הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכנת התפשטות כרומוזומים מיוטיים מביציות עכבר להערכת סינפסה ורקומבינציה

2.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68749

⸱

18 ביולי 2025

1Department of Biomedical Sciences, Cornell University, 2Cornell Reproductive Sciences Center, Cornell University

במאמר זה

סיכום

שגיאות מיוטיות בסינפסות ורקומבינציה נפוצות בביציות של יונקים. ניתוח קפדני של חלבונים המעורבים בתהליכים אלה חיוני להבנה כיצד ומדוע ביציות משתבשות לעתים קרובות. הטכניקות המוצגות כאן מאפשרות ניטור מקיף של רקומבינציה וסינפסות כדי להעריך את איכות הביציות בעכברים.

תקציר

שלושה תהליכים קריטיים ותלויים זה בזה מגדירים את הפרופאזה המיוטית I: כרומוזומים הומולוגיים חייבים להזדווג יחד, מבנה חלבוני הנקרא הקומפלקס הסינפטונמלי נוצר כדי לקשור הומולוגים יחד (סינפסיס), והומולוגים עוברים רקומבינציה, מחליפים הדדית חומר גנטי ליצירת הצלבות (COs). טעויות בתהליכים אלה עלולות לגרום לאי ספיקת שחלות מוקדמת, אנופלואידיה, ובסופו של דבר, אובדן הריון ואי פוריות. רקומבינציה מיוטית מועדת במיוחד לטעויות בביציות, כאשר למעלה מ-7% מהביציות האנושיות מכילות לפחות זוג כרומוזומים אחד ללא הצלבה, ובין 20%-80% מהביציות לעומת 2.5%-7% מהזרע הן אנופלואידיות. עם זאת, עדיין לא ברור מדוע שגיאות כרומוזומליות מראות פערים כה בולטים בין המינים. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות להכנה וניתוח של התפשטות כרומוזום ביצית I ומטפאזה I מעכברים עובריים וצעירים, בהתאמה. כדי לעקוב אחר דינמיקת כרומוזומים קריטית לאורך פרופאזה מיוטית I, פרוטוקול זה משתמש בצביעה אימונופלואורסצנטית של סמנים נפוצים לרקומבינציה מיוטית (RAD51 לשבירות גדיל כפול, MSH4 למתווכי CO ו-MLH1/MLH3 לזיהוי רוב ה-COs) וסינפסיס (SYCP3 לצירי כרומוזומים, SYCP1 לאזורים סינפסיים ו-HORMAD1 לאזורים אסינפסיים). יתר על כן, פרוטוקול זה משתמש בהבשלה חוץ גופית של ביציות שנאספו כדי להעריך את מספר הכרומוזומים הזוגיים (דו-ערכיים) ואת המספר הכולל של הצלבות (כיאזמטה) במטפאזה I. יחד, טכניקות אלו מספקות מסגרת מקיפה וכמותית לבחינת מנגנונים המווסתים את הדינמיקה המוקדמת של הכרומוזומים במיוזה נשית.

מבוא

מיוזה היא חלוקת תאים מיוחדת החיונית לייצור גמטות הפלואידיות. במהלך הפרופאזה I, כרומוזומים הומולוגיים (כל אחד מהם מורכב מכרומטידות אחיות המוחזקות יחד על ידי קוהיזין) חייבים לבצע שלוש משימות קריטיות: 1) לזהות ולהזדווג זה עם זה, 2) לרוץ יחד על ידי יצירת הקומפלקס הסינפטונמלי (SC) בין הצירים הרוחביים שלהם, ו-3) להחליף DNA באמצעות רקומבינציה הומולוגית, וכתוצאה מכך הצלבות (COs) בין כרומטידות שאינן אחיות 1,2. החיבור הפיזי הנובע מהיווצרות הצלבה, הנשמר על ידי קוהסין, מבטיח דו-כיוון והפרדה תקינים של כרומוזומים במהלך המטפאזה I 3,4,5.

פרופאזה מיוטית I מורכבת מחמישה שלבים, כל אחד מוגדר על ידי הסטטוס של סינפסיס6. בלפטונמה (ביוונית חוט דק), הכרומוזומים מתעבים כאשר האלמנט הצירי (המסומן על ידי SYCP3) נוצר לאורך צירי הכרומוזומים. במהלך זיגונמה (חוטים מחוברים), הומולוגים מתחילים לסינפסה כאשר האלמנט הרוחבי של ה- SC (SYCP1) נוצר בין צירים7. בפכינמה (חוט עבה), הכרומוזומים מסונפסים לכל אורכם. לאחר מכן ה-SC מתפרק במהלך דיפלונמה (שני חוטים), ומשאיר הומולוגים מחוברים רק באתרי הצלבה (chiasmata). Chiasmata הם תוצר של רקומבינציה הומולוגית, תהליך שהחל באינדוקציה מתוכנתת של שבירות DNA כפולות גדיל (DSBs). ממאות DSBs, רק ~10% הופכים ל-COs. בעכברים, רובם (90%-95%) נוצרים דרך מסלול CO מסוג I המבוצע על ידי MutLγ (MLH1-MLH3), כאשר שאר ה-COs מיוצרים על ידי MUS81-EME1 דרך מסלול CO Class II 8,9,10,11.

זיווג, סינפסה ורקומבינציה הם תהליכים מווסתים ותלויים זה בזה. שגיאות בדרך כלל מפעילות מנגנוני מחסום, מה שמוביל למוות של תאים. אצל נקבות, אובדן תאי נבט משגיאות מוקדמות של פרופאזה I יכול לגרום לאי ספיקת שחלות מוקדמת12,13, בעוד ששגיאות מאוחרות (למשל, הומולוגים לא מצליחים ליצור COs, מיקום לא נכון של COs או אובדן קוהיזין מוקדם) עלולות להוביל לאי ספיקת כרומוזומים ואנופלואידיה. בבני אדם, טעויות מיוטיות הן הגורם המוביל לאובדן הריון ואי פוריות. מיוזה נשית מועדת במיוחד לטעויות. כ-20%-80% מהביציות האנושיות (לעומת 2.5%-7% מהזרע) נושאות מספרי כרומוזומים חריגים, רובם נובעים מטעויות בחלוקה המיוטית הראשונה 14,15,16,17. למרות שהגיל זוהה כגורם הגדול ביותר לאנופלואידיה אימהית, הסיבה לכך שביציות רגישות כל כך לטעויות נותרה לא ברורה.

למרות החשיבות של הבנת הגורמים העומדים בבסיס שיעורי שגיאה גבוהים בביציות, רוב הידע שלנו על ויסות אירועי פרופאזה I מגיע ממחקרים על מיוזה זכרית. מכיוון ששבר קטן של חומר אשך בוגר מספק מספיק חומר להערכת כל השלבים של תאי נבט מיוטיים ופוסט-מיוטיים, מיוזה זכרית נגישה זה מכבר לחוקרים. לעומת זאת, מיוזה נשית מתרחשת בצורה לא רציפה. בעכברים, פרופאזה I מתקדמת באופן חצי סינכרוני בשחלה העוברית, החל מסביבות 14 יום לאחר קיום יחסי מין (dpc; איור 1A), זמן קצר לאחר קביעת מין בלוטת המין 18,19,20. בסביבות מועד הלידה, הביציות נכנסות למעצר דיקטיבי עד לחודשי הביוץ (בעכברים) או עשרות שנים (בבני אדם) מאוחר יותר 21,22,23. כתוצאה מכך, שלבי פרופאזה I ספציפיים נגישים רק במהלך חלונות התפתחות מוגבלים (איור 1A), כאשר אירועים פוסט-פרופאזה I מתרחשים רק בביציות בודדות בכל פעם אצל צעירים ובוגרים. למרות שההתקדמות הטכנולוגית שיפרה את מחקרי המיוזה של ביציות יונקים, שיטות אלה נותרו מאתגרות וגוזלות זמן בהשוואה לטכניקות דומות המשמשות במחקרים זכריים.

ניתוח מיוטי נשי מסובך עוד יותר על ידי מגבלה בביציות פצ'יטן תת-קשורות - קריטי לחקר ייעוד והתבגרות מוצלבת. מחקרים גברים נהנים מדינמיקת זיווג כרומוזומי מין מאופיינת היטב ומנוכחות וריאנט ההיסטון, H1t, המשמשים כסמנים לפכינמה מוקדמת, אמצעית ומאוחרת 24,25,26. עם זאת, לא גובשה שיטה אמינה לביצוע ביציות פצ'יטן.

הפרוטוקולים המוצגים כאן מאפשרים ניתוח מקיף של סינפסיס ורקומבינציה בביציות עכברים מפרופאזה מוקדמת I ועד מטאפזה I. עבודה זו מתבססת על טכניקות התפשטות כרומוזומים קלאסיות שפותחו על ידי פיטרס ואחרים 27 וטרקובסקי28 ושכלולים קודמים של שיטות אלה על ידי האנט29 וסאן וכהן30. פרוטוקול זה פותח כדי להדגיש: 1) העשרה וזיהוי של תת-שלבים ספציפיים של פרופאזה I, 2) מקסום מספר היישומים המבוצעים לכל זוג שחלות עובריות, ו-3) מדדים יסודיים ונגישים להערכת פגמים בסינפסיס ורקומבינציה ממוקדים לכיאזמטה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הטיפול וההליכים בבעלי חיים בוצעו לאחר אישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של קורנל (IACUC) תחת פרוטוקול 2004-0063.

1. הכנת שקופית התפשטות כרומוזום ביצית פרופאזה I

  1. בשעות אחר הצהריים המאוחרות, קבעו הזדווגות מתוזמנת של עכברים נקבות C57BL/6J (בגילאי 2-6 חודשים) עם זכרים (בני 2-12 חודשים). החל מהיום למחרת, בדוק את הנקבות בכל בוקר (לפני 9 בבוקר) אם יש פקק הזדווגות. הצהריים ביום התקע מוגדר כ-0.5 dpc.
  2. הכינו את הדברים הבאים לפני הקרבת עכברים בהריון.
    1. הגדר תא לח עם טמפרטורת החדר H2O.
    2. הכן 10 מ"ל של מאגר מיצוי היפוטוני (HEB; ראה טבלה 1) המורכב מ-30 מ"מ Tris-HCl, 50 מ"מ סוכרוז, 17 מ"מ נתרן ציטראט, 5 מ"מ EDTA, 2.5 מ"מ DTT ו-0.5 מ"מ PMSF במי Milli-Q. לפני הוספת DTT ו-PMSF, התאם את ה-pH ל-8.2 - 8.4 באמצעות חומצה בורית של 50 מ"מ. הפוך את HEB לטרי והשתמש תוך שעתיים מהוספת DTT.
    3. הכן 100 מ"מ סוכרוז על ידי הוספת 342 מ"ג סוכרוז ל-10 מ"ל של H2O טהור במיוחד.
    4. מחממים מראש H2O טהור במיוחד במיקרוגל רגיל למשך דקה אחת (עד 90 - 95 מעלות צלזיוס). מתחת למכסה אדים, הוסף את ה-H2O האולטרה-טהור המחומם ל-0.5 גרם פרפורמלדהיד (PFA). מוסיפים שתי טיפות של 1 N NaOH, מערבולת לערבוב ומניחים להתקרר לטמפרטורת החדר. התאם את ה-pH ל-9.2 - 9.3 באמצעות חומצה בורית של 50 מ"מ והוסף טריטון X-100 ל-0.15% (v/v). הוסף H2O טהור במיוחד לנפח סופי של 50 מ"ל (תמיסת קיבוע PFA 1%) ושפך את הקיבוע לצנצנת זכוכית של 50 מ"ל קופלין.
      הערה: פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה באמצעות מים כמעט רותחים להכנת PFA; עם זאת, חימום PFA בתמיסה מעל 65 מעלות צלזיוס עלול לגרום לפירוק ושחרור אדים רעילים. לחלופין, יש לחמם מראש H2O עד 60 מעלות צלזיוס באמבט מים.
    5. שקופיות מיקרוסקופ זכוכית נקיות עם 70% אתנול. השתמש בעט PAP מחסום הידרופובי כדי לצייר עד שלושה ריבועים (כ-20 x 20 מ"מ; ראה איור 1E). זוג שחלות בודד יספק חומר מספיק לשישה ריבועים (או שתי שקופיות של 3 ריבועים, כל אחת).
  3. הקרבת עכברים בהריון 14.5 - 18.5 dpc על ידי חנק CO2 ופריקת צוואר הרחם על פי הנחיות IACUC.
    1. נקודות זמן להעשרה של שלבים ספציפיים של פרופאזה I בעכברי C57BL/6J מתוארות באיור 1A. עבור נקודות הזמן ההתפתחותיות הנתונות, האחוז המשוער של הביציות בכל שלב של פרופאזה I סופק באמצעות נתונים מ-Evans et al. (1982)31. עבור ביציות זיגוטן, יש לאסוף על 16.5 dpc; פצ'יטן מוקדם על 17.5 dpc; ואמצע פצ'יטן - דיפלוטין ב-18.5 dpc.
  4. השתמש במספריים לדיסקציה כדי לפתוח את חלל הבטן ולהסיר את קרני הרחם.
  5. נתח את העכברים העובריים מקרן הרחם, הרקמה העציונית ושק החלמון. מניחים עכברים עובריים בצלחת פטרי 100 מ"מ עם 1x מי מלח פוספט (PBS).
  6. לנתח שחלות מעובר נקבה אחד בכל פעם תוך שמירה על השאר ב-PBS 1x. להקריב עכברים עובריים על ידי עריפת ראשים בהתאם להנחיות IACUC. בעזרת סיכות דגימה מנירוסטה, אבטח את משטח הגחון של פלג גוף עליון עד לכרית סיליקון בצלחת דיסקציה.
  7. השתמש במספריים מיקרו-דיסקציה כדי לבצע חתך בבטן ממש מתחת לטבור, היזהר להימנע מחתך עורקים. השתמש במלקחיים עדינים כדי לעקור את המעי עד שקרני הרחם של העובר נראות לעין.
  8. כדי לאתר את השחלות, עקוב אחר כל קרן רחם החוצה משלפוחית השתן לכיוון הכליה. השחלה וצינור הביצית יופיעו כמבנים כדוריים קטנים בקצה קרני הרחם, הממוקמים ממש מתחת לכליה וליד החלק האחורי של חלל הצפק (איור 1B).
  9. השתמש במלקחיים עדינים כדי לצבוט את השחלות ולאסוף אותן בכוס שעון קטנה מלאה ב-750 מיקרוליטר של 1x PBS.
  10. נתחו את השחלה מהרקמות שמסביב והניחו את שתי השחלות בכוס שעון המכילה 750 מיקרוליטר HEB, תוך הקפדה על כך שהשחלות שקועות לחלוטין (ראו איור 1C ו-1D). דגרו על השחלות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  11. פיפטה 35 מיקרוליטר של סוכרוז 100 מ"מ על מגלשת קעורה. השתמש במלקחיים עדינים כדי להעביר את שתי השחלות מ-HEB לסוכרוז.
  12. השתמש במחט 25G כדי להדק את השחלה לשקופית תוך שימוש במחט שנייה, משופעת כלפי מטה, כדי ללחוץ החוצה את הביציות מהשחלה.
    1. כאשר השחלה הופכת שקופה ודמוית ג'לי, הסר את השחלה מה-HEB וחזור על התהליך עם השחלה השנייה. פיפטה בעדינות את התמיסה כדי לפזר תאים.
  13. טבלו את השקופית בצנצנת הצביעה של קופלין של PFA וטבלו בקצרה את קצה השקופית במגבת נייר. לאחר שה-PFA נאסף לטיפות קטנות לאורך הגבול ההידרופובי של כל ריבוע (איור 1E), פיפטה 5 מיקרוליטר מתמיסת הביצית-סוכרוז לתוך כל טיפה של PFA.
  14. מורחים את הביציות על החלקים המרובעים על ידי הטיה עדינה של השקופיות קדימה ואחורה. היזהר לא לאפשר לתמיסה מכל ריבוע אחד לזלוג לריבועים סמוכים.
  15. הנח את השקופית בתא לח והמשיך להכין שקופיות עד שתמיסת הביצית-סוכרוז תמוצה.
  16. חזור על שלבים 1.6 - 1.15 עד שנעשה שימוש בכל העוברים הנקבות. דגרו מגלשות בתא לח בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
  17. לאחר הדגירה, פתח את החדר הלח. מכיוון שרוב (אם לא כולם) הנוזל/מקבע עדיין צריכים להיות נוכחים על משטח ההחלקה (בערך 10 מיקרוליטר בכל קטע מרובע), העבירו בעדינות את השקופיות למגבת נייר, ואפשרו לשקופיות להתייבש לחלוטין באוויר בטמפרטורת החדר על ספסל מעבדה (תהליך זה אורך בדרך כלל 30 - 60 דקות, תלוי בלחות המקומית).
    הערה: ניתן לייבש מגלשות גם באוויר מתחת למכסה אדים כדי להפחית חשיפה פוטנציאלית לאדי PFA שנותרו. זה גם יקצר את הייבוש לכ-20 - 30 דקות.
  18. יש לשטוף את ההחלקות בחומר הרטבה של 0.4% ב-Ultrapure H2O למשך 2 דקות. הניחו לשקופיות להתייבש לחלוטין.
    הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את השקופיות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס; עם זאת, אפיטופים מסוימים אינם יציבים (למשל, מניסיוננו, MLH1 מכתים בצורה גרועה, ולצביעת SYCP3 יש חפצים משמעותיים לאחר הקפאה). מומלץ בחום שהשקופיות יהיו מוכתמות חיסון באופן מיידי.

2. צביעה אימונופלואורסצנטית של התפשטות כרומוזום פרופאזה I

  1. הכן מאגר דילול נוגדנים 10x (ADB; ראה טבלה 2) המכיל 10% (v/v) סרום עיזים רגיל, 3% (w/v) אלבומין בסרום בקר (BSA) ו-0.05% טריטון X-100 ב-1x PBS. מסננים מעקרים באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבועיים.
  2. שטפו שקופיות בצנצנת מכתים של קופלין של 0.4% חומר הרטבה ב-1x PBS למשך 10 דקות. שטפו את השקופיות בצנצנת מכתים של קופלין של 0.1% טריטון X-100 ב-1x PBS למשך 10 דקות. בלוק שקופיות בצנצנת צביעה של קופלין של 1x ADB למשך 10 דקות.
  3. לדלל נוגדנים ראשוניים נבחרים ב-10x ADB (ראה טבלת חומרים לרשימת הנוגדנים והדילולים שלהם בהתאמה).
    1. הכן ארבעה שילובים של נוגדנים לצביעה חיסונית מרובה: (1) SYCP332,33, SYCP133, HORMAD133; (2) SYCP332,33, RAD5132,33, MLH332; (3) SYCP332,33, MSH432, MLH332; ו-(4) SYCP334, MLH1 32,33,34, CREST 35.
  4. הסר שקופיות מ-ADB, הקש על עודפי נוזלים והנח שקופיות בתא לח עם מים בטמפרטורת החדר. מרחו 30 מיקרוליטר של נוגדנים מדוללים לכל קטע מרובע של כל שקופית, והקפידו שהנוגדנים מריבוע אחד לא ישפכו לריבועים סמוכים.
  5. סגור את החדר הלח ואפשר למגלשות לדגור למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
  6. למחרת בבוקר, פתחו את החדר הלח והקישו על הנוגדנים המדוללים מהשקופיות. חזור על שלב 2.2.
  7. לדלל נוגדנים משניים נבחרים ב-10x ADB (ראה טבלת חומרים).
    הערה: מנקודה זו ואילך, שקופיות ונוגדנים רגישים לאור. השלם את כל הדגירות הבאות בחושך.
  8. הסר שקופיות מ-ADB, הקש על עודפי נוזלים והנח שקופיות בתא לח של מים בטמפרטורת החדר. יש למרוח 30 מיקרוליטר של נוגדנים מדוללים נבחרים לכל קטע מרובע של כל שקופית, תוך הקפדה על כך שנוגדנים מריבוע אחד לא ישפכו לריבועים סמוכים.
  9. סגור את החדר הלח ואפשר למגלשות לדגור למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
  10. שטפו שקופיות 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחת בצנצנות מכתים של קופלין של 0.4% חומר הרטבה ב-1x PBS. שטפו את השקופיות למשך 5 דקות בצנצנת מכתים של קופלין של חומר הרטבה של 0.4% ב-H2O טהור במיוחד.
  11. החל טיפה קטנה (כ-10 מיקרוליטר) של אמצעי הרכבה נגד דהייה עם צבע 4', 6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) או שווה ערך של חומצת גרעין. הנח כיסוי זכוכית בגודל 60 מ"מ על 24 מ"מ מס' 1.5 על כל שקופית וספוג בזהירות עודפי נוזלים.
    הערה: ניתן לאטום את השקופיות עם לק שקוף או מלט גומי. אם משתמשים בתושבת ריפוי, איטום המגלשות מיותר. יש לאחסן שקופיות בקופסת שקופיות או בתיקיה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. למרות שמומלץ לצלם שקופיות זמן קצר לאחר הצביעה, מניסיוננו שקופיות המאוחסנות בחושך ב-4 מעלות צלזיוס יכולות לשמור על עוצמת האות שלהן למשך מספר חודשים עד שנה. לאחסון לטווח ארוך יותר, ניתן לשמור על שקופיות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך מספר שנים ללא אובדן משמעותי של איכות האות.
  12. תאי תמונה ב-63x באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי (ראה טבלת חומרים). השתמש בתוכנת ניתוח תמונה (למשל, Zen of ImageJ, ראה טבלת חומרים) כדי למדוד את אורך SC ועוצמת הקרינה של כל הערוצים לאורך הציר. עקוב אחר אורכו של כל ציר כרומוזום (SYCP3), החל מהצנטרומר (אזור צפוף CREST או DAPI).
    1. לניתוח של HORMAD1 ו- SYCP1, רשום את אורכי שיאי אות הקרינה. חשב את האורכים הכוללים של פסגות HORMAD1 או SYCP1 וחלקו אותם באורך ציר הכרומוזום.
    2. לניתוח MSH4, כמת את מספר שיאי אות הקרינה עבור כל מדידה של SYCP3. רשום הן את המספר הכולל של פסגות MSH4 לכל גרעין והן את מספר פסגות MSH4 החופפות את שיאי MLH3. אשר ספירות של MSH4 על ידי השוואת פסגות לספירת המוקדים המתאימה.

3. תכשירים דיאקינזיס/פרומטפאזה לתצפית על כיאזמטה

  1. כדי למקסם את התשואה של ביציות מוכשרות מיוטית, השתמש בעכברים נקבות צעירות (בנות 25 - 28 יום).
    הערה: ניתן לבצע גירוי על ידי הזרקה תוך-צפקית של עכברים נקבות עם גונדוטרופין בסרום של סוסה בהריון (PMSG) של 5 יחב"ל 48 שעות לפני איסוף הביציות כדי לשפר את התפוקה. עם זאת, למטרות ניתוחי כיאזמטה, ניתן לאסוף מספיק ביציות שלפוחית נבט (GV) מנקבות לא מגורות.
  2. לפני הקרבת עכברים, הכינו את הריאגנטים והפתרונות הבאים.
    1. אפשר ל-M2 (3 מ"ל לעכבר) ול-KSOM (1 מ"ל לעכבר) להתאזן בחממת תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) למשך שעה אחת לפחות.
      הערה: ניתן להניח צינורות של חומרי גלם קפואים באינקובטור כשמכסיהם משוחררים בערב שלפני איסוף הביציות, מה שמאפשר כ-14 שעות של שיווי משקל.
    2. הכן מדיה M2 עם 2.5 מיקרומטר מילרינון (מעכב איזואנזים פוספודיאסטראז המונע חידוש מיוטי)36. שפכו חמש טיפות של 20 מיקרוליטר של M2 + מילרינון לתוך צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ ומעליה שמן מינרלי קל (איור 2C).
    3. פיפטה של 5 מיקרוליטר KSOM טיפות לתוך צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ ומעליה שמן מינרלי קל (איור 2C).
      זהירות: בקרת הטמפרטורה וה-pH היא קריטית להבשלת הביציות במבחנה. איסוף הביציות צריך להתבצע על ספסל מחומם (37 מעלות צלזיוס). יש לשמור את כל המדיה בחממה עד לשימוש, ולהסיר צלחות מדיה אחת בכל פעם כדי להגביל את ההפרעה הנגרמת מחשיפה לאוויר הסביבה.
    4. נקה שקופיות מיקרוסקופ זכוכית עם 70% אתנול ואפשר לייבוש באוויר. בגב שקופיות מיקרוסקופ זכוכית, קלעו קלות (עם עט עם קצה יהלום) או ציירו (עם דיו עמיד במים) רשת של 5 x 5 של ריבועים של ~ 4 מ"מ x 4 מ"מ (דוגמה מוצגת באיור 2B וניתן להשתמש בה כדי לעקוב אחר הרשת).
  3. אסוף ביציות מעכבר אחד בכל פעם. להקריב עכבר נקבה על ידי חנק CO2 ופריקת צוואר הרחם על פי הנחיות IACUC.
  4. השתמש במספריים לדיסקציה כדי לפתוח את חלל הבטן. השתמש במלקחיים עדינים כדי לעקור את המעיים.
  5. עקוב אחר כל קרן רחם משלפוחית השתן לכיוון הכליה. שחלות וביציות יהיו קשורות לכרית שומן קטנה ליד הכליה.
  6. השתמש במספריים מיקרו-דיסקציה כדי להסיר את השחלות ולהניח אותן במדיה M2 עם גז עם מילרינון.
  7. השתמש במספריים מיקרו-דיסקציה כדי להסיר את כל השומן והרקמות האחרות (כולל הבורסה) מהשחלות. השתמש במחטים של 25 גרם כדי לקרוע זקיקים אנטרליים.
  8. השתמשו בפיפטה כדי לפזר את הביציות ב-M2 + מילרינון בשכבה דקה בצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ, תוך הקפדה לא לתת למדיה לגעת בדפנות הכלי (איור 2C).
  9. השתמשו במיקרוסקופ דיסקציה (הגדלה של 25x - 50x) כדי להמחיש ביציות GV (איור 2F). ביציות GV עשויות להיות קשורות לתאי קומולוס בקומפלקס קומולוס-ביצית (COC). הסר תאי קומולוס עם פיפטינג חוזר ונשנה.
  10. אסוף ביציות GV באמצעות פיפטת זכוכית המופעלת בפה (קוטר 100 - 150 מיקרומטר; איור 2A). העבירו ביציות GV לתוך טיפה של 20 מיקרוליטר של M2 + מילרינון עם שמן מינרלי קל (איור 2C). אין להכניס יותר מ-30 ביציות לטיפה אחת.
  11. לאחר שנאספו כל ביציות ה-GV, העבירו אותן דרך שתיים או שלוש טיפות של 20 מיקרוליטר של M2 + מילרינון המכוסות בשמן מינרלי קל כדי להסיר תאים סומטיים.
  12. העבירו ביציות GV (עם כמה שפחות מדיה) לתוך טיפה של 30 מיקרוליטר של KSOM. שטפו את המילרינון על ידי העברת ביציות דרך חמש טיפות KSOM (איור 2C).
  13. העבירו את כל ביציות ה-GV לטיפות של 20 מיקרוליטר של KSOM המכוסות בשמן מינרלי קל, מקסימום 30 ביציות לכל טיפת KSOM (איור 2C). מניחים ביציות באינקובטור תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
  14. דגירה על ביציות למשך כ-5 שעות.
    הערה: התמוטטות GV (סימון היעלמות המעטפת הגרעינית וחידוש מיוטי; איור 2G) מתרחש בדרך כלל לאחר שעתיים בתרבית, אך קצב הבשלת הביציות עשוי להשתנות בהתאם לזן העכבר או לגירוי ההורמונים. מניסיוננו, בסך הכל 5 שעות בתרבית מייעלת בצורה הטובה ביותר להתפשטות כיאזמטה ברוב זני העכברים. אם משאירים אותם להתבגר זמן רב מדי, החלוקה המיוטית הראשונה ושחול הגוף הקוטבי עשויים להתרחש (איור 2H).
  15. העבירו 5 - 10 ביציות (עם כמה שפחות KSOM) לטיפה של 30 מיקרוליטר של תמיסה היפוטונית. דגרו ביציות בתמיסה ההיפוטונית, למשך 5 - 10 דקות.
  16. פיפטה טיפה קטנה (~1 מיקרוליטר) של מים מחומצים (8 טיפות של חומצה אצטית קרחונית ב-50 מ"ל של H2O אולטרה-טהור במיוחד) על אחד הריבועים בשקופיות המוכנות (איור 2B).
  17. השתמש בפיפטה מזכוכית בקוטר 100 - 150 מיקרומטר המופעלת על ידי הפה כדי להעביר במהירות ביצית אחת מטיפת המים המחומצת. העבירו כמה שפחות תמיסה היפוטונית, עם הביצית. השתמש באותה פיפטה כדי להסיר חלק מהנוזל עד שהביצית נדבקת לשקופית.
    הערה: נפח הנוזל סביב הביצית הוא קריטי. צריך להיות מספיק נוזלים כדי שהביצית לא תתייבש לפני הקיבוע, אך לא עד כדי כך שהביצית לא תוכל להיצמד לשקופית.
  18. עבור במהירות לקצה פיפטה מזכוכית בקוטר 150 מיקרומטר. הוסף טיפה אחת של קיבוע קרנוי טרי (שלושה חלקים מתנול מוחלט לחלק אחד של חומצה אצטית קרחון) לביצית. אפשר לקיבוע להתפזר על פני השקופית. הביצית אמורה להיראות פחות מובחנת ונמסה כאשר החומצה מהקיבוע ממיסה את ה-zona pellucida והתאים מתפוצצים.
  19. כאשר החלק הקדמי של הקיבוע מתחיל להתכווץ, הוסף במהירות 2-3 טיפות נוספות של קיבוע. נשפו בעדינות על המגלשה כדי להאיץ את הייבוש.
  20. חזור על שלבים 3.16 - 3.19 עם ביציות נוספות מהתמיסה ההיפוטונית.
  21. חזור על שלבים 3.15 - 3.20 עד שכל הביציות יתוקנו. בדוק את התפשטות הכרומוזומים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
  22. כאשר המגלשה התייבשה לחלוטין באוויר, הנח את השקופית בצנצנת צביעה של קופלין עם 50 מ"ל של 4% Giemsa (v/v) ב-ddH2O. שקופיות כתמים ב-Giemsa למשך 6 דקות בטמפרטורת החדר.
  23. יש לשטוף את המגלשות 3 פעמים למשך 3 דקות כל אחת ב-ddH2O בטמפרטורת החדר. הניחו לשקופיות להתייבש לחלוטין.
  24. מרחו שכבה דקה (~60 מיקרוליטר) של Permount על גבי כיסוי זכוכית מס' 1.5 בגודל 60 מ"מ x 24 מ"מ. הרכיבו מגלשות על ידי היפוכם על החלקות הכיסוי וניקוי בזהירות של עודפי נוזלים. הניחו לשקופיות להתייבש למשך הלילה לפני הדמיה ב-63x בשדה בהיר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הערכת פגמים בסינפסה בתאים דמויי פצ'יטן
ניסוי זה מעריך פגמים בסינפסה בביציות פצ'יטן ועוקב אחר התקדמות הפרופאזה I (איור 3A). צביעה חיסונית עבור SYCP3 (רכיבי SC ציריים/רוחביים), SYCP1 (אלמנט SC מרכזי) ו-HORMAD1 (צירי כרומוזומים לא סינפסים/דה-סינפסה) מאפשרת הערכת שלב וסינפסה. HORMAD1 מתמקם עם SYCP3 במהלך זיגונמה ודיפלונמה (לפני סינפסיס ואחרי דה-סינפסיס)37,38...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ביציות יונקים מועדות במיוחד לטעויות בהשוואה לזרעונים. בעוד שמחסום הרכבת הציר הפחות יעיל של הביצית (SAC) תורם לפגיעות זו 14,52,53, האסולד והאנט מציעים כי פגיעות מרובות מובילות לאנופלואידיה, כאשר רקומבינציה פגומה היא גורם עיקרי54. מחקרים בבני אדם קושרים בין אנופלואידיה להבטחת הצלבה לא מספקת ומיקום מוצלב לא אופטימלי55,56

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחבר אין קונפליקטים לחשוף.

תודות

המימון לפרויקט זה ניתן על ידי פרס K99 מהמכון הלאומי לבריאות והתפתחות הילד ע"ש יוניס קנדי שרייבר (HD112986 עד TH).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.45 & mu; מסנן מזרק mמיליפור סיגמאSLHAR33SBלייצור פיפטה שמופעלת בפה
0.5 M EDTA, pH 8.0קורנינג46-034-CI עבור HEB
מזרק סטרילי 1 מ"ל עם מחט 25 גייג', 16 מ"מפישר סיינטיפיק14-817-125 לקרעת שחלות
צלחת פטרי בגודל 100 על 15 מ"מVWR25384-302 
פיפטות פסטר חד-פעמיות מזכוכית בורוסיליקט 14.6 ס"מפישר סיינטיפיק13-678-20B לייצור פיפטה שמופעלת בפה
צלחת פטרי 35 על 10 מ"מקורנינג351008
40 מ"מ x 0.45 מ"מ #3 פיני נירוסטה לאנטומולוגיהאמזוןB0CSSPW5S7להצמדת עכברים עובריים לניתוח
חומצה אצטית, קרחוניתפישר סיינטיפיקA38-212עבור הקיבוע של קרנוי
מכלולי צינורות שאפירטור לפיפטות מיקרוקפילריות מכויליםמיליפור סיגמאA5177-5EAלייצור פיפטה שמופעלת בפה
B.P.I. Watch GlassNDS Technologies 1580-00חלופה נוספת להשתמש בצלחת עובר בקוטר 30 מ"מ על עומק 12 מ"מ (Electron Microscopy Sciences SKU: 70543-30)
חומצה בוריתפישר סיינטיפיקBP168-1להתאמת pH של HEB, PFA
אלבומין סרום בקרמיליפור סיגמאA7906-100Gעבור ADB
מיכל CO2לאינקובטור
שקופיות מיקרוסקופ קורנינגמיליפור סיגמאCLS294875X25אורך x רוחב 75 מ"מ x 25 מ"מ, צד אחד מטושטש
מגלשות מיקרוסקופ קורנינג, מצופות בצד אחד, קצה אחדVWR294875X25
כיסוי זכוכית מלבני. 60 x 24 מ"מ, #1.5VWR48393-251
צלחת ניתוחמדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים70540
מיקרוסקופ דיסקציהכל דגם סטנדרטי
מספריים לניתוח, קצה חד, 4.5 אינץ'VWR82027-578
מלקחיים דקים וחדים בקצהVWR76548-836
גימסה סטייןמיליפור סיגמאGS500-500לצביעת ממרחי קיאזמטה
עט מחסום מים הידרופובי של ImmEdgeמעבדות וקטורH-4000
חממהכל דגם סטנדרטי עם טכנולוגיית CO2 וציפוי מים
תחנת עבודה IVFK-Systemsכל דגם עם משטח חימום
פתרון Kodak Photo-Flo 200BH Photo & וידאו1464510לשטיפות שקופיות
מתנולפישר סיינטיפיקA412-4עבור הקיבוע של קרנוי
צנצנת צביעת קופלין של MP Biomedicalsפישר סיינטיפיקICN17006201
סרום רגיל של עזגיבקו16210-072עבור ADB
פרפורמלדהיד, דרגת EM, פריל מטוהרמדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים19200
פרמונטפישר סיינטיפיקSP15-100for  שקופיות התקנה לפריסות כיאזמטה
התקנת אנטי-פייד זכוכית ProLong עם כתם NucBlueתרמו-סיינטיפיקP36985להרכבת שקופיות עם צבעי חיסון
צינור סיליקון, קוטר פנימי: 0.125", קוטר חיצוני: 0.25"VWR89068-474לייצור פיפטה שמופעלת בפה
נתרן ציטראט דיהידראטפישר סיינטיפיקS279-500עבור HEB, תמיסה היפוטונית
מערכת צביעת סלייד StainTrayמדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים71396-Bלשימוש כחדר לח. חייבים להשתמש במכסה השחור לצביעת אימונופלואורסנציה. ניתן לחלופין לרפד את תחתית קופסת סלייד אטומה או כלי טאפר עם מגבות נייר לחות לשימוש כחדר לחות  
טיפים לחשפניות - 100קופר כירורג'יהMXL3-100לפיפטה המופעלת בפה
טיפים לחשפניות - 150קופר כירורג'יהMXL3-150לפיפטה המופעלת בפה
סוקרוזהמיליפור סיגמאS-8501עבור HEB, תמיסה היפוטונית של סוכרוז
בסיס טריספישר סיינטיפיקBP152-5עבור HEB
טריטון X-100פישר סיינטיפיקBP151-100 עבור PFA, ADB ו-Triton-PBS
צנצנת הצביעה של United Scientific Coplinפישר סיינטיפיקS17495Aפלסטיק לבן אטום לשטיפות וחסימת שקופיות לאחר הוספת נוגדנים משניים רגישים לאור
שקופיות קונקויטי זכוכית של United Scientific Scientificפישר סיינטיפיקS139533עובי 1.3 מ"מ, ספירת 2 בארות
Vannas Microdissection Scissors 5 מ"מ ישרVWR76457-358
Zeiss Axio Imager.Z2, Colibri 7קרל צייס000000-2624-307
תוכנת Zen Blue 3.11קרל צייסתוכנות לרכישת וניתוח תמונות
נוגדנים
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Mouse IgG, ספציפי לקטע FcJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-546-071השתמשו בדילול 1:1,000
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Rabbit IgG, Fc ספציפי לקטעJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-546-046השתמשו בדילול 1:1,000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ ספציפי לקטעJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.109-606-170השתמשו בדילול 1:1,000
Alexa Fluor 647 AffiniPure עז אנטי-חזיר ים IgG, מקטע fc ספציפיJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.106-605-008השתמשו בדילול 1:1,000
גינאי פיג נגד MLH3 pAbיוצר בהתאמה אישית עם Thermo-Fisher, השתמש בדילול של 1:500
pAb נגד SYCP1 של גינאי פיגמאת Christer Hö ö g (קוזנצובה ואח' 2005), השתמשו בדילול 1:200
pAb חלבון אנטי-צנטרומר אנושינוגדנים בע"מ.15-234השתמשו בדילול 1:1,000
עכבר נגד MLH1 mAbBD ביוסיינסס550838שימוש בדילול 1:100
עכבר נגד SYCP3 mAbאבקאםab97672השתמשו בדילול 1:1,000
Rabbit Anti-HORMAD1 pAbפרויטנטק13917-1-APשימוש בדילול 1:500
Rabbit anti-MSH4 pAbאבקלונלA8556שימוש בדילול 1:100
Rabbit anti-RAD51 pAbמיליפורPC130שימוש בדילול 1:500
Rabbit anti-SYCP3 pAbאבקאםab15093השתמשו בדילול 1:1,000
Rhodamine Red-X (RRX) AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Mouse IgG, ספציפי לקטע FcJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-296-071השתמשו בדילול 1:1,000
Rhodamine Red-X (RRX) AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Rabbit IgG, Fc ספציפי לקטעJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-296-046השתמשו בדילול 1:1,000

מקורות

  1. Gray, S., Cohen, P. E. Control of Meiotic Crossovers: From Double-Strand Break Formation to Designation. Annu Rev Genet. 50, 175-210 (2016).
  2. Hunter, N. Meiotic Recombination: The Essence of Heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7, a016618(2015).
  3. Kudo, N. R., et al. Resolution of Chiasmata in Oocytes Requires Separase-Mediated Proteolysis. Cell. 126, 135-146 (2006).
  4. Murdoch, B., et al. Altered Cohesin Gene Dosage Affects Mammalian Meiotic Chromosome Structure and Behavior. PLoS Genet. 9, 1003241(2013).
  5. Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1β-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37, 1351-1355 (2005).
  6. Zickler, D., Kleckner, N. Meiosis: Dances Between Homologs. Ann Rev Genet. 57, 1-63 (2023).
  7. Billmyre, K. K., et al. SYCP1 head-to-head assembly is required for chromosome synapsis in mouse meiosis. Sci Adv. 9, eadi1562(2023).
  8. Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171, 447-458 (2005).
  9. Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31, 385-390 (2002).
  10. Oh, S. D., Lao, J. P., Taylor, A. F., Smith, G. R., Hunter, N. RecQ Helicase, Sgs1, and XPF Family Endonuclease, Mus81-Mms4, Resolve Aberrant Joint Molecules during Meiotic Recombination. Mol Cell. 31, 324-336 (2008).
  11. Holloway, J. K., Booth, J., Edelmann, W., McGowan, C. H., Cohen, P. E. MUS81 generates a subset of MLH1-MLH3-independent crossovers in mammalian meiosis. PLoS Genet. 4, e1000186(2008).
  12. Edelmann, W., et al. Mammalian MutS homologue 5 is required for chromosome pairing in meiosis. Nat Genet. 21, 123-127 (1999).
  13. Kneitz, B., et al. MutS homolog 4 localization to meiotic chromosomes is required for chromosome pairing during meiosis in male and female mice. Genes Dev. 14, 1085-1097 (2000).
  14. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13, 493-504 (2012).
  15. Capalbo, A., Hoffmann, E. R., Cimadomo, D., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Human female meiosis revised: new insights into the mechanisms of chromosome segregation and aneuploidies from advanced genomics and time-lapse imaging. Hum Reprod Update. 23, 706-722 (2017).
  16. Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365, 1466-1469 (2019).
  17. Gruhn, J. R., Hoffmann, E. R. Errors of the Egg: The Establishment and Progression of Human Aneuploidy Research in the Maternal Germline. Ann Rev Genet. 56, null(2022).
  18. Soygur, B., et al. Intercellular bridges coordinate the transition from pluripotency to meiosis in mouse fetal oocytes. Sci Adv. 7, eabc6747(2021).
  19. Bowles, J., et al. Retinoid Signaling Determines Germ Cell Fate in Mice. Science. 312, 596-600 (2006).
  20. Bullejos, M., Koopman, P. Germ cells enter meiosis in a rostro-caudal wave during development of the mouse ovary. Mol Reprod Dev. 68, 422-428 (2004).
  21. Borum, K. Oogenesis in the mouse: A study of the meiotic prophase. Exp Cell Res. 24, 495-507 (1961).
  22. Grive, K. J., Freiman, R. N. The developmental origins of the mammalian ovarian reserve. Development. 142, 2554-2563 (2015).
  23. Hu, M., et al. PRC1-mediated epigenetic programming is required to generate the ovarian reserve. Nat Commun. 13, 4510(2022).
  24. Drabent, B., Bode, C., Bramlage, B., Doenecke, D. Expression of the mouse testicular histone gene H1t during spermatogenesis. Histochem Cell Biol. 106, 247-251 (1996).
  25. Goetz, P., Chandley, A. C., Speed, R. M. Morphological and temporal sequence of meiotic prophase development at puberty in the male mouse. J Cell Sci. 65, 249-263 (1984).
  26. Solari, A. J. The spatial relationship of the X and Y chromosomes during meiotic prophase in mouse spermatocytes. Chromosoma. 29, 217-236 (1970).
  27. Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
  28. Tarkowski, A. K. An Air-Drying Method for Chromosome Preparations from Mouse Eggs. Cytogenetics. 5, 394-400 (2008).
  29. Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
  30. Sun, X., Cohen, P. E. Studying Recombination in Mouse Oocytes. Mammalian Oocyte Reg Meth Protoc. , 1-18 (2013).
  31. Evans, C. W., Robb, D. I., Tuckett, F., Challoner, S. Regulation of meiosis in the foetal mouse gonad. Development. 68, 59-67 (1982).
  32. Horan, T. S., et al. The DNA helicase FANCJ (BRIP1) functions in double strand break repair processing, but not crossover formation during prophase I of meiosis in male mice. PLoS Genet. 20, e1011175(2024).
  33. Wood, A. J., et al. CNTD1 is crucial for crossover formation in female meiosis and for establishing the ovarian reserve. J Cell Biol. 224, e202401021(2025).
  34. Horan, T. S., et al. Replacement Bisphenols Adversely Affect Mouse Gametogenesis with Consequences for Subsequent Generations. Curr Biol. 28, 2948-2954.e3 (2018).
  35. Lee, C., Oh, J. S. Novel BRCA1-PLK1-CIP2A axis orchestrates homologous recombination-mediated DNA repair to maintain chromosome integrity during oocyte meiosis. Nuc Acid Res. 53, gkae1207(2025).
  36. Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biol Reprod. 71, 1142-1149 (2004).
  37. Wojtasz, L., et al. Mouse HORMAD1 and HORMAD2, Two Conserved Meiotic Chromosomal Proteins, Are Depleted from Synapsed Chromosome Axes with the Help of TRIP13 AAA-ATPase. PLoS Genet. 5, e1000702(2009).
  38. Kogo, H., et al. Differential phosphorylation of two serine clusters in mouse HORMAD1 during meiotic prophase I progression. Exp Cell Res. 440, 114133(2024).
  39. Jiao, X., et al. Aberrant activation of chromosome asynapsis checkpoint triggers oocyte elimination. Nat Commun. 16, 2260(2025).
  40. Cloud, V., Chan, Y. L., Grubb, J., Budke, B., Bishop, D. K. Rad51 Is an Accessory Factor for Dmc1-Mediated Joint Molecule Formation During Meiosis. Science. 337, 1222-1225 (2012).
  41. Lan, W. H., et al. Rad51 facilitates filament assembly of meiosis-specific Dmc1 recombinase. Proc Natl Acad Sci. 117, 11257-11264 (2020).
  42. Hinch, A. G., et al. The Configuration of RPA, RAD51, and DMC1 Binding in Meiosis Reveals the Nature of Critical Recombination Intermediates. Mol Cell. 79, 689-701.e10 (2020).
  43. Snowden, T., Acharya, S., Butz, C., Berardini, M., Fishel, R. hMSH4-hMSH5 recognizes Holliday Junctions and forms a meiosis-specific sliding clamp that embraces homologous chromosomes. Mol Cell. 15, 437-451 (2004).
  44. Rinaldi, V. D., Bolcun-Filas, E., Kogo, H., Kurahashi, H., Schimenti, J. C. The DNA Damage Checkpoint Eliminates Mouse Oocytes with Chromosome Synapsis Failure. Mol Cell. 67, 1026-1036.e2 (2017).
  45. Premkumar, T., et al. Genetic dissection of crossover mutants defines discrete intermediates in mouse meiosis. Mol Cell. 83, 2941-2958.e7 (2023).
  46. Polani, P. E., Crolla, J. A., Seller, M. J., Moir, F. Meiotic crossing over exchange in the female mouse visualised by BUdR substitution. Nature. 278, 348-349 (1979).
  47. Imai, H. T., Moriwaki, K. A re-examination of chiasma terminalization and chiasma frequency in male mice. Chromosoma. 85, 439-452 (1982).
  48. Kanda, N., Kato, H. Analysis of crossing over in mouse meiotic cells by BrdU labelling technique. Chromosoma. 78, 113-121 (1980).
  49. Hultén, M., Lawrie, N. M., Laurie, D. A. Chiasma-based genetic maps of chromosome 21. Am J Med Genet. 37, 148-154 (1990).
  50. Lawrie, N. M., Tease, C., Hultén, M. A. Chiasma frequency, distribution and interference maps of mouse autosomes. Chromosoma. 104, 308-314 (1995).
  51. Speed, R. M. The effects of ageing on the meiotic chromosomes of male and female mice. Chromosoma. 64, 241-254 (1977).
  52. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139, 1941-1946 (2012).
  53. Sebestova, J., Danylevska, A., Dobrucka, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11, 3011-3018 (2012).
  54. Hassold, T. J., Hunt, P. A. Missed connections: recombination and human aneuploidy. Prenatal Diagnos. 41, 584-590 (2021).
  55. Oliver, T. R., et al. New Insights into Human Nondisjunction of Chromosome 21 in Oocytes. PLoS Genet. 4, e1000033(2008).
  56. Ghosh, S., Feingold, E., Dey, S. K. Etiology of Down syndrome: Evidence for consistent association among altered meiotic recombination, nondisjunction, and maternal age across populations. Am J Med Genet A. 149A, 1415-1420 (2009).
  57. Wang, S., et al. Inefficient crossover maturation underlies elevated aneuploidy in human female meiosis. Cell. 168, 977-989.e17 (2017).
  58. Shin, Y. H., McGuire, M. M., Rajkovic, A. Mouse HORMAD1 Is a Meiosis I Checkpoint Protein That Modulates DNA Double-Strand Break Repair During Female Meiosis. Biol Reprod. 89, 29(2013).
  59. Kogo, H., et al. HORMAD1-dependent checkpoint/surveillance mechanism eliminates asynaptic oocytes. Genes Cells. 17, 439-454 (2012).
  60. Ward, J. O., et al. Mutation in Mouse Hei10, an E3 Ubiquitin Ligase, Disrupts Meiotic Crossing Over. PLoS Genet. 3, e139(2007).
  61. Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
  62. Hodges, C. A., Hunt, P. A. Simultaneous analysis of chromosomes and chromosome-associated proteins in mammalian oocytes and embryos. Chromosoma. 111, 165-169 (2002).
  63. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome Spreads with Centromere Staining in Mouse Oocytes. Mammal Oocyte Regul Method Protoc. , 203-212 (2013).
  64. Yun, Y., Ito, M., Sandhu, S., Hunter, N. Cytological Monitoring of Meiotic Crossovers in Spermatocytes and Oocytes. Homologous Recomb Method Protoc. , 267-286 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הכנת התפשטות כרומוזומים מיוטיים מביציות עכבר להערכת סינפסה ורקומבינציה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.