מאמר שיטה

תכנות מחדש של תאי גידול לתאים דמויי תאים דנדריטיים קונבנציונליים מסוג 1

DOI:

10.3791/68739

⸱

1 באוגוסט 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Medicine and Gene Therapy, Science for Life Laboratory, Lund Stem Cell Centre, Lund University, 2Wallenberg Centre for Molecular Medicine, Lund University, 3Centre for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר תכנות מחדש in vivo של תאי סרטן עכבר לתאים דמויי דנדריטי מסוג 1 בתוך מיקרו-סביבת הגידול באמצעות ביטוי מאולץ של גורמי השעתוק PU.1, IRF8 ו-BATF3.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היעילות של אימונותרפיה לסרטן מסתמכת על גיוס והפעלה של תגובות תאי T ציטוטוקסיות כנגד גידולים מוצקים על ידי תאים דנדריטיים קונבנציונליים מסוג 1 (cDC1s). עם זאת, יצירת cDC1s לאימונותרפיה של סרטן מתמודדת עם מגבלות משמעותיות, כולל תפוקת תאים ירודה, הטרוגניות תפקודית ורגישות לדיכוי חיסוני במיקרו-סביבת הגידול (TME). לאחרונה פיתחנו שיטת אימונותרפיה המבוססת על תכנות מחדש in vivo של תאים סרטניים לתאים דמויי cDC1 אימונוגניים, שאפשרו לתאים סרטניים להציג אנטיגנים של גידול כ-cDC1s ועוררו תגובות תאי T ציטוטוקסיים רב-שבטיים וחסינות מערכתית עמידה נגד גידולים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ניתן לביצוע ליצירת תאים דמויי cDC1 בתוך ה-TME על ידי ביטוי יתר של רשת ויסות הגנים המינימלית הספציפית ל-cDC1 - PU.1, IRF8 ו-BATF3 (המכונה ביחד PIB) - בתאי סרטן, ואחריו השתלה תת עורית של תערובת של תאים מותמרים ותאי הורים. ביטוי יתר של PIB מניע את הרכישה ההדרגתית של הסמן ההמטופויאטי CD45 וקומפלקס הצגת האנטיגן המקצועי MHC Class II על תאי גידול, המשמשים כקריאות פני התא לתכנות מחדש של cDC1 in vivo . בהשוואה לתהליך התכנות מחדש במבחנה, תכנות מחדש של מודל המלנומה של העכבר YUMM1.7 in vivo הדגים קינטיקה מהירה יותר ויעילות גבוהה יותר. תאים דמויי cDC1 גרמו לעיצוב מחדש מהיר של ה-TME על ידי גיוס תאי חיסון מארחים במהלך 3 הימים הראשונים והובילו להיווצרות מבנה לימפואיד שלישוני עד היום התשיעי. תאים דמויי cDC1 שתוכנתו מחדש המשיכו להתקיים בגידולים במשך 9 ימים לפחות, אך לא זוהו ביום ה-15. פרוטוקול התכנות מחדש in vivo cDC1 המתואר כאן מספק שיטה ניתנת לביצוע וחזקה להפיכה יעילה של גידולים "קרים ממערכת החיסון" ל"חמים ממערכת החיסון". בסך הכל, הוא מציע פלטפורמה רבת עוצמה לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס חסינות אנטי-גידולית בתיווך cDC1 ולחשוף שילובים סינרגטיים עם שיטות אימונותרפיה אחרות לסרטן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתקדמות האחרונה בשיטות אימונותרפיה לסרטן, כולל חסימת מחסום חיסוני (ICB), טיפול בתאים מאמצים (ACT) וחיסונים, שינו את נוף הטיפול בסרטן1. במלנומה, שיעורי התגובה לחלבון מוות תאי מתוכנת 1 (PD-1) ולעיכוב חלבון 4 הקשור ללימפוציטים מסוג T ציטוטוקסי (CTLA-4) יכולים להגיע עד 60%2. עם זאת, למעלה מ-40% מחולי המלנומה אינם מגיבים ל-ICB, ושיעורי התגובה בסרטן פחות אימונוגני, כגון סרטן השד, סרטן המעי הגס וגליובלסטומה, נותרו מתחת ל-5%, מה שמדגיש את הפערים הקליניים 3,4,5. מחסום עיקרי להצלחה קלינית רחבה הוא הפעלה לקויה של תגובות תאי T ציטוטוקסיות, התלויות בהצגת אנטיגן יעילה בתוך המיקרו-סביבה של הגידול (TME)6.

תאים דנדריטיים קונבנציונליים מסוג 1 (cDC1s) הם נדירים, אך הכרחיים להתחלת חסינות ספציפית לגידול, ומציעים שלושה אותות מפתח לתגובות תאי T: (1) עיבוד מקצועי והצגה של אנטיגנים על קומפלקסים עיקריים של תאימות היסטולוגית (MHC) Class I ו-II, (2) גירוי משותף באמצעות CD80 ו-CD86, ו-(3) איתות ציטוקינים פרו-דלקתיים כולל IL-12 7,8. בין תת-הקבוצות של התאים הדנדריטים (DC), cDC1s מצטיינים בהצגה צולבת של אנטיגנים הקשורים לתאי גידול כדי להפעיל מחדש תאי CD8+ T של זיכרון או להניע התמיינות של תאי CD4+ T לתאי T מסוג 1 T (TH1)9. בנוסף, cDC1s הם היצרנים העיקריים של כימוקינים, ליגנדים כימוקינים מוטיב C-X-C 9 ו-10 (CXCL9/10), המתווכים גיוס תאי T לרקמת הגידול 10,11,12,13. במהלך השנים האחרונות, מחקרים רבים הדגישו כי דחיית הגידול ותגובות יעילות ל-ICB או ACT קשורות מאוד לנוכחות cDC1s תוך-גידולי12,13. לפיכך, cDC1s התפתחו כיעד אטרקטיבי לאימונותרפיה לסרטן ורתימת התכונות הייחודיות שלהם יכולה להיות בעלת פוטנציאל תרגומי משמעותי.

השיטות הנוכחיות ליצירת cDC1s מבוססות על בידוד דם או התמיינות מאבות CD34+ או תאי גזע פלוריפוטנטיים 14,15,16. האסטרטגיות הקליניות השולטות מסתמכות על בידוד תערובת של תת-קבוצות DC אוטולוגיות מהדם וגירויים ex vivo עם אגוניסטים של קולטנים דמויי טול או ציטוקינים פרו-דלקתיים כדי לגרום לתוכנית בוגרת ואימונוגנית לפני עירוי חוזר16. עם זאת, אסטרטגיות אלו מוגבלות על ידי התבגרות תאים לקויה, מחסומים מדכאי חיסון ב-TME והטרוגניות תת-קבוצה בתערובת ה-DC המוחדרת, שבה רק חלק קטן של cDC1s קיים7. יתר על כן, בידוד רק cDC1s לאימונותרפיה או חיסון לסרטן הוא מאתגר בשל שכיחותם הנמוכה ביותר בדם היקפי (<0.3%)16. בנוסף, ניתן לייצר cDC1s מתאי אב CD34+ או מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים באמצעות ציטוקינים ואיתות NOTCH. עם זאת, שיטות אלו דורשות פרוטוקולים מורכבים וארוכים ומניבות מספרים נמוכים ואוכלוסיות הטרוגניות של תת-קבוצות DC 17,18,19.

כדי להתמודד עם מגבלות אלה, תכנות מחדש in vivo מספק אסטרטגיה מתאימה לאימונותרפיה לסרטן ליצירת תאים דמויי cDC1, הדומים לתכונות הפנוטיפיות, השעתוק והתפקודיות של cDC1s20. באמצעות ביטוי יתר של רשת ויסות הגנים המינימלית הספציפית ל-cDC1 - PU.1, IRF8 ו-BATF3 (המכונה ביחד PIB) - פיברובלסטים, תאי סטרומה ותאי סרטן תוכנתו מחדש בהדרגה לתאים דמויי cDC1 המאפשרים עיבוד והצגה של אנטיגן גידול ב-MHC Class I ו-II, איתות מעורר משותף באמצעות CD80 ו-CD86, והפרשת ציטוקין/כימוקין, כולל CXCL9/10 ו-IL-1220, 21,22,23. תכנות מחדש של cDC1 התקדם מהר יותר ויעיל יותר על פני xenografts אנושיים in vivo וללא תלות בדיכוי חיסוני, ויצר תאים דמויי cDC1 עם חתימה אימונוגנית בוגרת20. בגידולי מלנומה סינגניים, ראינו שתאים דמויי cDC1 עיצבו מחדש את ה-TME שלהם, גרמו להיווצרות מבנה לימפואיד שלישוני (TLS), וגייסו והרחיבוT T פוליקלונלי ותאי זיכרון ציטוטוקסיים, מה שהוביל לחסינות מערכתית ארוכת טווח20. לבסוף, פיתחנו שיטת אימונותרפיה חדשה לסרטן המבוססת על תכנות מחדש באתרם של תאים סרטניים לתאים דמויי cDC1 על ידי הזרקה תוך-גידולית של וקטורים אדנו-ויראליים20. ממצאים אלה סוללים את הדרך לתרגום קליני של תכנות מחדש של cDC1 כשיטת אימונותרפיה חדשה לסרטן שיכולה לרתום את התכונות הפונקציונליות של cDC1s.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ניתן לביצוע ליצירת תאים דמויי cDC1 בתוך ה-TME בהתבסס על תכנות מחדש של cDC1 in vivo . אספקה לנטיוויראלית של PIB לתאים סרטניים והשתלה לאחר מכן כתערובת מוגדרת של תאי סרטן מתמרים עם תאי סרטן הורים לא מתמרים מאפשרת תכנות מחדש in vivo של חלק מבוקר של תאים סרטניים בתוך ה-TME. בנוסף, שיטה זו אינה מוגבלת על ידי יעילות המסירה באתרם של וקטורים נגיפיים20. אנו מתארים את השלבים לייצור יעיל של וקטור לנטי-ויראלי, טיטרציה פונקציונלית ותכנות מחדש של cDC1 in vivo באמצעות מודל המלנומה הסינגנית, YUMM1.7, כדוגמה. אנו מפרטים את מערך הניסוי ואת אסטרטגיית השער לניתוח תאים דמויי cDC1 שתוכנתו מחדש in vivo על ידי ציטומטריית זרימה לאחר דיסוציאציה של הגידול. אנו מספקים גם את השלבים להערכת שינויים ב-TME על ידי ביצוע שימור בהקפאה, חתך וצביעה אימונופלואורסצנטית של קטעי גידול, ולאחר מכן מיקרוסקופיה קונפוקלית. לבסוף, אנו עוסקים כיצד לנטר חסינות הנגרמת על ידי cDC1 על ידי מדידת צמיחת הגידול והישרדותו. גישה ניתנת להרחבה זו מציעה לחוקרים כלי רב ערך להערכת אסטרטגיות טיפול קומבינטוריות עם תכנות מחדש של cDC1 in vivo , לאפיין שינויים בניאוגנזה של TME ו-TLS על פני מודלים של סרטן או לבצע מסכים גדולים המשנים את הביטוי של מסלולי חיסון שונים, למשל, הצגת אנטיגן או הפרשת ציטוקין/כימוקין, ולפענח את השפעתם על חסינות אנטי-גידולית.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הליכי ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לתקנות השוודיות לאחר אישור מועצת החקלאות השוודית.

1. הכנת ריאגנטים

  1. כדי להכין את המדיום השלם של Eagle's Medium (DMEM) של Dulbecco, הוסיפו 10% (v/v) סרום בקר עוברי (FBS), 1 מ"מ נתרן פירובט, 100 U/mL פניצילין (Pen), 2 מ"מ תחליף גלוטמין ו-100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין (סטרפטומיצין).
  2. להכנת מדיה מלאה RPMI 1640, הוסף 10% (v/v) FBS, תחליף גלוטמין 2 מ"מ, 1 מ"מ נתרן פירובאט, 50 מ"מ 2-מרקפטואתנול, 100 U/מ"ל עט ו-100 מ"ג/מ"ל סטרפטוקוק.
  3. להכנת מדיה מלאה DMEM/F12, הוסף 10% (v/v) סרום בקר עוברי (FBS), 1 מ"מ נתרן פירובאט, 0.1 מ"מ חומצות אמינו לא חיוניות ו-100 U/mL Pen ו-100 מ"ג/מ"ל סטרפטוקוק.
  4. להכנת 1 מ"ג/מ"ל פוליאתילנימין (PEI), ממיסים 100 מ"ג אבקת PEI ב-100 מ"ל מים סטריליים נטולי יונים בכוס זכוכית או בצינור חרוטי. מניחים את הכוס על מערבל מגנטי ומערבבים בטמפרטורת החדר (RT) ליצירת מערבולת עד להמסה מלאה. התאם את ה-pH ל-6.9-7.1, הוסף חומצה הידרוכלורית (HCl)/נתרן הידרוקסיד (NaOH) טיפה, וסנן את התמיסה דרך מסנן ממברנה PES של 0.22 מיקרומטר.
  5. להכנת 1 מ"מ נתרן בוטיראט, ממיסים 1.10 מ"ג ב-10 מ"ל מים סטריליים נטולי יונים.
  6. להכנת 8 מ"ג/מ"ל פוליברן, ממיסים 80 מ"ג אבקת פוליברן ב-10 מ"ל מים סטריליים נטולי יונים.
  7. להכנת מאגר FACS, הוסף 2% FBS ו-1 מ"מ EDTA לתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS).

2. ייצור Lentivirus

  1. הפשירו תאי HEK 293T על ידי הוספת 1 מ"ל של תאים ל-9 מ"ל של מדיום שלם DMEM שחומם מראש וצנטריפוגה של התאים ב-350 × גרם למשך 5 דקות. השעו מחדש את גלולת התא ב-20 מ"ל של מדיום שלם ותאי תרבית DMEM בצלחת של 150 מ"מ ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  2. הרחב ופצל תאי HEK 293T כאשר הם מגיעים למפגש של 80-90%. כדי לפצל תאים, יש לשטוף פעם אחת עם PBS, להוסיף 5 מ"ל טריפסין כדי לנתק אותם מהצלחת, ולדגור 5-10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  3. אסוף תאים עם 5 מ"ל של מדיום שלם DMEM, צנטריפוגה אותם ב-350 × גרם למשך 5 דקות, ופצל אותם 1:6 לצלחות חדשות של 150 מ"מ, 48 שעות לפני הטרנספקציה.
    הערה: איכות קו התאים המייצר לנטי-וירוס היא קריטית לייצור טיטרים גבוהים. אל תאפשר לתאים לחרוג מ-95% מפגש והימנע מזריעתם במפגש של <30%.
  4. לאחר 48 שעות, או כאשר התאים מגיעים למפגש של 70-80%, הכינו את תערובת הטרנספקציה בצינור חרוטי של 50 מ"ל. השתמש בפלסמיד ההעברה הבא: 1) SFFV-PIB-IRES-eGFP-a וקטור לנטי-ויראלי פוליציסטרוני המכיל את גורמי השעתוק PU.1, IRF8, BATF3, אתר כניסה ריבוזומלי פנימי (IRES), וחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP) כמדווח התמרה פלואורסצנטית; או 2) SFFV-eGFP, וקטור לנטי-ויראלי בקרה עם אתר שיבוט מרובה ו-eGFP; או 3) SFFV-mCherry, וקטור לנטי-ויראלי המבטא mCherry. הוסף 10 מיקרוגרם של פלסמיד העברה, 7.5 מיקרוגרם של פלסמיד אריזה psPAX2 ו-2.5 מיקרוגרם של פלסמיד מעטפת pMD2.G. מלאו את הצינור ב-Opti-MEM כדי להגיע לנפח כולל של 2 מ"ל. לבסוף, הוסף 60 מיקרוליטר של מגיב הטרנספקציה PEI (ממלאי 1 מ"ג/מ"ל) לתערובת הטרנספקציה.
    הערה: הווקטור הלנטי-ויראלי SFFV-eGFP משמש כבקרת התמרה לתכנות מחדש של ניסויים כדי להסביר אימונוגניות בתיווך לנטיויראלי, בעוד SFFV-mCherry משמש ליצירת קווי תאים סרטניים בעלי תווית פלואורסצנטית.
  5. מערבולת הטרנספקציה מתערבבת היטב במשך דקה אחת ודוגרת למשך 15 דקות ב-RT כדי לאפשר היווצרות של קומפלקסים של DNA-שומנים.
    הערה: מפגש משפיע באופן משמעותי על טיטרים ויראליים. העברת תאים בפחות מ-70% מפגש תביא לטיטר ויראלי נמוך יותר עקב פחות תאים המקבלים את הפלסמידים.
  6. שאפו את המדיום של תאי HEK 293T והוסיפו 10 מ"ל של DMEM ללא עט/צעד ועם 10% של FBS מסונן סטרילי.
  7. הוסף את תערובת הטרנספקציה עם היד הטיפתית ללוחות 150 מ"מ ודגירה למשך 16 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  8. לאחר הטרנספקציה, החלף את המדיום ב-20 מ"ל של מדיום שלם DMEM בתוספת 1 מ"מ נתרן בוטיראט, ודגר תאים למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
    הערה: נתרן בוטיראט הוא מעכב היסטון דאצטילאז (HDAC) מסוג 1 ויכול לשפר את ביטוי הגנים בתאי HEK 293T על ידי השראת היפראצטילציה של היסטון, הפותחת את מבנה הכרומטין ומקלה על שעתוק של אריזות נגיפיות והעברת פלסמידים. ניתן להעריך את יעילות הטרנספקציה על ידי בדיקת ביטוי eGFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  9. אסוף את הסופרנטנט המכיל לנטי-וירוס 48 שעות ו-60 שעות לאחר הטרנספקציה לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל. לאחר הקולקציה הראשונה, הוסף 12 מ"ל של מדיום שלם DMEM מחומם מראש לכל צלחת 150 מ"מ לקולקציה השנייה. אחסן את הקולקציות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, סנן אותן דרך מסנן PES קושר חלבון נמוך של 0.45 מיקרומטר ושלב אותן.
  10. כדי לרכז את הנגיף, פיפטה 37 גרם של מדיום המכיל לנטי-וירוס לתוך צינורות פוליפרופילן דקים פתוחים בנפח 38.5 מ"ל. מדוד את משקל הצינורות באמצעות סולם ספסל.
    הערה: מדוד את משקל המדיום המכיל lentivirus ולא את נפחו, מכיוון שהמשקל מספק דיוק רב יותר לאיזון. משקל הצינורות חייב להיות מאוזן היטב כדי למנוע פגיעה באולטרה-צנטריפוגה.
  11. הכניסו את הצינורות לדלי האולטרה-צנטריפוגה, סגרו את המכסים והניחו את הדליים ברוטור דלי מתנדנד. צנטריפוגה ב-25,000 × גרם למשך 90 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  12. לאחר הצנטריפוגה, הסר את הצינורות מהדליים ושאף את הסופרנטנט.
    הערה: ניתן למלא את אותם צינורות שוב ושוב ולהשתמש בהם למספר כולל של שלושה סבבי צנטריפוגה כדי לייצר גלולת לנטי-וירוס גדולה יותר לכל צינור.
  13. הנח את צינורות הפוליפרופילן הפתוחים הפוכים למשך 5 דקות על מגבון מעבדה או חומר סופג דומה כדי לאפשר לעודפי נוזלים להתנקז ולייבש את הגלולה.
  14. הוסף 200 מיקרוליטר של DMEM קר כקרח בתוספת HEPES או PBS לכל גלולה. הנח את צינורות המיקרו-צנטריפוגה לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל וסגור את המכסה כדי לשמור על סטריליות.
  15. דגרו את הגלולה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס כדי לאפשר השעיה מחדש.
  16. שלבו את הכדורים התלויים, שימו לב, ואחסנו אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שנה.
    הערה: כדי למנוע אובדן טיטר על ידי סבבים חוזרים ונשנים של הקפאה-הפשרה, השתמש בנפחים קטנים יותר (למשל, 50-200 מיקרוליטר).

3. טיטרציה פונקציונלית של וירוסים

הערה: יש לחזור על שלב זה עבור כל אצווה של lentivirus כדי לקבוע את המינון הנגיפי האופטימלי הנדרש להשגת יחס של 1:1 בין תאים מתמרים (eGFP+) לתאים לא מתמרים (eGFP-).

  1. להפשיר ולהרחיב תאים סרטניים במצע תרבית מתאים (למשל, קו תאי מלנומה של עכברים YUMM1.7 במדיום השלם DMEM/F12).
    הערה: תאים צריכים לעבור לפחות סבב אחד של חלוקה לפני ניסוי תכנות מחדש. מעברי תאים צריכים להיות דומים בין ניסויים.
  2. יום אחד לפני התבססות הגידול, העלו תאים סרטניים על ידי שאיבת אמצעי התרבית שלהם, שטיפה פעם אחת עם PBS והוספת 2 מ"ל או 5 מ"ל טריפסין לכל צלחת 100 מ"מ או צלחת 150 מ"מ. דגירה למשך 5-10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ואיסוף התאים על ידי הוספת מדיה שלמה של 8 מ"ל או 5 מ"ל לכל צלחת של 100 מ"מ או 150 מ"מ, בהתאמה, לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל.
  3. תאי צנטריפוגה במשקל 350 × גרם למשך 5 דקות להסרת טריפסין והשעיה מחדש במדיום שלם.
  4. קח 10 מיקרוליטר של תאים, הוסף 10 מיקרוליטר של טריפן כחול וספור תאים ברי קיימא באמצעות המוציטומטר.
  5. העבירו 6 × 105 תאים לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל המכיל 12 מ"ל של מדיום שלם והוסיפו 12 מיקרוליטר של 8 מ"ג/מ"ל פוליברן לתרחיף התא כדי להגיע לריכוז עבודה של 8 מיקרוגרם/מ"ל.
  6. פיפטה 2 מ"ל של תרחיף התאים לכל באר על צלחת תרבית רקמות בת 6 בארות.
    הערה: במידת הצורך, הגדל את מספרי התאים ל-1.2-1.8 x 106 לכל צלחת של 6 בארות.
  7. הוסף נפחים הולכים וגדלים של lentivirus לכל באר כדי לקבוע את הנפח האופטימלי הדרוש להשגת יחס של 1:1 בין תאים מתמרים (eGFP+) לתאים לא מתמרים (eGFP-).
    הערה: הוסף את נפחי ה-lentivirus המומלצים של lentivirus של 1, 2, 4, 8, 16 ו-32 מיקרוליטר בשלוש עותקים. בצע את הטיטרציה הפונקציונלית עבור וקטור הבקרה הריק SFFV-eGFP ו-SFFV-mCherry.
  8. דגרו על התאים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  9. ביום 0, הסר את החומר המכיל לנטי-וירוס, החלף בחומר טרי ודגר במשך 72 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  10. ביום השלישי, בדקו את ביטוי ה-eGFP בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    הערה: שלב זה מספק אימות מהיר של העברת תאים אך אינו מחליף את הניתוח המבוצע על ידי ציטומטריית זרימה בשלב 3.14 כדי לקבוע את היחס המדויק בין תאי eGFP+ לתאי eGFP.
    בחלק מתאי הסרטן (למשל, תאי מלנומה של עכבר B16) אות ה-eGFP עשוי להיות נמוך וקשה לזיהוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מומלץ להמשיך ישירות לזרימה ציטומטרית.
  11. שאפו את המדיום, שטפו את התאים פעם אחת עם PBS והוסיפו 500 מיקרוליטר טריפסין לבאר. יש לדגור במשך 5-10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2.
  12. הרם את התאים בכל באר עם 1.5 מ"ל של מאגר FACS ופיפטה את תרחיף התאים לצינורות פוליסטירן של 5 מ"ל. קח אליקוט וספור תאים ברי קיימא באמצעות המוציטומטר וצביעה כחולה של טריפאן.
  13. צנטריפוגה את תרחיף התא ב-350 × גרם למשך 5 דקות, השעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של מאגר FACS, והמשיכו בניתוח ציטומטריית זרימה.
  14. כמת את היחס המדויק בין תאים מתמרים (eGFP+) לתאים לא מתמרים (eGFP-) על ידי ציטומטריית זרימה. לבדיקות in vivo , השתמש בנפח ה-lentivirus שמניב את היחס הקרוב ביותר ל-1:1.
    הערה: כדי לקבוע במדויק את היחס בין תאי eGFP+ לתאי eGFP, כלול תאי סרטן שאינם מתמרים כבקרות שליליות לשער.

4. הקמת גידול תת עורי לתכנות מחדש in vivo

  1. להפשיר ולהרחיב תאים סרטניים במדיום התרבית המתאים שלהם ליצירת תאים המבטאים mCherry.
    הערה: ביטוי mCherry מקל על ההבחנה בין תאים סרטניים במהלך ניתוח ציטומטריית זרימה לבין אוכלוסיות אחרות בגידול, למשל, תאי סטרומה אנדוגניים ותאי חיסון.
  2. בצע את שלבים 3.2-3.4 והשהה מחדש תאים במדיה שלמה בריכוז של 105 תאים למ"ל.
  3. הוסף 8 מיקרוגרם/מ"ל של פוליברן ואת הנפח שנקבע של SFFV-mCherry lentivirus לתרחיף התא כדי להגיע ליעילות התמרה של >90%.
    הערה: לחלופין, אם השגת התמרה של >90% פוגעת בכדאיות התא, מיין תאי mCherry+ על ידי מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) 72 שעות לאחר הטרנסדוקציה והרחיב את התאים הממוינים בתרבית.
  4. לוח 5 מ"ל של תרחיף התאים (מכיל 5 × 105 תאים) לכל צלחת 100 מ"מ ודגירה של תאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 24 שעות.
  5. לאחר 24 שעות, החלף את המדיום ב-10 מ"ל של מדיום שלם והרחיב את התאים על ידי תרביתם ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 7 ימים לפחות לפני תחילת ניסויי תכנות מחדש.
  6. לאחר ההרחבה, בצע את שלבים 3.2-3.4 כדי להכין את מתלי התאים להתמרה הבאה עם הנפח שנקבע בעבר של SFFV-PIB-IRES-eGFP, וכתוצאה מכך היחס הקרוב ביותר של 1:1 בין תאים מתמרים (eGFP+) לתאים לא מתמרים (eGFP-) ביום 3.
  7. הוסף 8 מיקרוגרם/מ"ל של פוליברן לתרחיף התא, יחד עם נפח ה-lentivirus שנקבע בעבר לתרחיף התא בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל. מערבבים היטב מבלי ליצור בועות.
  8. פיפטה 2 מ"ל של תרחיף התאים (המכילה 105 תאים) לבאר בצלחת תרבית רקמה בת 6 בארות ודגירה למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
    הערה: לחלופין, צלחת את התאים ב-5 מ"ל של אמצעי התמרה בלוחות תרבית רקמה של 100 מ"מ. עם זאת, שימו לב שיעילות ההתמרה עשויה להיות מופחתת בנפחים גדולים יותר ויש לקבוע אותה אמפירית כמתואר בשלבים 3.1-3.13.
    מומלץ להמיר לפחות 10% יותר תאים כדי לפצות על אובדן תאים פוטנציאלי במהלך תהליך ההתמרה וכדי להבטיח נפח מספיק לפיפטינג או הזרקה במהלך הקמת הגידול.
  9. לאחר 24 שעות, הסר את המדיום המכיל לנטי-וירוס, שטוף פעמיים עם PBS, הוסף 500 מיקרוליטר טריפסין לכל באר ודגר במשך 5-10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  10. בדוק במיקרוסקופ אור אם התאים התנתקו לחלוטין מהצלחות ולאחר מכן אסוף אותם עם מדיה שלמה לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל.
  11. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה למשך 5 דקות ב -350 × גרם, שטפו את הגלולה עם PBS וצנטריפוגה שוב למשך 5 דקות ב -350 × גרם. קח אליקוט וספור תאים ברי קיימא באמצעות המוציטומטר וצביעה כחולה של טריפאן.
  12. השעו מחדש את הגלולה ב- PBS קר כקרח כדי להגיע לריכוז של 2-4 × 107 תאים למ"ל, המתאים ל 1-2 × 106 תאים בנפח הזרקה של 50 מיקרוליטר לכל גידול.
    הערה: חשוב לציין, מספרים אלה אומתו עבור גידולי מלנומה YUMM1.7 כדי לבודד תאים דמויי cDC1 שתוכנתו מחדש in vivo לניתוח ציטומטריית זרימה. עבור קווי תאים אחרים ועבור קריאות ניסיוניות אחרות, כגון גידול גידול וניסויי הישרדות, המספרים צריכים להיבדק אמפירית. עבור ניסויי גידול והישרדות גידול, מומלץ מספר תאים נמוך יותר - הנע בין 100,000 ל -250,000 תאים לכל גידול.
  13. עברו לאזור העבודה שבו מתבצעים ניסויים בבעלי חיים והשאירו את התאים על הקרח.
    הערה: לאחר הכנת התאים, בצע הזרקות תאים במהירות האפשרית ככל שחיוניות התאים מופחתת עם הזמן.
  14. הכן את תמיסת ההרדמה המכילה 3 מיקרוליטר קסילזין (20 מ"ג/מ"ל), 27 מיקרוליטר קטמין (100 מ"ג/מ"ל) ו-30 מיקרוליטר PBS לעכבר.
  15. להרדים עכברי CD45.1 על ידי הזרקת 60 מיקרוליטר של חומר הרדמה תוך צפק. חלק את העכברים באופן אקראי ושמור אותם על כרית חימום כדי למנוע ירידה בטמפרטורת הגוף. מרחו קרם עיניים על העיניים כדי למנוע התייבשות בעיניים במהלך ההרדמה.
    הערה: זה קריטי להשתמש בעכברי CD45.1 כדי לאפשר הבחנה בין תאים דמויי cDC1 מתוכנתים מחדש in vivo המבטאים את האלל CD45.2 מסוג הבר לבין תאי חיסון אנדוגניים. אם קו התא הוא CD45.1 C57BL/6 עכברים (CD45.2) יכולים לשמש כנמענים. עכברים צריכים להיות מותאמים למין ולגיל בין קבוצות הניסוי ולחלק אותם באופן אקראי לפני התבססות הגידול.
  16. המתן 5-10 דקות עד שכל העכברים מורדמים לחלוטין.
  17. לגלח את הצד הימני של העכברים בעזרת סכין גילוח; לחלופין, סמן אותם באמצעות קוצץ אוזניים. יש לחטא את האזור ולהחליק את שאריות השיער עם 70% אתנול.
  18. השעו מחדש תאים סרטניים על ידי פיפטה למעלה ולמטה באמצעות פיפטה P1000. טען את מתלה התא למזרק 0.5 מ"ל 30 גרם.
  19. הרם בעדינות את עור הצד המגולח של העכבר באמצעות שתי אצבעות והכנס את קצה המחט במקום שבו העור יוצר קמט.
    הערה: היזהר להימנע מניקוב האצבעות עם המחט.
  20. שחרר את העור, החזק את המזרק במקומו ביד אחת והשתמש בשתי אצבעות של היד השנייה כדי למתוח את עור העכבר.
  21. הזרקו לאט 50 מיקרוליטר מתרחיף התאים הסרטניים ליצירת בליטה אליפסה (נפיחות תת עורית) במקום ההזרקה.
    הערה: אם לא נוצרת בליטה, ייתכן שהתרחיף דלף לרקמה התת עורית שמסביב, מה שעלול להוביל להיווצרות גידול לא עקבי או כושל.
  22. לאחר ההליך, עקוב אחר כל העכברים מתעוררים כדי להבטיח הישרדות לאחר ההרדמה.
  23. שמור על העכברים בסביבת טמפרטורה מבוקרת עם 23 ± 2 מעלות צלזיוס ומחזור אור/חושך קבוע של 12 שעות וגישה חופשית למזון ומים.
    הערה: אם ברצונך לעקוב אחר צמיחת הגידול, המשך בשלבים 4.24-4.26. אחרת, דלג על שלבים אלה והמשך ישירות לסעיפים הבאים.
  24. כדי לעקוב אחר צמיחת הגידול, רסנו בעדינות את העכבר ביד אחת, ואפשרו הדמיה ברורה של הגידול.
  25. בעזרת קליפר אלקטרוני מודדים את אורך הגידול (l), רוחב (w) וגובהו (h). חשב את נפח הגידול (V) באמצעות הנוסחה: V = (l x w x h) / 2.
  26. מדוד את מידות הגידול כל יומיים-שלושה. כאשר הגידול מגיע לנפח העומד בקריטריון נקודת הקצה ההומאנית (למשל, 1,500 מ"מ³), המתת חסד של בעל החיים בהתאם להנחיות אתיות ומוסדיות.

5. בידוד גידול לניתוח ציטומטריית זרימה

  1. הכן מספריים, מלקחיים, מאגר FACS וצלחות תרבית שאינן רקמות בעלות 12 בארות עם מדיום שלם RPMI קר כקרח לאיסוף דגימות גידול.
  2. הכן את תמיסת העיכול של הגידול על ידי ערבוב של 30 מיקרוליטר של 100 מ"ג/מ"ל קולגנאז D ו-3 מיקרוליטר של 10 מ"ג/מ"ל DNAse I ב-3 מ"ל של מדיום שלם RPMI לכל גידול (כדי להגיע לריכוז עבודה של 1 מ"ג/מ"ל קולגנאז D ושל 10 מיקרוגרם/מ"ל DNAse I).
    הערה: אם יעילות העיכול אינה אופטימלית, הוסיפו 2-5 מ"מ CaCl2 כדי לתמוך בפעילות הקולגנאז.
  3. המתת חסד של העכברים על ידי פריקת צוואר הרחם או חנק CO2 ביום הבידוד.
  4. כרתו גידולים תת עוריים בעזרת מספריים ומלקחיים והניחו כל גידול בבאר של צלחת התרבית שאינה רקמה בת 12 בארות עם RPMI קר כקרח. נסה למזער כריתה של רקמה שאינה גידולית.
  5. חותכים דגימות גידול ל-1-2 מ"מ3 חתיכות בעזרת מספריים, אוספים את החלקים לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל המכילים 3 מ"ל תמיסת עיכול, ודוגרים ב-37 מעלות צלזיוס תוך ניעור ב-200-250 סל"ד למשך 30-45 דקות.
    הערה: מערבולת או פיפטה כל 15 דקות כדי להקל על תהליך העיכול.
  6. לאחר העיכול, פיפטה נמרצת את התערובת למשך דקה אחת באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל. סנן את מתלה התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מ"ל.
  7. השתמש בבוכנה של מזרק 10 מ"ל כדי לרסק חתיכות לא מעוכלות כנגד מסננת התאים של 70 מיקרומטר ולשטוף את המסננת עם 10 מ"ל של מדיום שלם RPMI.
  8. צנטריפוגה את תרחיף התא ב-350 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, השעיה מחדש ב-1 מ"ל של מאגר FACS וספור תאים ברי קיימא.
  9. העבירו את תרחיף התאים לצינורות פוליסטירן של 5 מ"ל, תאי גלולה ב-350 × גרם למשך 5 דקות, והשעו מחדש 106 תאים ברי קיימא לכל 100 מיקרוליטר של מאגר FACS.
  10. הפרד תאים עבור בקרות צבע יחיד (SC) ו-FMO לצינורות פוליסטירן נפרדים.
  11. הכן תערובת מאסטר לצביעת נוגדנים המכילה סרום חולדות (1:100) כדי לחסום כריכה לא ספציפית; צבע כדאיות ניתן לתיקון (1:100) כדי לא לכלול תאים מתים בניתוח; ונוגדנים עם תווית פלואורסצנטית אנטי CD45.1, אנטי CD45.2 ואנטי MHC-II בריכוז האופטימלי שלהם. מוסיפים 100 מיקרוליטר מתערובת המאסטר לכל דגימה ודוגרים במשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס בחושך.
  12. שטפו את הדגימות פי 2 עם 2 מ"ל של מאגר FACS והמשיכו בניתוח ציטומטריית זרימה.
  13. כמת את אחוזי התאים דמויי cDC1 המבטאים CD45.2 ו/או MHC-II, על ידי שער בתאי סרטן מותמרים (eGFP+) (CD45.1-mCherry+).
    הערה: ניתן להשתמש בפרוטוקול זה לביצוע אימונופנוטיפ של גידולים לאחר תכנות מחדש של cDC1 in vivo על ידי השלמת לוח הצביעה בנוגדנים כנגד אוכלוסיות תאי חיסון לימפואידים ו/או מיאלואידים אנדוגניים.

6. הקפאת גידול וחתך לניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. התכוננו לבידוד הגידול על ידי ביצוע שלבים 5.1 ו-5.3. כריתת גידולים תת עוריים בעזרת מספריים ומלקחיים.
  2. תקן גידולים ב-4% פרפורמלדהיד טרי (PFA) ב-PBS ב-4 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין. התאם את זמן הקיבוע בהתאם לגודל הגידול, תוך שימוש בשעה אחת לכל מ"מ³ של רקמה כקו מנחה.
  3. מעבירים גידולים לסוכרוז של 15% ב-PBS ודוגרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס תוך ניעור עדין של הרקמות עד שהן שוקעות לתחתית הצינור. לאחר מכן, העבירו אותם ל-20% סוכרוז ב-PBS באותם תנאים.
  4. לאחר שהגידולים התיישבו בתחתית הצינור, דגרו אותם בתערובת 1:1 של 20% סוכרוז בתרכובת PBS ו-OCT למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס עם טלטול.
  5. הסר את התערובת, הטמיע את הרקמות בקריומולד עם 100% OCT והקפיא באמצעות חנקן נוזלי.
    הערה: ללבוש תמיד ציוד מגן אישי מתאים (כפפות קריו, מגן פנים ומעיל מעבדה) כדי למנוע כוויות קור או פציעה מהתפשטות אדים מהירה. עבדו באזור מאוורר היטב כדי למנוע סכנת חנק.
    1. יש לאחסן בלוקים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס במיכלים סגורים כדי למנוע התייבשות.

7. צביעה אימונופלואורסצנטית של קטעי גידול

  1. בעזרת קריוסטט, חותכים את הגידולים למקטעים בעובי של כ-8 מיקרומטר ומרכיבים אותם על שקופיות זכוכית מיקרוסקופ. במידת הצורך, אחסן את השקופיות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: כדי לשמור על שלמות הרקמות, שמור את הבלוקים והמגלשות עם חתכי גידול רכובים על קרח יבש במהלך ההובלה אל הקריוסטט וממנו. ודא שהקריוסטט נשמר ב-20 מעלות צלזיוס במהלך החיתוך.
  2. הפשירו את השקופיות ב-PBS למשך 5 דקות וקבעו אותן בתמיסת PFA של 4% למשך 10 דקות ב-RT.
  3. לאחר הקיבוע יש לשטוף את השקופיות ב- PBS למשך 5 דקות.
    הערה: ודא שהרקמות נשארות לחות; שמור אותם תמיד בנוזל לאורך כל שלבי הצביעה הבאים. אם יש צורך להשהות את הניסוי, ניתן לאחסן שקופיות ב-PBS ב-RT עד 3 שעות. הימנע מאחסון השקופיות ב-PBS למשך הלילה.
  4. לאחזור אנטיגן, מלאו ספינת קיטור במים והפעילו אותה. מניחים צנצנת המכילה מים נטולי יונים וצנצנת המכילה 10 מ"מ נתרן ציטראט (pH 6) לתוך ספינת הקיטור ומכסים את הפתח בנייר אלומיניום. מבלי להסיר את המכסה, הכנס מדחום דרך פתחי האוורור של מכסה ספינת הקיטור, נקב את נייר האלומיניום ופקח על הטמפרטורה, וודא שהתמיסות יגיעו ל-~99 מעלות צלזיוס.
  5. כאשר המאגרים מגיעים ל-~99 מעלות צלזיוס, טבלו את המגלשות במים נטולי יונים למשך 10 שניות ולאחר מכן העבירו אותן במהירות לתמיסת אחזור האנטיגן.
  6. דגרו את המגלשות בטמפרטורה של ~99 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  7. שטפו את השקופיות ב-1x PBS למשך 3 x 5 דקות.
  8. השתמש בעט פאפ מחסום הידרופובי כדי לתאר כל קטע רקמה, וליצור היקף הידרופובי המונע דליפה של כל נוזל שנוסף לרקמות.
    הערה: שטיפות PBS עוקבות עלולות לשבש את ההיקף ההידרופובי המקיף את הרקמות ולדרוש חידוש. צייר אותו שוב לפי הצורך.
  9. חסום וחלחל רקמות עם 150 מיקרוליטר של בופר חוסם (5% סרום ו-0.5% טריטון X-100 ב-1x PBS) למשך 60 דקות ב-RT. עבור כל שלבי הצביעה השתמש בסרום מאותו מין כמו המארח של הנוגדן המשני.
  10. שטפו את המגלשות ב-1x PBS למשך 3 x 5 דקות.
  11. דגירה של רקמות עם 20 מיקרוגרם/מ"ל של הנוגדן העיקרי נגד CD45 במאגר חוסם (5% סרום ו-0.5% טריטון X-100 ב-1X PBS) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: כדי להשתמש בנוגדנים אחרים, יש לאמת אמפירית את ריכוז הנוגדנים.
  12. שטפו את המגלשות ב-1x PBS למשך 3 x 5 דקות.
  13. דגרו את חלקי הרקמה עם הנוגדן המשני נגד חולדות העז מצומד עם AlexaFluor-647 בדילול של 1:250 במאגר חוסם (סרום 5%) למשך שעתיים בחושך ב-RT.
    הערה לאחר הוספת הנוגדן המשני, בצע את כל השלבים הבאים בחושך כדי למנוע פוטוהלבנה של הפלואורופורים.
  14. שטפו את המגלשות ב-1x PBS למשך 3 x 5 דקות.
  15. דגירה של רקמות עם 1 מיקרוגרם/מ"ל של DAPI ו-20 מיקרוגרם/מ"ל של נוגדנים מצומדים AlexaFluor-594 במאגר חוסם (סרום 5%) למשך שעה אחת בחושך ב-RT.
  16. שטפו את המגלשות ב-1x PBS למשך 3 x 5 דקות.
  17. הוסף טיפה של תמיסת הרכבה על כל קטע גידול, ולאחר מכן החל כמה טיפות של מדיום הרכבה על הכיסוי. הפוך במהירות את הכיסוי על המגלשה כדי להרכיב אותה ולהבטיח היעדר בועות ליד הגידולים.
  18. הניחו לשקופיות להתייבש למשך הלילה וצלמו אותן במיקרוסקופיה קונפוקלית.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סקירה סכמטית של פרוטוקול התכנות מחדש in vivo הניתן להעברה מוצגת באיור 1. ראשית, ייצרנו את הווקטור הלנטי-ויראלי הפוליציסטרוני SFFV-PIB-IRES-eGFP (PIB-eGFP), המקודד לגורמי התכנות מחדש של cDC1 PU.1, IRF8, BATF3, ואחריו אתר כניסה ריבוזומלי פנימי (IRES) וחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP) בקו תאי האריזה של HEK 293T. כדי לשלוט באימונוגניות בתיווך לנטי-וירוס, ייצרנו וקטור SFFV-MCS-eGFP ריק (eGFP), המכיל אתר שיבוט מרובה (MCS) ו-IRES-eGFP, אך לא כולל גורמי תכנות מחדש. לאחר ייצור הווירוס, קטפנו את הסופרנטנט המכיל לנטי-וירוס וריכזנו אותו על ידי אולטרה-צנטריפוגה. ביצענו טיטרציה תפקודית של הנגיף כדי לקבוע את הכמות הנדרשת להשגת יחס של 1:1 בין תאים מתמרים (eGFP+) לתאים לא מתמרים (eGFP-), אותם הערכנו ביום השלישי לאחר ההעברה. לאחר מכן, השתמשנו בכמות הנגיף שהתקבלה כדי להמיר את קו התאים הסרטני שנבחר ביום -1. אחרי 24 שעות אספנו את התאים והשתלנו אותם תת-עורית כדי ליצור גידולים. אסטרטגיה זו הבטיחה שתאים מתמרים מתוכנתים מחדש לתאים דמויי cDC1 in vivo, בתוך ה-TME. בנקודות זמן שצוינו לאחר ההשתלה, כרתנו ועיבדנו גידולים לניתוחים במורד הזרם, כולל זרימה ציטומטרית של תאי גידול מנותקים, כדי לכמת את יעילות התכנות מחדש in vivo, או צביעה אימונופלואורסצנטית של קטעי גידול שמורים בהקפאה כדי לאפיין שינויים ב-TME.

ראשית, כדי להבטיח ייצור של טיטרים לנטי-ויראליים גבוהים, ניטרנו תאי HEK 293T לפני הטרנספקציה, במטרה להגיע למפגש של 70-80% ו-24 שעות לאחר מכן, הערכנו את יעילות הטרנספקציה באמצעות ביטוי eGFP על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (איור 2A). לאחר מכן, אספנו מדיום המכיל וירוס 48 שעות ו-60 שעות לאחר הטרנספקציה, ביצענו אולטרה-צנטריפוגה ואחסנו אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס (איור 2B). לאחר מכן, קבענו את הכמות הנגיפית האופטימלית הנדרשת להשגת יחס של 1:1 בין תאי eGFP+ לתאי eGFP בתאי מלנומה YUMM1.7. זרענו 105 YUMM1.7 תאים לבאר בצלחת של 6 בארות, התמרנו את התאים בכמויות הולכות וגדלות של לנטי-וירוס, והחלפנו את הסופרנטנט המכיל וירוס במדיה שלמה טרייה של DMEM/F12 לאחר 24 שעות (איור 2C). ביום השלישי, הערכנו את ביטוי eGFP על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, לפני שהמשכנו לכמת את האחוזים המדויקים של תאי eGFP+ על ידי זרימה ציטומטרית (איור 2C). כדי לכמת את היחס בין תאי eGFP+ לתאי eGFP, הגדרנו תאים בודדים חיים כדי לא לכלול תאים מתים וכפילים (איור 2D). הנפח האופטימלי של אצווה ה-lentivirus המיוצר נקבע הן עבור PIB-eGFP והן עבור נגיף ה-eGFP הבקרה כ-2 מיקרוליטר לכל 105 תאי YUMM1.7, וכתוצאה מכך 50.0 ±-0.3% ו-63.0 ±-0.9% תאי eGFP+, בהתאמה (איור 2E).

לאחר מכן, כדי להעריך את יעילות התכנות מחדש in vivo, יצרנו קו תאי סרטן עם תווית פלואורסצנטית (mCherry+) (YUMM1.7-mCherry). זה הבטיח שנוכל להבחין בין תאים סרטניים לתאי סטרומה או חיסון על ידי שער בתאי mCherry+ חיים בניתוח ציטומטריית הזרימה (איור 3A,B). לאחר מכן התמרנו תאי YUMM1.7-mCherry עם 2 מיקרוליטר של PIB-eGFP או וירוס eGFP בקרה לכל 105 תאים כדי להשיג יחס של 1:1 eGFP+ ל-eGFP. השתלנו תת עורית 1.6 × 106 תאים לגידול בעכברי CD45.1 ושמרנו עלייה של תאים לתרבית במבחנה לצורך השוואה. הערכנו את יעילות התכנות מחדש על ידי זרימה ציטומטרית, שער תאי mCherry+ eGFP+ ו-CD45.1- חיים כדי לא לכלול תאי חיסון מארחים שבלעו eGFP או mCherry (איור 3B). מימים 1 עד 9, צפינו ברכישה הדרגתית של ביטוי CD45.2 ו/או MHC-II, וסימנו תאים דמויי cDC1 שתוכנתו מחדש חלקית (CD45.2+ MHC-II- או CD45.2- MHC-II+) ותאים דמויי cDC1 שתוכנתו מחדש במלואם (CD45+ MHC-II+) (איור 3C). אימתנו כי תכנות מחדש של תאי סרטן עכברים in vivo הביא לאחוזים גבוהים יותר של תאים דמויי cDC1 ביום 9 בהשוואה לתנאי מבחנה (9.54 ± 1.54% CD45+ MHC-II+ in vivo לעומת 4.72 ± 1.1% CD45+ MHC-II+ במבחנה, P = 0.018). הקינטיקה של תכנות מחדש הואצה גם כאשר צפינו באחוז גבוה יותר של תאים דמויי cDC1 כבר ביום הרביעי (8.7 ± 3.3% CD45+ MHC-II+ in vivo לעומת 0.3 ± 0.1% CD45+ MHC-II+ במבחנה, P = 0.05), מה שמצביע על כך שנוכחותם של רמזים סביבתיים מקדמת תכנות מחדש מהיר ויעיל יותר לקראת תאים דמויי cDC119. בעוד שתאים דמויי cDC1 שתוכנתו מחדש במבחנה היו נוכחים עד היום ה-15, תאים דמויי cDC1 in vivo המשיכו להתקיים במשך 9 ימים, אך לא זוהו עד היום ה-15, מה שמרמז על דלדול מה-TME על ידי מערכת החיסון המארחת (איור 3C). 

לבסוף, מטרתנו הייתה לאפיין את השינויים המוקדמים של ה-TME כתוצאה מתכנות מחדש של in vivo cDC1 בתשעת הימים הראשונים. ביצענו צביעה אימונופלואורסצנטית של רקמות גידול שמורות וחתוכות מגידולי eGFP ו-PIB-eGFP לאחר 3 ו-9 ימים של תכנות מחדש in vivo, תוך התמקדות בחדירת תאים חיסוניים המסומנים על ידי הסמן הפאן-המטופויאטי CD45. יש לציין כי תאים דמויי cDC1 גייסו באופן משמעותי יותר תאי CD45 ל-TME בקלות ביום השלישי, בהשוואה לגידולי eGFP (49.6 ± 17.0 לעומת 8.0 ±-5.8 eGFP עוצמת פלואורסצנטית ממוצעת של צביעת CD45 לכל אזור גידול; איור 4A,B). מעניין שזיהינו TLS בתוך ה-TME של גידולים לאחר 9 ימים של תכנות מחדש in vivo. זה מצביע על כך שתאים דמויי cDC1 יכולים לעצב מחדש במהירות את ה-TME מסביבה "קרה-חיסונית" לסביבה "חמה חיסונית" תוך 3 ימים, מה שמוביל לאחר מכן להיווצרות TLS ביום התשיעי.

figure-results-1
איור 1: סקירת פרוטוקול ליצירת תאים דמויי cDC1 על ידי תכנות מחדש in vivo של תאים סרטניים. וקטורים לנטי-ויראלים SFFV-PIB-IRES-eGFP-מקודדים PU.1, IRF8 ו-BATF3 בקלטת פוליציסטרונית בשליטת מקדם הנגיף היוצר מיקוד טחול (SFFV) ו-eGFP לאחר אתר כניסת ריבוזום פנימי (IRES) למעקב אחר תאים מתמרים על ידי ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית - מיוצרים בקו תאי האריזה HEK 293T. לאחר מכן, וקטורים לנטי-ויראלים עוברים אולטרה-צנטריפוגה ועוברים טיטרציה תפקודית כדי לקבוע את כמות הנגיף הנדרשת להתמרת תאים סרטניים ביחס של 1:1 eGFP+ מתמר לתאי eGFP לא מתמרים. עבור ניסויי תכנות מחדש in vivo, תאי סרטן מצופים בכמות האופטימלית של lentivirus ביום -1. למחרת, תערובת זו של 1:1 של תאי GFP+ מתמרים ותאי GFP לא מתמרים נשטפת ונאספת להקמת גידול תת עורי בעכברים. תרביות מקבילות במבחנה נשמרות כדי לאמת התמרה ביום 3 על ידי ציטומטריית זרימה. בעלי חיים מנוטרים כל 2-3 ימים לצמיחת הגידול והישרדותו. גידולים נאספים בנקודות זמן מוגדרות, מפורקים וצבועים לביטוי סמני פני השטח לניתוח זרימה ציטומטרית. לחלופין, רקמות שלמות מקובעות, נשמרות בהקפאה ומחולקות לצביעה אימונופלואורסצנטית וניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית. יעילות התכנות מחדש in vivo מוערכת על ידי ניתוח ציטומטריית זרימה, בעוד ששינויים במיקרו-סביבת הגידול מאופיינים בהדמיה קונפוקלית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ייצור וטיטרציה פונקציונלית של lentivirus עבור תכנות מחדש של cDC1 in vivo.(A) כאשר תאי HEK 293T מגיעים למפגש ~70-80%, הם עוברים טרנספטציה עם תערובת המכילה 10 מיקרוגרם של פלסמיד העברה SFFV-PIB-eGFP (PIB-eGFP) או בקרת וקטור לנטי-ויראלית ריקה SFFV-eGFP (eGFP), יחד עם 7.5 מיקרוגרם של psPAX2, ו-2.5 מיקרוגרם של mPD2.G ו-60 מיקרוליטר של 1 מ"ג/מ"ל PEI. תמונות מיקרוסקופיה בהירפילד ופלואורסצנטי של תאי HEK 293T המציגות ביטוי eGFP 24 שעות לאחר הטרנספקציה, מה שמעיד על אספקת פלסמיד מוצלחת. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B) ייצוג סכמטי של זרימת העבודה של אולטרה-צנטריפוגה לריכוז lentivirus. הסופרנטנט המכיל לנטי-וירוס של תאי HEK 293T נאסף 48 שעות ו-60 שעות לאחר הטרנספקציה, מסונן דרך מסנן PES קושר חלבון נמוך של 0.45 מיקרומטר, ו-37 גרם נשקלים בצינורות פוליפרופילן דקים פתוחים באמצעות משקל ספסל. הצינורות עוברים אולטרה-צנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד, הסופרנטנט נשאב והכדור מיובש במשך 5 דקות. לאחר מכן הכדורים מושעים מחדש ב-DMEM קר כקרח המכיל HEPES ומודגרים למשך הלילה לפני שהם מביאים ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס. (C) אסטרטגיה ניסיונית של הטיטרציה הפונקציונלית לקביעת המינון הנגיפי האופטימלי להשגת יחס של 1:1 בין תאי GFP+ לתאי GFP. תמונות מיקרוסקופיה של שדה בהיר ופלואורסצנטי המציגות ביטוי eGFP בתאי מלנומה YUMM1.7, 72 שעות לאחר ההתמרה, מה שמעיד על אספקה מוצלחת של גורמי התכנות מחדש ו-eGFP. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. (D) תרשימי ציטומטריית זרימה מייצגים המציגות אסטרטגיית שער לכימות היחס בין תאי eGFP+. תאים חיים היו מגודרים לאוכלוסייה שלילית של צבע חי (DAPI) ואחריה הדרה כפולה. (E) כימות זרימה ציטומטרית של יעילות התמרה עם הגדלת מינונים נגיפיים כדי לקבוע את הנפח האופטימלי להשגת תאי GFP+/GFP 1:1. הן עבור PIB-eGFP והן עבור eGFP lentivirus, נפח של 2 מיקרוליטר לכל 105 תאים השיג את היחס הרצוי. קיצורים: cDC1s = תאים דנדריטיים קונבנציונליים מסוג 1; DAPI = 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול; PIB = PU.1, IRF8 ו-BATF3; PEI = פוליאתילנימין. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: הערכת יעילות תכנות מחדש של in vivo cDC1. (A) ייצוג סכמטי של זרימת העבודה הניסיונית להערכת יעילות תכנות מחדש של in vivo cDC1. תאי סרטן עוברים בתחילה התמרה עם lentivirus המבטא mCherry כדי ליצור קו תאים עם תווית פלואורסצנטית (YUMM1.7-mCherry), ואחריו התמרה עם מינון אופטימלי של PIB-eGFP lentivirus ביום -1. לאחר מכן מוזרקים תאים תת עורית עם יחס של 1:1 של תאי eGFP+/eGFP ביום 0 כדי לבסס גידולים בעכברי CD45.1 ולאפשר לתאים שעברו התמרת PIB לתכנת מחדש לתאים דמויי cDC1 בתוך ה-TME. לאחר מכן, הגידולים מבודדים בנקודות זמן שצוינו, מפורקים וצבועים עבור CD45.1, CD45.2 ו-MHC-II באמצעות ציטומטריית זרימה. זה מאפשר להוציא את תאי החיסון המארחים CD45.1 כדי לכמת את יעילות התכנות מחדש של cDC1 in vivo על ידי ביטוי של CD45.2 ו-MHC-II. תרבויות מקבילות במבחנה נשמרות לאורך כל נקודות הזמן כהשוואה לתכנות מחדש in vivo. (B) תרשימי ציטומטריית זרימה מייצגים הממחישים את אסטרטגיית השער ביום 9. התאים היו מגודרים על mCherry+ ו-GFP+ כדי לזהות תאים סרטניים שהועברו בהצלחה. תאי חיסון מארחים לא נכללו על ידי שער תאי CD45.1+. (C) כימות יעילות התכנות מחדש in vivo (משמאל) של תאי YUMM1.7-mCherry על ידי זרימה ציטומטרית כאחוז של תאי CD45+ MHC-II+ (מתוכנתים מחדש לחלוטין) ו-CD45.2+ HLA-DR- או CD45.2- HLA-DR+ תאים דמויי cDC1 (מתוכנתים מחדש חלקית) מגודרים בתוך eGFP+ mCherry+ תאים. תרשימי ציטומטריית זרימה מייצגת (מימין) המראים את הרכישה ההדרגתית של ביטוי CD45.2 ו-MHC-II בתאי YUMM1.7-mCherry שהועברו על ידי PIB-eGFP לאורך נקודות הזמן שצוינו. תאי YUMM1.7-mCherry שהועברו על ידי eGFP שימשו כביקורת ותאים דמויי cDC1 שתוכנתו מחדש במבחנה שימשו להשוואה. הנתונים ב-(C) מצביעים על ממוצע ±-SD של 3-5 ניסויי שכפול ביולוגי. ניתוח סטטיסטי ב-(C) בוצע עבור תאי CD45+ MHC-II+ באמצעות מבחן מאן-וויטני. *P < 0.05. קיצורים: cDC1s = תאים דנדריטיים קונבנציונליים מסוג 1; PIB = PU.1, IRF8 ו-BATF3; TME = מיקרו-סביבה של גידול. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ניתוח חדירה חיסונית במיקרו-סביבת הגידול בעקבות תכנות מחדש של cDC1 in vivo . (A) תמונות קונפוקליות מייצגות שמציגות תאי CD45+ בגידולי YUMM1.7 לאחר השתלה תת-עורית של תאי PIB-eGFP או תאי ביקורת שעברו התמרת eGFP (יחס של 1:1 בין תאי התמרה לתאי הורים) בימים 3 ו-9. פסי קנה מידה = 500 מיקרומטר. (B) כימות ה-MFI עבור צביעת CD45 בגידולי YUMM1.7 שטופלו ב-PIB ובקרה ב-eGFP בימים 3 ו-9. הנתונים ב-(B) מצביעים על ממוצע ±-SD של 3-6 ניסויי שכפול ביולוגיים. ניתוח סטטיסטי ב-(B) בוצע באמצעות מבחן מאן-וויטני. *P < 0.05 ו-***P < 0.001. קיצורים: cDC1s = תאים דנדריטיים קונבנציונליים מסוג 1; PIB = PU.1, IRF8 ו-BATF3; MFI = עוצמת הקרינה הממוצעת. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה ניתנת לביצוע ליצירת תאים דמויי cDC1 המבוססת על תכנות מחדש in vivo של תאים סרטניים מגידולים מוצקים. התוצאות שלנו מראות כי ביטוי יתר של PU.1, IRF8 ו-BATF3 מניע את הרכישה ההדרגתית של פנוטיפ cDC1 ב-TME עד ליום 9, ולאחר מכן תאים דמויי cDC1 מתרוקנים מהגידולים. בסופו של דבר, זה מוביל לעלייה בחדירה של תאי CD45 לתוך ה-TME ביום השלישי, מה שגורם לעיצוב מחדש של TME "קר חיסוני" להפוך ל"חם חיסוני".

הפרוטוקולים הנוכחיים ליצירת cDC1 כוללים העשרה של DCs אוטולוגיים מדם היקפי, התמיינות מתאי אב המטופויאטיים CD34+, או התמיינות מתאי גזע פלוריפוטנטיים 14,15,16,17,18,19. עם זאת, שיטות אלו מציגות גורמים מגבילים: התבגרות לא מספקת, הצגת אנטיגן מופחתת ויכולת ייצור ציטוקין/כימוקין in vivo, רגישות לדיכוי חיסוני, הטרוגניות DC גבוהה ומספר נמוך של תאים שנוצרו7. כאן, אנו מספקים פרוטוקול המאפשר יצירה ניתנת להרחבה של תאים דמויי cDC1 in vivo למחקרים פונקציונליים ומכניסטיים.

בשיטה זו, בדקנו אם הביטוי של שילוב גורמי השעתוק PU.1, IRF8 ו-BATF3 היה מספיק כדי להניע תכנות מחדש in vivo . פרוטוקול זה מאפשר בקרה מדויקת על יעילות המסירה, שכן שינוי המינון של תאים מהונדסים גנטית המושתלים משפיע ישירות על יעילות הטיפול. הראינו בעבר כי 2% תאים מתמרים, התואמים לתאים דמויי CD45+ ו-MHC-II+ cDC1, מספיקים כדי לעורר חסינות נגד גידול20. יתר על כן, החדירה החיסונית המהירה שנצפתה ביום השלישי מצביעה על כך שתאים דמויי cDC1 שתוכנתו מחדש חלקית פעילים מבחינה תפקודית in vivo, מכיוון שאין עלייה משמעותית בתאים דמויי cDC1 שתוכנתו מחדש במלואם בשלב זה. בעתיד, יהיה מעניין לחשוף את התפקיד התפקודי של תאים דמויי cDC1 שתוכנתו מחדש באופן חלקי לעומת מלא ביעילות אנטי-גידולית באמצעות וקטורים מותאמים המכילים גן התאבדות כדי לגרום למוות תאים באוכלוסיות תאים נבחרות בנקודות זמן מוגדרות24. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לחקור את השילוב עם אדג'ובנטים אפיגנטיים, שיכולים להגביר את יעילות התכנות מחדש25. לבסוף, ניתן להתאים שיטה זו גם ליצירת תת-סוגים אחרים של DC in vivo, תוך הפעלת סוגים שונים של תגובות חיסוניות, למשל, תגובות אנטי-ויראליות או טולרוגניות14. בנוסף, אנו יכולים לרתום תכנות מחדש in vivo כפלטפורמה לביצוע מסכי ברקוד לשילובי גורמי שעתוק ליצירת סוגי תאים חיסוניים מגוונים. אפשרות זו יכולה להגביר את גמישות הטיפולים על ידי מינוף תכונות פונקציונליות מגוונות של תת-קבוצות חיסוניות ספציפיות.

במחקר הקודם שלנו, הראינו שהסביבה המדכאת את מערכת החיסון in vivo אינה מעכבת את התכנות מחדש של תאי סרטן אנושיים ל-cDC1s20 אימונוגניים. במאמר זה, אנו מראים כי בעכברים, תכנות מחדש מהיר ויעיל יותר in vivo מאשר in vitro, מה שמרמז על כך שהתכנות מחדש המשופר שנצפה in vivo הוא תופעה שמורה בשני המינים. עם זאת, אחת המגבלות של שיטה זו היא היעדר סביבת in vivo במהלך מסירת וקטור ראשונית; לפיכך, הוא אינו יכול להבחין אם רמזים סביבתיים משפיעים על יעילות האספקה in vivo. יש לקבוע זאת באתרו על ידי השוואת חלקים שונים. ניתן להשוות וקטורים אדנו-ויראליים, שזיהינו כיעילים יותר מווקטורים לנטי-ויראליים למסירה באתרו 20 לחלקים לא נגיפיים כגון RNA ליניארי, מעגלי ומגביר את עצמו או קוקטיילים של מולקולות קטנות2 6,27.

הראינו בעבר כי תכנות מחדש של cDC1 מעניק לתאי סרטן הפרשת כימוקין פרו-דלקתית וגיוס לימפוציטים ועיבוד אנטיגן מקצועי והצגה על MHC-I ו-MHC-II במודלים של מלנומה23,28. התוצאה היא עיצוב מחדש של ה-TME ממצב "הצטננות חיסונית" למצב "חם חיסוני" על ידי השראת היווצרות TLS, מה שמגביר את החדירה של תאי T אפקטורים ציטוטוקסיים, תאי NK ותאי B, ומפחית אוכלוסיות מדכאות חיסון כגון תאי T רגולטוריים ומותשים20. בחולים, תגובות חיוביות לאימונותרפיה נקשרו לנוכחות TLS בתוך גידולים, כאשר תחול מתמשך של תאי T ו-B כנגד אנטיגנים של הגידול מייצר תגובות נוגדנים ספציפיות לגידול29,30. בעתיד, אנו חוזים להשתמש בפרוטוקול תכנות מחדש זה in vivo cDC1 כדי לחשוף את המנגנונים של ניאוגנזה מושרית TLS, שיפוץ TME וחסינות נגד גידול על פני סוגי סרטן שונים ולאפיין אם ייצור נוגדנים ספציפיים לגידול מעורר.

ראינו בעבר סינרגיה בין תכנות מחדש של cDC1 in vivo ו-ICB עם anti-PD-1 או anti-CTLA-420. זה מצביע על כך שה-TME "החם ממערכת החיסון" שנוצר על ידי תכנות מחדש של cDC1 יכול לספק סביבה נוחה לשילובים אפשריים עם אימונותרפיות אחרות כגון ACT כולל תאי T קולטני תאי T (TCR)-T, תאי T קולטני אנטיגן כימריים (CAR)-T או לימפוציטים חודרים לגידול (TILs). יתרון נוסף של שיטה זו הוא האפשרות לבצע מסכי קומבינטוריים או CRISPR גדולים ובלתי מוטים, שבהם קולטנים אימונולוגיים, ציטוקינים, כימוקינים או לימפוטוקסינים עלולים להתבטא יתר על המידה או להתרוקן בתאים דמויי cDC1 בסוגי גידולים עמידים, ובכך לחשוף את תפקידם של מסלולים מובחנים בשיפור החסינות המתווכת cDC1. לסיכום, הפרוטוקול הנוכחי מספק משאב רב ערך לקהילה מדעית רחבה, שכן תכנות מחדש של cDC1 in vivo הוא פלטפורמה גמישה ועוצמתית למחקרים מכניסטיים וחדשנות טיפולית באימונותרפיה של סרטן.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ל-C.-F.P. יש מניות והיא מכהנת בתפקידי ניהול ב-Asgard Therapeutics AB, המפתחת אימונותרפיה לסרטן המבוססת על טכנולוגיות תכנות מחדש in vivo DC. C.-F.P היא ממציאה של פטנטים רשומים US 11,345,891, JP 7303743 ו-CN ZL201880005047.3 ובקשות פטנט WO 2018/185709 ו-WO 2022/243448 (יחד עם E.A.) המוחזקות על ידי Asgard Therapeutics, המכסות את גישת התכנות מחדש של התאים המתוארת כאן.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למריאנה לופס ולקמיל שאטליין, חברות במעבדה לתכנות מחדש של התאים בהמטופואיזיס ומערכת החיסון, על העריכה וההגהה של כתב היד.

מחקר זה הושג בהקשר של בית הספר הלאומי למחקר ATMP במימון מועצת המחקר השוודית. הפרויקטים שנדונו כאן מומנו במשותף על ידי מועצת המחקר האירופית במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי (866448-TrojanDC ו-101189370), Novo Nordisk Fonden (NNF22C0079466), מועצת החדשנות האירופית (101130218-RESYNC), Cancerfonden (23 2932 Pj), מועצת המחקר השוודית (2020-00615), סוכנות החדשנות השוודית (2024-02178), ALF (44410), FCT (2022.02338.PTDC) ו-Plano de Recuperação e Resiliência de Portugal pelo fundo NextGenerationEU (C644865576-00000005). קרן קנוט ואליס וולנברג, הפקולטה לרפואה באוניברסיטת לונד ואזור סקונה זוכים להכרה על תמיכתם הכספית הנדיבה.

זמינות חומרים:

מבנים ווקטורים המשמשים לתכנות מחדש זמינים מ-Asgard Therapeutics תחת הסכם העברת חומרים עם החברה. כל שאר הנתונים הדרושים להערכת המסקנות במאמר נמצאים בטקסט הראשי או בחומרים המשלימים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.45 μ מסנן קשירה דל חלבון m, מסנן ואקום עליון של בקבוק 150 מ"לפישר סיינטיפיק15983297
2-מרקפטואתנול 50 מ"מתרמו-פישר סיינטיפיק31350010
נוגדן חד-שבטי CD45 נגד עכבר (שיבוט: 30-F11), IgG2b של חולדה וקאפה;תרמו-פישר סיינטיפיק14-0451-82
ב6. SJL-PtprcaPepcb/BoyCrl (CD45.1)מעבדת ג'קסון002014
מזרקי אינסולין BD Micro-Fine U-100 (0.5 מ"ל)פישר סיינטיפיק11395751
עכברי C57BL/6Jמעבדת ג'קסון000664
קולגנאז דסיגמא אולדריץ'11088882001
מסננת תאי פלקון קורנינג לשימוש עם צינורות חרוטיים 50 מ"לסיגמא אולדריץ'CLS352340
משקפי כיסוי קורנינג 24 x 50 מ"מ סיגמא אולדריץ'CLS2975245
DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד)תרמו-פישר סיינטיפיקD1306
דנאס אסיגמא אולדריץ'10104159001
eBioscience צבע כדאיות לתיקון eFluor 450Invitrogen65-0863-14
תמיסת אחזור אנטיגן eBioscience IHC - pH נמוך (פי 10)תרמו-פישר סיינטיפיק00-4955-58
סרום בקר עוברי (FBS)תרמו-פישר סיינטיפיקA5256701
מדיום הרכבה Fluoromount-Gתרמו-פישר סיינטיפיק00-4958-02
נוגדן GFP [Alexa Fluor 594]נובוס ביולוגיתNB600-308AF594
Gibco DMEM/תערובת נוטריינטים F-12 (DMEM/F-12)תרמו-פישר סיינטיפיק31331028
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות של Gibco MEM (פי 100)תרמו-פישר סיינטיפיק11140035
ג'יבקו אופטי-MEM Iתרמו-פישר סיינטיפיק11058021
מכון הזיכרון של פארק ג'יבקו רוזוול (RPMI) 1640 בינוניתרמו-פישר סיינטיפיק52400025
גיבקו נתרן פירובט (100 מ"מ)תרמו-פישר סיינטיפיק11360070
Gibco Trypan Blue Solution, 0.4%תרמו-פישר סיינטיפיק15250061
תוסף GlutaMAX תרמו-פישר סיינטיפיק35050061
נוגדן משני IgG (H+L) נגד חולדות עיזים, פוליקלונלי, Alexa Fluor 488תרמו-פישר סיינטיפיקא-11006
תאי HEK 293TATTCCRL-11268
הקסדימתרין ברומיד (פוליברן)סיגמא אולדריץ'H9268
מדיום הנשר המותאם (DMEM) של HyClone Dulbecco עם גלוקוז גבוהציטיבהSH30243.01
תמיסת HyClone Penicillin Streptomycin 100x (עט/סטרפטוקוק)ציטיבהSV30010
תמיסת מלח חוצצת HyClone פוספט (PBS)ציטיבהSH30028.02
וטרינר קטמינול. פתרון להזרקה 100 מ"ג/מ"לMSD בריאות בעלי חיים שוודיהQN01AX03
להב מיקרוטום - C35PFM רפואי207500005
עכבר Anti-CD45.2 (104), משטח, APC, חד-שבטיביולג'נד109814
עכבר אנטי-MHCII (M5/114.15.2), משטח, PE-Cy7, חד-שבטיביולג'נד107630
סרום עיזים רגילאבקםאילן אלכסנדר
סרום חולדות רגיל (סטרילי)אבקםאילן אלכסנדר
צינורות פוליפרופילן דקים פתוחיםבקמן קולטר מדעי החיים326823
פרפורמלדהיד, 16% משקל/נפח aq. סולן., ללא מתנולתרמו-פישר סיינטיפיק043368.9 מיליון
pFUW-tetO-Batf3, עכבר מקודד קלטת מונוציסטרונית Batf3אדג'ן139837
pFUW-tetO-Irf8, עכבר קלטת מונוציסטרונית המקודד Irf8אדג'ן139838
pFUW-tetO-Pu.1, עכבר קסטה מונוסיסטרונית המקודד Pu.1אדג'ן139839
פלסמיד pMD2.Gאדג'ן12259
פלסמיד psPAX2אדג'ן12260
פלסמיד SFFV-eGFP (eGFP)שיבוט בבית-
פלסמיד SFFV-mCherry (mCherry)שיבוט בבית-
פלסמיד SFFV-PIB-eGFP,   קלטת פוליציסטרונית המקודדת עכבר PU.1, IRF8 ו-BATF3 (PIB) שיבוט בבית-מבנים ווקטורים המשמשים לתכנות מחדש זמינים מ-Asgard Therapeutics תחת הסכם העברת חומרים עם החברה
פוליאתילנימין (PEI), ליניארי, MW 25000, דרגת טרנספקציהמדעי העולם23966
ReadyProbes עט פאפ מחסום הידרופוביתרמו-פישר סיינטיפיק₪777
נתרן בוטיראטסיגמא אולדריץ'303410
סוכרוזסיגמא-אולדריץ'S7903
SuperFrost Plus שקופיות מיקרוסקופ הידבקותאפרדיהJ1800AMNZ
תרכובת Tissue-Tek O.C.T.סאקורה פינטק4583
אנזים TrypLE Express (1x) ללא פנול אדוםתרמו-פישר סיינטיפיק12604021
TT Cryomold בינוני, מרובע (15 x 15 x 5 מ"מ)סאקורה פינטק4566
UltraPure 0.5 מ' EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020
וטרינר Xysol. פתרון להזרקה 20 מ"ג/מ"לVM פארמהQN05CM92
תאי YUMM1.7אנטינאו

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Oliveira, G., Wu, C. J. Dynamics and specificities of T cells in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 23 (5), 295-316 (2023).
  2. Larkin, J., et al. Five-year survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. N Engl J Med. 381 (16), 1535-1546 (2019).
  3. Adams, S., et al. Pembrolizumab monotherapy for previously untreated, PD-L1-positive, metastatic triple-negative breast cancer: cohort B of the phase II KEYNOTE-086 study. Ann Oncol. 30 (3), 405-411 (2019).
  4. Patel, M. R., Falchook, G. S., Hamada, K., Makris, L., Bendell, J. C. A phase 2 trial of trifluridine/tipiracil plus nivolumab in patients with heavily pretreated microsatellite-stable metastatic colorectal cancer. Cancer Med. 10 (4), 1183-1190 (2021).
  5. Reardon, D. A., et al. Randomized phase 3 study evaluating the efficacy and safety of nivolumab vs bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: CheckMate 143. Neuro Oncol. 19 (suppl_3), iii21-iii21 (2017).
  6. Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy. Cell. 168 (4), 707-723 (2017).
  7. Heras-Murillo, I., Adán-Barrientos, I., Galán, M., Wculek, S. K., Sancho, D. Dendritic cells as orchestrators of anticancer immunity and immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 21 (4), 257-277 (2024).
  8. Heras-Murillo, I., et al. Immunotherapy with conventional type-1 dendritic cells induces immune memory and limits tumor relapse. Nat Commun. 16 (1), 3369(2025).
  9. Theisen, D. J., et al. WDFY4 is required for cross-presentation in response to viral and tumor antigens. Science. 362 (6415), 694-699 (2018).
  10. Meiser, P., et al. A distinct stimulatory cDC1 subpopulation amplifies CD8+ T cell responses in tumors for protective anti-cancer immunity. Cancer Cell. 41 (8), 1498-1515.e10 (2023).
  11. Spranger, S., Dai, D., Horton, B., Gajewski, T. F. Tumor-residing Batf3 dendritic cells are required for effector T cell trafficking and adoptive T cell therapy. Cancer Cell. 31 (5), 711-723.e4 (2017).
  12. Hubert, M., et al. IFN-III is selectively produced by cDC1 and predicts good clinical outcome in breast cancer. Sci Immunol. 5 (46), eaav3942(2020).
  13. Mahadevan, K. K., et al. Type I conventional dendritic cells facilitate immunotherapy in pancreatic cancer. Science. 384 (6703), eadh4567(2024).
  14. Ascic, E., Pereira, C. -F. Transcription factor-mediated reprogramming to antigen-presenting cells. Curr Opin Genet Dev. 90, 102300(2025).
  15. Silk, K. M., et al. Cross-presentation of tumour antigens by human induced pluripotent stem cell-derived CD141+ XCR1+ dendritic cells. Gene Ther. 19 (10), 1035-1040 (2012).
  16. Nair, S., Archer, G. E., Tedder, T. F. Isolation and generation of human dendritic cells. Curr Protoc Immunol. Chapter 7, 7.32.1-7.32.23 (2012).
  17. Makino, K., et al. Generation of cDC-like cells from human induced pluripotent stem cells via Notch signaling. J Immunother Cancer. 10 (1), e003827(2022).
  18. Balan, S., et al. Large-scale human dendritic cell differentiation revealing Notch-dependent lineage bifurcation and heterogeneity. Cell Rep. 24 (7), 1902-1915.e6 (2018).
  19. Kirkling, M. E., et al. Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells. Cell Rep. 23 (12), 3658-3672.e6 (2018).
  20. Ascic, E., et al. In vivo dendritic cell reprogramming for cancer immunotherapy. Science. 386 (6719), eadn9083(2024).
  21. Rosa, F. F., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into antigen-presenting dendritic cells. Sci Immunol. 3 (30), 1-16 (2018).
  22. Rosa, F. F., et al. Single-cell transcriptional profiling informs efficient reprogramming of human somatic cells to cross-presenting dendritic cells. Sci Immunol. 7 (69), eabg5539(2022).
  23. Zimmermannova, O., et al. Restoring tumor immunogenicity with dendritic cell reprogramming. Sci Immunol. 8 (85), eadd4817(2023).
  24. Bouquet, L., et al. RapaCaspase-9-based suicide gene applied to the safety of IL-1RAP CAR-T cells. Gene Ther. 30 (9), 706-713 (2023).
  25. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2. Nat Biotechnol. 26 (11), 1269-1275 (2008).
  26. Rojas, L. A., et al. Personalized RNA neoantigen vaccines stimulate T cells in pancreatic cancer. Nature. 618 (7963), 144-150 (2023).
  27. Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
  28. Ferreira, A. G., Zimmermannova, O., Kurochkin, I., Ascic, E., Åkerström, F., Pereira, C. F. Reprogramming cancer cells to antigen-presenting cells. Bio Protoc. 13 (22), 1-25 (2023).
  29. Cabrita, R., et al. Tertiary lymphoid structures improve immunotherapy and survival in melanoma. Nature. 577 (7791), 561-565 (2020).
  30. Ng, K. W., et al. Antibodies against endogenous retroviruses promote lung cancer immunotherapy. Nature. 616 (7957), 563-573 (2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

cDC1TCD45

מאמרים קשורים