הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הזדקנות הנגרמת על ידי תרופות בתאי כבד מקדמת קיטוב מקרופאגים M2: השלכות על רעילות כבד הקשורה למעכב טירוזין קינאז

898 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68725

⸱

17 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, Shiv Nadar Institution of Eminence, 2Independent Researcher, 3Servier Institute of Translational Medicine

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו חוקרים רעילות כבד הנגרמת על ידי לפטיניב ונרטיניב באמצעות קיטוב מקרופאגים מונע SASP, המציע הבנה מכניסטית עמוקה יותר מעבר לבדיקות רעילות מסורתיות. גישה זו מדגימה כיצד הפטוציטים מזדקנים משפיעים על תגובות חיסוניות. זה חשוב במיוחד להערכת השפעות ארוכות טווח של תרופות וגילוי יעדים טיפוליים חדשים לניהול רעילות כבד הנגרמת על ידי תרופות.

תקציר

לפטיניב ונרטיניב הם מעכבי טירוזין קינאז (TKIs) המאושרים לטיפול בסרטן שד גרורתי חיובי ל-HER2, אך השימוש הקליני בהם מוגבל על ידי רעילות לכבד. בתוך הפטוציטים, אנזימי ציטוכרום P450 מייצרים מטבוליטים תגובתיים של תרופות אלה, וגורמים לנזק ל-DNA, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה ומתח חמצוני, המובילים לפגיעה בהפטוציטים. מתח תאי זה מעורר הזדקנות הפטוציטים, מצב של עצירת גדילה המלווה בהפרשת גורמים פרו-דלקתיים ועיצוב מחדש של רקמות הנקראים פנוטיפ הפרשה הקשור להזדקנות (SASP). SASP משנה באופן משמעותי את המיקרו-סביבה של הכבד, משפיע על התנהגות תאי החיסון ומחמיר את הנזק לרקמות. אנו מראים כי לפטיניב ונרטיניב גורמים להזדקנות ו-SASP בקו תאי הכבד HepG2. בנוסף, SASP מתאים מזדקנים אלה מקדם קיטוב דמוי M2 של מקרופאגים RAW264.7. למרות שמקרופאגים M2 קשורים לתגובות אנטי דלקתיות ולתיקון רקמות, פעילותם המוגזמת או הממושכת עלולה להוביל לנזק לרקמות ולפיברוזיס. הממצאים שלנו מדגישים מנגנון שבאמצעותו הזדקנות הפטוציטים הנגרמת על ידי TKI ו-SASP מווסתים את התגובה החיסונית ועשויים לתרום לרעילות הכבד בחולי סרטן השד. זה מדגיש את החשיבות של התמקדות בתאים מזדקנים או גורמי SASP כדי להפחית את רעילות הכבד ולשפר את תוצאות הטיפול, מה שהופך את הזיהוי של סנותרפיוטיקה יעילה למוקד מחקר חיוני. לא היה שום דוח ספרות המדגים את ההשפעה של הפרשת תאי כבד המושרה על ידי TKI על קיטוב מקרופאגים.

מבוא

לפטיניב ונרטיניב, שניהם מעכבי טירוזין קינאז במולקולות קטנות (TKI), קיבלו את אישור ה-FDA בשנים 2007 ו-2017, לטיפול בסרטן שד גרורתי1. תרופות אלו ידועות כמעכבות את קולטן גורם הגדילה האפידרמלי האנושי 2, HER22, קולטן טירוזין קינאז המתבטא יתר על המידה בסרטן שד מסוים3. למרות הצלחתם הקלינית, לפטיניב ונרטיניב קשורים גם לתופעות לוואי, במיוחד רעילות לכבד 4,5. פגיעה חריפה בכבד, המתבטאת ברמות גבוהות של אמינוטרנספראז, מתרחשת בכ-14% מהחולים העוברים טיפול בלפטיניב או בנראטיניב6. רעילות הכבד מיוחסת במידה רבה לחילוף החומרים בכבד של תרופות אלה, הכולל אנזימי ציטוכרום P450 (CYP), בעיקר CYP3A4/5 7,8. אנזימים אלה מזרזים את היווצרותם של חומרי ביניים קינון-אימין, שהם אלקטרופיליים ותגובתיים מאוד 9,10. מטבוליטים ריאקטיביים אלה, כולל לפטיניב O-dealkylated, N-dealkylated lapatinib, ו-N-hydroxy lapatinib, O-dealkylated neratinib ו-N-demethylated neratinib, יכולים ליצור תוספות קוולנטיות עם מקרומולקולות תאיות, ובכך לשבש את תפקודי התאים הרגילים ובסופו של דבר לגרום לפגיעה בכבד11.

מטבוליטים תגובתיים של לפטיניב ונרטיניב יכולים גם לגרום למתח חמצוני, טריגר מרכזי להזדקנות תאית12. הזדקנות תאית היא מצב עצור גדילה אך פעיל מטבולית, המאופיין בהפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים שונים, גורמי גדילה ופרוטאזות. פנוטיפ הפרשה זה ידוע כפנוטיפ הפרשה הקשור להזדקנות (SASP)13,14,15. ה-SASP יכול להשפיע עמוקות על המיקרו-סביבה שמסביב, ולעתים קרובות לקדם דלקת ועיצוב מחדש של רקמות. בהקשר של טיפול בסרטן, ה-SASP יכול להעשיר את אוכלוסיית תאי הגזע הסרטניים ולשנות את התגובה החיסונית לטובת הישרדות הגידול16. בנוסף, הציטוקינים הדלקתיים יכולים להחמיר את הנזק לרקמות. שיערנו כי בחולים שטופלו בלפטיניב ונרטיניב, הפגיעה בכבד תורמת בחלקה על ידי הזדקנות הנגרמת על ידי TKI וייצור SASP פרו-דלקתי.

הניסויים שלנו הראו כי לפטיניב ונרטיניב גורמים לייצור של מיני חמצן תגובתיים (ROS) בתאי הכבד, מה שמוביל לנזק ל-DNA ולתפקוד לקוי של המיטוכונדריה, אשר בתורו מעורר הזדקנות תאית. הזדקנות זו עשויה לתרום לרעילות כבד הנגרמת על ידי לפטיניב/נרטיניב על ידי שחרור גורמי SASP, שיכולים להשפיע על קיטוב המקרופאגים.

מקרופאגים ממלאים תפקיד קריטי בתגובה החיסונית, והפנוטיפ התפקודי שלהם יכול להשתנות בתגובה לגירויים שונים17,18. הפנוטיפ הקלאסי של מקרופאגים M1 קשור בדרך כלל לתגובות פרו-דלקתיות, כולל ייצור ציטוקינים כגון TNF-α ו-IL-1β, ונחשב בדרך כלל לסמן של דלקת חריפה19,20. לעומת זאת, פנוטיפ המקרופאגים M2 קשור לפיברוזיס, תיקון רקמות21, דיכוי חיסוני ותגובה לדלקת כרונית22,23. הציטוקינים הדלקתיים ב-SASP יכולים להשפיע על קיטוב המקרופאגים, ולקדם את ההמרה של מקרופאגים M1 לפנוטיפ דמוי M223. לשינוי זה בקיטוב יכולות להיות השלכות משמעותיות על המיקרו-סביבה החיסונית, מה שעלול להוביל לדיכוי חיסוני, התקדמות הגידול ועיצוב מחדש של ארכיטקטורת הרקמות.

כדי לחקור את הקיטוב של המקרופאגים המושרה על ידי לפטיניב ונרטיניב, השתמשנו בקו התאים RAW264.7, קו תאים דמוי מקרופאג עכברי המשמש בדרך כלל במחקר אימונולוגי24,25. תאי RAW264.7 נגזרים מעכברי BALB/c ונמצאים בשימוש נרחב לחקר דלקת, פגוציטוזיס ותגובות חיסוניות25. הם מגיבים לגירויים שונים, כולל ליפופוליסכרידים (LPS), והם בעלי ערך מיוחד לחקר תפקוד המקרופאגים, ייצור ציטוקינים וביולוגיה של הסרטן26. במחקר זה, HepG2, קו תאי הפטומה אנושי, טופל בלפטיניב ונרטיניב כדי לחקות את ההשפעות הכבדטוקסיות שנצפו בחולים. קו התאים HepG2 משמש לעתים קרובות כמודל מחקר מטבוליזם של תרופות ורעילות כבד בשל מקורו האנושי ושושלת קרצינומה של הכבד27. לאחר טיפול בתאי HepG2 עם TKIs, המדיה המותנית נאספה ונוספה לתאי RAW264.7. השינויים הפנוטיפיים של המקרופאגים שלאחר מכן נוטרו, תוך התמקדות בשאלה האם הטיפול גורם למעבר מפנוטיפ M1 פרו-דלקתי לפנוטיפ M2 מדכא חיסון.

רעילות כבד הנגרמת על ידי תרופות נחקרת בדרך כלל באמצעות מבחני ציטוטוקסיות, הערכת סמנים דלקתיים ושימוש במודלים של בעלי חיים. בהשוואה לאלה, לשיטה שלנו לבחינת רעילות כבד הנגרמת על ידי TKI lapatinib ו-neratinib באמצעות גורמי פנוטיפ הפרשה הקשורים להזדקנות (SASP) והשפעתם על קיטוב המקרופאגים יש מספר יתרונות. ראשית, השיטה שלנו מבססת קשר בין גורמי SASP המיוצרים על ידי תאי כבד מזדקנים המושרים על ידי תרופות לבין חסינות מולדת, אשר ניתן לקשר עוד יותר לעיצוב מחדש של רקמות, דלקת כרונית וסרטן 28,29,30,31. מסכי רעילות קונבנציונליים אינם יכולים לעזור לנו ללכוד את האינטראקציות קצרות הטווח בין הכבד לתאי החיסון, והם גם אינם יכולים לחשוף את ההשפעה ארוכת הטווח של TKIs על דלקת כבד ופיברוזיס, במיוחד בהקשר של חשיפה כרונית לתרופות. בשילוב עם גישת פרוטאומיקה מתאימה לזיהוי מרכיבי SASP, טכניקה זו יכולה לסייע בזיהוי סמנים ביולוגיים מנבאים של רעילות כבד הנגרמת על ידי TKI וליידע על תכנון התערבויות טיפוליות כדי להפחית אותה 29,30,31.

לצורך יישום, על החוקרים להשתמש בתרבית משותפת או במערכות מדיה מותנות עם קווי תאים בכבד ומערכת החיסון, כמתואר, ולהעריך סמנים ביולוגיים של הזדקנות כמו גם מקרופאגים M1 ו-M2. שיטה זו יעילה ביותר להערכת פגיעה חריפה או כרונית בכבד הנגרמת על ידי תרופות, או לבחינת אסטרטגיות למזעור ההשפעות החריגות של טיפולים בסרטן 29,30,31.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תרבית תאים

  1. תרבית תאי HepG2 ב-Modified Eagle Medium (MEM) גלוקוז גבוה עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ותאי RAW264.7 ב-Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco עם 10% FBS ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 ומרעננים כל 3 ימים.
    הערה: שימוש באנטיביוטיקה אינו מומלץ אלא אם כן יש זיהום פטרייתי או חיידקי. תאי RAW264.7 גדלים מהר מאוד ויש לעבור אותם לאחר יומיים.

2. בדיקת MTT

  1. ספירת תאים וציפוי תאים
    1. לגדל תאי HepG2 בצלחת תרבית של 60 מ"מ באינקובטור תרבית תאים במצעי גידול מלאים (MEM + 10% FBS).
    2. כאשר התאים היו כ-80% מתלכדים, הסר את אמצעי הגידול, שטוף במהירות עם 1 מ"ל של 1x PBS, והוסף 600 מיקרוליטר של 0.5x טריפסין. דגירה למשך 5-6 דקות.
      הערה: יש לבצע את כל השלבים בארון תרבית תאים BSL 2.
    3. נטרל טריפסין על ידי הוספת 1.2 מ"ל של מצע גידול שלם בתוך BSL 2.
      הערה: כדי למנוע טריפסיניזציה יתר, יש להוסיף מדיה מלאה, פי שניים מנפח הטריפסין הנוסף.
    4. קח את תרחיף התא בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 5 מ"ל (MCT) וגלגל אותו למטה על ידי צנטריפוגה ב-180 גרם (1000 סל"ד) למשך 3-4 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    5. השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את כדור התא ב-1 מ"ל של מדיה, פיפטה לערבב כתרחיף תא בודד וספרו באמצעות המוציטומטר תחת מיקרוסקופ.
    6. לאחר מכן, צלחו תאי HepG2 בצלחת של 96 בארות ב-5000-7000 תאים לבאר, במצע גידול מלא, במשולש לכל מנת תרופה, ושמרו באינקובטור למשך 12-16 שעות.
      הערה: מפגש תאים צריך להיות 50-60% לטיפול תרופתי, ושלב זה צריך להתבצע בתוך מכסה המנוע.
  2. טיפול תרופתי
    1. הכן ריכוזי עבודה הולכים וגדלים בהדרגה של לפטיניב ונרטיניב בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) מריכוז המלאי (30 מ"מ ו-3.5 מ"מ, בהתאמה) בתוך מכסה המנוע. הריכוזים הסופיים הם 1, 2.5, 5, 10, 15, 25, 50 מיקרומטר עבור לפטיניב ו- 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10 מיקרומטר עבור נרטיניב במצעי גידול (MEM + 5% FBS). שמור על בקרה אחת ללא טיפול לשתי התרופות.
    2. השליכו את המדיה הקודמת מצלחת 96 הבארות המכילה תאים, והוסיפו 100 מיקרוליטר של מדיה עם התרופה ודגרו במשך 48 שעות בתוך החממה.
  3. צביעה וכימות
    1. לאחר 48 שעות, יש להוסיף 10 מיקרוליטר של צבע 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT; 5 מ"ג/מ"ל), להמיס במי מלח 1x פוספט (PBS) בכל באר, ולדגור לפחות שעתיים בתוך החממה עד להופעת גבישים בצבע סגול.
      הערה: הוסף את הצבע ישירות למדיה המכילה תרופות ואל תדגור תאים עם צבע במשך יותר מ-4 שעות.
    2. לאחר הדגירה, הסר את הצבע, ממיס את הגבישים ב-100 מיקרוליטר של DMSO בכל באר, ודגירה למשך 15 דקות, ולאחר מכן לקיחת הצפיפות האופטית (OD) ב-595 ננומטר.
      הערה: ניתן לבצע שלב זה מחוץ למכסה המנוע.

3. בדיקת SA-β גלקטוזידאז

  1. טיפול תרופתי
    1. צלחת תאי HepG2 בכלים של 35 מ"מ בצפיפות של 40 x 104 תאים לצלחת בשלוש קבוצות, אחת ללפטיניב, אחת לנרטיניב וביקורת אחת לא מטופלת.
      הערה: שלבי ספירת התאים והציפוי הם כמתואר בשלב 2.1.
    2. הוסף 1 מיקרוליטר של לפטיניב ממלאי עבודה של 5 מ"מ ו-1.43 מיקרוליטר של נרטיניב ממלאי עיקרי של 3.5 מ"מ ב-2 מ"ל של מדיה כדי ליצור ריכוז סופי של 2.5 מיקרומטר (מינון תת-קטלני) של לפטיניב ונרטיניב.
      הערה: מינון התרופה התת-קטלנית נבחר בהתאם לגרף הישרדות התא בבדיקת MTT.
    3. הסר את המדיה הקודמת מהכלים ושטוף עם 500 מיקרוליטר של 1x PBS פעם אחת, והוסף מדיה המכילה תרופות (בתוך מכסה המנוע) ושמור למשך 48 שעות בתוך החממה.
  2. תיקון ומכתים
    1. לאחר 48 שעות, הסר את התרופה, שטוף במהירות עם 500 מיקרוליטר של 1x PBS פעם אחת, ותקן עם 1.5 מ"ל של 2% פורמלדהיד ו-0.2% גלוטראלדהיד ב-1x PBS למשך 10 דקות ב-RT.
    2. לאחר הקיבוע, שטפו את הצלחות עם 1 מ"ל של 1x PBS פעמיים וודאו שתמיסת הקיבוע מוסרת כהלכה. הוסף 1.5 מ"ל של תמיסת צביעה (40 מ"מ חומצת לימון/מאגר Na-פוספט, 5 מ"מ K4 [Fe(CN)6], 5 מ"מ K3 [Fe(CN)6], 150 מ"מ NaCl, 2 מ"מ MgCl 2, 1 מ"ג/מ"ל X-gal במים חיטוי) ודגירה למשך 8 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ללא CO2.
      הערה: תקופת הדגירה עשויה להשתנות בהתאם לסוג התא; עבור HepG2, תקופת הדגירה לא תעלה על 8 שעות.
    3. לאחר הצביעה, שטפו את הצלחות במהירות ב-1 מ"ל של 1x PBS פעמיים וצלמו תמונות שדה בהיר בהגדלה של פי 20 ו-40x עם מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי. לכוד לפחות ארבעה עד חמישה שדות עבור כל קבוצת טיפול.
      הערה: נפח תמיסת הקיבוע והצביעה ישתנה בהתאם לגודל הצלחת, וכל השלבים עשויים להתבצע מחוץ למכסה המנוע.
  3. כימות תמונה
    1. צלם תמונה משדה אחד, ספור את מספר התאים הכולל וכן את התאים המציגים אות כחול. חישוב ידני של אחוז התאים עם אות כחול. חשב לפחות ארבע תמונות, קח את הממוצע, שרטט בגרף גיליון אלקטרוני וערוך מבחן t.

4. זיהוי ROS

  1. ציפוי תאים וטיפול תרופתי
    1. צלחת תאי HepG2 בכלי זכוכית תחתית זכוכית 35 מ"מ בצפיפות של 40 x 104 תאים לצלחת בשלוש סטים: אחד ללפטיניב, אחד לנרטיניב ואחד ביקורת לא מטופלת.
      הערה: שלבי ספירת התאים והציפוי הם כמתואר בשלב 2.1.
    2. עקוב אחר אותה אסטרטגיית טיפול כמתואר בשלב 3.1.
  2. צביעה והדמיה
    1. לאחר 48 שעות של טיפול, הוסף מגיב אדום עמוק ROX של תא 2 מיקרומטר (מלאי 5 מ"מ), 1 מיקרומטר Mito Tracker Green (מלאי 1 מ"מ) למשך 30 דקות, וצבע נגד עם צבע צביעה גרעיני 500 ננומטר Hoechst (מלאי 500 מיקרומטר).
      הערה: יש להוסיף צבע בתוך מכסה המנוע, ולהימנע מחשיפה ישירה לאור. צביעה נגדית נעשית על ידי הוספת צבע צביעה גרעיני Hoechst במהלך מתן צבעים אחרים.
    2. לאחר 30 דקות, הסר את הצבע ושטוף עם 1x PBS כדי להסיר עודפי צבע ותמונה עם מיקרוסקופ קונפוקלי בהגדלה של פי 100 (אורך גל עירור של 640 ננומטר, 488 ננומטר ו-405 ננומטר, בהתאמה).
  3. כימות תמונה
    1. כמת את האות של תא ROX אדום באמצעות תוכנת Fiji ImageJ והשווה אותו לאות של הבקרה הלא מטופלת. השתמש בירוק MitoTracker כדי לציין שהאות מקורו במיטוכונדריה. לאחר התוויית גרפי העמודות עם ערכים ממוצעים, ערוך מבחן t.

5. אוסף מדיה מותנית (CM).

  1. טפל בתאי HepG2 עם 2.5 מיקרומטר של לפטיניב או נרטיניב למשך 48 שעות (אסטרטגיית טיפול דומה לשלב 3.1, למעט ניסוי זה, צלחת 70x104 תאים בצלחת 60 מ"מ).
  2. לאחר 48 שעות, הסר את התרופה ושטוף עם 500 מיקרוליטר של 1x PBS פעם אחת.
  3. ביום ההזדקנות המקסימלי (לאחר 48 שעות של טיפול תרופתי), הוסף 4 מ"ל של חומר MEM נטול סרום (ללא FBS או כל תוסף אחר) לתאים שטופלו בתרופה וכן לביקורת הלא מטופלת למשך 48 שעות.
    הערה: נפח המדיה ללא סרום יהיה תלוי בגודל הצלחת.
  4. לאחר מכן, אסוף את המדיה נטולת הסרום המכילה את כל ה-secretome, המכונה מדיה מותנית, ואחסן ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
    הערה: לאחר איסוף ה-CM, יש לצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-2800 גרם (4000 סל"ד) כדי להסיר תאים מתים ופסולת תאית אחרת. תאי RAW264.7 מתורבתים בדרך כלל ב-DMEM, אך CM נאסף ב-MEM בהתאם לתנאי תרבית HepG2. כדי לשמור על תאימות, יש לערבב מדיה מותנית עם DMEM ללא סרום ביחס של 1:1 לפני הדגירה של RAW264.7.

6. קיטוב M1/M2 ב-RAW264.7

  1. ציפוי תאים
    1. עקוב אחר ספירת התאים וציפוי התאים כמתואר בשלב 2.1, למעט שלב הטריפסיניזציה. תוך כדי ניסיון תאי RAW264.7, הוסף 600-700 מיקרוליטר של 0.5x טריפסין, דגירה למשך 15-20 דקות בחממה, ולנטרול טריפסין, הוסף 2 מ"ל של מצע גידול (DMEM + 10% FBS) וצלחת 70x104 תאים בצלחת 60 מ"מ בשלוש קבוצות: לפטיניב, נרטיניב וביקורת אחת לא מטופלת.
  2. אינדוקציה RAW264.7
    1. הסר את אמצעי הגידול הרגיל, שטוף עם 1 מ"ל של 1x PBS פעם אחת, והוסף את ה-CM המתאים למשך 48 שעות.
      הערה: לפני הוספת ה-CM, הקפד לרכך אותו עם DMEM ללא סרום ביחס של 1:1, מכיוון שתאי RAW264.7 גדלים ב-DMEM, כך ששמירה על התאים ב-MEM תגרום ללחץ, שעלול לפגוע בתוצאה. תרבית RAW264.7 ב-CM (מדיה נטולת סרום) במשך 48 שעות עלולה גם היא לגרום ללחץ; במקרה כזה, ניתן לבצע דגירה של 24-30 שעות לפני איסוף הנתונים.
    2. לאחר הדגירה, השליכו את ה-CM, שטפו עם 1 מ"ל של 1x PBS, הוסיפו 600 מיקרוליטר טריפסין בכל צלחת, דגרו למשך 10 דקות ולאחר מכן גלולו ב-180 גרם (1000 סל"ד) למשך 3 דקות ב-RT. השתמש בגלולה לטיהור חלבון או אחסן אותה ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
      הערה: זמן הטריפסיניזציה ישתנה בהתאם לסוג התא, וצנטריפוגה אינה מומלצת מעל 180 גרם.
  3. בידוד חלבונים והכתמה מערבית
    1. הכן את מאגר הליזיס על ידי ערבוב מאגר ליזה של בדיקת רדיו-אימונו-משקעים (RIPA) וקוקטייל מעכב פרוטאז ביחס של 100:1. הוסף את מאגר הליזיס לכדור התא, השהה מחדש ודגר על קרח למשך 30 דקות.
      הערה: נפח מאגר הליזיס ישתנה בהתאם לגודל לוח התאים, וניתן לבצע ליזה מחוץ למכסה המנוע. אם הגלולה מאוחסנת בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, תחילה יש להפשיר את הגלולה על קרח, לתת סיבוב קצר ולהסיר את כל המדיה שנותרה.
    2. לאחר הדגירה, סובב את התא ליזאט ב -20,000 גרם למשך 30 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. אספו את הסופרנטנט והמשיכו לכתם המערבי, או אחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
    3. הכן דגימת חלבון על ידי נטילת 35-40 מיקרוגרם חלבון, הוסף צבע טעינה 1x, חמם למשך 5-6 דקות ב-95 מעלות צלזיוס, הפעל SDS-PAGE (10% ו-12% ג'ל אקרילאמיד) ב-90 וולט, והעביר לקרום הניטרוצלולוזה.
    4. הערה: למידע מפורט יותר על הכתם המערבי, עיין ב-Joubert et al.32.
    5. בדוק את הביטוי של סמני הקיטוב M1 ו-M2, באמצעות פיתוח הכתם באמצעות מפתח פרוקסידאז חזרת (HRP), iNOS (M1) ו-arginase1 (M2), בהתאמה, על ידי שימוש בנוגדנים נגד NOS2 ואנטי-ARG1.
      הערה: הריכוז של שני הנוגדנים הראשוניים, anti-NOS2 ו-anti-ARG1 הוא 1:1000, והנוגדן המשני נגד ארנב הוא 1:10,000.
  4. קיטוב מקרופאגים באמצעות LPS ו-IFN-γ
    1. צלחת 70 x 104 תאים RAW264.7 בשתי צלחות 60 מ"מ.
      הערה: הליך הציפוי דומה לשלב 6.1.
    2. לאחר 12-16 שעות, מערבבים 4 מיקרוליטר של 1 מיקרוגרם/מ"ל ליפופוליסכריד (LPS, ריכוז המלאי הוא 1 מ"ג/מ"ל) ו-1.33 מיקרוליטר של 33 ננוגרם/מ"ל אינטרפרון-γ (IFN-γ, ריכוז המלאי הוא 100 מיקרוגרם/מ"ל) ב-4 מ"ל של מצע גידול (DMEM + 10% FBS) ומוסיפים ל-RAW264.7 המצופה מראש, תוך שמירה על בקרה אחת ללא השראה.
    3. לאחר 48 שעות, אספו את כדורית התא באמצעות טריפסיניזציה, בודדו חלבון, הריצו כתם מערבי ובדקו את הביטוי של iNOS (M1) ו-ARG1 (M2), בהתאמה, על ידי שימוש בנוגדנים נגד iNOS ואנטי-ARG1.
      הערה: יש להשליך את כל פסולת תרבית התאים והפסולת הביוכימית לפח סכנה ביולוגית, לבצע חיטוי כראוי ולאחר מכן להשליך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סדרה של בדיקות נערכה כדי להעריך את ההשפעה של TKI lapatinib ו-neratinib על תאי קרצינומה הפטו-תאית (HepG2) והשפעותיהם הפרקריניות במורד הזרם על מקרופאגים. תאי HepG2 טופלו בריכוזים משתנים של לפטיניב או נרטיניב, וכדאיות התאים נמדדה לאחר 48 שעות באמצעות בדיקת MTT (איורים 1A,B). בהתבסס על עקומות ההישרדות, נבחר מינון תת-קטלני של 2.5 מיקרומטר לניסויים נוספים.

ריכוז זה הצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המחקר הנוכחי בוחן את ההשפעות העקיפות של טיפול בלפטיניב או נרטיניב על קיטוב מקרופאגים באמצעות מדיה מותנית שנאספה מתאי כבד HepG2 שטופלו ב-TKI. תוך שימוש במקרופאגים RAW264.7, אנו צופים בפנוטיפ M2 בעת חשיפה למדיה המותנית, כפי שמצוין על ידי הוויסות המוגבר של ARG1. מבחינה מורפולוגית, המקרופאגים המטופלים הציגו צורה מוגדלת ומוארכת אופיינית, התומכת עוד יותר באינדוקציה של מצב דמוי M2. להלן, אנו דנים בשלבים הקריטיים של הפרוטוקול, שינויים פוטנציאליים, פתרון בעיות, מגבלות והשוואות לשיטות קיימות.

...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם ניגוד אינטרסים.

תודות

המחברים מודים למוסד המכובד של שיב נאדר על תמיכת התשתיות. מחקר זה ממומן על ידי מענק המחלקה למדע וטכנולוגיה CRG/2022/003242.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קו תאים HepG2NCCSקו תאים דבק
קו תאים RAW264.7NCCSקו תאים דבק
DMEM (מדיום הנשר המותאם של דולבאקו)הימדיהAT066סוכר גבוה, אבקה
MEM (Modified Eagle Mediumגיבקו611100-053אבקה
PBS (מלח בופר פוספט)הימדיהTS1101אבקה
פתרון Trypsin-EDTAהימדיהTCL007תמיסה
FBS (סרום בקר עוברי)הימדיהRM1112נוזל
MTT DyeהימדיהTC191אבקה
לפטיניבסלקכםS2111אבקה
נראטיניבחברת קיימן כימיקלים18404אבקה
DMSO (דימתיל סולפוקסיד) הימדיהTC185תמיסה
פורמלדהיד רנקםF0080תמיסה
גלוטראלדהידסיגמא-אלדריץ'340855תמיסה
חומצה ציטרית מונוהידראט, טהורהימדיהGRM229אבקה
נתרן פוספט דיביסיקלי אנהידרוסי הימדיהMB024אבקה
פרוציאניד אשלגן, K4[Fe(CN)6]פישר סיינטיפיק  P-236-500
פריציאניד אשלגן, K3[Fe(CN)6]פישר סיינטיפיק  P-232-500
NaClSRL41721אבקה
MgCl2 הקשהידרטהימדיהGRM-1068אבקה
X-GalSRL45904אבקה
ליפופוליסכרידסיגמא-אלדריץ'L6529
אינטרפרון-וגמא רקומביננטים אנושיים;הימדיהCF040-20MCG
תגובת CELL ROX באדום עמוקתרמודפישר סיינטיC10422
הוכסטInvitrogen, תרמו פישר סיינטיפיקH3570אבקה
MitoTRACKER ירוקInvitrogen, תרמו פישר סיינטיפיק1842298אבקה
נוגדן אנטי-ARG1זיקהDF6657תמיסה, MW מחושב - 35kDa, MW נצפתה - 65kDa
נוגדן אנטי-NOS2קלאודו קלון קורפ.PAA837Hu01תמיסה, מחושבת MW - 130kDa, MW נצפתה - 65kDa
נוגדן אנטי-iNOSזיקהתמיסה, חישוב MW - 130kDa, MW נצפתה - 120kDa
נוגדן אנטי-GAPDHביובהארטי למדעי החיים Pvt.LtdBB-AB0060תמיסה
נוגדן אנטי-ארנבחברת קיימן כימיקלים10004301תמיסה
ממברנת ניטרוצלולוז  מרק מיליפור בע"מ;HATF00010 (מספר מוצר)
femtoLUCENTTMPLUS HRPG Bioscience 786-003
צלחות 60 מ"מנאק150462
לוח 96 באר,  נאק165306
חממת תרבית תאים תרמו פישר סיינטיפיק371
מיקרוסקופ 1. מיקרוסקופ הפוך LEICA     2. מיקרוסקופ קונפוקלי ניקון 1. DMIL LED        2. Ti2E, A1R  שניהם הם מספר דגם
מערכת ההדמיה iBrightInvitrogen, תרמו פישר סיינטיפיקCL1500 (מספר דגם)
קורא לוחותביו-RADקורא המיקרופלט של iMark
צנטריפוגה תרמו פישר סיינטיפיקסורוול ST 8R (מספר דגם)

מקורות

  1. Xuhong, J. C., Qi, X. W., Zhang, Y., Jiang, J. Mechanism, safety and efficacy of three tyrosine kinase inhibitors lapatinib, neratinib and pyrotinib in HER2-positive breast cancer. Am J Cancer Res. 9 (10), 2103-2119 (2019).
  2. Yang, X., Wu, D., Yuan, S. Tyrosine kinase inhibitors in the combination therapy of HER2-positive breast cancer. Technol Cancer Res Treat. 19, 1533033820962140(2020).
  3. Slamon, D. J., et al. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 235 (4785), 177-182 (1987).
  4. Viganò, M., et al. Hepatotoxicity of small molecule protein kinase inhibitors for cancer. Cancers (Basel). 15 (6), 1766(2023).
  5. Chan, A., et al. Final efficacy results of neratinib in HER2-positive hormone receptor-positive early-stage breast cancer from the Phase III ExteNET trial. Clin Breast Cancer. 21 (1), 80-91.e87 (2021).
  6. Hoofnagle, J. H., Serrano, J., Knoben, J. E., Navarro, V. J. LiverTox: a website on drug-induced liver injury. Hepatology. 57 (3), 873-874 (2013).
  7. Guengerich, F. P. Cytochrome P-450 3A4: regulation and role in drug metabolism. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 39, 1-17 (1999).
  8. Jackson, K. D., Durandis, R., Vergne, M. J. Role of cytochrome P450 enzymes in the metabolic activation of tyrosine kinase inhibitors. Int J Mol Sci. 19 (8), 2367(2018).
  9. Paludetto, M. N., Puisset, F., Chatelut, E., Arellano, C. Identifying the reactive metabolites of tyrosine kinase inhibitors in a comprehensive approach: implications for drug-drug interactions and hepatotoxicity. Med Res Rev. 39 (6), 2105-2152 (2019).
  10. Kalgutkar, A. S., Dalvie, D. K. Drug discovery for a new generation of covalent drugs. Expert Opin Drug Discov. 7 (7), 561-581 (2012).
  11. Andreu, I., et al. Protein binding of lapatinib and its N- and O-dealkylated metabolites interrogated by fluorescence, ultrafast spectroscopy and molecular dynamics simulations. Front Pharmacol. 11, 576495(2020).
  12. Lin, W., et al. Promoting reactive oxygen species accumulation to overcome tyrosine kinase inhibitor resistance in cancer. Cancer Cell Int. 24 (1), 239(2024).
  13. Choi, Y. W., et al. Senescent tumor cells build a cytokine shield in colorectal cancer. Adv Sci (Weinh). 8 (4), 2002497(2021).
  14. Birch, J., Gil, J. Senescence and the SASP: many therapeutic avenues. Genes Dev. 34 (23-24), 1565-1576 (2020).
  15. Dong, Z., et al. Cellular senescence and SASP in tumor progression and therapeutic opportunities. Mol Cancer. 23 (1), 181(2024).
  16. Salminen, A., Kauppinen, A., Kaarniranta, K. Emerging role of NF-κB signaling in the induction of senescence-associated secretory phenotype (SASP). Cell Signal. 24 (4), 835-845 (2012).
  17. Lichtnekert, J., Kawakami, T., Parks, W. C., Duffield, J. S. Changes in macrophage phenotype as the immune response evolves. Curr Opin Pharmacol. 13 (4), 555-564 (2013).
  18. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat Immunol. 12 (11), 1035-1044 (2011).
  19. Wang, N., Liang, H., Zen, K. Molecular mechanisms that influence the macrophage M1-M2 polarization balance. Front Immunol. 5, 614(2014).
  20. Tardito, S., et al. Macrophage M1/M2 polarization and rheumatoid arthritis: a systematic review. Autoimmun Rev. 18 (11), 102397(2019).
  21. Novak, M. L., Koh, T. J. Macrophage phenotypes during tissue repair. J Leukoc Biol. 93 (6), 875-881 (2013).
  22. Kanterman, J., Sade-Feldman, M., Baniyash, M. New insights into chronic inflammation-induced immunosuppression. Semin Cancer Biol. 22 (4), 307-318 (2012).
  23. Mazzoni, M., et al. Senescent thyrocytes and thyroid tumor cells induce M2-like macrophage polarization of human monocytes via a PGE2-dependent mechanism. J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 208(2019).
  24. Hartley, J. W., et al. Expression of infectious murine leukemia viruses by RAW264.7 cells, a potential complication for studies with a widely used mouse macrophage cell line. Retrovirology. 5, 1(2008).
  25. Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogenesis study: phenotype and stimuli. J Cell Mol Med. 23 (5), 3077-3087 (2019).
  26. Li, Y., et al. D(-)-Salicin inhibits the LPS-induced inflammation in RAW264.7 cells and mouse models. Int Immunopharmacol. 26 (2), 286-294 (2015).
  27. Castell, J. V., Jover, R., Martínez-Jiménez, C. P., Gómez-Lechón, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
  28. Huang, Y., et al. The hepatic senescence-associated secretory phenotype promotes hepatocarcinogenesis through Bcl3-dependent activation of macrophages. Cell Biosci. 11 (1), 173(2021).
  29. Wang, B., Han, J., Elisseeff, J. H., Demaria, M. The senescence-associated secretory phenotype and its physiological and pathological implications. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (12), 958-978 (2024).
  30. Ohtani, N. The roles and mechanisms of senescence-associated secretory phenotype (SASP): can it be controlled by senolysis. Inflamm Regen. 42 (1), 11(2022).
  31. Cuollo, L., Antonangeli, F., Santoni, A., Soriani, A. The senescence-associated secretory phenotype (SASP) in the challenging future of cancer therapy and age-related diseases. Biology (Basel). 9 (12), 485(2020).
  32. Joubert, O., Nehmé, R., Bidet, M., Mus-Veteau, I. Heterologous expression of human membrane receptors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 601, 87-103 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

הזדקנות תאי כבדמעכבי טירוזין קינאזמנגנוני רעילות כבדיתפנוטיפ הפרשה הקשור להזדקנותתאי HepG2מדיה מותניתמיני חמצן רדיקלייםWestern Blotting
הזדקנות הנגרמת על ידי תרופות בתאי כבד מקדמת קיטוב מקרופאגים M2: השלכות על רעילות כבד הקשורה למעכב טירוזין קינאז
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.