זרימת עבודה של אפיון נוירופפטיד מדגימה לספקטרומטריית מסה של רכישה בלתי תלויה בנתונים

Summary

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה מקיפה של נוירופטידומיקה ברקמת מוח של חולדות המשלבת רכישה תלוית נתונים-הצטברות מקבילה-פיצול סדרתי (DDA-PASEF) וספקטרומטריית מסה של רכישה בלתי תלויה בנתונים (DIA).

Abstract

נוירופפטידים אנדוגניים הם מודולטורים מרכזיים של תפקוד המוח, ממלאים תפקידים קריטיים בהתנהגות, מתח, כאב וויסות הומאוסטטי, אך הניתוח שלהם נותר קשה. מבחינה ביולוגית, הם נמוכים בשפע, מתפרקים במהירות ומעובדים באופן משתנה מחלבונים קודמים, עם ביטוי מוגבל לאוכלוסיות תאים קטנות ומקומיות. מבחינה טכנית, הזיהוי שלהם מסובך על ידי טווח דינמי רחב, שינויים מגוונים לאחר תרגום ואותות דלילים במערכי נתונים של ספקטרומטריית מסה. פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה מקיפה לניתוח נוירופפטידים ברקמת המוח Rattus norvegicus באמצעות ספקטרומטריית מסה (MS) של רכישה תלוית נתונים (DDA) ורכישה בלתי תלויה בנתונים (DIA) בפלטפורמת timsTOF. לאחר הכנת דגימת מוח אופטימלית, כולל דיסקציה, מיצוי פפטידים וניקוי, כרומטוגרפיה נוזלית ננו (LC)-MS מבוצעת עם פיצול פאזת גז ניידות יונים כדי לשפר את רגישות הזיהוי והדיוק. הספרייה הספקטרלית שנוצרה על ידי DDA תומכת בכימות מבוסס DIA ב-Skyline, ומאפשרת מדידות ברמת MS2 ברמת MS2 ברמת ביטחון גבוה. זרימת עבודה משולבת זו מגדילה את כיסוי הנוירופפטידים ומשפרת את יכולת השחזור הכמותית, ומספקת פלטפורמה חזקה לחקר נוירופפטידים ברקמת מוח מורכבת.

Introduction

נוירופפטידים הם סוג מגוון מבחינה תפקודית של מולקולות איתות אנדוגניות המשמשות כמודולטורים קריטיים של תקשורת עצבית, תפקודי מערכת העצבים והנוירואנדוקרינית. הם פועלים כנוירומודולטורים, הורמונים או מוליכים משותפים, ומשפיעים על מגוון רחב של תהליכים פיזיולוגיים, כולל ויסות כאב, תגובת לחץ, ויסות צירקדי ושליטה בתיאבון. בניגוד לנוירוטרנסמיטורים קלאסיים, המסונתזים כמולקולות קטנות, נוירופפטידים מקודדים בתוך חלבונים קודמים גדולים המסונתזים באמצעות תרגום של mRNA. חלבונים קודמים, או פרוהורמונים, עוברים לאחר מכן עיבוד פרוטאוליטי כדי לשחרר את הפפטידים הפעילים, הארוזים בשלפוחיות ליבה צפופות (DCV). עם הגירוי, נוירופפטידים משתחררים כדי להפעיל השפעות מודולטוריות, בדרך כלל איטיות וממושכות יותר באמצעות אינטראקציות עם קולטנים מצומדים לחלבון G. חשיבותם בשמירה על תפקוד מערכת העצבים המרכזית וההיקפית הפכה אותם לתחום עניין ביולוגי וקליני אינטנסיבי 1,2,3,4,5.

למרות הרלוונטיות שלהם, נוירופפטידים נותרו מאתגרים מבחינה אנליטית לאפיון. המבנים ההטרוגניים ביותר שלהם - הנעים בין רצפים קצרים לרצפים מורחבים, הנושאים לעתים קרובות שינויים מגוונים לאחר התרגום (PTMs) כגון אמידציה, אצטילציה, זרחון, איזומריזציה של חומצות אמינו או חיתוך - מובילים לשונות בהתנהגויות יינון ופיצול בספקטרומטריית מסה (MS)1,6,7,8 . יתר על כן, הם נמצאים בדרך כלל בריכוזים נמוכים ביחס לרכיבי מטריצה ביולוגית, מתפרקים בקלות וממוקמים בצורה מוגבלת מרחבית בתוך הרקמה המורכבת של מערכת העצבים. תכונות אלו מסבכות הן את הזיהוי והן את הכמות, במיוחד כאשר משתמשים בגישות פרוטאומיקה מסורתיות המסתמכות על עיכול אנזימטי צפוי ותכונות פפטיד אחידות ^9,10,11.

כאן, אנו מציגים אסטרטגיה מקיפה לזיהוי וכימות של פפטידים אנדוגניים במוח של Rattus norvegicus, עם דגש ספציפי על נוירופפטידים. זרימת העבודה כאן מתחילה בהליכי דגימת מוח אופטימליים, ולאחר מכן הפרדות נרחבות של כרומטוגרפיה נוזלית (LC), ומסתיימת בניתוח MS ברזולוציה גבוהה באמצעות פיצול הצטברות סדרתי מקביל (PASEF) על פלטפורמת ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים (TIMS) 12,13,14,15,16. על ידי שילוב פיצול פאזת גז ניידות יונים (IM-GPF) לפני בחירת המבשר, גישת הרכישה תלוית הנתונים של PASEF (DDA-PASEF) מאפשרת הפרדה משופרת של מבשר וזיהוי משופר של נוירופפטידים בשפע נמוך, שרבים מהם היו מתפספסים בתהליכי עבודה חד-ממדיים של DDA¹⁷.

בעוד ש-DDA נותרה האסטרטגיה הנפוצה ביותר בזיהוי פפטידים בשל ספקטרום MS/MS האיכותי שלה, היא מוגבלת מטבעה על ידי הסתמכותה על בחירת יונים קודמים לפי עוצמה, מה שמוטה נגד מינים בעלי שפע נמוך 18,19,20. יתר על כן, הדגימה הסטוכסטית למחצה שלו מובילה לערכים חסרים על פני שכפולים, מה שמעכב את הכימות הניתן לשחזור. כדי להתגבר על מגבלות אלה, בנינו ספרייה ספקטרלית חזקה באמצעות נתוני DDA-PASEF שלנו, שניתן להשתמש בה לאחר מכן לניתוח רכישה בלתי תלויה בנתונים (DIA). בניגוד ל-DDA, DIA דוגם את כל יוני המבשר בתוך חלונות m/z מוגדרים, מה שמבטיח דגימה עקבית של פפטידים בשפע ונדירים כאחד, ובשילוב עם הספרייה הספקטרלית וניתוח ממוקד ב-Skyline, מאפשר כימות רגיש וניתן לשחזור ברמת MS2 21,22,23,24.

גישה אינטגרטיבית זו - המשתרעת על מיצוי פפטידים במוח, הפרדה כרומטוגרפית, רכישת MS משופרת בניידות יונים וכימות היברידי מבוסס DDA / DIA - פותחה תוך מחשבה על המורכבות של נוירופפטידים. הוא ממקסם את כיסוי הפפטידים תוך מזעור אובדן נתונים, תוך התייחסות למגבלות העיקריות של פפטידומיקה פשוטה יותר מונעת DDA. ככזה, אנו מציגים פלטפורמה גמישה ורבת עוצמה לחקר נוף הנוירופפטידים במוח היונקים, הניתנת להתאמה בקלות למגוון רחב של שאלות ניסיוניות ודגימות רקמה.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים במחקר זה נערכו בהתאם לפרוטוקול השימוש בבעלי חיים שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אילינוי (23228) תוך הקפדה על תקנים לאומיים וסטנדרטים של ARRIVE לטיפול אתי וטיפול בבעלי חיים.

1. נתיחת בעלי חיים ובידוד מוחי

1. בצע זלוף מי מלח קר מיד ואחריו הקפאת רקמות כדי לשמור על שלמות הנוירופפטיד, למזער חפצי פירוק ולשפר את איכות הנתונים לניתוח פפטידומי במורד הזרם.
2. המתת חסד של החולדה בשיטת CO₂ בהתאם להנחיות מוסדיות לטיפול בבעלי חיים. אשר מוות על ידי היעדר דופק והיעדר רפלקסים.
3. הניחו את החולדה בשכיבה; בצע חתך כדי לחשוף את חלל בית החזה.
4. בצע חתך קטן בחדר השמאלי של הלב.
5. בצע חתך קטן בפרוזדור הימני כדי לאפשר זרימת דם ותמיסת זלוף.
6. הכנס קצה פיפטה מפלסטיק חתוך לגודל המחובר למזרק של 60 מ"ל מלא ב-50 מ"ל של תמיסה פיזיולוגית קרה כקרח (למשל, 0.9% מי מלח או mGBSS) לחדר השמאלי.
7. לחלחל את גוף החיה עם התמיסה. ערפו את ראשו של החולדה בעזרת מספריים חדים או גיליוטינה.
8. הסר עור וגולגולת המכסה את המוח בעזרת מספריים או מספריים עדינים.
9. הרם בזהירות את המוח מחלל הגולגולת, וחתוך עצבי גולגולת לפי הצורך.
10. הקפיאו מיד את המוח על קרח יבש או הקפיאו באיזופנטן מקורר על קרח יבש.
11. מעבירים לקריוביאל או נייר כסף מסומנים, ואז מאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

2. מיצוי פפטיד מרקמת מוח של חולדה

1. עבור דגימות מוח שלמות, שקלו כל רקמה קפואה במהירות באמצעות איזון אנליטי. הומוגניזציה של הרקמה באמצעות תמיסה בדרגת LC-MS המכילה 10% חומצה אצטית קרחונית ו-1% מים במתנול, תוך שימוש ביחס ממס לרקמה של 10:1 (v/w).
2. דגרו את הדגימות ההומוגניות על הקרח למשך 20 דקות.
3. צנטריפוגה את הדגימות ב-16,000 × גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. אסוף בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
4. השעו מחדש את הגלולה במים בדרגת LC-MS, תוך שימוש ביחס ממס לרקמה של 10:1 (v/w), וחזרו על הדגירה על הקרח למשך 20 דקות.
5. צנטריפוגה שוב באותם תנאים (16,000 × גרם, 20 דקות, 4 מעלות צלזיוס), ואוספים את הסופרנטנט השני.
6. שלב את שני הסופרנטנטים והעביר 1/10 מהנפח הכולל לצינור חדש לעיבוד במורד הזרם. יבש את המנה הזו באמצעות רכז ואקום עד לייבוש מלא. אחסן את התמצית הנותרת בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.

3. מיצוי פאזה מוצקה (SPE) באמצעות עמודות ספין C18

הערה: כל הממיסים צריכים להיות בדרגת LC-MS. אלא אם צוין אחרת, שלבי הצנטריפוגה מבוצעים ב-1,500 × גרם בטמפרטורת החדר באמצעות צנטריפוגה על שולחן.

1. הכנת ריאגנטים
   1. הכן תמיסת הפעלה (A): 50% אצטוניטריל/50% 0.1% חומצה פורמית במים.
   2. הכן תמיסת שיווי משקל ושטיפה (B): 0.1% חומצה פורמית במים.
   3. הכן תמיסת פליטה (C): 50% אצטוניטריל/50% 0.1% חומצה פורמית במים.
2. הכנת מדגם
   1. הרכיבו מחדש את תמצית הפפטיד המיובשת ב-200 מיקרוליטר של תמיסה (B).
   2. צנטריפוגה את הדגימה ב-16,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   3. יש לאסוף בזהירות את הסופרנטנט ל-SPE.
3. התניה ושיווי משקל של עמודים
   1. הוסף 150 מיקרוליטר של תמיסה (A) לעמודת הספין C18.
   2. צנטריפוגה למשך דקה אחת במשקל 1,500 × גרם.
   3. חזור על שלבים 3.3.1 ו-3.3.2 פעמיים כדי להבטיח הפעלה מלאה.
   4. הוסף 150 מיקרוליטר של תמיסה (B).
   5. צנטריפוגה למשך דקה.
   6. חזור על שלבים 3.3.4 ו- 3.3.5 פעמיים.
4. טעינה וכביסה לדוגמא
   1. טען 200 מיקרוליטר מתמיסת הדגימה המוכנה על העמודה.
   2. צנטריפוגה למשך דקה.
   3. טען מחדש את הזרימה בחזרה אל העמודה שלוש פעמים כדי למקסם את שימור הפפטיד.
   4. הוסף 150 מיקרוליטר של תמיסה (B).
   5. צנטריפוגה למשך דקה.
   6. חזור על שלבים 3.4.4 ו-3.4.5 שלוש פעמים כדי להסיר מזהמים שאינם נשמרים.
5. פליטת פפטיד
   1. הוסף 150 מיקרוליטר של תמיסת פליטה (C) לעמודה.
   2. צנטריפוגה למשך דקה.
   3. חזור על שלבי הפליטה 3.5.1-3.5.2 פעם נוספת.
   4. שלבו את שני הנוזלים ואחסנו על קרח או המשיכו לייבוש בוואקום.

4. ניתוח LC-MS/MS

1. הכן תמיסה (A): 0.1% חומצה פורמית במים, תמיסה; (B): 0.1% חומצה פורמית באצטוניטריל, תמיסה; (C): 25 fmol/μL זמן שמירה סטנדרטי (iRT) 0.1% חומצה פורמית במים.
2. השעו מחדש את הדגימות בתמיסה של 20 מיקרוליטר (C) לפני הזרקת LC-MS.
   הערה: שתי דגימות ביולוגיות נותחו, וכל אחת מהן הוזרקה חמש פעמים הן לריצות DDA והן לריצות DIA, וכתוצאה מכך חמישה שכפולים טכניים לכל שיטה לכל דגימה.
3. בצע את הפרדת הפפטידים באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), כאשר שלב A נייד המורכב מתמיסה (A) ושלב B נייד המורכב מתמיסה (B).
4. טען 1 מיקרוליטר של דגימות על עמודה אנליטית של עשרים וחמישה C18 (150 מיקרומטר × 250 מ"מ, חלקיקים של 1.9 מיקרומטר, גודל נקבוביות 120 Å) ושמור על 40 מעלות צלזיוס לאורך כל הריצה.
5. בצע את הפרדת ה-LC בקצב זרימה של 600 נ"ל/דקה באמצעות פרופיל השיפוע הבא: 0-5 דקות: 2-10% B; 5-85 דקות: 10-45% B; 85-87 דקות: 45-50% B; ואחריו שטיפה אורגנית גבוהה ושיווי משקל מחדש.
   הערה: ה-LC חובר ישירות ל-timsTOF MS באמצעות מקור יונים.
6. לניתוח DDA, השתמש בשיטת היישום המוגדרת כברירת מחדל DDA PASEF-standard_1.1sec_cycletime ב-timsTOF MS.
   1. בקצרה, הפעל את ספקטרומטר המסה במצב PASEF עם אי-הכללה דינמית מופעלת. הגדר כל מחזור כך שיכלול 10 סריקות PASEF MS/MS לאורך מחזור עבודה של 1.1 שניות.
   2. הגדר את טווח המסה ל-m/z 100-1700, ואת טווח ניידות היונים בין 0.60 ל-1.60 V·s/cm², תוך שימוש בזמן רמפה של 100.0 ms. הגדל את אנרגיית ההתנגשות מ-20.0 ל-59.0 eV כפונקציה של ניידות יונים.
7. פיצול פאזת גז ניידות יונים (IM-GPF)
   1. פלח את טווח ניידות היונים של 0.6-1.6 V·s/cm² לשלושה חלונות חופפים: 0.6-1.0, 0.9-1.3 ו-1.2-1.6 V·s/cm².
   2. לשם כך, שנה את ערכי ההתחלה והסיום של הניידות בהקשה על הגדרות TIMS של timsControl או בעורך timsControl לערכי החלון המתאימים.
   3. השגת נתונים עבור כל חלון. עבור כל חלונות רכישת ניידות יונים, השתמש בזמן הצטברות קבוע ורמפה של 100 אלפיות השנייה.
   4. השג נתונים במצב DDA-PASEF באמצעות אותם פרמטרים המפורטים בשלב 4.6.
8. עבור ניתוח DIA, השתמש ברוחב חלון בידוד של 25 m/z על פני תחום המסה של 400-1200 m/z. השתמש באותן הגדרות ניסיוניות של ניידות יונים (IMEX) המשמשות בשיטת DDA.
   1. הגדרות DIA נוספות כוללות רמפה אחת של MS1 ואחריה 16 רמפות MS/MS למחזור, מה שמניב זמן מחזור כולל של 1.8 שניות.
   2. השתמש בפעולת השירות DIA-PASEF של פרוטאומיקה המוגדרת כתבנית לפיתוח שיטת DIA. לאחר יצירת שיטת DIA, טען אותה ללשונית השיטה של Hystar. אין צורך בהפעלה של מצב DIA.
      הערה: פעולת השירות DIA תירשם אוטומטית לאחר הטעינה בהצלחה.

5. עיבוד נתונים

הערה: לאחר רכישת נתונים, יש לבצע זיהוי פפטידים באמצעות כלים ביואינפורמטיים כגון PEAKS Online, PEAKS Studio, MSFragger, Maxquant או פלטפורמות דומות. מחקר זה השתמש ב-Peaks Online, המסוגל לעבוד עם נתונים גולמיים בפורמט .d.

1. חיפוש במאגרי מידע
   1. השתמש במסד נתונים ייחוס מתאים לחיפושי פפטידים, כגון מסד נתונים של פפטידים לאיתות חולדות, פרוטאום של חולדה או הפרוטאום האנושי, או מסד נתונים של פפטידי איתות שנאסף בהתבסס על מקור הדגימה.
      הערה: ניתן להשיג מאגרי מידע אלה ממקורות אמינים כגון NCBI או UniProt (https://www.uniprot.org/). הערה: רק חלבון או פפטידים במסד הנתונים יזוהו. נתוני אות החולדה נאצרו על ידי סינון פרוטאום החולדה על ידי ביאור "פפטיד האות" ב-UniProt. במונחי Uniprot, סינון על ידי "פפטיד אותות" פירושו צמצום הפרוטאום לחלבונים המעורבים בהפרשה, לוקליזציה של הממברנה או סחר מדור. מסד נתונים מותאם אישית זה מכיל 5630 חלבונים. הגבלת גודל מסד הנתונים של החלבונים מ-50,000 ל-5,000 מציעה מספר יתרונות. ראשית, הוא משפר את ביטחון הזיהוי על ידי הפחתת הסבירות להתאמות אקראיות של ספקטרום פפטידים, ובכך מגדיל את הדיוק של הקצאות פפטידים. שנית, מסד נתונים קטן יותר משפר את היעילות החישובית, ומאפשר זמני עיבוד מהירים יותר והפחתת הביקוש למשאבי חישוב. שלישית, מסד נתונים תמציתי יותר יכול להוביל לשליטה טובה יותר בשיעור הגילוי השגוי (FDR), וכתוצאה מכך זיהויי חלבון אמינים וחזקים יותר מבחינה סטטיסטית. עם זאת, מסד הנתונים צריך להיות גדול יחסית כדי למנוע אינפלציה מלאכותית של ציוני ביטחון והערכה לא מדויקת של FDR.
   2. הגדר את חיפוש מסד הנתונים בממשק המשתמש הגרפי של התוכנית עם הפרמטרים המומלצים הבאים: סובלנות לשגיאות מסה מבשר: 10-25 עמודים לדקה; סובלנות לשגיאת מסת שבר: 0.01-0.05 Da; ספציפיות אנזימים: אין (עיכול לא ספציפי); טווח אורך פפטיד: 4-45 חומצות אמינו.
   3. הגדר את קבוצת ה-PTM שתיכלל בחיפוש.
   4. לאחר השלמת החיפוש במסד הנתונים, ייצא את קבצי pepxml ו-mzXML (או MGF) המתאימים לכל חלון ניידות יונים, כולל טווח הניידות המלא הסטנדרטי (0.6-1.6 V·s/cm²).
2. בניית ספריית קו רקיע
   1. פתח את Skyline וצור מסמך חדש, ודא שממשק Proteomics נבחר והשתמש בהגדרות ברירת המחדל אלא אם צוין אחרת.
   2. נווט אל File > Import > Peptide Search.
   3. באשף חיפוש ייבוא פפטידים , בחר בנה והוסף את קבצי ה- pepxml הרלוונטיים (ודא שקבצי mzXML או MGF המתאימים נמצאים באותה ספריה).
   4. הגדר/י פפטידים סטנדרטיים של iRT ל ״אוטומטי״, בחר /י DIA כתהליך העבודה ולחץ/י על ״הבא״.
   5. לאחר בניית הספרייה, בחר כ-10-15 פפטידים כתקני iRT עבור יישור בין שכפולים. אם תתבקש לכייל מחדש את iRT, לחץ על אישור כדי להמשיך.
   6. בדף 'חילוץ כרומטוגרמות ', לחצו על 'עיון' כדי לבחור ולייבא את כל קובצי ה-DIA הגולמיים, ואחר כך לחצו על 'המשך'.
   7. בחלון הגדרות מעבר , הגדר את טווח החיובים המקדימים ל-1-5, טעינות המוצר נעות ל-1-3, סוגי יונים ל-,p,y,b והגדר את בחירת היונים של המוצר מיון 2 ליון האחרון. הגדרות מומלצות אחרות: סובלנות התאמת יונים: 0.05 Da, פסגות לבחירה: 5.
   8. בחלון הגדרות פפטיד , הגדר שינויים התואמים להגדרת החיפוש Peaks המתוארת ב- 4.1.3.
   9. בדף Isolation Scheme , הזן שם עבור הבידוד והסכמה ובחר Prespecified Isolation Windows. לחץ על ייבוא וטען אחד מקבצי ה-DIA כדי לייבא אוטומטית את תצורת חלון הבידוד של הניסוי.
   10. הגדר הגדרות רכישת סריקה מלאה עם הפרמטרים הבאים. שיטת רכישה: DIA; מנתח מסת מוצר: ממורכז; סכימת בידוד: השתמש בזו שהוגדרה לעיל; דיוק מסה: 10-20 עמודים לדקה; כוח פתרון ניידות: 30-50; הפעל את השתמש רק בסריקות תוך 5 דקות מה-RT החזוי; לחלופין, שנה את סינון MS1 אם יש צורך בייבוא כרומטוגרמות MS1. בחר מנתח מסה ורזולוציה מתאימים למיצוי כרומטוגרמה MS1 אופטימלי.
   11. ייבא FASTA וצור פיתויים. הגדרת שיטת יצירת פיתיון: רצף ערבוב.
   12. בחר אנזים: העיכול אינו ספציפי בניתוח פפטידים אנדוגניים. ערכו את האנזים על ידי בחירה באפשרות Add מתפריט האנזים הנפתח. הגדר את שם האנזים, סוג לשניהם, חתך את מסוף c ל-KR וחתך את מסוף ה-N ל-KR , אפשר מחשוף למחצה ולחץ על אישור. הגדר מחשופים שהוחמצו ל-3.
   13. ייבא את קובץ ה- FASTA היעד ולאחר מכן לחץ על סיום. אשרו את דף החלבונים המשויכים אם תתבקשו.
   14. ודא שהספרייה הספקטרלית נוצרה בהצלחה ושנתוני DIA יובאו. בדוק ידנית את רשימת הפפטידים שזוהו והמשך בניתוח כמותי ואיכותני במורד הזרם.
3. מדידות איכותיות וכמותיות
   הערה: הניתוחים האיכותיים והכמותיים נעשים ב-Skyline. לפרטים על ניתוח נתוני DIA ב-Skyline, בקר https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorial_dia_swath.
   1. אם נטענים נתוני DDA, בחר Settings > Transition Setting מהתפריט, בחר DDA ב-Acquisition Method; בהגדרות > הגדרת פפטיד, בחר רמת MS 1 לכימות.
   2. אם נתוני DIA נטענים, הגדרות > הגדרת מעבר, בחר DIA בשיטת רכישה; בהגדרות > הגדרת פפטיד, בחר רמת MS 2 לכימות.
   3. ב ״תצוגה > רשת המסמך״, בחר/י ״כימות פפטיד״ ולאחר מכן ״ייצא את גיליון העבודה״. שלב את הגיליונות האלקטרוניים מתוצאות DDA ותוצאות DIA.
      הערה: הגיליון האלקטרוני מסכם את אזורי השיא עבור כל הפפטידים בספרייה בכל הדגימות. בניסוי זה, אזורי שיא הפפטידים נורמלו לפפטיד תקן זמן השמירה GISNEGQNASIK, שהוא חלק מתערובת זמן השמירה של פירס. הנורמליזציה בוצעה על ידי חישוב היחס בין שטח השיא של כל פפטיד לזה של התקן.

Results

תוכנית ניסויים מייצגת מוצגת באיור 1. ניתוח נתוני DDA-PASEF (איור 2) שנרכשו הן באמצעות תחום ניידות היונים הסטנדרטי והן באמצעות IM-GPF חשף כיסוי פפטידי גבוה משמעותית עבור גישת IM-GPF (איור 2B). יש לציין כי רוב הפפטידים שזוהו בשיטת DDA-PASEF הסטנדרטית חפפו לאלה שנמצאו במערך הנתונים IM-GPF. כדי למקסם את כיסוי זיהוי הפפטידים, נוצרה ספרייה ספקטרלית מקיפה על ידי שילוב זיהויים משתי הגישות.

ניתוח מסד נתונים נוסף של מערכי נתונים משוכפלים שנרכשו באמצעות DDA ו-DIA-PASEF (איור 3), תוך שימוש במסד נתונים של פפטידי איתות חולדות, חשף 217 חלבונים המשותפים לשתי השיטות. בנוסף, 115 חלבונים זוהו באופן ייחודי על ידי DIA-PASEF, בעוד ש-69 היו בלעדיים ל-DDA-PASEF. ניתוחי גישוש תוך שימוש בספריות ספקטרליות שמקורן בנתוני DDA ו-IM-GPF הראו כי DIA-PASEF איפשר זיהוי בטוח של נוירופפטידים כגון NPAFLFQPQRF (נוירופפטיד SF) ו-YGGFMRRVGRPEWWMDYQ (נגזר מפרואנקפלין). נוירופפטידים אלה לא זוהו באופן מהימן במערכי הנתונים המתאימים של DDA-PASEF עקב הקצאת שיא לקויה (איור 3B,C).

מנקודת מבט כמותית, תרשים הפיזור באיור 4A חושף מתאם חיובי בינוני בין עוצמת מבשר DDA לעוצמת יונים של שבר DIA, כצפוי בהתחשב בכך ששתי הגישות מכמתות את אותם פפטידים אך לוכדות סוגי יונים שונים. תרשימי הקופסה עבור פפטידים נבחרים המוצגים באיור 4B ממחישים עוד יותר את יכולת השחזור של המדידות הכמותיות המתקבלות על ידי שתי הגישות. תרשימי הקופסה מציגים את אזורי השיא היחסיים עבור כל פפטיד שנמדד על ידי DIA ו-DDA, עם פסי שגיאה המייצגים שונות מדידה בין שכפולים טכניים. הפפטידים שנבחרו נגזרים מפרו-הורמונים אופיואידים, כולל פרואנקפלין (PENK) ופרודינורפין (PDYN), שניהם ממלאים תפקידים מרכזיים בוויסות כאב ושיכוך כאבים.

איור 1: סקירה כללית של זרימת העבודה של פפטידומיקה לזיהוי וכימות של פפטידים אנדוגניים מרקמת מוח של חולדות. זרימת העבודה כוללת דיסקציה של רקמות, מיצוי וטיהור פפטידים, רכישת נתונים של LC-ION MOBILITY-MS (LC-IM-MS) באמצעות פיצול פאזת גז (IM-GPF), ועיבוד נתונים ליצירת ספריות ספקטרליות וביצוע ניתוח כמותני. חלקים מהדמות נוצרו ב-BioRender. טאן, י. (2025) https://BioRender.com/vrejrsk. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: זיהוי פפטידים וחלבונים של מסד נתונים. (A) תרשים עמודות המשווה את המספר הכולל של קודמנים, התאמות ספקטרום-פפטיד (PSMs) ופפטידים ייחודיים שזוהו על פני חלונות ניידות יונים שונים. (B) תרשים עוגה הממחיש את שיעור הפפטידים המזוהים בדרך כלל בכל חלונות הניידות ואלה שזוהו באופן ייחודי בתוך חלונות בודדים. (ג,ד) מפות חום המתארות את התפלגות אותות היונים על פני ממדי הניידות m/z והיונים עבור טווח הניידות המלא (0.6-1.6 V·s/cm²) (C) וחלון הניידות המוגבלת (0.6-1.0 V·s/cm²) (D). (E) תרשים נסער המציג את מספר החלבונים שזוהו במערכי נתונים שנרכשו בשיטות DDA ו-DIA, תוך הדגשת זיהויי חלבונים משותפים וייחודיים. (F) מפת חום המייצגת פפטידים שמקורם במבשר הפרואנקפלין שזוהה בשכפולים שנרכשו על ידי DIA (פאנל עליון) ושכפולים שנרכשו על ידי DDA (פאנל תחתון). לאו-אנקפלין לא זוהה בשניים מתוך ארבעת שכפולי ה-DDA, מה שמצביע על ערכים חסרים פוטנציאליים ברכישה מבוססת DDA. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ניתוח השוואתי וגישושי של נתוני DDA-PASEF ו-DIA-PASEF באמצעות ספריות ספקטרליות. (A) יישור זמן השמירה של נוירופפטיד SF על פני DIA ו-DDA-PASEF משכפל. (B) EIC של PENK (212-229) שברי יונים ממערכי נתונים של DIA (למעלה) ו-DDA (למטה). (C) כרומטוגרמות יונים של נוירופפטיד SF מ-DIA משכפלות המדגימות קו-פליטה גבוהה ואיכות ספקטרלית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: השוואה של מדידות כמותיות בין DIA-PASEF (רמת MS2) ו-DDA-PASEF (רמת MS1). (A) תרשים פיזור זה משווה את עוצמות אותות הפפטיד המתקבלות באמצעות אופני DIA ו-DDA. באופן ספציפי, ציר ה-x מייצג את אזור השיא של מבשר ה-log₁₀ שעבר טרנספורמציה מ-DDA, בעוד שציר ה-y מציג את אזור השיא של שבר_{ה-log 10} שעבר טרנספורמציה מ-DIA עבור כל פפטיד. (B) תרשימי קופסה מייצגים את אזורי השיא היחסיים של ארבעה פפטידים מייצגים, PENK 107-133, PENK 188-195, PDYN 221-233 ו-PDYN 235-248. קווי שגיאה מייצגים שונות בין שכפולים טכניים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

בפפטידומיקה, במיוחד בעת ניתוח פפטידים אנדוגניים, שימור פרופיל הפפטיד המקורי חיוני לשלמות הנתונים ולפרשנות ביולוגית. זלוף מי מלח קר לא רק מסיר דם אלא גם מקרר את המוח, מה שמפחית משמעותית את הפירוק הפרוטאוליטי לאחר המוות המתרחש במהירות עקב פעילותם של פרוטאזות אנדוגניות. על ידי הורדת טמפרטורת המוח, הפעילות האנזימטית מואטת ופרוטאזות במחזור נשטפות מכלי הדם, תוך הפחתת שינויים מטבוליים לאחר המוות^25,26. החדרת מי מלח קרים כקרח גם שוטפת את הדם מכלי הדם של המוח. שלב זה חשוב במיוחד, מכיוון שהדם מכיל חלבונים בשפע גבוה (כגון אלבומין וגלובולינים) ופרוטאזות במחזור שיכולות להפריע לזיהוי נוירופפטידים. פירוק לאחר המוות של חלבוני דם בשפע יכול להגביר את המורכבות של תמציות נוירופפטידים ולהסוות אותות בשפע נמוך, ובסופו של דבר לפגוע הן בזיהוי והן בכימות 25,26,27. הקפאה מיידית של רקמת המוח, בין אם על קרח יבש או באמצעות הקפאה מהירה באיזופנטן מקורר, עוצרת תהליכים אנזימטיים כמעט באופן מיידי. שימור זה חשוב במיוחד לאיתור נוירופפטידים בוגרים בשפע נמוך ובאורך מלא ולהבטחת כימות אמין. ללא שלבים אלה, פירוק פפטידים יכול להוביל לשונות מוגברת ולחפצים הפוגעים הן בזיהוי והן בכמות. לפיכך, הסרת דם, זלוף קר וקירור מוחי מהיר הן טכניקות בסיסיות המשפיעות ישירות על האיכות, הרגישות ויכולת השחזור של נתוני פפטידומיקה לפני המדידות.

ניתוח של פפטידים שחולצו ממוח חולדה חשף נוכחות של שתי פלומות ניידות יונים נפרדות (איור 2C,D). ניתן לייחס תופעה זו למחלקות מולקולריות שונות או למצבי מטען משתנים של הפפטידים. אם הפלומה תואמת למחלקות מולקולריות נפרדות, מינים שאינם פפטידים עשויים להתחרות עם פפטידים על ברירה ופיצול. כמו כן, אם ההפרדה נובעת מהבדלים במצבי המטען, הפלומה המכילה פפטידים טעונים מאוד צפויה להניב ספקטרום MS/MS באיכות גבוהה יותר, מה שמקל על זיהוי פפטידים בטוח יותר.

כדי לחקור זאת, יישמנו אסטרטגיית פיצול ניידות יונים, והשגנו נתונים על פני שלושה חלונות ניידות בדידים: 0.6-1.0, 0.9-1.3 ו-1.2-1.6 V·s/cm². חלונות אלה משתרעים ביחד על פני טווח ניידות היונים המלא המנותח בדרך כלל בניסויים סטנדרטיים של DDA-PASEF עבור פפטידים. כפי שמודגם באיור 2, למרות שהמספר הכולל של קודמנים שזוהו היה הגבוה ביותר בטווח הסריקה המלא (0.6-1.6 V·s/cm²), נצפה מספר גדול יותר משמעותית של התאמות ספקטרום פפטידים (PSMs) בחלון של 0.6-1.0 V·s/cm² . ממצא זה מצביע על כך שנוכחותן של שתי פלומות אכן עשויה לנבוע מהפרעות של מולקולות אחרות.

פיצול קודמן מבוסס ניידות יונים הביא לעלייה של 30% בכיסוי הפפטידים בהשוואה לשיטת הסריקה המלאה הקונבנציונלית. כ-82% מהפפטידים שזוהו במערך הנתונים של הסריקה המלאה חפפו לפפטידים שזוהו באמצעות פיצול (איור 2B), מה שמדגיש את העקביות והחוסן של אסטרטגיית הפיצול. בהתבסס על תצפיות אלה, השתמשנו בפיצול ניידות היונים ובנתוני הסריקה המלאה כדי לבנות ספריות ספקטרליות לניתוח כמותי של פפטידים נוירואנדוקריניים באמצעות DIA-PASEF.

ניתוח מסד נתונים של מערכי נתונים משוכפלים שנרכשו באמצעות DDA ו-DIA חשף מספר גבוה יותר של זיהויי פפטידים וחלבונים בנתוני DIA, כולל 115 חלבונים שזוהו באופן ייחודי על ידי DIA (איור 2E). אלה כללו נוירופפטידים כגון פפטידים הקשורים ל-Pro-FMRFamide FF ו-VF. לעומת זאת, 69 חלבונים זוהו באופן בלעדי על ידי DDA, שרבים מהם קשורים להידבקות תאים והתפתחות עצבית. ממצאים אלה מצביעים על כך שניתן ליישם מתודולוגיות DDA ו-DIA בצורה משלימה כדי להשיג כיסוי פפטידי רחב יותר.

ניתוח נוסף הראה כי רכישת DIA מטפלת ביעילות בחלק מבעיית הערך החסר שנתקלים בה לעתים קרובות בניתוח פפטידים אנדוגניים באמצעות DDA. לדוגמה, Leu-enkephalin זוהה רק בשניים מתוך ארבעה שכפולים של DDA (איור 2F, פאנל תחתון), בעוד שהוא זוהה באופן עקבי בכל ארבעת שכפולי ה-DIA (איור 3F, הפאנל העליון).

Skyline, פלטפורמה בשימוש נרחב לפרוטאומיקה כמותית, שימשה לניתוח מערכי נתונים של DDA ו-DIA-PASEF²⁸. התוכנה מאפשרת זיהוי פפטידים באמצעות התאמת ספרייה ספקטרלית, פליטת יונים משותפת של שברים ויישור זמן שמירה. כדי להעריך את היכולת של DIA-PASEF להפחית את הזיהוי החסר, ביצענו הערכה איכותית של פפטידים שזוהו באופן בלעדי במערך הנתונים של DIA.

כפי שמוצג באיור 3D, נוירופפטיד SF זוהה באופן עקבי בכל שכפולי ה-DIA באותו חלון זמן שמירה. הגילוי בשכפולי ה-DDA הראה שונות ניכרת, עם זמני שימור שנעו בין 25 דקות ל-45 דקות (איור 3A). חוסר העקביות שנצפה, כולל הקצאות שגויות שיא עם ציוני ביטחון נמוכים, נבעו ככל הנראה מכיסוי יונים מוגבל או באיכות נמוכה, כפי שמוצג באיור 3B. לעומת זאת, איור 3C מראה כי יוני שבר המתאימים לנוירופפטיד SF היו מיושרים היטב על פני כל שכפולי ה-DIA, ותמכו בזיהוי אוטומטי בטוח.

השוואה של האיכות הספקטרלית של MS/MS עבור פפטיד PENK (212-229), שמקורו בפרואנקפאלין, הדגימה עוד יותר את היתרונות של DIA-PASEF. ספקטרום שהתקבל מ-DIA הראה עוצמה גבוהה יותר ואיכות יוני מקטע משופרת ביחס ל-DDA (איור 3), מה שמועיל במיוחד לאיתור פפטידים אנדוגניים בשפע נמוך.

ניתוח כמותי אישר כי DIA-PASEF הניב מדידות עקביות וניתנות לשחזור על פני שכפולים ביולוגיים, עם ביצועים דומים ל-DDA (איור 4). יתר על כן, DIA איפשר כימות ברמת MS2, והציע ספציפיות ברמת יונים של שבר וביטחון מוגבר בזיהוי פפטידים ביחס ל-DDA מבוסס MS1. ממצאים אלה תומכים בשימוש ב-DIA-PASEF כגישה אמינה ויעילה לכימות נוירופפטידים ממוקד במטריצות ביולוגיות מורכבות, במיוחד כאשר שלמות הנתונים ויכולת השחזור הם קריטיים.

פרוטוקול זה מתווה אסטרטגיה מקיפה לניתוח וכימות נוירופפטידים. גישת IM-GPF מקלה על בניית ספריות ספקטרליות באיכות גבוהה. בעוד ש-DIA-PASEF מציע יכולת שחזור משופרת וכיסוי פפטידים מוגבר בהשוואה ל-DDA-PASEF, הוא גם משפר את הכימות המבוסס על MS2. שילוב שתי אסטרטגיות הרכישה מגדיל את כיסוי הפפטידים הכולל, מכיוון שכל שיטה תורמת באופן ייחודי לזיהוי פפטידים מובחנים (איור 2E). המגבלה של פרוטוקול זה היא הדרישה לחומר מדגם בשפע כדי לתמוך הן ביצירת ספרייה ספקטרלית והן ברכישת נתונים באמצעות שיטות DDA ו-DIA-PASEF.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% חומצה פורמית מים	פישר סיינטיפיק	LS118-500	LC/MS
חומצה אצטית	פישר סיינטיפיק	A11350	LC/MS כיתה
אצטוניטריל	פישר מדעי	AA47138K7	בדרגת LC/MS
	פישר מדעי	PI28905	LC/MS כיתה
מתנול	פישר מדעי	AA47192K7	עמודי סיבוב בדרגת LC/MS
nanoELute2	Bruker	N/A
Pierce C18 עמודי ספין	פישר סיינטיפיק
תערובת כיול זמן שימור פפטיד פירס	תרמו פישר	A11351	בדרגת LC/MS
	ז'נבה	https://scientificproducts.com/product_cat/benchtop-solvent-evaporators/	הדגם הספציפי ששימש במחקר זה אינו זמין עוד מהיצרן. קישור לדגם המקביל הנוכחי מסופק לזמני
התייחסותTOF Pro2	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-pro-2.html
Water	Fisher Scientific	AA47146M6	דירוג LC/MS