Method Article

ניתוח/תפירה של עצב סיאטי בעכבר ללימוד תיקון עצב והתאוששות פונקציונלית

DOI:

10.3791/68724

⸱

January 16th, 2026

 , 
1Barshop Institute for Longevity and Aging Studies, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Department of Cell Systems and Anatomy, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 3Department of Molecular Medicine, University of Texas Health Science Center at San Antonio

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר מודל חיתוך והחזרת עצב סיאטי בעכברים לחקר התחדשות עצבים היקפיים באמצעות נוירוני גנגליון שורש גבי בוגרים. הוא מאפשר ניתוח in vivo של התחדשות אקסון, עצבוב שרירים והתאוששות תפקודית לאחר פגיעה עצבית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיקון עצבי הוא חיוני לשיקום התפקוד לאחר פגיעה אקסונלית. עם זאת, לנוירונים בוגרים במערכת העצבים המרכזית (CNS) יש יכולת מוגבלת לחדש את האקסונים שלהם לאחר פציעה, בשל ירידה ביכולת הצמיחה הפנימית וסביבה עוינת. לעומת זאת, נוירונים במערכת העצבים ההיקפית (PNS) מציגים פוטנציאל רגנרטיבי חזק. ביניהם, נוירוני גרנגליון שורש גב (DRG) בוגרים ידועים במיוחד ביכולתם להתחדש ביעילות לאחר פגיעות עצב פריפריאלי, מה שהופך אותם למודל אידיאלי לחקר המנגנונים התאיים והמולקולריים שמאחורי תיקון העצבים. כאן, טכניקת מיקרו-תפר מותאמת, הנקראת "לופ-לופ-לפני-חתך", מתוארת ליצירת מודל חיתוך והחזרת עצב סיאטי בעכברים, ואחריו ניתוח של רגנרציה של אקסון. הערכות התנהגותיות ועצבוב שרירים הוכחו גם הן כמעריכות התאוששות פונקציונלית. לאחר ניתוק והחזרת עצב סיאטיקה, בעלי חיים מראים בתחילה ליקויים התנהגותיים, אך החלמה מלאה נצפית בדרך כלל עד 30 יום לאחר הפציעה. שימוש בתרופות המעודדות מיזוג אקסונלי באתר הפציעה מאיץ משמעותית את ההתאוששות התפקודית. מערכת מודל זו מציעה כלי עוצמתי לחקר המנגנונים השולטים בתיקון עצבי יונקים ב-vivo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פגיעה אקסונלית היא תוצאה נפוצה וחמורה של נזק למוח ולחוט השדרה, הנגרמת לעיתים קרובות מפגיעות טראומטיות, נוירוטוקסינים או הפרעות נוירולוגיות שמפריעות לקישוריות העצבית ומפריעות להתחדשות אקסונים 1,2. לא לכל הנוירונים יש יכולת פנימית להתחדשות, שהיא חיונית לתיקון אקסונים שנחתכו. קצב ההתחדשות האקסונלית מושפע ממספר גורמים, כולל פוטנציאל הגדילה הפנימי של הנוירון, יעילות סינתזת החלבונים, דינמיקת השלד הציטוסקלטלי, ניקוי שאריות המיאלין, וזמינות גורמי גדילה 3,4.

במערכת העצבים המרכזית של היונקים הבוגרים (CNS), פגיעה אקסונלית גורמת לירידה ביכולת ההתחדשות, בעיקר בשל היעדר גורמי גדילה פנימיים ונוכחות רמזים חיצוניים מעכבים 1,5. לעומת זאת, אקסונים במערכת העצבים ההיקפית (PNS) מחזיקים ביכולת חזקה להתחדש לאחר פציעה, בזכות מנגנוני התיקון העצמי הפנימיים של הנוירונים ההיקפיים וההפעלה המהירה של תוכניות צמיחה פרו-רגנרטיביות. עם הפציעה, המקטע הדיסטלי של האקסון מתנתק מהסומה הנוירונית ועובר ניוון וולרי, המאופיין בפירוק ופיצול אקסונלי 6,7. ניקוי יעיל של שאריות אקסונליות ומיאלין על ידי תאי גליה חיוני להתחדשות מוצלחת, שכן הוא מונע היווצרות צלקות שעלולות להפריע לצמיחת האקסונלים 3,8. תהליך זה, יחד עם עיצוב מחדש של אקסונים פגועים, תומך בצמיחה מחודשת של הגדם הפרוקסימלי ומקל על עצבוב המטרה. אירועים אלו מתרחשים בשלבים חופפים חלקית, שבמהלכם הפעלה של גורמי שעתוק כמו ATF3 ו-c-Jun מעודדת תוכניות ביטוי גנים פרו-רגנרטיביות 4,9,10.

מיזוג אקסונלי רגנרטיבי מהווה מנגנון יעיל לשיקום הקישוריות הנוירונית לאחר פגיעה אקסונית11. תהליך זה תואר לראשונה בסרטנים Procambarus clarkii בשנת 196712, ומאז תועד על פני מספר מינים 13,14,15,16, כולל Caenorhabditis elegans17. למרות שהראיות הישירות לאיחוי אקסונים ביונקים נותרות מוגבלות, אסטרטגיות השראת היתוך יושמו בהצלחה לשיפור תיקון העצבים11. ראוי לציין כי הכימיקל פוזוגן פוליאתילן גליקול (PEG) מקדם איטום מחדש של הממברנה והוכח כמסייע בהתאוששות תפקודית לאחר פגיעות עצב היקפי וחוט השדרה במודלים יונקים 18,19,20,21,22,23,24. ממצאים עדכניים מצביעים על כך שדלדול גלוטתיון פרוקסידאז (GPX) מספיק לקידום מיזוג אקסונים ב-C. elegans25. באופן דומה, עכברים מותנים של Gpx4 או אלו שטופלו במעכב GPX ML162 הראו התאוששות מואצת תפקודית לאחר חיתוך עצב סיאטי, ייתכן באמצעות מיזוג אקסוני משופר25.

עצב הסיאטי הוא עצב מעורב המורכב מאקסונים סנסוריים, מוטוריים סומטיים ואקסונים מוטוריים אוטונומיים26. הוא נובע ממקטעי עמוד השדרה L4 ו-L5 בעכברים27, וממקטעי L3 ו-L4 בעכברים28. בשל הנגישות והעקביות האנטומית, פגיעת עצב סיאטי הפכה לאחד המודלים הנפוצים ביותר לחקר התחדשות עצבים היקפיים29,30. מודלים אלו מאפשרים חקירה של מנגנונים נוירונליים פנימיים ושל גורמים סביבתיים חיצוניים המשפיעים על גדילה אקסונית והתאוששות תפקודית 3,4,9. השימוש בכיבוש עצב סיאטי כפרדיגמה ניסויית במדעי המוח מתחיל בסוףהמאה ה-19. בנוסף למודלים של ניתוק עצבים, חיתוך עצב משמש באופן נרחב לחקר התחדשות אקסונים והתאוששות פונקציונלית. עם זאת, החיתוך הקלאסי של עצב סיאטי ואחריו תפר בעכברים הוא לעיתים פחות ניתן לשחזור ואמין מאשר בעכברים, בשל גודלו הקטן ומרקמו השברירי של העצב31.

באמצעות מודל חיתוך והחזרת עצב סיאטי מותאם שנקרא "לופ-לפני-חתך", נוצרו בהצלחה מודלים של ניתוח ושיקום עצב סיאטי ניתנים לשחזור25. גישה זו מבטלת את הצורך בטיפול בעצבים לאחר החתך על ידי הכנסת התפר לפני החיתוך, ובכך מפחיתה את המתח המכני ומפחתת שונות בשל טכניקת הניתוח. רמות בינוניות של מודולציית GPX נמצאו תורמות להחלמה תפקודית לאחר חיתוך מלא של עצב הסיאטיבעכבר 25. טיפול משותף בריכוזים נמוכים ML162 (0.25 μM)32, מעכב GPX ופוליאתילן גליקול (PEG, 500 mM)18,19,20,21,22,23,24 בניתוח עצב סיאטי (SNT) / פצע שיקום שיפר בהצלחה את ציון ההתנהגות שנערך על ידי בדיקת סיכה, אסימטריית שבר כף הרגל ובדיקת פיזור אצבעות 25,33,34. קטעי אקסון דיסטליים שנקטעו בנוירוני הגנגליון הגבי של יונקים (DRG) מתדרדרים תוך 3 ימים, מה שגורם להפרעה במפרקים הנוירומוסקולריים (NMJ)6,35, ונוירוני DRG מתחדשים יעצבנו מחדש את השרירים כדי לשקם את תפקודם. קבוצת הטיפול המשותפת SNT/Resurure-ML162/PEG הראתה NMJ מעצבבים וציוני התנהגות משופרים בשלב מוקדם (3 ימים לאחר הניתוח), מה שמעיד על התאוששות מוקדמת של תפקוד נוירומוסקולרי25.

כאן מתוארים שיטת התפירה המיקרוסקופית "לולאה לפני חיתוך" ומתן התרופות שאפשרו את התצפיות לעיל בעכברים. פרוטוקול מיזוג PEG שהיה קיים קודם לכן, המאפשר תיקון מהיר של עצבי עכברוש שנקטעו, שונהב-18. פוליאתילן גליקול (PEG) דווח בתחילה כמעודד חיבור מחדש חיצוני של אקסונים ענקיים מדיאליים של סרטנים חתוכים (MGA) במבחנה36. פרוטוקולי PEG-fusion שיפרו את תוצאות ההתנהגות ב-25%-30% מהניסויים שעסקו בפציעות ניתוק של עצב הסיאטי בעכברוש, אם כי לא נצפתה התאוששות פונקציונלית בנקודות זמן מוקדמות34. שיפורים מאוחרים יותר שילבו את מושג אטימת הממברנה האנדוגנית37. לאחר פגיעת עצב, תיקון מהיר של פלזמלמים הוא מגן נוירולוגי ומונע ניוון עצבי. הצטברות וזיקולות קשורות לממברנה על ידי Ca2+ מקלה על תהליך האיטום הזה38. חיתוך עצבי מלא משבש את האקסולמה וכן את המעטפות האנדונאוריאליות, הפרינוריאליות והאפינויריאליות באתר הפצע. מיקרו-תפר של מעטפת האפינוירום מיישר את גדמי העצבים הפרוקסימליים והדיסטליים. במהלך שלב התפרה, השימוש במי מלח היפוטוניים חסרי Ca2+ מפחית את היווצרות הוזיקולות הקשורות לממברנה, ושומר על המעטפת האנדוניוריאלית והסביבתית פתוחה ומאפשר להתקרב אליהם מקרוב על ידי התפרים האפינויריאליים. לאחר מכן, יישום של מלח המכיל Ca2+ גורם להצטברות ווסיקולות כדי לאטום את ההפרעה הפלזמלמלית שנותרה18.

בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בעכברים בוגרים עם FVB (8-10 שבועות) ועכברים C57BL/6, ולא נצפה הבדל ספציפי לזן. העצב הסיאטי בעכברים ממוקם כ-1-2 מ"מ מתחת לשריר הישבן בגובה אמצע הירך, והוא דק ושביר במיוחד מאשר בעכברים, מה שמצריך דיוק ניתוחי גבוה יותר במהלך הדיסקציה והתפירות. יש להיזהר להימנע ממתיחה עצבית יתר או מניפולציה מופרזת שעלולה לפגוע בהתאוששות תפקודית. גישה זו כוללת ניתוק מלא של העצב, מה שיוצר רווח פיזי בין הגזע הפרוקסימלי והדיסטלי. מכיוון שפער זה מעכב התחדשות אקסונלית ישירה, החלמה מוצלחת דורשת בדרך כלל התערבות מיקרוכירורגית או השתלת עצבים.

בהינתן שהעצב הסיאטי של העכבר דק ועדין יותר מזה של העכברוש, נדרשת דיוק ניתוחי גבוה יותר. למרות שתפר מיקרו נפוץ בשימוש, הוא עלול לגרום בטעות לטראומה נוספת עקב מניפולציה מופרזת או מעבר מחט חוזר39. מגבלות אלו עלולות להכניס שונות ואף לבלבל את הערכת אסטרטגיות טיפול חדשות. לכן, השגת תוצאות ניתוח עקביות תוך מזעור נזק עצבי שנגרם מתפר היא חיונית להערכת התאוששות פונקציונלית באופן אמין במודלים של ניתוק עצבים. באמצעות שיטת "לולאה לפני חיתוך" זו, נוצרו מודלים ניתנים לשחזור של חיתוך ושיקום עצב סיאטיק, והוערכו השפעות הטיפול הכפול ב-PEG ו-ML162 על ההתאוששות התפקודית. בסך הכל, למרות השימוש הנרחב, מודל החיתוך של עצב סיאטי בעכבר מציב אתגרים טכניים בשל גודלו הקטן ושבריריותו של העצב. שיטת השיקום המותאמת הזו המתוארת כאן מתייחסת לצורך קריטי בפרוטוקול מיקרוכירורגי סטנדרטי שניתן לשחזור ולמזער נזק מכני.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים לבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית (IACUC) במרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו (מספר פרוטוקול: 20200082AR). עכברי FVB בוגרים זכרים ונקבות (8-10 שבועות, משקל 20-25 גרם) שימשו לפרוצדורות הניסוי של JoVE המתוארות כאן. עכברים מסוג C57BL/6 (בגיל 8-10 שבועות, 20-25 גרם) שימשו רק בניתוחי פרקטיקה ראשוניים שנערכו לפני הניסויים הפורמליים לצורך אופטימיזציה של טיפול ודיוק תפירה. מפגשי התרגול הללו אישרו כי הליך "לופ-לופ-לפני חיתוך" הניב תוצאות דומות בשני הזנים; לכן, כל הנתונים הפורמליים שהוצגו בכתב יד זה התקבלו מעכברי FVB. בסך הכול נכללו תחילה עשרה עכברי FVB (חמישה זכרים וחמש נקבות) לניתוח עצב סיאטי ולאחר מכן טיפול ML162 + PEG. בעל חיים אחד הראה שונות אנטומית מולדת שבה העצב הסיאטי התפצל לשני ענפים עיקריים לפני אתר החיתוך, מה שהוביל לניתוח לא שלם ולהוצאה מהניתוח. לכן, נערכו ניתוחים התנהגותיים והיסטולוגיים על תשעה בעלי חיים (n = 9). שני המינים הראו התאוששות רגנרטיבית והתנהגותית דומה, ולא נצפו הבדלים ספציפיים למין. עכבר נוסף עבר חדירה כפולה של תפר ללא חיתוך עצבי (שליטה מזויפת) כדי להעריך את ההשפעה האפשרית של הליך התפר עצמו על תוצאות התנהגותיות. לא נצפו הבדלים ניכרים בתגובה הרגנרטיבית בין המינים. בעלי החיים אוחסנו בתנאים סטנדרטיים עם מחזור אור/חושך של 12 שעות, בטמפרטורה של 75°F ולחות יחסית של 40%-60%, עם גישה חופשית למזון ולמים. נעשה שימוש בעכברים זכרים ונקבות, ולא נצפה הבדל מורגש בין זכרים לנקבות. ההליכים הניתוחיים בוצעו תחת הרדמה איזופלורנית של מערכת ההרדמה SomnoSuite. בדיקות התנהגות נערכו החל מיום 2 לאחר הניתוח, וחזרו על עצמן בימים 4, 7, 10, 14, 18, 22 ו-27, כפי שמצוין בנתונים המתאימים. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. חיתוך/שיקום עצב סיאטי וטיפול תרופתי

  1. הניחו את החיה על כרית מחוממת שבה ניתן לצפות בעצב הסיאטי תחת מיקרוסקופ ניתוח סטריאו (איור 1A).
  2. הרדימו את העכבר באמצעות מערכת ההרדמה SomnoSuite עם זרימה נמוכה.
    הערה: אשר את עומק ההרדמה בהיעדר תגובות רפלקסיות, כמו תגובה לצביטה באצבע, לפני תחילת הניתוח. מרחו משחת עיניים וטרינרית לעיניים כדי למנוע יובש בקרנית.
  3. לגלח את השיער על הירך ומסביב.
    הערה: הסירו את השיער הגולח והנשור בצורה הכי נקייה שאפשר. אחרת, השערות יידבקו לתפר ניילון 10-0 ויזהמו את עצב הסיאטיקה. שערות שנותרו ניתנות להסרה עדינה באמצעות סרט מעבדה או סרט סקוטש לאחר הגילוח כדי להבטיח שדה ניתוח נקי. חטא את אתר הניתוח על ידי ניקוי רציף של האזור המגולח עם 70% אתנול, בטדין, וניגוב אחרון עם 70% אתנול באמצעות כדורי כותנה מאוטוקלב.
  4. אכן את עצם הירך ויצר חתך קטן בעור בגודל כ-1.0 ס"מ (טווח 0.8-1.2 ס"מ) בגובה אמצע הירך, כ-~1 מ"מ אחורי ובמקביל לעצם הירך באמצעות מספריים כירורגיים עדינים.
    1. משכו בעדינות את הישבן המקסימוס כדי לחשוף את הבייספס הפמוריס שמתחת. לאחר מכן, השתמשו בקצות המספריים כדי להפריד בעדינות את ראשי הבייספס הקדמיים והאחוריים של הבייספס פמוריס, ללא חיתוך, כדי לחשוף את העצב הסיאטי מתחת לחריץ הסיאטי. שלבים אלו מתבצעים תחת תצפית חזותית ישירה, ולא תחת מיקרוסקופ.
  5. משכו את העצב הסיאטי החוצה מהגוף באמצעות מלקחיים מיקרו-דיסקאטיים כדי להקל על ניתוח בעצב הסיאטי (איור 1A).
    הערה: אבטחו את המלקחיים עם סרט דבק כדי למנוע מהם להתפשט מעבר לרמה מסוימת ולמזער נזק לעצב הסיאטי. מניחים את קצה המלקחיים מתחת לעצב הסיאטי והרימו את העצב הסיאטי כלפי מעלה תוך שימוש בירך העכבר כנקודת משען. הקפידו להרים את העצב רק ככל שצריך כדי להקל על התפירות, והימנעו מהפעלת מתח או משיכתו החוצה, שכן מתיחה מופרזת עלולה לפגוע באקסונים או במבנים הסובבים.
  6. למקד את המיקרוסקופ על העצב הסיאטי החשוף. מהשלב הזה, המשיכו דרך שלב 15 באמצעות מיקרוסקופ (איור 1A).
  7. חדר פעמיים לעצב הסיאטי עם תפר ניילון 10-0 (איור 1B,C). עבור לשלב 1-8 לשליטה לא מנוצלת. עבור לשלב 1-11 לניתוח העצבים.
    הערה: שתי חדירות בוצעו בערך ברוחב עצב אחד (~0.7 מ"מ), ממוקמות באופן סימטרי משני צידי אתר החיתוך המיועד. המרווח הזה הבטיח יישור נכון של הגזעים הפרוקסימליים והדיסטליים, תוך מזעור העומס המכני בפצע. יש לבצע חדירה דרך מרכז העצב הסיאטי עם התפיר, כדי לוודא ששתי החדירות שמתבצעות על ידי התפר מקבילות בדיוק. תפרים בגודל 10-0 קטנים ויש לשלוט בהם עם פינצטה עדינה במיוחד. ניילון 10-0 שאינו נספג שימש כי הוא מספק יציבות מתיחה מצוינת ותגובתיות רקמה מינימלית במהלך תקופת התצפית של 30 יום. חומר זה נמצא בשימוש נרחב במודלים לתיקון עצבים מיקרוכירורגיים בעכברים וחולדות18,31. תפרים נספגים לא שימשו משום שההתדרדרות הדרגתית עלולה לפגוע ביישור גזעי העצבים המנותקים לפני שההתאוששות התפקודית הושלמה. כדי למזער שונות תלויה במפעיל, כל ההליכים הכירורגיים בוצעו על ידי מנתח מיומן יחיד לאחר ניסיון מיקרוכירורגי נרחב תחת מיקרומיקרוסקופ. שיטת "לופ-לופ-לפני חיתוך" עצמה מפחיתה עוד יותר את השונות על ידי ביטול הצורך במניפולציה עצבית לאחר החיתוך, ובכך מבטיחה יישור ומתח עקביים בין בעלי החיים. זה דורש תרגול רב ורמת שליטה גבוהה. לפני ביצוע ניתוחי בעלי חיים, ייתכן שמתחילים ימצאו מועיל לתרגל את תנועת התפירה באמצעות חוטים סינתטיים עדינים כמו חוט דנטלי, כדי לפתח מיומנות ושליטה תחת מיקרוסקופ סטריאו.
  8. קשור בזהירות קשר עם תפר ניילון.
  9. הניחו את העצב הסיאטי החשוף מתחת לשכבת השריר וסגרו את העור באמצעות תפרי ניילון 4-0.
  10. קבע שהחדירה הכפולה של העצב הסיאטי עם תפר ניילון 10-0 אינה משפיעה על התנהגות העכבר.
    הערה: לאישור זה, עכברים שעברו חדירה כפולה ללא חתך עברו את אותן בדיקות התנהגות ששימשו בקבוצות הניסוי, כולל דקירות, אסימטריית שבר כף הרגל ופירוס האצבעות. עכברים אלו השיגו בעקביות ציונים מלאים השווים לבקרות פראיות לא מנותחות, מה שמעיד כי הליך התפירה לבדו לא פגע בתפקוד העצב הסיאטי.
  11. חתכו את העצב הסיאטי באמצע הדרך בין שני תפרי הניילון 10-0 באמצעות סכין (איור 1D).
    הערה: כדי למזער שונות, כל הניתוחים בוצעו על ידי אותו ניסוי מיומן באמצעות הליך סטנדרטי. בנוסף, עיצוב "לולאה לפני חיתוך" מפחית באופן מהותי שונות על ידי הימנעות מטיפול עצבי לאחר החיתוך, ומבטיח מיקום תפרים ומתח אחידים בכל בעלי החיים. מיקום התפרים נבדק תחת מיקרוסקופ ניתוח כדי להבטיח אחידות בין בעלי החיים.
  12. תכניס את המלקחיים.
  13. שטפו את העצב החתוך עם מלח בופר פספט ללא Ca2+ (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mMNa 2HPO4/NaH2PO4, pH 7.4), שהוכן ללא סידן כלורי.
    הערה: שטפו את גזע העצב הכרות עם PBS ללא סידן למשך כ-10-20 שניות כדי לנקות דם ולמנוע אטימה מוקדמת. יש להשלים את התפירה מחדש במהירות תוך 1-2 דקות כדי לשמור על יישור וחיוניות הרקמה.
  14. הסר את ה-PBS ללא Ca2+ על ידי ספיגתו עם רקמה.
  15. קשור בזהירות קשר עם תפר ניילון (איור 1E). המשך לשלב 20 אם טיפול בסמים אינו מתוכנן או נדרש.
    הערה: קשר מרובע סטנדרטי שימש למיקרו-תפירה, שכלל שתי זריקות מנוגדות שהודקו בעדינות במלקחיים עדינים תחת מיקרומיקרוסקופ. שני האקסונים המנותקים המחוברים על ידי התפר חוזרים לצורה הקרובה לצורתם המקורית. חיבור מחדש של כלי דם שנקטע יכול להיות אינדיקטור חזותי לכך שגדמי העצבים הפרוקסימלי והדיסטלי מיושרים כראוי. במהלך ההליך, הרקמה צריכה להיראות רעננה ולחותה, ללא חיוורון או לחץ. הימנע מקשירת התפר חזק מדי, שכן הדבר עלול לקרוס כלי דם או לעוות את העצב. לפני קשירת הקשר הסופי, ודא שקצות העצבים משוערים ללא מתח. אם יש צורך, הזיזו בעדינות את מיקום הגפה כדי לאפשר יישור טבעי במקום למשוך את העצב, שכן מתח מופרז עלול להגדיל את הסיכון לנוירומה או פיברוזיס.
  16. הנח 0.25 מיקרומום ML162 ב-DMSO מדולל ב-PBS על העצב הסיאטי התפור באמצעות מזרק. אפשר לטבול את עצב הסיאטי התפור בתרופה למשך דקה.
  17. הסר את ה-ML162 על ידי ספיגתו עם מטלית כותנה סטרילית.
  18. הניחו 500 מ"מ PEG במים מזוקקים, מחוממים מראש ל-37 מעלות צלזיוס, על עצב הסיאטי התפור באמצעות מזרק. אפשר לטבול את עצב הסיאטי התפור בתרופה למשך דקה.
    הערה: 500 mM של PEG הוא תמיסה צפופה שעלולה להפוך למוצקה בטמפרטורת חדר הניתוח. הנח את המזרק על כרית מחוממת במהלך ההפעלה כדי לוודא שה-PEG נשאר נוזלי. סבורים ש-PEG מקדם היתוך ממברנה על ידי הסרת מולקולות מים מבין שכבות ליפידים סמוכות, ובכך מאפשר מגע קרוב עם הממברנה והיתוך ספונטני. למרות שהמנגנון המולקולרי המדויק עדיין נמצא בבדיקה, הוכח כי גישה זו מסייעת בהמשכיות האקסונים ומשפרת התאוששות פונקציונלית במודלים של פגיעות עצבים פריפריים.
  19. הסר את ה-PEG על ידי ספיגתו באמצעות רקמה.
  20. שטוף את העצב התפור עם PBS המכיל Ca2+ (PBS בתוספת 1 mM CaCl2; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM בופר פוספט, pH7.4).
  21. הסר את ה-PBS המכיל Ca2+ על ידי ספיגתו עם רקמה.
  22. הניחו את העצב הסיאטי החשוף מתחת לשכבת השריר וסגרו את העור באמצעות תפרי ניילון 4-0.
  23. לאחר שהחיה החלימה מההרדמה, החזירו אותה לכלוב שלה.
    הערה: לאחר סגירת העור, אתר הניתוח טופל במשחה אנטיביוטית מקומית המכילה משכך כאבים. כל בעל חיים היה תחת פיקוח על כרית חימום עד שחזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבת עצם החזה. החיות אוחסנו בנפרד והוחזרו לקבוצתן רק לאחר התאוששות מלאה של תפקוד מוטורי. למרות שהסביבה הכירורגית לא נשמרה תחת מכסה זרימה למינרי, כל כלי הניתוח עברו סטריליזציה, וההליכים בוצעו בטכניקת אספטיקה עם ידיים מכוסות כפפות וכלים סטריליים.

2. מבחן התנהגות - פינק

הערה: להעריך את תגובתיות הרגישות המכאנית בסף גבוה לאחר פציעה33.

  1. הנח את העכבר ברשת רשת תיל ותן לו להסתובב בחופשיות במשך 30 דקות כדי להתרגל לסביבה החדשה.
  2. החלק הצידי ביותר של משטח כף הרגל האחורית חולק ל-5 אזורים (A עד E). מרחו בעדינות את האוסטרליץ (מידה 000) על פני כף הרגל המקסילטרית. הדקירה הונחה פעמיים מהבוהן הצידית ביותר (אזור A) ועד העקב (אזור E).
    הערה: אין לחדור לעור.
    הערה: תגובה נחשבה חיובית כאשר החיה הסירה במהירות את כפה משני הגירויים הדקדקים. העכבר קיבל דירוג 1 באזור זה ואז נבדק לאזור הבא (מקסימום 5). אם אף אחת מהבקשות לא גרמה לתגובה חיובית, הציון הכולל היה 0. השתמשו בשטח הספנוס של אותו צד איפסילטרלי כשליטה חיובית. זה תמיד יעורר תגובה חיובית.

3. מבחן התנהגות - אסימטריה של תקלה בכף הרגל (FF)

הערה: למדוד עד כמה אקסונים סיאטיים מעצבבים שרירים פרוקסימליים34.

  1. אפשר לבעלי החיים להסתובב בחופשיות על רשת רשת תיל מוגבהת על הכלוב כדי להתרגל לסביבה. ניסוי אחד כולל 50 צעדים בסך הכל לכל גפה אחורית.
  2. נקודות כשהחיות טועות. קריטריוני הניקוד הם כדלקמן.
    תוצאה 1: אשמה חלקית. משכה לאחור לפני שהרגל נפלה לגמרי עד הירך.
    תוצאה 2: אשמה מלאה. נפל לגמרי למפשעה.
  3. חשב את ציון התקלות המשולבת של כף הרגל מכל הגפיים האחוריות הפצועות והלא פצועות של בעלי החיים בכל זמן לאחר הניתוח.
    ציון תקלות רגל משולבות = (# תקלות חלקיות x 1) + (# תקלות מלאות x 2)
  4. חלק את ציון העתק המשולב ברגל ב-50 (סך כל צעדים/גפה) כדי לקבל את אחוז העתק עבור כל גפה אחורית.
    % טעות רגל = ציון שקלה משולבת ברגל / 50 (סך הצעדים) x 100%
  5. החסרו את הפגמים בכף הרגל בגפה האחורית הפגועה מהיחס של השברים בכף הרגל בגפה האחורית השלמה כדי לקבל ציון אסימטריה לכל בעל חיים בזמן נתון לאחר הניתוח.
    ציון אסימטריה של שבר בכף הרגל (FF) = %FF (גפה שלמה) - %FF (גפה פגועה)

4. מבחן התנהגות - פיזור האצבעות

הערה: להעריך התאוששות מוטורית לאחר פגיעת עצב. לפי מחקר קודם, מבחן המוטורי של פיזור האצבעות רגיש יותר מניתוח ההליכה כדי לאתר התאוששות תפקוד מוטורי לאחר פגיעת עצב סיאטי30.

  1. כסו בעדינות את החיה בחתיכת בד והרימו את הזנב לצפייה ברורה בכפות האחוריות.
    הערה: חלופה: תפסו בעדינות את עורף העכבר, תקנו את הזנב, הפכו אותו, וגרמו לעכבר להתפתל כדי לצפות בתנועת האצבעות.
  2. הענק את הציון לפיסת האצבעות כדלקמן:
    תוצאה 2: התפשטות מלאה. הגדר כהתפשטות מלאה, רחבה ומתמשכת של כל האצבעות למשך לפחות 2 שניות.
    תוצאה 1: התפשטות ביניים. כל תנועה שאינה מגיעה לציון מתפשט מלא. רעד קלות, או תנועה חלקית.
    תוצאה 0: אין התפשטות. אין שום תנועה.
    הערה: כל ההערכות ההתנהגותיות (דקירות, שבר כף הרגל והתפשטות האצבעות) נבדקו פעמיים על ידי חוקר שהיה עיוור לקבוצות טיפול. בעלי החיים חולקו באקראי לקבוצות טיפול בזמן הניתוח בהתאם לעיצוב ששימש במחקר הקודם שלנו (Ko ואח' 25), שכלל ארבעה מצבים ניסיוניים (תפר בלבד, PEG, ML162, ML162 + PEG). המאמר הנוכחי מציג נתונים מקבוצת ML162 + PEG, שנותחו באופן עצמאי תוך שמירה על הקפדנות הניסויית המקורית.

5. פרפוזיה ועיבוד רקמות להיסטולוגיה

  1. הרדמה עמוקה של בעל החיים וביצוע פרפוזיה טרנסקרדיאלית עם מי מלח עם פוספאט (PBS) דרך החדר השמאלי.
  2. חרטו את העלייה הימנית כדי לאפשר ניקוז דם מלא.
  3. טבלו את הרקמות שנאספו ב-4% פאראפורמלדהיד (PFA) בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה לקיבוע הרקמות.
  4. שטפו את הרקמות הקבועות שלוש פעמים עם PBS, ואז דגרו אותן ב-PBS בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה.
  5. הגנו על הרקמות על ידי טבילה בסוכרוז של 30% בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
  6. הטמיעו את הרקמות בתרכובת OCT, הקפיאו אותן וחתכו בעובי 12 מיקרון באמצעות קריוסטט.
  7. אחסן בלוקי רקמה בטמפרטורה של -80°C וכריחות קריואקטיביות ב-20-°C עד לשימוש.
  8. לגבי איסוף עצב סיאטי בלבד, יש להימנע מהפרפוזיה, שכן תכולת הדם אינה משפיעה משמעותית על איכות צביעת החיסון ברקמות היקפי אלו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול ה-PEG-fusionהקודם 18 שונה כדי לשמור על תוצאות ניתוח עקביות ולהפחית נזק עצבי שנגרם מתפר25. על ידי הנחת התפר לחדור דרך העצב לפני החתכה, הנזק שנגרם מצביטה עם פינצטה או דקירה במחט לאחר החתכה צומצם. כדי לבדוק את השפעת קשירת תפר החודר לעצב על תפקודו, התפר עבר פעמיים דרך עצב שלם וקשר אותו (איור 2A, תפר ללא SNT). התפרים שחדרו לעצב נצפו כלא יוצרים צלקת על העצב כאשר נבדקו 30 יום לאחר הניתוח (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרי רגנרציה עצבית באמצעות מודלים של חיתוך עצבי מבוצעים באופן נרחב על עצב סיאטיבעכבר 31,39. עם זאת, בשל גודלו הקטן ומרקמו הרך, עצב הסיאטיק של העכבר קשה לטיפול עדין עם כלי ניתוח, והרקמה נוטה לקריעה במהלך התפרה. תהליך המיקרו-תפר, שלרוב כולל מניפולציה מופרזת, עלול להוביל לעיוות עצבי ולטראומה. גם כאשר גירוי כלי מיותר מצטמצם, תנועה מופרזת של העצב התפור עדיין עלולה לגרום לסטיות יישור, מה שעלול לפגוע בהתאוששות התפקודית המוקדמת. משתנים ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי NIA R01AG070214 ל-L.C., NIA R01AG071591 ל-L.C., ועל ידי NIA 1R01AG085545 ל-L.C. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו בהכרח מייצג את עמדות ה-NIH הרשמיות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#55 מלקחייםדומוסטאר-ביולוגיה11295-51אחד בכל יד. תצטרך שתיים כדי לתפוס תפר ניילון 10-0.
תפר ניילון 10-0DemeTECHNL761000,4F0P
תפר ניילון 4-0מטריקס וויזארד0197
אנטי-בטא-טובוליןR& D SystemsMAB1195
אנטי-NF-200מיליפור סיגמאN4142
גודל אוסטרליץ 000עבור מבחן Pinpick
CF488 קוניגטיד-אלפא-בונגארוטוקסיןביוטיום00005
מספריים ניתוחיםקנט סיינטיפיק 
מספריים עדינים לתפירהקנט סיינטיפיק 
מלקחי איריסקנט סיינטיפיק 
ק & פד מחומם לבעלי חיים קטניםק & מוצרי חיות מחמד H
ML162מיליפור סיגמאSML2561
ערכת ניתוח עכבריםקנט סיינטיפיק 
מחזיק מחטקנט סיינטיפיק 
פוליאתילן גליקול (PEG)מיליפור סיגמאP5413
SCG10Novus BiologicalsNBP1-49461
SomnoSuiteקנט סיינטיפיק להרדמה איזופלורנית
מלקחי מפצלמשמש לחשיפת העצב הסיאטי.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akram, R., et al. Axonal Regeneration: Underlying molecular mechanisms and potential therapeutic targets. Biomedicines. 10 (12), 10123186(2022).
  2. Sutherland, T. C., Geoffroy, C. G. The influence of neuron-extrinsic factors and aging on injury progression and axonal repair in the central nervous system. Front Cell Dev Biol. 8, 190(2020).
  3. Farah, M. H., et al. Reduced BACE1 activity enhances clearance of myelin debris and regeneration of axons in the injured peripheral nervous system. J Neurosci. 31 (15), 5744-5754 (2011).
  4. Mahar, M., Cavalli, V. Intrinsic mechanisms of neuronal axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 19 (6), 323-337 (2018).
  5. He, Z., Jin, Y. Intrinsic control of axon regeneration. Neuron. 90 (3), 437-451 (2016).
  6. Tsao, J. W., George, E. B., Griffin, J. W. Temperature modulation reveals three distinct stages of Wallerian degeneration. J Neurosci. 19 (12), 4718-4726 (1999).
  7. Vargas, M. E., Barres, B. A. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annu Rev Neurosci. 30, 153-179 (2007).
  8. Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: Gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8, 110(2011).
  9. Hussain, G., et al. Current status of therapeutic approaches against peripheral nerve injuries: A detailed story from injury to recovery. Int J Biol Sci. 16 (1), 116-134 (2020).
  10. Raivich, G., Makwana, M. The making of successful axonal regeneration: genes, molecules and signal transduction pathways. Brain Res Rev. 53 (2), 287-311 (2007).
  11. Neumann, B., Linton, C., Giordano-Santini, R., Hilliard, M. A. Axonal fusion: An alternative and efficient mechanism of nerve repair. Prog Neurobiol. 173, 88-101 (2019).
  12. Hoy, R. R., Bittner, G. D., Kennedy, D. Regeneration in Crustacean Motoneurons: Evidence for axonal fusion. Science. 156, 251-252 (1967).
  13. Birse, S. C., Bittner, G. D. Regeneration of giant axons in earthworms. Brain Res. 113, 575-581 (1976).
  14. Murphy, A. D., Kater, S. B. Specific reinnervation of a target organ by a pair of identified molluscan neurons. Brain Res. 156, 322-328 (1978).
  15. Deriemer, S. A., Elliott, E. J., Macagno, E. R., Muller, K. J. Morphological evidence that regenerating axons can fuse with severed axon segments. Brain Res. 272, 157-161 (1983).
  16. Bedi, S. S., Glanzman, D. L. Axonal rejoining inhibits injury-induced long-term changes in aplysia sensory neurons in vitro. J Neurosci. 21 (24), 9667-9677 (2001).
  17. Neumann, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H., Ben-Yakar, A., Hilliard, M. A. Axonal regeneration proceeds through specific axonal fusion in transected C. elegans neurons. Dev Dyn. 240 (6), 1365-1372 (2011).
  18. Bittner, G. D., et al. effective, and long-lasting behavioral recovery produced by microsutures, methylene blue, and polyethylene glycol after completely cutting rat sciatic nerves. J Neurosci Res. 90 (5), 967-980 (2012).
  19. Bamba, R., et al. A novel therapy to promote axonal fusion in human digital nerves. J Trauma Acute Care Surg. 81, S177-S183 (2016).
  20. Borgens, R. B., Shi, R., Bohnert, D. Behavioral recovery from spinal cord injury following delayed application of polyethylene glycol. J Exp Biol. 205, 1-12 (2002).
  21. Kim, C. Y., et al. Accelerated recovery of sensorimotor function in a dog submitted to quasi-total transection of the cervical spinal cord and treated with PEG. Surg Neurol Int. 7 (Suppl 24), S637-S640 (2016).
  22. Kim, C. Y., Oh, H., Hwang, I. K., Hong, K. S. GEMINI: Initial behavioral results after full severance of the cervical spinal cord in mice. Surg Neurol Int. 7 (Suppl 24), S629-S631 (2016).
  23. Liu, Z., et al. Restoration of motor function after operative reconstruction of the acutely transected spinal cord in the canine model. Surgery. 163 (5), 976-983 (2018).
  24. Shi, R., Borgens, R. B. Acute repair of crushed cuinea pig spinal cord by polyethylene glycol. Am Physiol Soc. 81 (5), 2406-2414 (1999).
  25. Ko, S. H., et al. GPX modulation promotes regenerative axonal fusion and functional recovery after injury through PSR-1 condensation. Nat Commun. 16 (1), 1079(2025).
  26. Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anat Rec. 215 (1), 71-81 (1986).
  27. Swett, J. E., Torigoe, Y., Elie, V. R., Bourassa, C. M., Miller, P. G. Sensory neurons of the rat sciatic nerve. Exp Neurol. 114 (1), 82-103 (1991).
  28. Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: Implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
  29. Savastano, L. E., et al. Sciatic nerve injury: A simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. J Neurosci Methods. 227, 166-180 (2014).
  30. Bozkurt, A., et al. Aspects of static and dynamic motor function in peripheral nerve regeneration: SSI and CatWalk gait analysis. Behav Brain Res. 219 (1), 55-62 (2011).
  31. Lee, J. I., et al. A novel nerve transection and repair method in mice: histomorphometric analysis of nerves, blood vessels, and muscles with functional recovery. Sci Rep. 10 (1), 21637(2020).
  32. Moosmayer, D., et al. Crystal structures of the selenoprotein glutathione peroxidase 4 in its apo form and in complex with the covalently bound inhibitor ML162. Acta Crystallogr D Struct Biol. 77 (Pt 2), 237-248 (2021).
  33. Ma, C. H., et al. Accelerating axonal growth promotes motor recovery after peripheral nerve injury in mice. J Clin Invest. 121 (11), 4332-4347 (2011).
  34. Britt, J. M., et al. Polyethylene glycol rapidly restores axonal integrity and improves the rate of motor behavior recovery after sciatic nerve crush injury. J Neurophysiol. 104 (2), 695-703 (2010).
  35. Bittner, G. D., Schallert, T., Peduzzi, J. D. Degeneration, trophic interactions, and repair of severed axons: A reconsideration of some common assumptions. Neuroscientist. 6 (2), 88-109 (2000).
  36. Bittner, G. D., Ballinger, M. L., Raymond, M. A. Reconnection of severed nerve axons with polyethylene glycol. Brain Res. 367 (1-2), 351-355 (1986).
  37. Spaeth, C. S., Robison, T., Fan, J. D., Bittner, G. D. Cellular mechanisms of plasmalemmal sealing and axonal repair by polyethylene glycol and methylene blue. J Neurosci Res. 90 (5), 955-966 (2012).
  38. Spaeth, C. S., Boydston, E. A., Figard, L. R., Zuzek, A., Bittner, G. D. A model for sealing plasmalemmal damage in neurons and other eukaryotic cells. J Neurosci. 30 (47), 15790-15800 (2010).
  39. Félix, S. P., Pereira Lopes, F. R., Marques, S. A., Martinez, A. M. Comparison between suture and fibrin glue on repair by direct coaptation or tubulization of injured mouse sciatic nerve. Microsurgery. 33 (6), 468-477 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Sciatic Nerve TransectionNerve RepairFunctional RecoveryAxon RegenerationPeripheral Nerve InjuryDorsal Root GanglionMicrosuture TechniqueMuscle ReinnervationAxonal FusionBehavioral Assessment
Video Coming Soon

Related Articles