מאמר שיטה

פיתוח קווי אורגנואידים שמקורם בעכבר מתאי אפיתל חצוצרות למידול קרצינומה של שחלות סרוזיות בדרגה גבוהה

DOI:

10.3791/68753

⸱

6 באוגוסט 2025

 ,  , 
1Laura and Isaac Perlmutter Cancer Center, NYU Grossman School of Medicine, NYU Langone Health

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט את הפיתוח של מודלים של עכברים בדרגה גבוהה של קרצינומה שחלות סרוזית (HGSOC) במבחנה וב-vivo. מגזירת אורגנואידים של חצוצרות עכברים, השינוי הגנטי שלהם לסיכום גנטיקה של HGSOC אנושי, והחדרתם לבורסה השחלתית של עכברים סינגניים להתפתחות גידולים in vivo .

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מידול יעיל של מחלות בסביבות מציאותיות הוא חיוני לשיפור ההבנה שלנו של פתולוגיות מגוונות. בהיבט זה, אורגנואידים מציעים סביבה נאמנה יותר מאשר עמיתיהם הדו-ממדיים הקלאסיים במבחנה. באופן דומה, מודלים של עכברים סינגניים מאפשרים גם לחוקרים לחקור אינטראקציות שלמות יותר בין גידול למארח, כגון עם מערכת החיסון, in vivo. כאן אנו מציגים פרוטוקול שלם על חילוץ תאי אפיתל של חצוצרות, תא המקור של קרצינומות שחלות סרוזיות בדרגה גבוהה (HGSOC), מעכבר וגוזרים אותם כתרביות אורגנואידים ראשוניות, כמו גם תרבית חוץ גופית ותחזוקתם. לאחר מכן, אנו מתארים כיצד להשתמש בטכניקות של הנדסה גנטית, כגון ביטוי יתר של גנים לנטי-ויראלים או רטרו-ויראליים, כמו גם מחיקת גן CRISPR-Cas9, כדי לשנות קווים אלה ולהפוך אותם לגידולים טרום-סרטניים. אנו מדווחים גם כיצד להשתמש בהם לאימות במבחנה , באמצעות מיצוי חומרים גנטיים וצביעה אימונופלואורסצנטית. לבסוף, אנו מציינים כיצד להזריק ביעילות את הגידולים הללו בבורסה השחלתית, האתר האוטוכטוני של HGSOC, להתחלת הגידול.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרצינומה של שחלות סרוזיות בדרגה גבוהה (HGSOC) נותרה מחלה לא מובנת וקטלנית מאוד. מבחינה היסטורית, היעדר מודלים נאמנים במבחנה וב-vivo המייצגים את הביולוגיה והתגובה הטיפולית של HGSOC היוו מחסום מרכזי להתקדמות. לדוגמה, מחקרים רבים (אם לא רובם) השתמשו בקווי תאים שאינם חולקים מאפיינים גנומיים/גנטיים מרכזיים של HGSOC, מה שהופך את הרלוונטיות של ממצאיהם למוטלת בספק 1,2,3,4. לדוגמה, מודל העכבר הסינגני הנפוץ ID8 נגזר מאפיתל פני השחלה (OSE) והוא Trp53-wild type5. לעומת זאת, רוב אם לא כל HGSOC מתעורר באפיתל החצוצרות (FTE)6, ו-HGSOC הוא כמעט אוניברסלי TP53 מוטנטי או מושתק7. חוקרים ניסו מאז לתקן קו זה על ידי שילוב מוטציות Trp53 בו5, אך מכיוון שמוטציה Trp53 היא אירוע מוקדם בפתוגנזה של HGSOC, שינוי זה מגיע אולי מאוחר מדי בטרנספורמציה של קו תאים זה וככל הנראה אינו מייצג התפתחות HGSOC תקינה.

במהלך העשור האחרון נעשו ניסיונות לתקן מצב עניינים זה על ידי יצירת מודלים מציאותיים יותר של HGSOC. לדוגמה, מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMMs) המכילים מוטציות רלוונטיות בתאי שושלת מולריאן, לעתים קרובות תחת מערכת Cre-recombinase לשליטה בפתוגנזה, מאפשרים לחוקרים לחקות טוב יותר את המחלה in vivo 8,9,10. למרבה הצער, מודלים אלה הם לעתים קרובות מסובכים ליצירה, ועשויים להיות להם בעיות אחרות כגון דליפת Cre, אפקט Cre או "אפקטי שדה"11,12,13. בהקשר זה, נראה כי מודלים אורגנואידים סינגניים מהווים פשרה חזקה עבור חוקרים המעוניינים לחקות טוב יותר את המחלה הן במבחנה והן ב-vivo 14,15,16,17,18,19. ואכן, בעוד שרוב המודלים של HGSOC הזמינים ומשמשים כרגע הם מודלים דו-ממדיים, למרבה הצער הם אינם יכולים לדמות כראוי את המורכבות של המטריצה החוץ-תאית (ECM), מרכיב מכריע המשפיע על הביולוגיה של התא. אורגנואידים הם רקמות תלת-ממדיות מאורגנות בעצמן, הנוצרות לעתים קרובות מתאי גזע, שיכולות לשחזר את המורכבות המבנית והתפקודית המוקדמת של איבר בצלחת פטרי20. הייצור שלהם פועל בדרך כלל על ידי השעיית תאים בודדים, שהם פלוריפוטנטיים, במטריצת ממברנת מרתף (BMM), כגון Matrigel21. במבחנה, מודלים אלה מדויקים יותר יחסית בסיכום תנאי in vivo מאשר מודלים דו-ממדיים. כמו כן, בשל אופיים הסינגני, מודלים אלה מסוגלים להשתיל בעכבר עם מערכת חיסון מתפקדת במלואה, מה שמאפשר שחזור נאמן יותר של פתוגנזה והתפתחות14,15. זהו יתרון ברור על פני קסנוגרפטים שמקורם בחולה, אשר, למרות שיש להם את הגנטיקה המציאותית ביותר של הגידול, דורשים השתלה במודלים של עכברים מדוכאי חיסון.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לפתח מודלים אורגנואידים HGSOC סינגניים. החל מיצירת תרבית האורגנואידים המקורית מסוג FTE שחולצה מעכבר, ההנדסה הגנטית שלהם ליצירת גנוטיפים מודעי מחלות, ועד לבסוף השתלתם בחזרה לבורסה של השחלות כדי ליצור גידולים מפותחים במלואם. כללנו גם כמה פרוטוקולים נוספים כדי לסייע בניסויים נפוצים, כגון צביעה אימונופלואורסצנטית (IF) של אורגנואידים במבחנה , והמרה דו-ממדית של קווי תאים לייצור תאים בקנה מידה גדול, כגון להזרקות. פרוטוקול זה מיועד לחוקרים שרוצים לפתח מודלים סינגניים אורגנואידים של HGSOC עם שליטה על ההרכב הגנטי שלהם, עם כוונה מיוחדת לחקור את הביולוגיה של HGSOC בתנאי מבחנה מציאותיים יותר כמו גם את האינטראקציות הקיימות במיקרו-סביבת הגידול in vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל איסוף הרקמות וההליכים של בעלי חיים בוצעו באופן אתי באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במרכז אלכסנדריה למדעי החיים ומרכז פרלמוטר לסרטן ב-NYU Langone Health, ניו יורק, ניו יורק.

1. הכנת חומרים

  1. הכנת מדיה אורגנואידית של עכברים (MOM)
    1. הכן את המדיום הבסיסי על ידי שילוב הפריטים בטבלה 1.
      הערה: המדיה יציבה עד חודש בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. הכנת מדיה דו-ממדית
    1. שלב עכברים רקומביננטיים EGF 50 ננוגרם/מ"ל, אינסולין-טרנספרין-סלניום (ריכוזים סופיים של 10 מ"ג/ליטר אינסולין, 5.5 מ"ג/ליטר טרנספרין, 6.7 מיקרוגרם/ליטר), 3% סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS), ופניצילין-סטרפטומיצין (100 U/mL), ב-DMEM (עם פירובט וגלוקוז גבוה).
  3. הכנת תערובת עיכול
    1. שלבו קולגנאז/היאלורונידאז (3000 U/mL קולגנאז, 1000 U/mL Hyaluronidase) עם DMEM (עם פירובט וגלוקוז גבוה) ביחס של 1:10. הכן מיניקוטים של 1 מ"ל במיקרו-צינורות של 1.5 מ"ל. אחסן את המינונים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס והפשיר על קרח.
    2. הכן מכסות חד פעמיות של DNAse I (10,000 U/mL) ו-Dispase (5 U/mL).
    3. לאחר הפשרת כמות של קולגנאז/היאלורונידאז ב-DMEM, הוסף DNAseI (10 מיקרוליטר, 100 יחידות) ו-Dispase (25 מיקרוליטר, 0.1 יחידות).
      הערה: תמיסת עיכול זו שימושית גם לעיכול של עד 0.5 גרם גידול.
  4. טיפול ב-BMM
    1. אחסן BMM בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לטווח ארוך. כדי למנוע הפשרה בהקפאה, הכינו 1 מ"ל בצינורות של 1.5 מ"ל. הפשירו אליקוט על ידי הנחתו על קרח למשך שעתיים, או לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: BMM יתמצק בטמפרטורת החדר (RT). לכן, מומלץ לשמור תמיד את הצינור של BMM על קרח או על מתלה צינור קר. השתמש בקצות פיפטות שצוננו מראש במקפיא של -20 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות.

2. בידוד תאים מ- FTE של עכבר

  1. יש להפשיר כמות גדולה של BMM, אנזים TrypLE Express טרם חימום וצלחת של 24 בארות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (אחסן את הצלחת בחממה למשך 24 שעות לקבלת התוצאות הטובות ביותר). לאחר מכן, הכינו את אזור הניתוח: כלים לדיסקציה וניקוי רקמות במיקרוסקופ הניתוח, צלחת עם PBS + P/S קר ותערובת עיכול חמה.
  2. המתת חסד של עכברי C57BL/6J נקבות על ידי חנק פחמן דו חמצני. בצע שיטת המתת חסד משנית (פריקת צוואר הרחם) כנדרש על ידי IACUC.
  3. יש לנתח ולהסיר את השחלות והחצוצרות ולהעביר אותם לצלחת פטרי סטרילית המכילה DMEM + P-S בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. בעזרת מיקרוסקופ מנתח, סט עדין של מלקחיים ומספריים מסיר את כמות השומן הנותרת מהשחלה ומבודד את החצוצרה (אינפונדיבולום וחלק מהאמפולה הדיסטלית) מהשחלה והרחם.
    הערה: היזהר להימנע מלגעת בעור או בשיער של העכבר עם הכלים כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי.
  4. העבירו את הרקמה לצינור המכיל את תערובת העיכול המלאה והשתמשו במספריים עדינים כדי לטחון את החצוצרה לחתיכות קטנות (<0.5 מ"מ). יש לדגור במשך 40-50 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  5. לאחר דיסוציאציה, צנטריפוגה של התאים ב-350 x g למשך 5 דקות והשליכו את הסופרנטנט. הוסף 500 מיקרוליטר של TrypLE Express מחומם מראש. יש לדגור למשך 15 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
  6. להרוות טריפסיניזציה עם 500 מיקרוליטר של 3% FBS ב-DMEM (מדיה דו-ממדית). מסננים את התערובת דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר למיקרו-צינור חדש. סובב במשך 5 דקות בחום של 350 גרם והשליך את הסופרנטנט.
  7. השעו מחדש את גלולת התא (בקושי נראית בהתאם למספר ה-FTs המשמשים) ב-12.5 מיקרוליטר של מדיה עכברית אורגנואידית ודגרו לזמן קצר על קרח. מערבבים עם 37.5 מיקרוליטר BMM קר כקרח וזורעים את כל הנפח (50 מיקרוליטר) לתחתית באר של צלחת 24 בארות מחוממת מראש.
  8. הנח את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות, אך לא יותר מ-48 שעות, כדי להגדיר את ה-BMM. היזהר לא להפריע לכיפות בעת העברת הצלחת לחממה.
  9. הוסף 500 מיקרוליטר של MOM מחומם מראש לכל באר על ידי פיפטינג המדיום בעדינות בצד הבאר. לעולם אל תוסיף מדיה ישירות לכיפה, מכיוון שהיא עלולה לגרום נזק או ניתוק. מניחים את המכסה על צלחת התרבות ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.

3. תחזוקה של אורגנואידים שמקורם בעכברים FTE

  1. החלפת מדיה
    1. בעזרת קצה לא מסונן וסטרילי של 10 מיקרוליטר, שאפו את המדיה מתחתית הבאר בזמן שהצלחת מוחזקת בשיפוע של 45°. אם הכיפה מתנתקת מהצלחת, שאפו בזהירות את המדיה מראש הבאר בזמן שהכיפה המנותקת נמצאת בתחתית.
    2. מוסיפים לאט לאט 750 מיקרוליטר MOM, שחומם מראש ב -37 מעלות צלזיוס, כשהקצה נלחץ על דופן הבאר.
    3. החלף את המדיה כל יומיים עד שלושה או עד שהמדיה משנה את צבעה מוורוד לצהוב. אם המדיה הופכת לצהובה פחות מ-24 שעות לאחר החלפתה, האורגנואידים מוכנים למעבר.
  2. מעבר אורגנואידים
    1. הסר את המדיה ושטוף כל באר עם 500 מיקרוליטר PBS קר (4 מעלות צלזיוס). שאפו PBS והוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסת התא הקרה (4 מעלות צלזיוס) ישירות לכיפת ה-BMM כדי להמיס אותה. המשיכו בפיפטינג עד שה-BMM מומס לחלוטין והעבירו אותו לצינור של 1.5 מ"ל.
    2. הניחו את הצינור על קרח למשך 30 דקות והחזירו את הצלחת לחממה כך שתישאר חמה. אם אתה משתמש בצלחת חדשה, ודא שהיא מחוממת מראש ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
      הערה: אם עוברים יותר מ-2x 50 כיפות מיקרוליטר, כגון במהלך הרחבות המתוארות להלן, ייתכן שיהיה צורך להאריך את הדגירה על הקרח למשך יותר מ-30 דקות לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
    3. צנטריפוגה ב-350 גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט בזהירות מבלי לשאוב את הגלולה ושטוף עם 500 מיקרוליטר PBS קר. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
      הערה: אם צנטריפוגה קרה אינה זמינה, אפשר לצינור להתקרר בין השטיפות על ידי הנחתו על קרח או מתלה קר.
    4. לאחר הכביסה האחרונה, צנטריפוגה בחום של 350 גרם למשך 5 דקות, הסר את הסופרנטנט והוסף 500 מיקרוליטר של אנזים TrypLE Express מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס). כדי למנוע אובדן תאים מפיפטינג, גרור את הצינור אל גריל האוורור במכסה המנוע של תרבית הרקמות כדי להומוגניזציה של התאים.
    5. דגרו את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות.
      הערה: הזמן עשוי להיות מותאם בהתאם לגנוטיפ האורגנואיד וזמן המעבר, מכיוון שחלקם עשויים לדרוש טריפסיניזציה ארוכה יותר כדי להניב תרחיפים של תא בודד.
    6. עצור את תהליך הדיסוציאציה של התאים על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של DMEM + 3% HI FBS וערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עד שהתמיסה הומוגנית.
    7. צנטריפוגה ב-350 × גרם למשך 5 דקות, ושואבים את הסופרנטנט עד שנותר ~20 מיקרוליטר של נפח. הסר ידנית את הסופרנטנט שנותר בעזרת פיפטה P20 ולא עם שואב ואקום, מכיוון שמקובל לשאוב את הגלולה בשלב זה.
    8. השעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של MOM קר (4 מעלות צלזיוס) ומדדו את ריכוז התאים. הכן דילול תאים כרצונך ושמור אותם על קרח. לאחר מכן, ערבבו עם BMM קר כקרח באמצעות קצות פיפטות שאוחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לפני כן.
      הערה: מומלץ להכין שתי כיפות של 50 מיקרוליטר ב-2 ×-105 תאים/מ"ל, כאשר היחס בין MOM ל-BMM הוא 1:4. לכן, היית צריך; 25 מיקרוליטר של תאים ב-MOM ב-8 ×-105 תאים/מ"ל, ו-75 מיקרוליטר של BMM בסך הכל 100 מיקרוליטר, מחולקים ל-2 כיפות. כך, אחד יזרע ביעילות 1 × 104 תאים לכל כיפה.
    9. זרע כל כיפה של 50 מיקרוליטר באמצע הבאר של צלחת 24 בארות שחוממה מראש. הנח את הצלחת בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 30 דקות לפחות כדי לאפשר ל-BMM להתמצק. הוסף 500 מיקרוליטר של MOM ב-37 מעלות צלזיוס כפי שהוצג קודם לכן בשלב 3.1.2 והחזר את הצלחת לחממה.
  3. הרחבה
    1. כדי להרחיב את תרבית התאים האורגנואידית לצלחת (מחוממת מראש) של 6 בארות, הכינו חמש כיפות של 50 מיקרוליטר ב-8 × 105 תאים/מ"ל. השעו מחדש את התאים בסך הכל 62.5 מיקרוליטר של MOM וערבבו עם 187.5 מיקרוליטר של BMM קר כקרח וזרעו את 5 הכיפות באותה באר.
    2. העבר את הצלחת לחממה למשך 30 דקות כדי לאפשר ל-BMM להתמצק. הוסף 2 מ"ל MOM ב-37 מעלות צלזיוס כפי שהוצג קודם לכן בשלב 3.1.2 והחזר את הצלחת לחממה. החלף מדיה לפי הצורך עד שהתאים יתלכדו.
      הערה: כדי לאסוף תאים למעבר, השתמש ב-1 מ"ל של תמיסת שחזור תאים במקום 500 מיקרוליטר, ודגר על קרח למשך 45 דקות במקום 30 דקות.
  4. שימור בהקפאה
    1. לאחסון לטווח ארוך של אורגנואידים, מעבר כמתואר בשלבים 3.2.1-3.2.7. לאחר מכן, השעו מחדש ב-250 מיקרוליטר של אמצעי הקפאה אורגנואידים (80% MOM, 10% FBS ו-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO)) והעבירו ל-cryotube. להקפיא 1 × 105 תאים לכל קריוביאל.
    2. אחסן את הצינור במיכל הקפאת בקבוקון קריוגני (למשל, מר פרוסטי) והניח לו להתקרר במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. לאחסון לטווח ארוך, שמור את התאים באחסון חנקן נוזלי או במקפיא של -150 מעלות צלזיוס.

4. שינוי גנטי של אורגנואידים שמקורם בעכברים לפיתוח קווי תאים חדשים

  1. התמרה על ידי חיסון (לנטי-ויראלי או רטרו-ויראלי)
    1. מכינים תערובת של 25 מיקרוליטר MOM ו-75 מיקרוליטר BMM ומוסיפים אותה לבאר אחת של צלחת קרה (4 מעלות צלזיוס, מאפשרת ל-BMM "להרטיב "את הבאר במלואה). דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות כדי לאפשר ל-BMM להתמצק לפני זריעת התאים.
    2. השג תאים בודדים שמקורם באורגנואידים (שלב 3.2.5) וזרע כ -2 × 104 על גבי ה- BMM. הוסף 200 מיקרוליטר של MOM חם (37 מעלות צלזיוס) ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 48 שעות.
    3. הוסף את הנגיף בריכוז הרצוי. לקבוע את ה-MOI באופן ניסיוני; מוצע MOI משוער של מתחת ל-30%.
      הערה: אורגנואידים קשים במיוחד להדביק בהשוואה לשורות תאים דו-ממדיות, וצפו ל-MOIs נמוכים אפילו בטיטרים גבוהים של הנגיף. תאי צנטריפוגה ב-600 × גרם למשך 60 דקות ב-32 מעלות צלזיוס. החזירו את הצלחת לחממה לאחר סיום החיסון.
    4. לאחר 8 שעות, הסר את המדיה והוסף תערובת של 25 מיקרוליטר MOM ו-75 מיקרוליטר BMM על גבי התאים כדי "לסנדוויץ'" אותם ב-BMM , מה שמאפשר לאורגנואידים לצמוח באופן טבעי בתלת מימד. אפשר ל-BMM להתמצק על ידי הנחת הצלחת בחממה למשך 30-60 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 250 מיקרוליטר של MOM חם (37 מעלות צלזיוס).
    5. לאחר שהתאים מתלכדים, המשך להעביר אותם כמפורט בשלב 3.2, והרחיב את כל נפח התאים לשתי כיפות בצלחת של 24 בארות.
      הערה: אם משתמשים בבחירת אנטיביוטיקה, מומלץ לבצע את הבחירה ישירות בבאר 48, החל מ-48 שעות לאחר החסימה הראשונית. אם מבצעים מיון תאים המופעל פלואורסצנטי (FACS), מומלץ להרחיב עוד יותר על צלחת של 6 בארות כמתואר לעיל כדי לרכוש מספיק תאים. מומלץ גם זמני טריפסיניזציה ארוכים יותר (שעה) כדי להבטיח תאים בודדים לפני סינון דגימות לזרימה.
  2. טרנספורמציה על ידי CRISPR-Cas9 מבוסס אלקטרופורציה
    הערה: לריכוזים והכנה מורכבים של ריבונוקלאופרוטאין (RNP), עיין במדריך התיקון המכוון להומולוגיה של IDT (עמ' 9-11)22. עם זאת, השמיט את ה-HDR Enhancer V2 לנוקאאוט, מכיוון שהוא מומלץ רק לעריכת גנום הדורשת רקומבינציה הומולוגית.
    1. הכן תרחיף חד-תאי שמקורו באורגנואידים (שלב 3.2.7). שוטפים עם PBS ומודדים את ריכוז התאים. העבר תרחיף תאים המכיל כמות בסדר גודל של 104 (1 × 104 עד 9 × 104 תאים) לתוך צינור של 1.5 מ"ל.
    2. צנטריפוגה בחום של 350 × גרם למשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש ב-10 מיקרוליטר של מאגר עריכת גנום. אם נדרשים >1 × 104 תאים לאלקטרופורציה, הכינו נפח מספיק לאלקטרופורציות סדרתיות, וודאו שכל 10 מיקרוליטר מכיל 1 × 104 עד 9 × 104 תאים.
    3. בעזרת מערכת פיפטה אלקטרופורציה, אספו 10 מיקרוליטר מתרחיף התא, וודאו שלא יוכנסו בועות. אלקטרופורט בתנאים הבאים: מתח 1200 וולט, משך דופק של 20 אלפיות השנייה, 4 פולסים בסך הכל. מניחים תאים בצינור עם MOM קר.
    4. לאחר אלקטרופורציה של תאים, צנטריפוגה את כל התרחיף ב -350 × גרם למשך 5 דקות. השעו מחדש את הגלולה ב-MOM קר כקרח וב-BMM (יחס של 1:4), והכינו מספיק כדי לזרוע כיפה אחת לכל סבב של אלקטרופורציה (כיפה אחת לכל 1 104 תאים).
    5. הנח את הצלחת בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 30 דקות לפחות כדי לאפשר ל-BMM להתמצק. הוסף 500 מיקרוליטר של MOM ב-37 מעלות צלזיוס כפי שהוצג קודם לכן בשלב 3.1.2 והחזר את הצלחת לחממה.
  3. בחירת שיבוטים בודדים
    1. כדי להשיג שיבוט המגיע מתא בודד, תאי מעבר כמתואר לעיל, אך זרעו 50 עד 100 תאים לכל כיפה (4 × 103 עד 8 × 103 תאים / מ"ל בתרחיף תאים לפני ערבוב עם BMM).
    2. החלף את האמא כל 3 ימים. בדוק שהאורגנואידים גדלים כראוי ושים לב אילו מהם מופרדים היטב מהאחרים.
    3. כאשר אורגנואידים גדלים לגודל שניתן להבחין בו (כ-500 מיקרומטר), השתמש במיקרוסקופ אור כדי לזהות 4-5 אורגנואידים גדולים המופרדים מספיק.
      הערה: הם צריכים להיות גלויים לעין בלתי, אך כדאי לסמן את תחתית הצלחת בטוש קצה דק על ידי ציור עיגול סביב אזור הצלחת שבו נמצא האורגנואיד.
    4. בעזרת פיפטה של 20 מיקרוליטר במכסה המנוע הסטרילי, הכנס בעדינות את הקצה לתוך ה-BMM ושאף את האורגנואיד הבודד (שאב נפח של כ-12.5 מיקרוליטר). מניחים את האורגנואיד בצינור איסוף של 1.5 מ"ל עם 500 מיקרוליטר של MOM.
    5. צנטריפוגה בחום של 350 × גרם למשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש ב-500 מיקרוליטר של אנזים TrypLE Express. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    6. להרוות את תגובת הדיסוציאציה של התאים עם 500 מיקרוליטר של 3% FBS ב-DMEM (מדיה דו-ממדית) וצנטריפוגה ב-350 × גרם למשך 5 דקות. הסר בזהירות רבה את הסופרנטנט, השהה מחדש ב-12.5 מיקרוליטר של MOM קר, ערבב עם 37.5 מיקרוליטר של BMM קר כקרח, וזרע את כל התרחיף ככיפה אחת של 50 מיקרוליטר בצלחת של 24 בארות, כמתואר לעיל.
    7. הנח את הצלחת בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 30 דקות לפחות כדי לאפשר ל-BMM להתמצק. הוסף 500 מיקרוליטר של MOM ב-37 מעלות צלזיוס כפי שהוצג קודם לכן בשלב 3.1.2 והחזר את הצלחת לחממה.
    8. החלף מדיה כל 3-4 ימים ועבור כאשר הכיפה מתכנסת.

5. גזירת קו תאים דו-ממדי מאורגנואידים

  1. תרבית תאי מעבר
    1. התחל מתרחיף תא בודד, כמו לאחר מעבר אורגנואידים.
    2. המשך כפי שהיית זורע צלחת עם 6 בארות (שלב 3.3), אך השתמש במקום זאת בצלחת מקוררת מראש (4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות). זרעו את הכיפות על צלחת בת 6 בארות המאוחסנת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה ותנו לצלחת לנוח במכסה המנוע הסטרילי למשך 5-10 דקות לפני הכנסתה לחממה.
      הערה: שלב זה יאפשר לתאים להתיישב בעדינות לתחתית הצלחת כדי להתאים למצב גידול דו-ממדי תוך גישה לרכיבי ה-ECM של BMM.
    3. דגרו את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 30 דקות, ולאחר מכן הוסיפו 2 מ"ל MOM ב-37 מעלות צלזיוס. שנה את המדיה לפי הצורך.
    4. כאשר אורגנואידים מגיעים למפגש, מעבר כמתואר בשלבים 3.2.1-3.2.7. לאחר שטיפת ה-PBS הסופית של הבאר כדי להסיר שאריות BMM, הוסף 2 מ"ל של מדיה דו-ממדית מחוממת מראש לבאר.
      הערה: הסרת ה-BMM לא תסיר תאים המחוברים לבאר, ואלה יכולים כעת לפלוש בחופשיות לשאר הבאר תוך הסתגלות לתנאים/מדיה דו-ממדיים.
    5. לאחר שהושג תרחיף תא בודד עם התאים שנותרו ב-BMM, זרע מחצית מנפח התאים, חזור על שלב 5.1.2. הוסף את החצי השני של הבאר המקורית, ואפשר ליותר תאים לזרוע, מה שיאיץ את המפגש.
    6. החלף מדיה דו-ממדית לאחר 24 שעות כדי להסיר תאים שאינם מחוברים.
      הערה: אמורים להיות תאים רבים שאינם מחוברים, מכיוון שתאים הגדלים ב-BMM אינם רגילים למצעי פלסטיק ולא יתחברו בקלות.
    7. חזור על שלב 5.1.4. לאחר מכן, השעו מחדש את כל נפח התאים ב -4 מ"ל של מדיה דו-ממדית וזרעו 2 מ"ל בכל אחת מהבארות ששימשו בעבר. החלף מדיה דו-ממדית כל 3-4 ימים.
  2. תרבית תאים דו-ממדית להרחבה
    1. לאחר שהתאים מגיעים לכ-80% מפגש, המשך למעבר הראשון.
    2. כדי לעבור, שאפו מדיה, שטפו פעם אחת עם 1 מ"ל PBS, והוסיפו 1 מ"ל של 0.25% טריפסין. דגרו על תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 עד 10 דקות.
      הערה: לקווי תאים שונים עשויות להיות תכונות הדבקה שונות, מה שהופך את משך הטריפסיניזציה למשתנה. בדוק במיקרוסקופ אם התאים התנתקו לפני שתמשיך לשלב הבא. הקשה עדינה על לוחית תרבית התאים ביד יכולה לעזור לנתק תאים.
    3. לאחר שכל התאים התנתקו, הרוו את הדיסוציאציה עם DMEM + 10% FBS וצנטריפוגה בטמפרטורה של 350 × גרם למשך 5 דקות.
    4. להרחבה הראשונה (כאשר 80-100% מתלכדים), זרע מחדש ביחס פיצול של 1:1. חזור על שלב 5.1.6 ושנה מדיה דו-ממדית כל 2-3 ימים.
    5. בהתרחבות שנייה (מפגש של 80-100%), זרעו את כל התאים לצלחת של 100 מ"מ על ידי השעיית תאים ב-10 מ"ל של מדיה דו-ממדית ב-37 מעלות צלזיוס. חזור על שלב 5.1.6 והחלף מדיה כל 2-3 ימים.
      הערה: תהליך זה גוזל זמן ויכול להימשך עד חודש שלם. אם עובדים עם קווי תאים שיש להם גנים משולבים ויראלית לביטוי יתר של חלבון, מומלץ לשמור על אנטיביוטיקה ברירה נוכחת במצע הגידול לאורך כל הדרך. אם הסמן הוא חלבון פלואורסצנטי, בצע מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטי בהקדם האפשרי (כלומר, סוף הרחבת צלחת של 100 מ"מ).
  3. שימור בהקפאה
    1. לאחסון תאים אלה, מעבר כמתואר בשלבים 5.2.1-5.2.3. לאחר מכן, השעו מחדש ~1 ×-106 תאים ב-1 מ"ל של אמצעי הקפאה דו-ממדיים, המורכבים מ-80% מדיה דו-ממדית, 10% FBS ו-10% DMSO, והעבירו ל-cryotube. אחסן את התאים לפי שלב 3.5.2.

6. אימות קווים אורגנואידים

  1. בידוד חומר גנטי מאורגנואידים
    1. החל מתרחיף תא בודד, זרע שתי כיפות בצפיפות תאים כפולה מהרגיל (1 ×10 6 תאים/מ"ל). החלף אמא ביום השלישי.
    2. ביום החמישי, הסר מדיה, שטוף פעם אחת עם PBS והוסף 350 מיקרוליטר של מאגר ליזה מועדף ישירות על הכיפות. לאחר 5 דקות של דגירה ב-RT-או עד להמסת ה-BMM - העבירו את הליזאט לצינור של 1.5 מ"ל.
    3. לשימוש ארוך טווח, אחסן את הליזט ב-80 מעלות צלזיוס. אחרת, המשך עם הפרוטוקול למיצוי DNA ו/או RNA באמצעות טכניקת המיצוי המועדפת או ערכה מסחרית.
  2. צביעה אימונופלואורסצנטית (IF)
    1. להכנת תאים, מעבר כמתואר בשלבים 3.2.1-3.2.5. השעו מחדש בתערובת של 37.5 מיקרוליטר של MOM ו-112.5 מיקרוליטר של BMM קר כקרח (מספיק לשלוש כיפות של 50 מיקרוליטר שישמשו כשכפולים ביולוגיים). בצע את שלב 3.2.6 ושנה מדיה ביום השלישי וביום החמישי.
    2. ביום 7, שאפו MOM ושטפו תאים עם 500 מיקרוליטר PBS. תקן כל כיפה בנפרד על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של תמיסת פרפורמלדהיד (PFA) 4% מחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) ב-PBS ישירות על הכיפה. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות עד להמסת ה-BMM.
    3. בעזרת קצה פיפטה P1000 רחב קדח (אם אינו זמין, פשוט חותכים קצה P1000 רגיל כ-0.5 ס"מ מהקצה העדין), אוספים את האורגנואידים ב-4% PFA ומעבירים את הנפח לצינור של 1.5 מ"ל.
      הערה: שימוש בקצה פיפטה רגיל יגרום לשבירת אורגנואידים.
    4. המתן 2 עד 3 דקות עד שהאורגנואידים ישקעו לתחתית הצינור. שאפו 4% PFA (תוך השארת כמות בטוחה של נפח כדי לא לשאוב אורגנואידים) והוסיפו 500 מיקרוליטר PBS כדי לשטוף את האורגנואידים. חזור על שלב זה פעמיים נוספות, בסך הכל 3 כביסות.
      הערה: המתנה עד שהאורגנואידים ישקעו לתחתית עדיפה על צנטריפוגה כדי לשמור על צורת האורגנואיד.
    5. לאחסון לטווח ארוך (4-6 שבועות), שמור אורגנואידים ב-PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. כדי להמשיך עם הצביעה, יש לחלחל עם PBS + 1% Triton-X למשך 30 דקות ב-RT. יש לשטוף פעם אחת עם PBS.
    6. יש לחסום עם PBS + 0.2% Triton-X + 4% FBS + 1% סרום עכבר למשך 60 דקות ב-RT. יש לשטוף פעם אחת עם PBS ולהשאיר 100 מיקרוליטר נפח בצינור.
    7. הכן את מאגר העבודה לצביעה של נוגדנים: PBS + 0.2% Triton-X, 0.4% FBS, 0.1% סרום חולדות. מאגר זה יעבוד עבור נוגדנים ראשוניים ומשניים כאחד.
    8. כדי להכין את כתם הנוגדנים הראשוני, חשב את הדילול כך שיהיה מרוכז פי שניים מהדילול הדרוש בפועל. הכן מספיק תמיסה כדי להוסיף 100 מיקרוליטר של נוגדן ל-100 מיקרוליטר של PBS שנותרו בכל צינור. לדוגמה, לדילול מקורי של 1:1000, הכינו 100 מיקרוליטר של תמיסה של 1:500.
    9. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, יש לשטוף שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר PBS.
    10. הכן את כתם הנוגדנים המשני כפי שהוסבר בשלב 6.2.8. דגירה למשך שעה ב-RT.
      הערה: משלב זה ואילך, הקפד לכסות את אזור העבודה בנייר אלומיניום/קופסה כהה מועדפת כדי למנוע פוטוהלבנה של הנוגדנים הפלואורסצנטיים.
    11. לאחר סיום הצביעה המשנית, יש לשטוף שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר PBS. הסר כמה שיותר נוזלים מהצינור לאחר הכביסה האחרונה כדי להכין את הדגימה להרכבה. השתמש בפיפטה של 20 מיקרוליטר כדי למנוע שאיבת האורגנואידים.
    12. באמצעות קצה פיפטה רחב או חתוך, הוסף 20 מיקרוליטר של מדיית הרכבה לבחירתך והומוגני היטב את התמיסה, תוך הימנעות מבועות.
    13. הניחו טיפת אורגנואידים בתמיסת הרכבה על תלוש כיסוי מלבני. בעזרת מלקחיים, הנח כיסוי עגול על גבי הטיפה, תוך הימנעות מבועות, והשאיר למשך הלילה לייבוש בחושך ב-RT. חזור על שלב זה באותה שקופית אם יש להניח יותר מדגימה אחת לכל שקופית.
    14. הוסף עוד 20 מיקרוליטר של מדיית הרכבה ישירות על גבי החלקת הכיסוי העגולה. כעת, צור "כריך" הרכבה על ידי היפוך הכיסוי המלבני ב-180 מעלות והנחתו על גבי שקופית המיקרוסקופ. השאירו לייבוש בחושך ב-RT למשך 8 שעות לפחות.
      הערה: השקופית צריכה להיות בסדר הבא מלמטה למעלה: שקופית מיקרוסקופ, החלקת כיסוי עגולה, אורגנואידים, שקופית כיסוי מלבנית. זה יוצר תנאי הדמיה אופטימליים.

7. פיתוח מודלים של גידולים בעכברים

  1. הכנת תאים
    1. הפשירו בקבוקון אחד של תאים דו-ממדיים לבחירה במדיה דו-ממדית. אפשרו לתאים אלה לגדול ולהתרחב לצלחת של 150 מ"מ. אם לתאים יש סמני ברירה אנטיביוטיים, בחר תאים לפני ההזרקה כדי להבטיח אוכלוסייה טהורה של התאים הרצויים.
    2. עבור 5 זריקות עכבר, הרחב את התאים לשתי צלחות 150 מ"מ. כאשר הצלחות מתכנסות ב-80%, קצרו את התאים על ידי ביצוע השלבים 5.2.2-5.2.3. השעו מחדש תאים ב-1 מ"ל של מדיום הסרום המופחת של Opti-MEM I ומדדו את ריכוז התאים.
      הערה: כל זריקה מכילה 4 × 106 תאים; עם זאת, מומלץ להתכונן לזריקה נוספת כדי להסביר את הנפח המת של המזרקים. במקרה זה, הכינו 24 × 106 תאים במקום 20 × 106 תאים.
    3. הנח את כל נפח התא עבור כל הזריקות בצינור של 1.5 מ"ל. הכן בסך הכל 44 מיקרוליטר להזרקה, המורכב מחלק אחד של תאים ב-Opti-MEM I ללא תוספת וחלק אחד של BMM קר כקרח. לדוגמה, עבור 24 × 106 תאים (6 זריקות), השעו מחדש 132 מיקרוליטר של Opti-MEM I ו-132 מיקרוליטר של BMM.
    4. מערבבים היטב תאים ושומרים על קרח עד לביצוע ההזרקה.
  2. מתכונן להליך
    1. הוצא בועות אוויר מהנפח המת של המזרק (אינסולין U-100 28 גרם) עם PBS קר.
    2. באמצעות התאים בצינור של 1.5 מ"ל, הכינו חמש זריקות של 40 מיקרוליטר על ידי טעינה איטית של המזרק כדי למנוע לייזינג של תאים עקב כוחות גזירה בתוך המחט. המשיכו על הקרח עד שהעכברים יקבלו הרגעה.
    3. לאחר שהכל מוכן להזרקות, הניחו את המזרקים ליד מנורת החימום כך שה-BMM יוכל להתחמם ולהפוך לצמיג, מה שמקל על ההזרקה והחריטה. אל תניח אותם ישירות מתחת למנורת החימום, מכיוון ש- BMM מוצק יתר על המידה לא יעבור דרך המזרק כראוי. באופן כללי, עבדו מהר כדי למנוע זאת.
  3. הזרקה תוך בורסלית (IBI) לשחלה
    1. להרדים עכבר C57BL/6J באמצעות קטמין (100 מ"ג/מ"ל). יש לתת 0.1 מ"ל לכל 10 גרם משקל גוף בהזרקה תוך-צפקית.
      הערה: עכברים נקבות צעירות זקוקות לרוב רק לזריקות של 0.2 מ"ל, אך עשויות להזדקק ליותר אם הן מבוגרות יותר. זה יספק הרדמה למשך 20-40 דקות אך לא יספק שיכוך כאבים.
    2. הנח את העכבר בכלוב שחומם על ידי מנורת החימום.
      הערה: אין להניח עכברים ישירות מתחת למנורת החימום, מכיוון שהדבר עלול לגרום לנמק זנב והיפרתרמיה, שעלולה להיות קטלנית.
    3. לאחר שהעכבר הראשון מורדם במלואו, בטכניקה אספטית, חותכים חתך של <1 ס"מ לאורך האגף של עכבר C57BL/6J באזור הבטן ומעל הירך. הקפידו לעבור דרך האפידרמיס וההיפודרמיס לפני ההגעה לאזור הבורסה.
    4. משוך בזהירות את השחלה (נמצא בקלות על ידי כרית השומן המחוברת אליה). קח את אחד המזרקים המוכנים והזריק תאים לאט דרך כרית השומן ממש מאחורי השחלה, דרך השחלה עצמה, לתוך שק הביצית.
      הערה: הזרקה מוצלחת תראה את בלון שק הביצית עם BMM. סביר להניח שהתערובת תדלוף גם על כל כרית השומן, וזה נורמלי.
    5. החזירו בזהירות את השחלה לבורסה וסגרו את החתך באמצעות סיכות כירורגיות או על ידי תפירה.
    6. החזר את העכבר לכלוב. השתמש במנורת חימום כדי לחמם את העכברים בזמן שהם מתאוששים לאחר הניתוח עד להכרה חלקית (>15 דקות). למחרת, בדוק את העכבר כדי לוודא שלא התרחש אלח דם במהלך הלילה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סכמטי המסכם את זרימת העבודה ליצירה ואימות של סרטן השחלות HGSOC מוצג באיור 1. תהליך זה מתחיל במיצוי רקמת חצוצרה מעכברה מסוג בר C57BL/6J נקבה (איור 2A). מומלץ להתחיל עם פיסת טישו נדיבה כדי להבטיח איסוף נכון. שימוש במיקרוסקופ מנתח מאפשר בידוד מדויק של החצוצרה הדיסטלית תוך הסרת רקמות מסביב כמו שומן ושחלה. כפי שמוצג באיור 2B, השחלה מכוסה בתחילה בשומן, אך לאחר הפירוק, צבעה הצהוב וצורתה הסגלגלה הופכים ברור...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות ההתקדמות המשמעותית במחקר האונקולוגי, HGSOC נותר הסוג האגרסיבי ביותר של ממאירות גינקולוגית וגורם התמותה המוביל מבין כל סרטן השחלות23,24. ככל שהמחקר הגינקולוגי האונקולוגי התפתח, כך גם המודלים המשמשים בו. ואכן, קווי תאים היסטוריים רבים של סרטן השחלות התגלו כלא אופטימליים לחקר מחלה זו מכמה סיבות, כולל רלוונטיות גנומית, אי התאמות בין תא המקור או מגבלות לגבי חיקוי תנאי in vivo 2. בהקשר זה, אורגנוא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R01(CA257507). הסכמות של הדמויות נוצרו באמצעות BioRender. אנו רוצים להודות לד"ר בנג'מין ניל על תמיכתו לאורך כל הפרויקט הזה, לד"ר שואנג ז'אנג על פיתוח הפרוטוקול המקורי ולד"ר קיומי אראקי על עזרתה באופטימיזציה שלו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% טריפסין, 0.1% EDTA ב-HBSS ללא סידן, מגנזיום ונתרן ביקרבונטקורנינג25053CI
A83-01Tocris Bioscience2939
DMEM/F12 מתקדםגיבקו12-634-028
גיל C57BL/6J (נקבה)מעבדת ג'קסון000664
ערכת מיני DNA/RNA של AllPrepQIAGEN80204לצורך חילוץ DNA/RNA
Alt-R S.p. Cas9-GFP V3טכנולוגיות DNA משולבות10008100
נוגדן אנטי-Ki67אבקאםAB15580
מערכת אוטוקליפכלי המדע המדויק12020-00לסגירת פצעים לאחר IBI
תוסף B-27 (50x), ללא סרוםגיבקו17-504-001
בלסטיצידין HCl (10 מ"ג/מ"ל) 50 מ"גInvivoGenאנט-בל-05
אלבומין סרום בקרסיגמא אולדריץ'A9647
Buffer RLT PlusQIAGEN1053393לפרק תאים לפני חילוץ DNA/RNA
פתרון לשחזור תאיםקורנינג354253
קולגנאז/היאלורונידאזטכנולוגיות STEMCELL07912
CoraLite 594-Phalloidin (אדום)פרויטנטקPF00003
זכוכית כיסוי 15CIR-1פישרברנד12-545-83
זכוכית כיסוי 24 מ"מ וחדה; 40 מ"מ-1פישרברנד12-544-12
תוסף N-2 של CTS (מערכות טיפול תאי)גיבקוA1370701
DAPIרוש10236276001
דאוקסיריבונוקלאז I (DNAse I) מהלבלב הפרסיגמא אולדריץ'D5025
דיפקו סרק מילקבקטון דיקינסון232100
Dispaseטכנולוגיות STEMCELL07913
DMEM עם L-גלוטמין, 4.5 גרם לליטר גלוקוז ונתרן פירובטקורנינג10013CV
DNase I רקומביננטי, ללא RNaseרוש04716728001
תמיסת הפוספאט של דולבקוסיגמא אולדריץ'D8537
דומונט #5 - מלקחיים מצופים קרמיקהכלי המדע המדויק11252-50לכריתת חצוצרות
סרום בקר עובריקורנינג35-010-CVכיבוי חום ב-56 ו-deg; C ל-60 דקות.
מספריים עדינים - ToughCutכלי המדע המדויק14058-09לאיסוף חצוצרות וחתך IBI
אנטיביוטיקה סלקטיבית גנטית (G418 סולפט) (50 מ"ג/מ"ל)גיבקו10131027
תוסף GlutaMAX (100x)גיבקו35-050-061
נוגדן משני מוצלב נגד עזים IgG (H+L), ציאנין3InvitrogenA10520
מלקחי גרפהכלי המדע המדויק11053-10לטיפול ברקמות
בופר HEPESקורנינג25060CI
חלבון רקומביננטי R-Spondin 1 אנושיPeproTech120-38
מזרק אינסולין, U-100 0.5 מ"ל 0.36 מ"מ (28 גרם) x 12.7 מ"מ (1/2")BDBD329461
אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS -G) (100x)גיבקו41-400-045
L-גלוטמין 200 מ"מ (100x)גיבקו25-030-081
מטריצת ממברנת הבסיס של Matrigel GFRקורנינג356231BMM
חלבון רקומביננטי EGF בעכברPeproTech315-09
חלבון רקומביננטי בסיסי FGF בעכברPeproTech450-33
חלבון רקומביננטי בראש העכברPeproTech250-38
חלבון רקומביננטי של עכבר Wnt-3aPeproTech315-20
תוספת N2גיבקו17502048
N-אצטילציסטאין אמידסיגמא אולדריץ'A0737
מערכת האלקטרופורציה Neon NxTInvitrogenNEON1Sלאלקטרופורציה של CRISPR-Cas9
מערכת האלקטרופורציה Neon NxT 10-μ ערכת L עם שפופרות חד-ערוציותInvitrogenN1025חומרים מתכלים לאלקטרופורציה, כולל מאגר עריכת גנום
ניקוטינאמידסיגמא אולדריץ'N3376
סרום עכבר רגילInvitrogen10410
סרום עכברוש רגילטכנולוגיות STEMCELL13551
Opti-MEM I מדיום סרום מופחתגיבקו31985070
PAX8 נוגדן פוליקלונליפרויטנטק10336-1-AP
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)גיבקו15-140-122
פורומיציןסיגמא אולדריץ'P8833
סלקטפרוסט 25 מ"מ וחרד; 75 מ"מ וחד; 1.0 מ"מפישרברנד12-550-003
טריטון X-100ביוריאגנטים של פישרBP151
אנזים TrypLE Express (פעם אחת), ללא פנול אדוםגיבקו12-604-013
מספריים קפיץ ואנאס - קצה חיתוך 4 מ"מכלי המדע המדויק15019-10לכריתת חצוצרות
Y27632טכנולוגיות STEMCELL72304מעכב רו-קינאז (ROCK)  

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Korch, C., et al. DNA profiling analysis of endometrial and ovarian cell lines reveals misidentification, redundancy and contamination. Gynecol. Oncol. 127 (1), 241-248 (2012).
  2. Domcke, S., Sinha, R., Levine, D. A., Sander, C., Schultz, N. Evaluating cell lines as tumour models by comparison of genomic profiles. Nat Commun. 4, 2126(2013).
  3. Anglesio, M. S., et al. Type-specific cell line models for type-specific ovarian cancer research. PLoS One. 8 (9), e72162(2013).
  4. Beaufort, C. M., et al. Ovarian cancer cell line panel (OCCP): Clinical importance of in vitro morphological subtypes. PLoS One. 9 (9), e103988(2014).
  5. Walton, J., et al. CRISPR/Cas9-mediated Trp53 and Brca2 knockout to generate improved murine models of ovarian high-grade serous carcinoma. Cancer Res. 76 (20), 6118-6129 (2016).
  6. Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nat. Commun. 8 (1), 1093(2017).
  7. Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma. Nature. 474 (7353), 609-615 (2011).
  8. Kim, J., Coffey, D. M., Creighton, C. J., Yu, Z., Hawkins, S. M., Matzuk, M. M. High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3921-3926 (2012).
  9. Sherman-Baust, C. A., et al. A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development. J Pathol. 233 (3), 228-237 (2014).
  10. Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).
  11. Vooijs, M., Berns, J. A. A highly efficient ligand-regulated Cre recombinase mouse line shows that LoxP recombination is position dependent. EMBO Rep. 2 (4), 293-297 (2001).
  12. Semprini, S., et al. Cryptic loxP sites in mammalian genomes: genome-wide distribution and relevance for the efficiency of BAC/PAC recombineering techniques. Nucleic Acids Res. 35 (5), 1402-1410 (2007).
  13. Loonstra, A., et al. Growth inhibition and DNA damage induced by Cre recombinase in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9209-9214 (2001).
  14. Zhang, S., et al. Genetically defined, syngeneic organoid platform for developing combination therapies for ovarian cancer. Cancer Discov. 11 (2), 362-383 (2021).
  15. Yver, S., et al. Genetically defined syngeneic mouse models of ovarian cancer as tools for the discovery of combination immunotherapy. Cancer Discov. 11 (2), 384-407 (2021).
  16. Lõhmussaar, K., et al. Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids. Nat. Commun. 11 (1), 2660(2020).
  17. Maniati, E., et al. Mouse ovarian cancer models recapitulate the human tumor microenvironment and patient response to treatment. Cell Reports. 30 (2), 525-540.e7 (2020).
  18. Ford, M. J., Harwalkar, K., Yamanaka, Y. Protocol to generate mouse oviduct epithelial organoids for viral transduction and whole-mount 3D imaging. STAR Protoc. 3 (1), 101164(2022).
  19. Xie, Y., Park, E. -S., Xiang, D., Li, Z. Long-term organoid culture reveals enrichment of organoid-forming epithelial cells in the fimbrial portion of mouse fallopian tube. Stem Cell Res. 32, 51-60 (2018).
  20. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2, 94(2022).
  21. Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. J Exp Med. 145 (1), 204-220 (1977).
  22. Homology-directed repair using the Alt-R CRISPR-Cas9 System and HDR Donor Oligos. , Integrated DNA Technologies (IDT). https://idtsfprod.blob.core.windows.net/sitefinity/docs/default-source/protocol/homology-directed-repair-using-the-alt-r-crispr-cas9-system-and-hdr-donor-oligos.pdf?sfvrsn=47121607_6 (2022).
  23. Santoro, A., et al. The multiple facets of ovarian high grade serous carcinoma: A review on morphological, immunohistochemical and molecular features. Crit Rev Oncol Hematol. 208, 104603(2025).
  24. Lisio, M. -A., Fu, L., Goyeneche, A., Gao, Z., Telleria, C. High-grade serous ovarian cancer: Basic sciences, clinical and therapeutic standpoints. Int J Mol Sci. 20 (4), 952(2019).
  25. Silva-Pedrosa, R., Salgado, A. J., Ferreira, P. E. Revolutionizing disease modeling: The emergence of organoids in cellular systems. Cells. 12 (6), 930(2023).
  26. Claassen, D. A., Desler, M. M., Rizzino, A. ROCK inhibition enhances the recovery and growth of cryopreserved human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells. Mol Reprod Dev. 76 (8), 722-732 (2009).
  27. Leibowitz, M., et al. Chromothripsis as an on-target consequence of CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Genet. 53 (6), 895-905 (2021).
  28. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
  29. Kossaï, M., Leary, A., Scoazec, J. -Y., Genestie, C. Ovarian cancer: A heterogeneous disease. Pathobiology. 85 (1-2), 41-49 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CRISPR Cas9

מאמרים קשורים