Method Article

זרימת עבודה מאומתת לעיבוד נתוני MiRNA-seq וניתוח ביואינפורמטיקה באמצעות R

DOI:

10.3791/68760

⸱

October 24th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, 905th Hospital of PLA Navy, Naval Medical University, 2Department of Nephrology, Naval Medical Center of PLA, Naval Medical University, 3Department of Nephrology, Gongli Hospital of Shanghai Pudong New Area, 4Department of Nephrology, Shanghai Changzheng Hospital, Second Affiliated Hospital of Naval Medical University (Second Military Medical University), 5Department of Cellular Biology and Anatomy, Medical College of Georgia at Augusta University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח נתוני miRNA-Seq באמצעות R. זרימת העבודה מאפשרת לחוקרים לחקור רשתות מווסתות miRNA, ואת משמעותן בשאלות ביולוגיות וקליניות מגוונות. עבודה זו נועדה לשמש מדריך מעשי לחוקרים מתחילים ומנוסים בתחום הביואינפורמטיקה של miRNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרו-רנ"א (miRNAs) הם מווסתים פוסט-שעתוק קריטיים המשפיעים על מגוון רחב של תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים. עם התקדמות טכנולוגיות ריצוף בתפוקה גבוהה, miRNA-Seq התגלה ככלי רב עוצמה לאפיון דפוסי ביטוי miRNA. עם זאת, פרשנות אמינה של נתונים כאלה דורשת צינור ניתוח סטנדרטי וניתן לשחזור. כאן, אנו מציגים זרימת עבודה מאומתת לעיבוד נתוני miRNA-Seq וניתוח ביואינפורמטיקה באמצעות R. פרוטוקול זה מקיף את כל השלבים החיוניים, כולל עיבוד מקדים של נתונים גולמיים, בקרת איכות, יישור, כמות, נורמליזציה, ניתוח ביטוי דיפרנציאלי, חיזוי יעדים, העשרה פונקציונלית ובניית רשת רגולטורית. זרימת העבודה תוכננה לגמישות ושקיפות, משלבת חבילות R שאומצו באופן נרחב ותומכת בהערות ספציפיות למין ובהתאמה אישית מודולרית. בנוסף, המשתמשים מונחים לבצע פרשנות ביולוגית במורד הזרם על ידי מינוף מסדי נתונים וכלי הדמיה שנאספו כגון Cytoscape. פרוטוקול זה לא רק תומך בניתוח סטטיסטי חזק אלא גם מאפשר תובנות משמעותיות לגבי אינטראקציות miRNA-mRNA ותפקידן במנגנוני המחלה. הוא מתאים במיוחד לחוקרים מתחילים ומנוסים כאחד המבצעים גילוי סמנים ביולוגיים של miRNA, מידול מחלות או מחקרי מולטי-אומיקס אינטגרטיביים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרו-רנ"א (miRNAs) הן מולקולות RNA קצרות שאינן מקודדות המשפיעות באופן משמעותי על ביטוי הגנים על ידי פעולה בשלב1 שלאחר השעתוק. הם מתפקדים בדרך כלל על ידי קשירה לרצפים משלימים ב-3' אזורים לא מתורגמים (UTRs) של RNA שליח מטרה (mRNAs), מה שמוביל לפירוק mRNA או דיכוי תרגומי1. במהלך שני העשורים האחרונים, miRNAs מוכרים יותר ויותר כמווסתים מרכזיים של תהליכים ביולוגיים שונים, כולל התפשטות תאים, התמיינות, אפופטוזיס, תגובות חיסוניות והתפתחות איברים2. יתר על כן, חוסר ויסות של ביטוי miRNA היה מעורב בפתוגנזה של מחלות רבות, כגון סרטן, מחלות לב וכלי דם, הפרעות נוירולוגיות ומחלות ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: חומרים עם קישורי תוכנה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת דגימות RNA וספריות רצף

הערה: בצע חילוץ ורצף של RNA מחוץ לזרימת עבודה חישובית זו. יש יותר מדרך אחת לנתח נתוני ריצוף miRNA. חלק זה מספק את ההקשר של מעשי אחד.

  1. חילוץ סך ה-RNA: חלץ את סך ה-RNA מהדגימות הביולוגיות באמצעות ערכה המותאמת לבידוד RNA קטן (למשל, ערכת בידוד miRNA). עקוב אחר פרוטוקול היצרן בקפידה. הקפד להשתמש בחומרים מתכלים ללא RNase ושמור דגימות על קרח כדי למזער את הפירוק.
  2. הערכת שלמות וכמות RNA: הפעל 1-2 מיקרוליטר של ה-RNA המופק על ביו-אנלייזר או מכשיר שווה ערך.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הורדנו את מטריצת ביטוי המיקרו-RNA מ-GSE133530 וביצענו ניתוח ביטוי דיפרנציאלי ישירות. סיפקנו סקריפט R אנליטי לדוגמה עבור מערך הנתונים בקובץ משלים 1. מערך הנתונים ביצע פרופיל miRNA גלובלי על 16 ציסטות כלייתית בגדלים שונים (ציסטות מינימליות: פחות מ-1-5 מ"ל, n = 10; ציסטות בינוניות: בין 10-25 מ"ל, n = 4; ציסטות גדולות: גדולות מ-50 מ"ל, n = 4) ורקמה ציסטית מינימלית (MCT, n = 7, כולל 1 שכפול) מארבע כליות פוליציסטיות PKD1. בנוסף, רקמות קליפת המוח הכלייתיות ללא ממאירות התקבלו משל.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח נתוני miRNA-Seq מציב אתגרים מובהקים בשל הגודל הקטן והיתירות של הקריאות, מה שהופך את בקרת האיכות הקפדנית והעיבוד המקדים לקריטיים. אחד השלבים החשובים ביותר בזרימת העבודה הוא חיתוך מתאם. מכיוון שאורכם של miRNAs הוא כ-22 נוקלאוטידים, רצפי מתאמים יכולים לשלוט בקלות בקריאות אם לא יוסרו כראוי. אי ביצוע חיתוך מדויק עלול לגרום לחוסר יישור ולניפוח של קריאות חיוביות כוזבות. באופן דומה, יש ליישם סינון איכותי לפני היישור כדי למנוע בסיסים באיכות נמוכה שעלולים לפגוע בדיוק המיפוי. מיפוי וכימות מיי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לסוכנויות המממנות ולמשתפי הפעולה התומכים בפרויקט זה. תוכנית פעולה לחדשנות מדעית וטכנולוגית בשנחאי (22Y11905500, 24142201800), פרויקט מוסדי של בית החולים מס' 905 של חיל הים PLA (2024Q021), פרויקט מחקר נוער של ועדת הבריאות המחוזית של צ'אנגנינג (2024QN29) ופרויקט מחקר של האוניברסיטה הרפואית הימית (2024QN040).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agilent-021827 מיקרו-מערך miRNA אנושיזריז/מערך מסחרי לאפיון מיקרו-רנ"א של דגימות אנושיות
עניבת פרפראוניברסיטת ג'ונס הופקינסhttp://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtmlכלי תוכנה ליישור קריאות רצף לרצפי התייחסות ארוכים
clusterProfiler (חבילת R)מוליכים ביולוגייםhttps://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/חבילת R המיועדת לניתוח העשרה פונקציונלית והדמיה של נתונים ביולוגיים בעלי תפוקה גבוהה.
קאטאדפטקוד פתוחhttps://cutadapt.readthedocs.ioכלי שורת פקודה שמסיר רצפי מתאמים, פריימרים, זנבות פולי-A ומקטעים לא רצויים אחרים מקריאות רצף בתפוקה גבוהה.
ציטוסקייפקונסורציום Cytoscapehttps://cytoscape.org/פלטפורמת תוכנה בקוד פתוח המיועדת להדמיה וניתוח של רשתות ביולוגיות מורכבות.
DESeq2 (חבילת R)מוליכים ביולוגייםhttps://bioconductor.org/packages/DESeq2/חבילת R המיועדת לניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי של נתוני ספירה
EnhancedVolcano (חבילת R)מוליכים ביולוגייםhttps://bioconductor.org/packages/EnhancedVolcano/  חבילת R שנועדה ליצור עלילות הר געש באיכות פרסום.
FastQCבאברהם ביואינפורמטיקהhttps://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/כלי בקרת איכות בקוד פתוח לנתוני ריצוף בתפוקה גבוהה.
ספירת תכונותקריאת משנה / SourceForgehttp://subread.sourceforge.net/תוכנה המשמשת לספירת קריאות הממופות לתכונות גנומיות
ספירת HTSeqחבילת Pythonhttps://htseq.readthedocs.ioכלי שורת פקודה שסופר כמה קריאות ריצוף מיושרות בתפוקה גבוהה חופפות תכונות גנומיות כגון גנים או אקסונים. אני
שבב חרוזים לביטוי MicroRNA של Illumina Human v2אילומינה /מערך מסחרי לאפיון מיקרו-רנ"א של דגימות אנושיות
multiMiR (חבילת R)מוליכים ביולוגייםhttps://bioconductor.org/packages/multiMiR/חבילת R המספקת את האוסף המשולב הגדול ביותר של microRNA&ndash חזוי ומאומת בניסוי; אינטראקציות ממוקדות יחד עם האסוציאציות שלהם למחלות ותרופות.
הארגוני. Hs.eg.db (חבילת R)מוליכים ביולוגייםhttps://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/חבילת הערות המיועדת למחקר גנומי אנושי (הומו ספיינס).
תוכנת Rפרויקט Rhttps://www.r-project.org/פרויקט קוד פתוח לחישוב סטטיסטי
סטודיופוזיט PBC/סביבת פיתוח משולבת עוזרת להיות פרודוקטיביים יותר עם R ו-Python
SAMtoolsקוד פתוחhttp://www.htslib.org/חבילת תוכנה למניפולציה של נתוני ריצוף מהדור הבא (NGS).

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hsu, P. W., et al. miRNAMap: genomic maps of microRNA genes and their target genes in mammalian genomes. Nucleic Acids Res. 34 (Database issue), D135-D139 (2006).
  2. Fragiadaki, M. Lessons from....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MiRNA SeqMiRNA ExpressionData ProcessingBioinformatics AnalysisDifferential ExpressionTarget PredictionFunctional EnrichmentRegulatory NetworkR PackagesCytoscape Visualization

Related Articles