיר
אור אופטי / מקוטב   מיקרוסקופZeiss CanadaAxio Observer A1מיקרוסקופ אופטי הפוך
OriginPro 2025 10.2 SR1OriginLab CorporationOriginPro 10.200196תוכנה לעיבוד וניתוח נתוני FTIR של צד שלישי
אשלגן דימימן פוספט (KH2PO4)Fisher ScientificP285-10משמש להכנת סמים
אשלגן פוספט דו-בסיסי (K2HPO4)FisherScientificBP363-500משמש להכנת סמים
ספק כוחALITOVEALT-1205מכשיר ספינינג רטוב - ממיר מתאם אספקת חשמל 12V 5A AC 100-240V כניסת עם שקע פלט DC 5.5x2.5 מ"מ - הערה: לביצועים מיטביים, עשוי לדרוש ספק כוח נפרד לכל מנוע
נתרן אצטט סיגמא-אולדריץ'S2889-1KGמשמש להכנת סמים
נתרן הידרוקסיד (NaOH)Millipore Sigma1310-73-2משמש להכנת
סמים גלילי ספינינג מיוצר בביתמשמש לכבלי מנוע צעד מסתובבים רטובים
XMSJSIYB0BD5FV3R2מכשיר ספינינג רטוב - מספק חיבור מבקרי מנוע צעד למנועי צעד
בקר מנוע צעד (Pi HAT)AdafruitDC & כובע מנוע צעד עבור Raspberry Piמכשיר ספינינג רטוב בקר מנוע תמורות 1 - שים לב קצב סיבוב מנוע מוגבל של ~46 סל"ד
בקר מנוע צעד (USB)PoluluTic T249התקן ספינינג רטוב בקר מנוע תמורות 2 - השתמש כאשר ייתכן שיהיה צורך בסיבוב מהיר יותר מ-46 סל"ד
משאבת מזרקKD ScientificModel 100מכשיר לבדיקת מתיחה ומכשיר ספינינג רטוב
חומצה טריפלואורואצטית (TFA)Millipore SigmaTX1276-7משמש להכנת סמים
Tris-hydrochloride EMD Millipore9310-500GMמשמש להכנת סמים
רכזת USBAcasisB07Q3TYF15 התקן ספינינג רטוב - רכזת USB מופעלת 48W - ACASIS 10 יציאות USB 3.0 Data Hub - עם מתגי הפעלה/כיבוי נפרדים ומתאם מתח 12V/4A מפצל USB - ממשק בין בקרי מנועי צעד Raspberry Pi ו-Tic T249
כפול טווח על

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gosline, J. M., Demont, M. E., Denny, M. W. The structure and properties of spider silk. Endeavour. 10 (1), 37-43 (1986).
  2. Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J Exp Biol. 202 (23), 3295-3303 (1999).
  3. Lewis, R. V. Spider silk: Ancient ideas for new biomaterials. Chem Rev. 106 (9), 3762-3774 (2006).
  4. Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. New opportunities for an ancient material. Science. 329 (5991), 528-531 (2010).
  5. Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. Int J Biol Macromol. 24 (2-3), 271-275 (1999).
  6. Römer, L., Scheibel, T. The elaborate structure of spider silk: structure and function of a natural high performance fiber. Prion. 2 (4), 154-161 (2008).
  7. Altman, G. H., et al. Silk-based biomaterials. Biomaterials. 24 (3), 401-416 (2003).
  8. Fahnestock, S. R., Irwin, S. L. Synthetic spider dragline silk proteins and their production in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 47, 23-32 (1997).
  9. Xia, X. -X., et al. Native-sized recombinant spider silk protein produced in metabolically engineered Escherichia coli results in a strong fiber. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (32), 14059-14063 (2010).
  10. Fahnestock, S. R., Bedzyk, L. A. Production of synthetic spider dragline silk protein in Pichia pastoris. Appl Microbiol Biotechnol. 47, 33-39 (1997).
  11. Bogush, V. G., et al. Recombinant analogue of spidroin 2 for biomedical materials. Dokl Biochem Biophys. 441, 276-279 (2011).
  12. Huemmerich, D., et al. Novel assembly properties of recombinant spider dragline silk proteins. Curr Biol. 14 (22), 2070-2074 (2004).
  13. Menassa, R., et al. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: Accumulation and field production. Plant Biotechnol J. 2 (5), 431-438 (2004).
  14. Hauptmann, V., et al. Native-sized spider silk proteins synthesized in planta via intein-based multimerization. Transgenic Res. 22, 369-377 (2013).
  15. Lazaris, A., et al. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295 (5554), 472-476 (2002).
  16. Xu, H. T., et al. Construct synthetic gene encoding artificial spider dragline silk protein and its expression in milk of transgenic mice. Anim Biotechnol. 18, 1-12 (2007).
  17. Ghimire, A., Xu, L., Liu, X. Q., Rainey, J. K. A recombinant chimeric spider pyriform-aciniform silk with highly tunable mechanical performance. Mater Today Bio. 26, 101073(2024).
  18. Wohlrab, S., et al. Cell adhesion and proliferation on RGD-modified recombinant spider silk proteins. Biomaterials. 33 (28), 6650-6659 (2012).
  19. Baker, L. A., et al. Nerve growth factor-binding engineered silk films promote neuronal attachment and neurite outgrowth. Adv Funct Mater. 32 (45), 2205178(2022).
  20. Kluge, J. A., Rabotyagova, O., Leisk, G. G., Kaplan, D. L. Spider silks and their applications. Trends Biotechnol. 26 (5), 244-251 (2008).
  21. Bakhshandeh, B., Nateghi, S. S., Gazani, M. M., Dehghani, Z., Mohammadzadeh, F. A review on advances in the applications of spider silk in biomedical issues. Int J Biol Macromol. 192, 258-271 (2021).
  22. Hijirida, D. H., et al. 13C NMR of Nephila clavipes major ampullate silk gland. Biophys J. 71 (6), 3442-3447 (1996).
  23. Vollrath, F., Knight, D. P. Liquid Crystalline Spinning of Spider Silk. Nature. 410 (6828), 541-548 (2001).
  24. Doblhofer, E., Heidebrecht, A., Scheibel, T. To spin or not to spin: spider silk fibers and more. Appl Microbiol Biotechnol. 99, 9361-9380 (2015).
  25. Koeppel, A., Holland, C. Progress and trends in artificial silk spinning: A systematic review. ACS Biomater Sci Eng. 3 (3), 226-237 (2017).
  26. Xu, L., Weatherbee-Martin, N., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Recombinant silk fiber properties correlate to prefibrillar self-assembly. Small. 15 (12), 1805294(2019).
  27. Teulé, F., et al. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. Nat Protoc. 4 (3), 341-355 (2009).
  28. Yang, M., Kawamura, J., Zhu, Z., Yamauchi, K., Asakura, T. Development of silk-like materials based on Bombyx mori and Nephila clavipes dragline silk fibroins. Polymer. 50 (1), 117-124 (2009).
  29. Lewis, R. V., Hinman, M., Kothakota, S., Fournier, M. J. Expression and purification of a spider silk protein: a new strategy for producing repetitive proteins. Protein Express Purif. 7 (4), 400-406 (1996).
  30. Arcidiacono, S., et al. Aqueous processing and fiber spinning of recombinant spider silks. Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).
  31. Weatherbee-Martin, N., et al. Identification of wet-spinning and post-spin stretching methods amenable to recombinant spider aciniform silk. Biomacromolecules. 17 (8), 2737-2746 (2016).
  32. Schmuck, B., et al. Strategies for making high-performance artificial spider silk fibers. Adv Funct Mater. 34 (35), 2305040(2024).
  33. Xu, L., et al. Structural and mechanical roles for the C-terminal nonrepetitive domain become apparent in recombinant spider aciniform silk. Biomacromolecules. 18, 3678-3686 (2017).
  34. Xu, L., Rainey, J. K., Meng, Q., Liu, X. Q. Recombinant minimalist spider wrapping silk proteins capable of native-like fiber formation. PLoS One. 7 (11), e50227(2012).
  35. Exler, J. H., Hümmerich, D., Scheibel, T. The amphiphilic properties of spider silks are important for spinning. Angew. Chem, Int Ed. 46 (19), 3559-3562 (2007).
  36. Teulé, F., Furin, W. A., Cooper, A. R., Duncan, J. R., Lewis, R. V. Modifications of spider silk sequences in an attempt to control the mechanical properties of the synthetic fibers. J Mater Sci. 42, 8974-8985 (2007).
  37. Khan, A. Q., et al. Innovations in spider silk-inspired artificial gel fibers: methods, properties, strengthening, functionality, and challenges. SusMat. 4 (3), e205(2024).
  38. Simmons, J. R., Xu, L., Rainey, J. K. Recombinant pyriform silk fiber mechanics are modulated by wet-spinning conditions. ACS Biomater Sci Eng. 5 (10), 4985-4993 (2019).
  39. Seidel, A., Liivak, O., Jelinski, L. W. Artificial spinning of spider silk. Macromolecules. 31 (19), 6733-6736 (1998).
  40. Venkatesan, H., et al. Artificial spider silk is smart like natural one: Having humidity-sensitive shape memory with superior recovery stress. Mater Chem Front. 3 (11), 2472-2482 (2019).
  41. Sommer, C., Scheibel, T. Suitable electrospinning approaches for recombinant spider silk proteins. Open Ceramics. 15, 100420(2023).
  42. Wang, M. Y., et al. Dry-spinning of artificial spider silk ribbons from regenerated natural spidroin in an organic medium. Macromol Rapid Commun. 44 (12), 2300024(2023).
  43. Chang, M., Zhang, X., Yang, Z. Artificial metal-ion doped spider silk fibers with excellent mechanical property and humidity-driven actuator property. Macromol Chem Phys. 226 (10), 2400502(2025).
  44. Kang, E., et al. Digitally tunable physicochemical coding of material composition and topography in continuous microfibres. Nat Mater. 10 (11), 877-883 (2011).
  45. Lin, B., et al. Overexpressed artificial spidroin based microneedle spinneret for 3D air spinning of hybrid spider silk. ACS Nano. 18 (37), 25778-25794 (2024).
  46. Gonska, N., et al. Structure-function relationship of artificial spider silk fibers produced by straining flow spinning. Biomacromolecules. 21 (6), 2116-2124 (2020).
  47. Blackledge, T. A., Cardullo, R. A., Hayashi, C. Y. Polarized light microscopy, variability in spider silk diameters, and the mechanical characterization of spider silk. Invert Biol. 124 (2), 165-173 (2005).
  48. Greco, G., et al. Properties of biomimetic artificial spider silk fibers tuned by postspin bath incubation. Molecules. 25 (14), 3244(2020).
  49. Andersson, M., et al. Biomimetic spinning of artificial spider silk from a chimeric minispidroin. Nat Chem Biol. 13 (3), 262-264 (2017).
  50. Tremblay, M. L., et al. Spider wrapping silk fibre architecture arising from its modular soluble protein precursor. Sci Rep. 5 (1), 11502(2015).
  51. Schmuck, B., et al. Impact of physio-chemical spinning conditions on the mechanical properties of biomimetic spider silk fibers. Commun Mater. 3 (1), 83(2022).
  52. Yue, X., et al. A novel route to prepare dry-spun silk fibers from CaCl2-formic acid solution. Mater Lett. 128, 175-178 (2014).
  53. Sulekha, A., et al. An engineered recombinant spider silk protein providing disulfide-locked control over self-assembly and fiber formation. Adv Funct Mater. 35 (15), 2420254(2025).
  54. Harvey, M., Ghimire, A., Cisek, R., Kreplak, L., Rainey, J. K., Tokarz, D. Polarization-resolved second harmonic generation microscopy of silk fibers is sensitive to β-sheet orientation and molecular structure. ACS Appl Bio Mater. 8 (6), 5229-5238 (2025).
  55. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  56. Huan, Y., et al. Experimental study of the mechanical properties of a novel supramolecular polymer filament using a microtensile tester based on electronic balance. Exp Tech. 40, 737-742 (2014).
  57. Hu, X., Kaplan, D., Cebe, P. Determining beta-sheet crystallinity in fibrous proteins by thermal analysis and infrared spectroscopy. Macromolecules. 39 (18), 6161-6170 (2006).
  58. Breslauer, D. N. Current progress on scale-up and commercialization of microbially-produced silk. Adv Funct Mater. 35 (15), 2408386(2025).
  59. Branković, M., et al. Review of spider silk applications in biomedical and tissue engineering. Biomimetics. 9 (3), 169(2024).
  60. Pan, L., et al. A supertough electro-tendon based on spider silk composites. Nat Commun. 11 (1), 1332(2020).
  61. Jin, H. J., Kaplan, D. L. Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature. 424 (6952), 1057-1061 (2003).
  62. Malay, A. D., et al. Spider silk self-assembly via modular liquid-liquid phase separation and nanofibrillation. Sci Adv. 6 (45), eabb6030(2020).
  63. Asakura, T., Naito, A. Structure of spider silk studied with solid-state NMR. Adv Funct Mater. 35 (15), 2407544(2024).
  64. Yarger, J. L., Cherry, B. R., Van Der Vaart, A. Uncovering the structure-function relationship in spider silk. Nat Rev Mater. 3 (3), 1-11 (2018).
  65. Lefèvre, T., Paquet-Mercier, F., Rioux-Dubé, J. F., Pézolet, M. Structure of silk by Raman spectromicroscopy: from the spinning glands to the fibers. Biopolymers. 97 (6), 322-336 (2012).
  66. Schiller, T., Scheibel, T. Bioinspired and biomimetic protein-based fibers and their applications. Commun Mater. 5 (1), 56(2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Optimizing and Evaluating Hand-drawing and Wet-spinning for Recombinant Spider Silk Fiber Production
Posted by JoVE Editors on 9/08/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68714

תגיות

FTIR
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים