מאמר שיטה

זרימת עבודה מאומתת לעיבוד נתוני MiRNA-seq וניתוח ביואינפורמטיקה באמצעות R

DOI:

10.3791/68760

⸱

24 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, 905th Hospital of PLA Navy, Naval Medical University, 2Department of Nephrology, Naval Medical Center of PLA, Naval Medical University, 3Department of Nephrology, Gongli Hospital of Shanghai Pudong New Area, 4Department of Nephrology, Shanghai Changzheng Hospital, Second Affiliated Hospital of Naval Medical University (Second Military Medical University), 5Department of Cellular Biology and Anatomy, Medical College of Georgia at Augusta University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח נתוני miRNA-Seq באמצעות R. זרימת העבודה מאפשרת לחוקרים לחקור רשתות מווסתות miRNA, ואת משמעותן בשאלות ביולוגיות וקליניות מגוונות. עבודה זו נועדה לשמש מדריך מעשי לחוקרים מתחילים ומנוסים בתחום הביואינפורמטיקה של miRNA.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרו-רנ"א (miRNAs) הם מווסתים פוסט-שעתוק קריטיים המשפיעים על מגוון רחב של תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים. עם התקדמות טכנולוגיות ריצוף בתפוקה גבוהה, miRNA-Seq התגלה ככלי רב עוצמה לאפיון דפוסי ביטוי miRNA. עם זאת, פרשנות אמינה של נתונים כאלה דורשת צינור ניתוח סטנדרטי וניתן לשחזור. כאן, אנו מציגים זרימת עבודה מאומתת לעיבוד נתוני miRNA-Seq וניתוח ביואינפורמטיקה באמצעות R. פרוטוקול זה מקיף את כל השלבים החיוניים, כולל עיבוד מקדים של נתונים גולמיים, בקרת איכות, יישור, כמות, נורמליזציה, ניתוח ביטוי דיפרנציאלי, חיזוי יעדים, העשרה פונקציונלית ובניית רשת רגולטורית. זרימת העבודה תוכננה לגמישות ושקיפות, משלבת חבילות R שאומצו באופן נרחב ותומכת בהערות ספציפיות למין ובהתאמה אישית מודולרית. בנוסף, המשתמשים מונחים לבצע פרשנות ביולוגית במורד הזרם על ידי מינוף מסדי נתונים וכלי הדמיה שנאספו כגון Cytoscape. פרוטוקול זה לא רק תומך בניתוח סטטיסטי חזק אלא גם מאפשר תובנות משמעותיות לגבי אינטראקציות miRNA-mRNA ותפקידן במנגנוני המחלה. הוא מתאים במיוחד לחוקרים מתחילים ומנוסים כאחד המבצעים גילוי סמנים ביולוגיים של miRNA, מידול מחלות או מחקרי מולטי-אומיקס אינטגרטיביים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרו-רנ"א (miRNAs) הן מולקולות RNA קצרות שאינן מקודדות המשפיעות באופן משמעותי על ביטוי הגנים על ידי פעולה בשלב1 שלאחר השעתוק. הם מתפקדים בדרך כלל על ידי קשירה לרצפים משלימים ב-3' אזורים לא מתורגמים (UTRs) של RNA שליח מטרה (mRNAs), מה שמוביל לפירוק mRNA או דיכוי תרגומי1. במהלך שני העשורים האחרונים, miRNAs מוכרים יותר ויותר כמווסתים מרכזיים של תהליכים ביולוגיים שונים, כולל התפשטות תאים, התמיינות, אפופטוזיס, תגובות חיסוניות והתפתחות איברים2. יתר על כן, חוסר ויסות של ביטוי miRNA היה מעורב בפתוגנזה של מחלות רבות, כגון סרטן, מחלות לב וכלי דם, הפרעות נוירולוגיות ומחלות כליות3. ממצאים אלה מדגישים את הפוטנציאל של miRNAs לא רק כמטרות טיפוליות אלא גם כסמנים ביולוגיים זעיר פולשניים באבחון קליני.

עם הופעתן של טכנולוגיות ריצוף מהדור הבא (NGS), חקר ה-miRNAs נכנס לעידן חדש. בניגוד לשיטות מבוססות מיקרו-מערך המוגבלות ל-miRNAs ידועים, ריצוף miRNA (miRNA-Seq) מאפשר פרופיל מקיף, תפוקה גבוהה ובלתי מוטה של miRNAs ידועים וחדשים על פני סוגי דגימות ותנאים שונים4. miRNA-Seq מספק רגישות, דיוק וטווח דינמי מעולים, מה שהופך אותו לשיטה מועדפת לחקירת דפוסי ביטוי miRNA וגילוי מנגנוני ויסות בסביבות פיזיולוגיות ופתולוגיות5. עם זאת, ניתוח נתוני miRNA-Seq מציג אתגרים חישוביים ספציפיים, כולל טיפול באורכי קריאה קצרים, הסרת רצפי מתאמים, הבחנה בין בני משפחת miRNA קרובים וניהול יתירות גבוהה בספירת קריאה6. מאפיינים אלה מחייבים זרימת עבודה אנליטית מתוקננת ומתוקננת בקפידה.

למרות שפותחו צינורות וכלי תוכנה שונים לניתוח נתוני miRNA-Seq, רבים מהם מסתמכים על ממשקי משתמש גרפיים או זרימות עבודה קבועות המגבילים את הגמישות ויכולת השחזור7. לעומת זאת, סביבת התכנות R מספקת פלטפורמה רבת עוצמה וניתנת להתאמה אישית לניתוח ביואינפורמטיקה8. R מציעה מערכת אקולוגית עשירה של חבילות למידול סטטיסטי, הדמיית נתונים ואינטגרציה עם מסדי נתונים ביולוגיים. זה מאפשר למשתמשים לבצע ניתוחים מקיפים וניתנים לשחזור בצורה שקופה ומבוססת סקריפטים. יתרה מכך, האופי המודולרי של זרימות עבודה R מאפשר לחוקרים להתאים כל שלב בהתאם לדרישות ניסוי ספציפיות, החל מעיבוד מקדים של נתונים גולמיים ועד לפרשנות פונקציונלית.

בפרוטוקול זה, אנו מציגים זרימת עבודה מאומתת ומלאה של ניתוח miRNA-Seq המיושמת כולה ב-R, במטרה לספק פתרון ניתן לשחזור והתאמה למשתמש לחוקרים העובדים עם נתוני ביטוי miRNA. זרימת העבודה מתחילה בבקרת איכות וחיתוך מתאם של קריאות ריצוף גולמיות, ולאחר מכן יישור לגנום ייחוס או לרצפי miRNA ידועים. השלבים הבאים כוללים כימות של ספירת קריאה, נורמליזציה, ניתוח ביטוי דיפרנציאלי, חיזוי גנים מטרה, העשרה פונקציונלית והדמיית רשת. זרימת העבודה משלבת מספר חבילות R בשימוש נרחב ומתוחזקות היטב, מה שמבטיח אמינות ותאימות לעדכונים והרחבות עתידיים.

אחת מנקודות החוזק המרכזיות של פרוטוקול זה טמונה ביכולתו להתקדם מעבר לתוצאות ביטוי דיפרנציאליות ולספק פרשנות ביולוגית משמעותית. על ידי שילוב מסדי נתונים שנאספו של אינטראקציות miRNA-mRNA מאומתות וחזויות, זרימת העבודה מאפשרת למשתמשים לזהות גני יעד רלוונטיים מבחינה ביולוגית. לאחר מכן ניתן לעבור מטרות אלה לניתוח אונטולוגיה גנטית והעשרת מסלולים כדי לחשוף תהליכים ביולוגיים ומסלולים מולקולריים מושפעים. בשלב האחרון, ניתן לדמיין רשתות אינטראקציה של miRNA-mRNA באמצעות כלים חיצוניים כגון Cytoscape9, המספקים תובנה לגבי הנוף הרגולטורי וזיהוי miRNAs מרכזיים בעלי חשיבות פונקציונלית פוטנציאלית.

שיטה זו יושמה בהצלחה בהקשרים של מחקר קליני, כולל מחקרים על מחלות כליות, שבהם miRNA במחזור משמשים כסמנים ביולוגיים מבטיחים לאבחון ופרוגנוזה10. עם זאת, העיצוב המודולרי והגמיש של זרימת העבודה הופך אותו למתאים למגוון רחב של יישומים, כולל מודלים של מחלות, מחקרי תגובה לתרופות, ביולוגיה התפתחותית וגנומיקה השוואתית. חוקרים יכולים להתאים בקלות את זרימת העבודה כך שתתאים להערות ספציפיות למין, תנאי ניסוי או שכבות נוספות של נתוני אומיקס.

על ידי הצעת פתרון מבוסס קוד פתוח ומבוסס סקריפטים, צינור ממוקד R זה נותן מענה לכמה מהמגבלות העיקריות הקשורות לכלי miRNA-Seq קיימים, כולל התאמה אישית מוגבלת, הסתמכות על ממשקים גרפיים לא שקופים, חוסר תמיכה באורגניזמים שאינם מודלים, יכולת שחזור לקויה עקב היעדר בקרת גרסאות וקושי בשילוב עם מסגרות ניתוח סטטיסטיות ופונקציונליות במורד הזרם. הוא מאפשר שליטה מלאה בפרמטרים של עיבוד נתונים, מעודד שחזור באמצעות קוד מבוקר גרסאות ומקדם שקיפות במחקר ביואינפורמטיקה. ככל שחשיבותם של miRNAs ממשיכה לגדול בהקשר של ביולוגיה מערכתית ורפואה תרגומית, גישה למסגרת ניתוח אמינה וניתנת להתאמה הופכת חיונית יותר ויותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: חומרים עם קישורי תוכנה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת דגימות RNA וספריות רצף

הערה: בצע חילוץ ורצף של RNA מחוץ לזרימת עבודה חישובית זו. יש יותר מדרך אחת לנתח נתוני ריצוף miRNA. חלק זה מספק את ההקשר של מעשי אחד.

  1. חילוץ סך ה-RNA: חלץ את סך ה-RNA מהדגימות הביולוגיות באמצעות ערכה המותאמת לבידוד RNA קטן (למשל, ערכת בידוד miRNA). עקוב אחר פרוטוקול היצרן בקפידה. הקפד להשתמש בחומרים מתכלים ללא RNase ושמור דגימות על קרח כדי למזער את הפירוק.
  2. הערכת שלמות וכמות RNA: הפעל 1-2 מיקרוליטר של ה-RNA המופק על ביו-אנלייזר או מכשיר שווה ערך. בדוק את מספר תקינות ה-RNA (RIN) וודא שהוא ≥ 7.0 לריצוף אמין. רשום את הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר או פלואורומטר.
  3. בנה ספריות RNA קטנות: הכן ספריות ריצוף מ-1 מיקרוגרם של RNA כולל באמצעות ערכת הכנת ספריית RNA-seq קטנה מסחרית. עקוב אחר פרוטוקול הערכה כדי לקשר מתאמים, לתמלל לאחור ולהגביר את ה-cDNA. טהר את מוצרי ה-PCR עם בחירת גודל (למשל, 18-30 nt insert) כדי להעשיר את שברי ה-miRNA.
  4. ספריות רצף: טען את הספריות על פלטפורמת ריצוף בעלת תפוקה גבוהה. הגדר את תצורת ההפעלה לרצף קצה יחיד עם אורך קריאה של ~50 bp. ודא שכל דגימה מייצרת כ-10 מיליון קריאות גולמיות כדי להשיג עומק מספיק.
  5. ייצוא פלט רצף: לאחר הרצף, ייצא את הנתונים הגולמיים כקבצי FASTQ באמצעות תוכנת פלט הנתונים של המכשיר. ודא שספריית הפלט מכילה הן את קריאות הרצף והן את קבצי ניקוד האיכות המשויכים. אחסן את קבצי FASTQ בספרייה מובנית לניתוח במורד הזרם.

2. עיבוד מקדים של קריאות גולמיות וביצוע בקרת איכות

  1. חיתוך רצפי מתאמים
    1. התקן והגדר את Cutadapt או fastp.
    2. הפעל חיתוך מתאם בכל קובץ FASTQ באמצעות הפקודה הבאה:
      cutadapt -a XXXX -o trimmed_reads.fastq raw_reads.fastq
      הערה: רצף המתאם שאחריו '-a' אמור לחול עם ערכת ההכנה הספציפית של ספריית sRNA. '-o' מגדיר את שם קובץ הפלט עם קובץ הקלט שאחריו.
  2. הערכת איכות הקריאה
    1. השתמשו ב-FastQC כדי להפיק דוחות בקרת איכות:
      fastqc trimmed_reads.fastq
    2. סקור ציוני איכות לפי בסיס, התפלגות אורך קריאה וזיהום מתאם: פתח את דוח ה- HTML של FastQC שנוצר עבור כל קובץ FASTQ בדפדפן אינטרנט. בחן את המודולים הבאים שלב אחר שלב:
      1. איכות רצף לכל בסיס: ודא שרוב הבסיסים נופלים בתוך האזור הירוק (ציון פרד ≥30). חפש כל ירידה באיכות בקצה 3′ שעלולה להצביע על שגיאות רצף.
      2. התפלגות אורך קריאה: ודא שההתפלגות תואמת את גודל ההכנסה הצפוי (למשל, 18-30 nt עבור miRNAs). בדוק שאין שיאים בלתי צפויים.
      3. תוכן מתאם: ודא שרצפי המתאמים נחתכו ביעילות. ודא שאחוז הזיהום של המתאם קרוב לאפס לאחר החיתוך.
    3. שמור את דוח הסיכום של FastQC וסמן דגימות עם מדדי איכות ירודים לצורך חיתוך מחדש או אי הכללה מניתוח נוסף.

3. מפת קוראת ומייצרת מטריצות ספירה

  1. יישור קריאות להפניה
    1. הורד את קובץ ה-FASTA של גנום הייחוס או רצפי miRNA בוגרים (למשל, מ-miRBase)11. דוגמה:
      wget ftp://mirbase.org/pub/mirbase/CURRENT/mature.fa
    2. אינדקס את גנום הייחוס באמצעות Bowtie.
      1. פתח מסוף והפעל את הפקודה הבאה כדי לבנות את האינדקס:
        bowtie-build reference.fa reference_index
      2. החלף את reference.fa בשם הקובץ FASTA בפועל.
      3. החלף reference_index בקידומת הרצויה לאינדקס.
      4. ודא ש-Bowtie יוצר קובצי אינדקס מרובים (לדוגמה, .ebwt). ודא שקבצים אלה קיימים בספריית העבודה, מכיוון שהם נדרשים ליישור.
    3. יישר קריאות באמצעות עניבת פרפר עם פרמטרים מתאימים לקריאות קצרות. דוגמה:
      bowtie -v 0 -a --best --strata reference_index trimmed_reads.fastq > aligned_reads.sam
      הערה: קובץ הקלט הוא trimmed_reads.fastq וקובץ הפלט הוא aligned_reads.sam. '-v 0' פירושו שאנחנו לא מאפשרים טעות בכל הקריאה. '-a -best -strata' פירושו שאנו זורקים כל יישור שיש בו יותר חוסר התאמה מהטוב ביותר.
  2. כימות ביטוי miRNA
    1. המרת קבצי SAM לפורמט BAM באמצעות SAMtools.
      samtools view -S -b aligned_reads.sam > aligned_reads.bam
      הערה: קובץ הקלט aligned_reads.sam הוא התוצאה של הפקודה האחרונה. קובץ הפלט aligned_reads.bam מוכן לניתוח הבא.
      1. השתמשו ב-SAMtools כדי לדחוס ולמיין את קובץ היישור:
        samtools sort aligned_reads.bam -o aligned_reads_sorted.bam
        samtools index aligned_reads_sorted.bam
      2. ודא שהפקודה הראשונה ממירה את קובץ ה-SAM לפורמט BAM.
      3. ודא שהפקודה השנייה ממיינת את קובץ ה-BAM לפי קואורדינטות גנומיות.
      4. ודא שהפקודה השלישית יוצרת קובץ אינדקס ( .bai), הנדרש לניתוחים במורד הזרם.
      5. ודא שגם קובץ ה- BAM הממוין וגם האינדקס שלו נוצרו בהצלחה לפני שתמשיך לכימות.
    2. השתמש ב-featureCounts או ב-HTSeq-count כדי ליצור מטריצת ספירה באמצעות ביאור miRNA GTF:
      featureCounts -a miRNA.gtf -o counts.txt aligned_reads.bam
      הערה: featureCounts מכמת קריאות בקובץ הקלט aligned_reads.bam בהתבסס על miRNA.gtf, ומוציא counts.txt.

4. לבצע ניתוח ביטוי דיפרנציאלי ב-R

  1. נתוני ספירת עומסים
    1. ייבא מטריצת ספירה ומטא נתונים לדוגמה ל-R:
      library(DESeq2)
      countData <- read.csv("counts.csv", row.names=1)
      colData <- read.csv("metadata.csv", row.names=1)
      dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = countData, colData = colData, design = ~ condition)
      הערה: יש לספק נתוני ספירה (counts.csv) וקבוצת דגימות (metadata.csv) ל-DESeq2. 'מצב' כאן מבהיר את קבוצת הדגימות שסופקו. לדרישות אישיות, עיין במדריך של DESeq212.
  2. נורמליזציה והמרה של נתונים
    1. נרמל נתוני ספירה באמצעות שיטת ברירת המחדל של DESeq2:
      dds <- DESeq(dds)
    2. ביצוע המרה מייצבת שונות:
      vsd <- vst(dds, blind=FALSE)
    3. הצג באופן חזותי אשכולות לדוגמה באמצעות PCA:
      plotPCA(vsd, intgroup="condition")
  3. זיהוי miRNAs המתבטאים באופן דיפרנציאלי
    1. חילוץ ומיון תוצאות ביטוי דיפרנציאלי:
      res <- results(dds)
      resOrdered <- res[order(res$pvalue), ]
      הערה: אנו מסדרים מחדש את קובץ התוצאות 'res' בהתבסס על הערך של pvalue.
      summary(res)
    2. סינון miRNAs בעלי ביטוי דיפרנציאלי משמעותי (ערך p < 0.05, |log2FC| > 1).
      sig_miRNA <- subset(res, pvalue < 0.05 & abs(log2FC) > 1)
      הערה: ישנם מספר ספים לסינון miRNAs שהשתנו באופן משמעותי. הדרישות 'ערך p < 0.05, |log2FC| > 1' מיושמים באופן נרחב. ניתן להתאים את ערכי הסף לנתונים בודדים.
  4. הצגה חזותית של שינויי ביטוי
    1. התקן וטען את חבילת EnhancedVolcano.
    2. צור את עלילת הר הגעש:
      library(EnhancedVolcano)
      EnhancedVolcano(res,
      lab = rownames(res),
      x = 'log2FoldChange',
      y = 'pvalue',
      title = 'Differentially Expressed miRNAs')

5. לחזות את גני המטרה של miRNAs

  1. מסדי נתונים של שאילתות
    1. השתמש במשאבים מקוונים כגון TargetScan, miRDB ו-miRTarBase כדי לחפש microRNA ספציפי ולאחזר גני יעד.
    2. התמקדו ביעדים מאומתים בניסוי לביטחון רב יותר.
  2. אוטומציה של חיזוי ב-R
    1. טען חבילת multiMiR ושאילתה על יעדים מאומתים:
      library(multiMiR)
      target_results <- get_multimir(mirna = c("hsa-miR-21-5p"), table = "validated")
      הערה: כאן ניקח לדוגמא את "has-miR-21-5p" ונקבל יעדים מאומתים.
    2. חלץ סמלי גן מטרה ייחודיים לניתוח העשרה:
      genes <- unique(target_results@data$target_symbol)

6. לבצע ניתוח העשרה פונקציונלית

  1. בצע העשרה GO
    1. עומס כלי העשרה:
      library(clusterProfiler)
      library(org.Hs.eg.db)
      הערה: כאן, אנו טוענים מסד נתונים המכיל הערות גנום אנושי, שימושיות להמרת מזהי גנים נפוצים.
    2. הפעל ניתוח העשרה GO לתהליכים ביולוגיים:
      ego <- enrichGO(gene = genes,
      OrgDb = org.Hs.eg.db,
      keyType = "SYMBOL",
      ont = "BP",
      pAdjustMethod = "BH",
      pvalueCutoff = 0.05)
      dotplot(ego)
      הערה: לשימוש ב-enrichGO, אנו מספקים רשימה של גנים, ומבהירים שהם מועמדים כ-'SYMBOL' כאן. ביצענו העשרה ביולוגית, המתאימה לפרמטר 'ont = "BP" '. אנו מבצעים תיקון בדיקות מרובות, ולכן אנו מייעדים pAdjustMethod = "BH". עבור סף משמעותי, אנו בוחרים pvalueCutoff = 0.05.dotplot מציג תוצאה חזותית. לאפשרויות בודדות יותר, עיין במדריך של clusterProfiler13.
  2. בצע העשרת מסלול KEGG
    1. הפעל את העשרת KEGG:
      ekegg <- enrichKEGG(gene = genes, organism = 'hsa')
      dotplot(ekegg)
      הערה: לשימוש ב-enrichKEGG, אנו מספקים רשימה של גנים, ומבהירים את האורגניזם כאנושי ("יש"). dotplot מציג תוצאה חזותית. לאפשרויות בודדות יותר, עיין במדריך של clusterProfiler13.

7. לבנות ולהמחיש רשת אינטראקציה miRNA - mRNA

  1. ייצוא נתונים לתצוגה חזותית של הרשת
  2. צור מסגרת נתונים של זוגות גנים יעד miRNA המבוססים על היעדים שנוצרו מ-TargetScan, miRDB או miRTarBase.
  3. כתוב את טבלת הרשת ל- CSV:
    write.csv(miRNA_target_pairs, "network.csv")
  4. ייבוא ל- Cytoscape
    1. פתח את Cytoscape וייבא את טבלת הרשת.
    2. דמיין את הרשת באמצעות פריסה מכוונת כוח או מעגלית.
    3. לנתח מאפיינים טופולוגיים (למשל, מרכזיות מעלות) כדי לזהות miRNAs רכזת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הורדנו את מטריצת ביטוי המיקרו-RNA מ-GSE133530 וביצענו ניתוח ביטוי דיפרנציאלי ישירות. סיפקנו סקריפט R אנליטי לדוגמה עבור מערך הנתונים בקובץ משלים 1. מערך הנתונים ביצע פרופיל miRNA גלובלי על 16 ציסטות כלייתית בגדלים שונים (ציסטות מינימליות: פחות מ-1-5 מ"ל, n = 10; ציסטות בינוניות: בין 10-25 מ"ל, n = 4; ציסטות גדולות: גדולות מ-50 מ"ל, n = 4) ורקמה ציסטית מינימלית (MCT, n = 7, כולל 1 שכפול) מארבע כליות פוליציסטיות PKD1. בנוסף, רקמות קליפת המוח הכלייתיות ללא ממאירות התקבלו משל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח נתוני miRNA-Seq מציב אתגרים מובהקים בשל הגודל הקטן והיתירות של הקריאות, מה שהופך את בקרת האיכות הקפדנית והעיבוד המקדים לקריטיים. אחד השלבים החשובים ביותר בזרימת העבודה הוא חיתוך מתאם. מכיוון שאורכם של miRNAs הוא כ-22 נוקלאוטידים, רצפי מתאמים יכולים לשלוט בקלות בקריאות אם לא יוסרו כראוי. אי ביצוע חיתוך מדויק עלול לגרום לחוסר יישור ולניפוח של קריאות חיוביות כוזבות. באופן דומה, יש ליישם סינון איכותי לפני היישור כדי למנוע בסיסים באיכות נמוכה שעלולים לפגוע בדיוק המיפוי. מיפוי וכימות מיי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לסוכנויות המממנות ולמשתפי הפעולה התומכים בפרויקט זה. תוכנית פעולה לחדשנות מדעית וטכנולוגית בשנחאי (22Y11905500, 24142201800), פרויקט מוסדי של בית החולים מס' 905 של חיל הים PLA (2024Q021), פרויקט מחקר נוער של ועדת הבריאות המחוזית של צ'אנגנינג (2024QN29) ופרויקט מחקר של האוניברסיטה הרפואית הימית (2024QN040).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Agilent-021827 מיקרו-מערך miRNA אנושיזריז/מערך מסחרי לאפיון מיקרו-רנ"א של דגימות אנושיות
עניבת פרפראוניברסיטת ג'ונס הופקינסhttp://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtmlכלי תוכנה ליישור קריאות רצף לרצפי התייחסות ארוכים
clusterProfiler (חבילת R)מוליכים ביולוגייםhttps://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/חבילת R המיועדת לניתוח העשרה פונקציונלית והדמיה של נתונים ביולוגיים בעלי תפוקה גבוהה.
קאטאדפטקוד פתוחhttps://cutadapt.readthedocs.ioכלי שורת פקודה שמסיר רצפי מתאמים, פריימרים, זנבות פולי-A ומקטעים לא רצויים אחרים מקריאות רצף בתפוקה גבוהה.
ציטוסקייפקונסורציום Cytoscapehttps://cytoscape.org/פלטפורמת תוכנה בקוד פתוח המיועדת להדמיה וניתוח של רשתות ביולוגיות מורכבות.
DESeq2 (חבילת R)מוליכים ביולוגייםhttps://bioconductor.org/packages/DESeq2/חבילת R המיועדת לניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי של נתוני ספירה
EnhancedVolcano (חבילת R)מוליכים ביולוגייםhttps://bioconductor.org/packages/EnhancedVolcano/  חבילת R שנועדה ליצור עלילות הר געש באיכות פרסום.
FastQCבאברהם ביואינפורמטיקהhttps://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/כלי בקרת איכות בקוד פתוח לנתוני ריצוף בתפוקה גבוהה.
ספירת תכונותקריאת משנה / SourceForgehttp://subread.sourceforge.net/תוכנה המשמשת לספירת קריאות הממופות לתכונות גנומיות
ספירת HTSeqחבילת Pythonhttps://htseq.readthedocs.ioכלי שורת פקודה שסופר כמה קריאות ריצוף מיושרות בתפוקה גבוהה חופפות תכונות גנומיות כגון גנים או אקסונים. אני
שבב חרוזים לביטוי MicroRNA של Illumina Human v2אילומינה /מערך מסחרי לאפיון מיקרו-רנ"א של דגימות אנושיות
multiMiR (חבילת R)מוליכים ביולוגייםhttps://bioconductor.org/packages/multiMiR/חבילת R המספקת את האוסף המשולב הגדול ביותר של microRNA&ndash חזוי ומאומת בניסוי; אינטראקציות ממוקדות יחד עם האסוציאציות שלהם למחלות ותרופות.
הארגוני. Hs.eg.db (חבילת R)מוליכים ביולוגייםhttps://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/חבילת הערות המיועדת למחקר גנומי אנושי (הומו ספיינס).
תוכנת Rפרויקט Rhttps://www.r-project.org/פרויקט קוד פתוח לחישוב סטטיסטי
סטודיופוזיט PBC/סביבת פיתוח משולבת עוזרת להיות פרודוקטיביים יותר עם R ו-Python
SAMtoolsקוד פתוחhttp://www.htslib.org/חבילת תוכנה למניפולציה של נתוני ריצוף מהדור הבא (NGS).

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hsu, P. W., et al. miRNAMap: genomic maps of microRNA genes and their target genes in mammalian genomes. Nucleic Acids Res. 34 (Database issue), D135-D139 (2006).
  2. Fragiadaki, M. Lessons from microRNA biology: top key cellular drivers of autosomal dominant polycystic kidney disease. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (5), 166358(2022).
  3. Li, D., Sun, L. MicroRNAs and polycystic kidney disease. Kidney Med. 2 (6), 762-770 (2020).
  4. Akintunde, O., Tucker, T., Carabetta, V. J. The evolution of next-generation sequencing technologies. arXiv. , (2023).
  5. Tam, S., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Optimization of miRNA-seq data preprocessing. Brief Bioinform. 16 (6), 950-963 (2015).
  6. Zhou, X., Oshlack, A., Robinson, M. D. miRNA-seq normalization comparisons need improvement. RNA. 19 (6), 733-734 (2013).
  7. Perez-Rodriguez, D., Agis-Balboa, R. C., Lopez-Fernandez, H. MyBrain-Seq: a pipeline for miRNA-seq data analysis in neuropsychiatric disorders. Biomedicines. 11 (4), 1230(2023).
  8. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , R Core Team. (2012).
  9. Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  10. Huang, L., et al. Integrated analysis of mRNA-seq and miRNA-seq reveals the potential roles of Egr1, Rxra and Max in kidney stone disease. Urolithiasis. 51 (1), 13(2022).
  11. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D155-D162 (2019).
  12. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
  13. Xu, S., et al. Using clusterProfiler to characterize multiomics data. Nat Protoc. 19 (11), 3292-3320 (2024).
  14. Friedländer, M. R., et al. miRDeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades. Nucleic Acids Res. 40 (1), 37-52 (2012).
  15. Rueda, A., et al. sRNAtoolbox: an integrated collection of small RNA research tools. Nucleic Acids Res. 43 (W1), W467-W473 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MiRNA ExpressionDifferential ExpressionTarget PredictionFunctional EnrichmentRegulatory NetworkR PackagesCytoscape Visualization

מאמרים קשורים